RPPA umożliwia jednoczesne badanie ekspresji białek setek próbek, wydrukowanych na szkiełkach nitrocelulozowych, przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Technika ta została zastosowana do zbadania wpływu heterogeniczności leczenia farmakologicznego w obrębie jasnokomórkowego raka nerki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie nie ma leczenia przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki, najczęstszego wariantu choroby. Uważa się, że kluczowym czynnikiem wpływającym na tę oporność na leczenie jest złożoność molekularna choroby 1. Stosowano terapię celowaną, taką jak inhibitor kinazy tyrozynowej (TKI)-sunitynib, ale tylko 40% pacjentów odpowie na leczenie, przy czym u przytłaczającej większości tych pacjentów nastąpi nawrót choroby w ciągu 1 roku 2. W związku z tym kwestia wewnętrznej i nabytej oporności u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym jest bardzo istotna 3.
Aby zbadać oporność na TKI, mając na celu opracowanie skutecznych, spersonalizowanych metod leczenia, wymagane jest sekwencyjne badanie tkanek po określonym okresie terapii celowanej, podejście, które okazało się skuteczne w przewlekłej białaczce szpikowej 4. Jednak zastosowanie takiej strategii w raku nerkowokomórkowym jest skomplikowane ze względu na wysoki poziom heterogeniczności zarówno między-, jak i wewnątrznowotworowej, co jest cechą raka nerkowokomórkowego5,6, a także innych guzów litych 7. Heterogeniczność międzynowotworowa wynikająca z różnic transkryptomicznych i genetycznych jest dobrze znana nawet u pacjentów z podobnym obrazem, stadium i stopniem guza. Ponadto oczywiste jest, że w RCC występuje duża heterogeniczność morfologiczna (wewnątrznowotworowa), co prawdopodobnie oznacza jeszcze większą heterogeniczność molekularną. Szczegółowe mapowanie i kategoryzacja nowotworów RCC za pomocą połączonej analizy morfologicznej i oceny Fuhrmana pozwala na wybór reprezentatywnych obszarów do analizy proteomicznej.
Analiza RCC8 oparta na białku jest atrakcyjna ze względu na jej powszechną dostępność w laboratoriach patologicznych; jednak jej zastosowanie może być problematyczne ze względu na ograniczoną dostępność specyficznych przeciwciał 9. Ze względu na punktowy charakter matryc białkowych odwróconej fazy (RPPA), swoistość przeciwciał musi być wstępnie zwalidowana; W związku z tym ścisła kontrola jakości stosowanych przeciwciał ma ogromne znaczenie. Pomimo tego ograniczenia, format igłów punktowych pozwala na miniaturyzację testu, co pozwala na drukowanie setek próbek na jednym szkiełku nitrocelulozowym. Wydrukowane preparaty mogą być następnie analizowane w podobny sposób jak analiza zachodnia przy użyciu docelowych specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych, co pozwala na multipleksowanie. Zróżnicowana ekspresja białek we wszystkich próbkach na szkiełku może być następnie analizowana jednocześnie, porównując względny poziom fluorescencji w sposób bardziej opłacalny i wysokoprzepustowy.
Protokół
1. Identyfikacja morfologicznej i molekularnej heterogeniczności guza
- Guzy usunięto z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przechowywano na suchym lodzie.
- Podziel guzy na odcinki o długości około 1 cm3. Odwzoruj pierwotne położenie każdej sekcji guza względem siebie i oznacz ją unikalną nazwą. Przechowywać próbki w oddzielnych kriowiach w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do użycia.
- Próbki należy pokryć w OCT i rozciąć w kriosacie w temperaturze -22 °C.
- Próbki barwione metodą przeciwbarwienia Hematoksyliny i Eozyny.
- Analiza mikroskopowa zamrożonych skrawków w celu upewnienia się, że mają one charakter ccRCC, żywotnego guza i do oceny (niski stopień, wysoki stopień lub mieszany niski/wysoki stopień trudności, trudne do rozróżnienia stopnie Fuhrmana od 1 do 4 na zamrożonym skrawku). Rysunek 1 a&b (barwienie H&E o wysokim niskim i mieszanym stopniu).
- Wybierz do 4 próbek z każdego morfologicznie różniącego się regionu w każdym guzie do ekstrakcji białka.
2. Ekstrakcja białka z próbek guza
- Wytnij próbkę guza z OCT.
- Umieścić 50-75 mg tkanki w probówkach o pojemności 2 ml z 990 μl buforu do lizy [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] uzupełnionym aprotyniną (Sigma A6279) (10 mg / ml), koktajlem inhibitora fosfatazy 2 (Sigma, P5716), koktajlem inhibitora fosfatazy 3 (Sigma, P0044) i koktajlem inhibitora proteazy (Roche, 11836153001).
- Dodać pojedynczą stalową kulkę o średnicy 5 mm do każdej probówki i dwukrotnie homogenizować pod częstotliwością 50 Hz przez 5 minut za pomocą TissueLyser, sprawdzając poziom homogenizacji po każdym okresie 5 minut.
- Przenieść homogenizowaną próbkę do nowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą pipety, pozostawiając stalową kulkę.
- Dodać 10 μl Triton X-100 do każdej próbki przed odwirowaniem w temperaturze 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatanty do świeżych probówek do mikrowirówek.
- Określ stężenie białka za pomocą testu BCA (ryc. 2).
- Normalizować stężenie białka na poziomie 1 mg/ml.
3. Walidacja przeciwciał
- Przygotuj próbki białek (wyekstrahowane z odpowiednich linii komórkowych lub tkanek) do western blot i uruchom na 10% żelu SDS-PAGE.
- Przenieść próbki na membranę nitrocelulozową przez noc w temperaturze 4 °C.
- Zablokuj membranę w buforze blokującym Li-Cor Odyssey (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze blokującym Li-Cor Odyssey (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) w zalecanym przez producenta rozcieńczeniu, zwykle 1 na 1,000.
- Inkubować błonę w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.
- Uzupełnić 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 1 ml Tween20 /1L PBS).
- Membranę myć w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 min (x3).
- Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym Odyssey (rozcieńczonym 50:50 w PBS) 0,01% SDS w rozcieńczeniu 1:10 000 (1,5 μl/15 ml).
- Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie wstrząsając - ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu, gdy zostanie ostatecznie zeskanowana.
- Umyj membranę w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 minut (x3), trzymając membranę w ciemności.
- Umyj membranę w PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut (x3), aby usunąć resztki Tween20, ponownie utrzymując membranę w ciemności.
- Połóż membranę płasko na kawałku bibuły filtracyjnej w ciemności i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu - pozwolenie membranie na wyschnięcie może wzmocnić sygnał i zmniejszyć tło, ale uczynić ją bezużyteczną do usuwania i ponownego sondowania.
- Zeskanuj membranę za pomocą skanera LiCor Odyssey. Trzymaj membranę w ciemności do czasu, gdy zostanie zeskanowana.
- Wybieraj tylko przeciwciała, które generują pojedynczy dominujący prążek o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Rycina 3 przedstawia przykłady dopuszczalnych i niedopuszczalnych przeciwciał do stosowania z RPPA.
4. Drukowanie RPPA
- Lizaty białkowe naniesiono na szkiełka pokryte nitrocelulozą (Fastslides-Whatman) za pomocą robota spottera MicroGrid II. Użyte preparaty zawierały 2 podkładki, na których nanoszono próbki. Na każdej klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to prowadnice z 1, 8 i 16 padami. Im większa liczba padów, tym mniejsza liczba próbek, które można dostrzec na każdej z nich.
- Z każdej próbki wykonano serię pięciu 2-krotnych rozcieńczeń, a następnie każdą z nich nakrapiano w trzech egzemplarzach (co dało w sumie 15 plamek na próbkę).
5. Wykrywanie białek RPPA
- Mokre szkiełka w nadmiarze buforu blokującego LiCor (rozcieńczonego 50:50 w PBS). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na platformie bujanej.
- Przygotować 800 μl przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym LiCor (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) w pożądanych stężeniach i przechowywać na lodzie.
- Zamontuj szkiełka w (i) pojedynczym ramie Chip Clip lub (ii) czterokomorowym uchwycie prowadnicy "FastFrame" tak, aby między szkiełkiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.
- Usunąć resztkowy bufor z dołków i dodać 600 μl przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek.
- Umieścić szkiełko i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pojemniku i inkubować na platformie bujanej przez noc w temperaturze 4 °C.
- Uzupełnić 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μl Tween 20 /100 ml PBS).
- Wyjmij szkiełka z chłodni i ostrożnie usuń pierwotne przeciwciała z każdej studzienki.
- Dodaj 600 μl PBS-T i myj szkiełka na platformie bujanej w temperaturze RT przez 5 minut (X3).
- Przygotować znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe, najpierw rozcieńczając w buforze blokującym Odyssey (rozcieńczonym 50:50 w PBS) 0,01% SDS w rozcieńczeniu 1:2,000 (1 μl/2 ml).
- Usunąć bufor z dołków i dodać 600 μl znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych do odpowiednich studzienek. Inkubować przeciwciała drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie potrząsając - ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu, gdy zostanie ostatecznie zeskanowana.
- Usunąć przeciwciała drugorzędowe ze studzienki i krótko przemyć (x3) w 600 μl PBS-T w temperaturze pokojowej. Wyjąć szkiełko z nośnika, przenieść do odpowiedniego pojemnika i myć nadmiar PBS-T przez 15 minut, trzymając membranę w ciemności.
- Usuń PBS-T i dalej myj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć resztki Tween-20, ponownie utrzymując membranę w ciemności.
- Suszyć Fastslide w piekarniku w temperaturze 50 °C przez 10 minut, a następnie zeskanować na skanerze Li-Cor Odyssey. Trzymaj slajd w ciemności, dopóki nie zostanie zeskanowany.
- Zeskanuj szkiełko przy długości fali 680 nm i/lub 800 nm, w zależności od użytego przeciwciała lub przeciwciał drugorzędowych. Do wykrywania dwukolorowego zawsze używaj wysoce zaadsorbowanych przeciwciał drugorzędowych, aby zminimalizować reaktywność krzyżową. Staranny dobór przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych jest konieczny do wykrywania dwukolorowego. Zasadnicze znaczenie ma selekcja różnych gatunków żywicieli (np. królika i myszy) dla dwóch podstawowych przeciwciał. Pozwala to na dyskryminację za pomocą drugorzędowych przeciwciał anty-króliczych i anty-myszy, które są znakowane barwnikiem o łatwo rozróżnialnych widmach emisyjnych.
- Pliki obrazów są zapisywane jako pliki .tiff. Rysunek 4 (obraz zeskanowanych plików).
6. Analiza danych
- Uruchom oprogramowanie MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
- Otwórz plik obrazu .tiff zawierający skan slajdu RPPA.
- Wybierz predefiniowany plik szablonu, który będzie zawierał siatkę do nałożenia na obraz slajdu RPPA.
- Kliknij przycisk Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI), aby wyświetlić siatkę.
- Umieść siatkę nad miejscami RPPA. Rysunek 6a (obraz siatki nad obrazem).
- Kliknij przycisk Zaznacz WSZYSTKO, aby podświetlić cały zwrot z inwestycji.
- Kliknij przycisk Znajdź wszystko. MicroVigene automatycznie znajdzie zwrot z inwestycji, znajdzie plamy, odejmie tło, usunie kurz i określi ilościowo plamy.
- Kliknij przycisk Wyświetl krzywą rozcieńczenia, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich próbek na slajdzie RPPA.
- Kliknij Zapisz dane rozcieńczenia.
- Ponieważ każda próbka jest drukowana w 5 punktach rozcieńczenia, z których każdy jest w trzech egzemplarzach, do analizy jest 15 punktów, co zmniejsza ryzyko błędów i poprawia jakość dopasowania krzywej. MicroVigene tworzy 4-parametrowy algorytm "Supercurve" modelu logarytmu logistycznego (Rysunek 6b), który obejmuje wszystkie plamki w celu wytworzenia sigmoidalnej krzywej kinetyki wiązania antygen-przeciwciało. Zakłada się, że ta sama kinetyka wiązania przeciwciało-antygen zachodzi w każdym miejscu próbki, nawet w różnych próbkach, więc biorąc wszystkie miejsca na tablicy w celu dopasowania do wspólnej krzywej odpowiedzi, można zwiększyć pewność krzywej pasującej10,11
Y=a+ ((b-a)/(1+e(c*d-ln(x))))
gdzie x jest współczynnikiem rozcieńczenia, a Y jest natężeniem sygnału.
Próbki można analizować porównawczo przy użyciu wartości y0, która w naszej analizie odpowiadała wartości y w punkcie środkowym wartości x po odwzorowaniu ich na superkrzywej. - Wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel i wykreśl y0, jak na rysunku 7.
- Wariancja białka wewnątrznowotworowego została obliczona oddzielnie dla pacjentów nieleczonych i leczonych w ramach ANOVA. Rozkłady wariancji łączące dane ze wszystkich analizowanych białek porównano za pomocą testu Manna-Whitneya (MWT). Wariancje wewnątrznowotworowe dla poszczególnych białek porównano za pomocą testu F, w którym utrzymały się założenia normalności i homoskedastyczności, ocenione odpowiednio za pomocą testów Lillefoursa i Flignera; Zastosowano korektę współczynnika fałszywych wykryć (FDR)12. Zróżnicowaną ekspresję białek między próbkami pacjentów nieleczonych i leczonych badano dla każdego białka za pomocą testu t studenta, w którym spełnione były założenia normalności i homoskedastyczności, w przeciwnym razie przeprowadzono MWT; FDR zastosowano w połączonym teście t i wartościach MWT 12. Znaczenie korelacji Pearsona i ekspresji białek dla białek oszacowano przy użyciu standardowego podejścia [odniesienie R] i zastosowano FDR 12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład zeskanowanego slajdu RPPA można zobaczyć na Ryc. 4(i), gdzie przedstawiono kanały 680 i 800 nm. Dzięki rozdzieleniu obrazów według długości fali, Ryc. 4(ii) umożliwia analizę każdego pola na slajdzie RPPA i określenie ekspresji poszczególnych białek Ryc. 4(iii). Jak widać na Ryc. 4(iii), ekspresja poszczególnych białek w próbkach jest unikalna; Gelsolina wykazuje wysoki poziom ekspresji na całym slajdzie w porównaniu do cMYC, który ma znacznie n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda RPPA stanowi wysokoprzepustową alternatywę dla szeroko stosowanej, ale stosunkowo niskoprzepustowej techniki analizy białek western blot. Metoda ta pozwala na półilościową analizę i jednoczesne porównywanie setek próbek, co pozwala na bezpośrednie porównanie kluczowych białek w szerokim wyborze linii komórkowych i próbek tkanek. Multipleksowanie z różnymi gatunkami przeciwciał dodatkowo zwiększa moc tej techniki, umożliwiając jednoczesne stosowanie wielu przeciwciał. Przedstawiony przykład podk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Praca autorów FCO, DF, JN, DJH i GDS wymienionych powyżej jest finansowana przez Biuro Głównego Naukowca, numer grantu: ETM37 i wspierana przez Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Praca AL jest finansowana przez Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for the care and cure of cancer oraz Medical Research Council. IO jest wspierany przez stypendium Królewskiego Towarzystwa Rządu Szkockiego w Edynburgu, współfinansowane przez działania Marie Curie i Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych. Autorzy pragną podziękować współwnioskodawcom i współpracownikom SCOTRRCC za ich użyteczne dyskusje na niektóre z tematów omawianych w tym artykule.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| aprotynina | Sigma | A6279 | |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy | |||
| Roche | 11836153001 | ||
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor | 927-40000 | ||
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II Spotter robotyczny | Biorobotics | ||
| FastFrame czterokieszeniowy uchwyt na prowadnice | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-padowy | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anty-mysi IgG Licor | 926-68020 | ||
| IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG Licor | 926-32211 |
Bibliografia
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52(2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49(2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557(2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53(2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
