Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Podsumowanie

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Streszczenie

Ten protokół przedstawia kroki wymagane do stworzenia solidnego modelu choroby zakaźnej i zapalenia jelita grubego, a także metody używane do scharakteryzowania infekcji Citrobacter rodentium u myszy. C. Rodentium jest Gram-ujemnym, mysim patogenem bakteryjnym, który jest ściśle spokrewniony z klinicznie ważnymi ludzkimi patogenami enteropatogennymi E. coli i enterokrwotoczną E. coli. Po zakażeniu C. rodentium myszy immunokompetentne cierpią na niewielką i przejściową utratę masy ciała i biegunkę. Histologicznie obserwuje się wydłużenie krypty jelitowej, naciekanie komórek odpornościowych i zubożenie komórek kubkowych. Usunięcie infekcji uzyskuje się po 3 do 4 tygodniach. Pomiar integralności bariery nabłonkowej jelit, obciążenia bakteryjnego i uszkodzeń histologicznych w różnych punktach czasowych po zakażeniu pozwala na scharakteryzowanie szczepów myszy podatnych na infekcję.

Mechanizmy wirulencji, dzięki którym patogeny bakteryjne kolonizują przewód pokarmowy swoich gospodarzy, a także specyficzne reakcje gospodarzy, które bronią przed takimi infekcjami, są słabo poznane. Dlatego model infekcji bakteryjnej jelit C. rodentium służy jako cenne narzędzie pomagające nam w zrozumieniu tych procesów. Bakterie jelitowe są również powiązane z chorobami zapalnymi jelit (IBD). Postawiono hipotezę, że nieadaptacyjne przewlekłe reakcje zapalne obserwowane u pacjentów z IBD rozwijają się u osób podatnych genetycznie w wyniku nieprawidłowej ekspozycji układu odpornościowego błony śluzowej jelit na bakterie jelitowe. W związku z tym badanie modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego oferuje znaczny potencjał w definiowaniu potencjalnie patogennych odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe. Zapalenie jelita grubego wywołane przez C. rodentium jest jednym z takich rzadkich modeli, który pozwala na analizę odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe, pogłębiając nasze zrozumienie potencjalnych mechanizmów patogenezy IBD; niezbędne w opracowywaniu nowatorskich metod leczenia zapobiegawczego i terapeutycznego.

Wprowadzenie

Zakażenie patogenami bakteryjnymi jelit wywołuje zapalenie przewodu pokarmowego (GI), a także patologię i patofizjologię jelit, w tym biegunkę i dysfunkcję bariery nabłonkowej jelit. Mechanizmy wirulencji, za pomocą których patogeny bakteryjne kolonizują przewód pokarmowy swoich gospodarzy, a także specyficzne odpowiedzi gospodarza, które bronią się przed takimi infekcjami, są słabo poznane, jednak ostatnie postępy w modelowaniu infekcji bakteryjnych jelitowych zaczęły pomagać w zrozumieniu tych procesów. Bakterie jelitowe są również powiązane z chorobami zapalnymi jelit (IBD). Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i WZJG są złożonymi chorobami o nieznanej etiologii, charakteryzującymi się przewlekłym zapaleniem jelit i uszkodzeniem tkanek. Istnieje wiele mysich modeli zapalenia jelit, od spontanicznego zapalenia u genetycznie zmodyfikowanych szczepów, takich jak myszy IL10 -/-, po wyzwania chemiczne związane ze związkami, takimi jak siarczan sodu dekstranu (DSS) i kwas dinitrobenzenosulfonowy (DNBS)¹. Postawiono hipotezę, że nieadaptacyjne przewlekłe reakcje zapalne obecne u pacjentów z IBD rozwijają się u osób podatnych genetycznie po nieprawidłowym narażeniu układu odpornościowego błony śluzowej jelit na bakterie jelitowe², dlatego badanie modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego oferuje również znaczny potencjał w określaniu potencjalnie patogennych odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe. Zapalenie jelita grubego wywołane przez Citrobacter rodentium jest jednym z rzadkich modeli zakaźnego zapalenia jelita grubego, który został dobrze scharakteryzowany^1,3, co pozwala na analizę odpowiedzi gospodarza na bakterie jelitowe i dalsze zrozumienie potencjalnych mechanizmów patogenezy IBD; Jest to istotny krok w kierunku opracowania nowatorskich metod leczenia zapobiegawczego i terapeutycznego.

C. rodentium to gram-ujemny patogen bakteryjny specyficzny dla myszy (A/E), który jest blisko spokrewniony z ważnymi ludzkimi patogenami enteropatogennymi E. coli (EPEC) i enterokrwotocznymi E. coli (EHEC)^3-8. Rodzina patogenów A/E ściśle przyczepia się do wierzchołkowej błony komórkowej gospodarza nabłonka jelita ślepego i okrężnicy, tworząc nieinwazyjną strukturę przypominającą cokół na komórce gospodarza. Doustne prowokowanie C. rodentium 10^{8-10 9} organizmów daje solidny model zakaźnego zapalenia jelita grubego charakteryzującego się przerostem okrężnicy lub wydłużeniem krypt, jednojądrzastym naciekiem komórek odpornościowych i zubożeniem komórek kubkowych^3,4. Początkowe miejsce kolonizacji, kilka godzin po prowokacji, znajduje się w plamie jelita ślepego, po której następuje progresja do dystalnej okrężnicy 2 do 3 dni po zakażeniu³. W immunokompetentnych szczepach myszy klirens patogenu uzyskuje się 3 do 4 tygodni po zakażeniu^1,3,4. Stwierdzono jednak, że wiele genetycznie zmodyfikowanych szczepów, tj. myszy z niedoborem genu lub myszy z nokautem (-/-), wykazuje zwiększoną podatność na infekcje, co skutkuje nadmiernymi uszkodzeniami i/lub przewlekłą infekcją i stanem zapalnym^9-14. Zastosowanie tego modelu zakaźnego zapalenia jelita grubego w tych nokautujących szczepach, z których wiele nie ma wrodzonych białek sygnałowych, było niezbędne do ujawnienia kilku białek gospodarza integralnych dla ustąpienia infekcji jelitowej i stanu zapalnego.

Protokół

1. Przygotowanie inokulum Citrobacter rodentium i zgłębnika jamy ustnej myszy

1. Przygotuj i autoklaw bulionu Luria Bertani (LB).
2. Uzyskać żywotną C. rodentium z zamrożonego wywaru glicerolowego i rozprowadzić na płytce agarowej LB za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania lub końcówki pipety. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Zaszczepić 3 ml sterylnego bulionu LB w probówce do hodowli sokoła koloniami z płytki LB za pomocą pętli do zaszczepiania lub końcówki pipety. Przygotowanie inokulum powinno odbywać się przy użyciu technik aseptycznych.
3. Inkubować kulturę C. rodentium w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez noc w wytrząsarce stołowej z prędkością 200 obr./min. Zaszczepiony bulion LB powinien wydawać się mętny po całonocnej hodowli.
4. Użyj igły do zgłębnika z końcówką gródki dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml, aby wstrzyknąć każdej myszy 100 μl nocnej kultury C. rodentium. Delikatnie potrząśnij myszą, mocno chwytając kciukiem i palcami luźną skórę na szyi i plecach. Odciągnij głowę zwierzęcia palcem wskazującym, aby unieruchomić głowę i wyprostować przełyk w celu wprowadzenia igły do zgłębnika.
5. Utrzymuj mysz w pozycji pionowej i skieruj końcówkę gruszka igły do wbijania wzdłuż boku ust i nad językiem. Delikatnie przełóż igłę wzdłuż podniebienia i przesuń ją w dół przełyku. Jeśli podczas tej procedury odczuwalny jest jakikolwiek opór, wyjmij igłębkę i włóż ją ponownie.
6. Powoli wstrzyknąć 100 μl inokulum bakteryjnego i delikatnie usunąć igłębkę. Monitoruj częstość oddechów i zachowanie myszy po powrocie do klatki.

Uwagi:

• W krokach 2 i 3 należy również przygotować probówkę do hodowli sokoła przy użyciu technik aseptycznych z 3 ml sterylnego bulionu LB do hodowli przez noc, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteryjnego samego bulionu. Rosół LB powinien wydawać się klarowny po całonocnej hodowli.
• Delikatnie wymieszaj kulturę w probówce Falcon przed załadowaniem strzykawek do zgłębnika, tak aby taka sama dawka bakterii została dostarczona do każdej myszy w kroku 4.
• Posiew pobrany przez noc należy wyrzucić, jeśli był zaszczepiany przez ponad 24 godziny.
• Wszystkie zakażenia C. rodentium i pomieszczenia z zakażonymi zwierzętami powinny być przeprowadzane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

2. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej okrężnicy u myszy zakażonych C. rodentium

1. Zmierz integralność bariery w żądanym punkcie czasowym po infekcji.
2. W dniu badania należy przygotować wystarczającą ilość izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu o masie 4 kDa rozpuszczoną w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stężenia 80 mg ^ml-1, aby podać każdej myszy 150 μl i przygotować krzywą wzorcową.
3. Oczyścić mysz i przetrzeć ją 150 μl dekstranu FITC. W tym czasie wyjmij jedzenie z klatki.
4. Znieczulenie myszy 4 godziny po znieczuleniu i pobranie jak największej ilości krwi (~450 μl) przez nakłucie serca. Dodać krew do końcowego stężenia 3% dekstrozy kwasowo-cytrynianowej w probówce mikrowirówkowej, aby zahamować krzepnięcie. Poddaj myszy eutanazji i zbierz tkanki okrężnicy w PBS w celu zliczenia bakterii (kroki 3.1 - 3.5) oraz w 10% formalinie w celu utrwalenia tkanek i ostatecznie barwienia immunofluorescencyjnego (kroki 4.1 - 4.8).
5. Wirować próbki krwi w temperaturze 1 000 x g przez 12 minut w wirówce w temperaturze 4 °C. Zebrać surowicę i rozcieńczyć do 1/10 i 1/100 w PBS. Dodać 100 μl każdej próbki w tych dwóch rozcieńczeniach do 96-dołkowej płytki w kontrpróbach.
6. Aby przygotować krzywą wzorcową, należy rozcieńczyć oryginalny 80 mg ^ml-1 FITC-dekstran użyty do zgłębnika myszy w PBS do następujących stężeń: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 μg/ml. Dodać 100 μl każdego stężenia do 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach.
7. Określić ilościowo fluorescencję każdej próbki za pomocą fluorometru przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 535 nm.
8. Analizuj nieprzetworzone dane, wykreślając krzywą standardową. Wprowadzić surowe dane dla każdej próbki do równania linii wygenerowanej przez krzywą wzorcową w celu określenia stężenia dekstranu FITC-dekstranu w każdej próbce.

Uwagi:

• Począwszy od kroku 4, trzymaj próbki krwi na lodzie i zminimalizuj ekspozycję na światło.
• Podczas pomiaru integralności bariery nabłonkowej optymalny jest punkt czasowy przypadający na 7 dni po zakażeniu lub wcześniej, ponieważ po tym czasie dochodzi do poważnego uszkodzenia tkanek. Pomiar integralności bariery przed wystąpieniem poważnych uszkodzeń pozwala określić maksymalne różnice w przepuszczalności podczas infekcji C. rodentium między szczepami myszy.
• Upewnij się, że niezakażone myszy kontrolne są również testowane pod kątem integralności bariery nabłonkowej.

3. Pomiar obciążenia bakteryjnego w tkankach myszy zakażonych C. rodentium

1. Dodać 1 ml sterylnego PBS i autoklawizowany metalowy koralik do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml z okrągłym dnem, stosując technikę aseptyczną. Poszczególne tkanki pobrane od każdego zwierzęcia zostaną umieszczone w oddzielnych probówkach PBS. Zważyć probówki przed dodaniem tkanki.
2. Usuń jelito ślepe i okrężnicę z myszy. Oddziel jelito ślepe od okrężnicy i wypchnij zawartość światła za pomocą kleszczy. Dodaj zawartość do probówki PBS. Po oddzieleniu 0,5 cm odcinków od dystalnej okrężnicy i jelita ślepego w celu 10% utrwalenia formaliny, należy rozciąć pozostałą okrężnicę i jelito ślepe wzdłużnie i przemyć sterylnym PBS przed umieszczeniem tkanek w probówkach.
3. Zważyć probówki PBS z tkanką, a następnie homogenizować próbki za pomocą ubijaka do kulek przez 6 minut przy 30 Hz.
4. Stosując techniki aseptyczne, dodać 180 μl sterylnego PBS na studzienkę do płytki 96-dołkowej. Dodać 20 μl każdej homogenizowanej próbki do pierwszego dołka w każdym rzędzie. Dobrze wymieszać i seryjnie rozcieńczyć, dodając 20 μl z każdego poprzedniego dołka, aby uzyskać rozcieńczenia od ^10-1 (pierwszy dołek) do ^10-6. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia z każdej próbki w trzech egzemplarzach na kwadratowej płytce LB z siatką. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
5. Policz jednostki tworzące kolonie (CFU), a następnie uśrednij 3 zliczenia i zapisz rozcieńczenie, w którym policzono każdą próbkę. Pomnóż średnią jtk przez 50, ponieważ użyto 20 μl pierwotnej próbki o objętości 1 ml i przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka została policzona, co daje jtk/ml. Na koniec podziel przez masę tkanki, aby określić jtk/g.

4. Ocena histologiczna i barwienie immunofluorescencyjne zakażonych tkanek jelita grubego

1. Pobrać tkanki jak w kroku 3.2. Przechowuj chusteczki w formalinie przez noc, a następnie umyj 70% etanolem. Zanurz tkanki w parafinie i wytnij odcinki 5 μm do barwienia. Wybarwić hematoksyliną i eozyną w celu oceny histologicznej i przejść do kolejnych etapów barwienia immunofluorescencyjnego.
2. Aby odparafinować tkanki przed barwieniem, umieść szkiełka w słoiku do barwienia coplin i umieść w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 10 minut. Następnie umieść szkiełka w ksylenie na cztery prania po 2 minuty każde. Szkiełka należy następnie ponownie nawodnić dwoma 5-minutowymi płukaniami w 100% etanolu, a następnie jednym 5-minutowym myciem w każdym z poniższych: 95% etanolu, 75% etanolu i dH₂0. Mycie to powinno odbywać się w dygestorium, aby uniknąć narażenia na szkodliwe opary.
3. Umieść szkiełka w słoiku z podgrzanym buforem cytrynianu sodu, a następnie wstaw do naczynia do gotowania na parze na 30 minut, a następnie odstaw na 30 minut. Proces ten zrywa wiązania krzyżowe białek utworzone przez wiązanie formaliny, pobierając potencjalne miejsca antygenowe.
4. Płukać azydkiem PBS przez 5 minut, trzy razy. Wysuszyć szkiełka i oznaczyć obszar wokół tkanki pisakiem PAP, aby stworzyć hydrofobową barierę, utrzymując odczynniki barwiące zlokalizowane na tkance.
5. Blokować tkankę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego (np. surowicy α-kozy) w komorze wilgotnościowej barwiącej immunologicznie.
6. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia za pomocą buforu rozcieńczającego przeciwciała. Odlać bufor blokujący i dodać 50-100 μl przeciwciała pierwszorzędowego do tkanek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
7. Płukać azydkiem PBS przez 5 minut, trzy razy. Dodać 50-100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym przeciwciała do tkanek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Myć dH₂O przez 5 minut, trzy razy.
8. Odwodnić szkiełka, dodać podłoże mocujące DAPI Prolong Gold i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zobacz preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Uwagi:

• Azydek PBS można zastąpić świeżo przygotowanym PBS jako alternatywę, aby uniknąć rozwoju bakterii w podłożu myjącym począwszy od kroku 4.

Wyniki

Podczas standardowego eksperymentu z infekcją, myszy są zarażane około 2,5 x 10⁸ CFU poprzez zgłębnik 100 μl w ciągu nocy hodowli C. rodentium. Zakażenie myszy C57BL/6 C. rodentium powoduje niewielką i przejściową utratę masy ciała i biegunkę. Chociaż jest to rzadkie zjawisko u myszy C57BL/6, zwierzęta mogą zachorować i wymagać eutanazji. Dlatego myszy powinny być monitorowane pod kątem stopnia utraty masy ciała i objawów stresu, takich jak piloerekcja sierść i zgarbiona postawa, aby określić...

Dyskusja

Zakażenie Citrobacter rodentium stanowi cenny model do badania zarówno chorób zakaźnych, jak i zapalenia jelita grubego u myszy. Ten unikalny model pozwala na scharakteryzowanie zarówno reakcji gospodarza, jak i właściwości patogennych bakterii. Kroki opisane w tym protokole szczegółowo opisują pomyślne użycie tego modelu.

W tym protokole jest kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać podczas wywoływania zapalenia jelita grubego i analizowania odpowiedzi. Po pierwsze, przygo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion Luria	ABM	G247	Dodaj 25 g proszku LB do 1L wody. Autoklaw przed użyciem.
Kwadratowa płyta dolna z siatką	Fisher	08-757-11A Rurka
hodowlana Falcon	Sarstedt	62.515.006
Igła do gastra gastric gagul z końcówką grusznika	Fine Science Tools	18060-20
ml strzykawka	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dekstran	Sigma	FD-4
Kwas cytrynowy	Sigma	C7129
Cytrynian sodu	Fisher	S279-500
Dekstroza	Fisher	D16.1
Cytrynian kwaśny dekstroza			20 mM kwas tyrynowy, 110 mM cytrynian sodu, 5 mM dekstroza
płytka 96-dołkowa	Fisher	07-200-762
Koraliki metalowe (5 mm)	Qiagen	69989
10% formaliny	Fisher	5F93-4
5 ml fiolka	DiaMed	STK3205
Hematoxylin	Fisher	H345-23
Eosin	Fisher	E511-100
Xylene	Fisher	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Słoik do barwienia Coplin	VWR	47751-792
Bufor cytrynianu			sodu 10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0
Pióro do cytologii	Cedarlane	Mu22
Kozia surowica	Sigma	G902-3
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Azydek sodu	Sigma	SZ002
Bufor blokujący			2% surowica kozia, 1% BSA, 0,1% tryton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% azydek sodu, 0,01 M PBS, pH 7,2, wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
		do rozcieńczania przeciwciał	0,1% tryton X-100, 0,1% BSA, 0,05% azydek sodu, 0,04%
EDTA Bufor blokujący i Bufor do rozcieńczania przeciwciał dla tir			Te same przepisy co powyżej, ale bez dodatku detergentów (triton X-100 i tween 20)
Przedłuż złoty odczynnik Antifade z DAPI	Invitrogen	P-36931
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12.54SE
Wytrząsarka stołowa do inkubacji	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorometr	Perkin Elmer	Victor2D
Wirówka z chłodzeniem	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Parowiec	Black Decker
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Axio Image.Z1