Method Article

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

DOI:

10.3791/50231

⸱

January 6th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laserowa mikrodysekcja (LMD) to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek i tkanek z niewielkich ilości miąższu 1,2. Wypreparowane komórki mogą być wykorzystywane do różnych badań, takich jak badania transkryptomiczne lub proteomiczne, ocena DNA lub analiza chromosomalna 2,3. Szczególnie wymagającym zastosowaniem LMD jest analiza transkryptomu, która ze względu na labilność RNA 4 może być szczególnie widoczna, gdy komórki są wycinane z tkanek bogatych w RNazy, takich jak trzustka. Protokół mikrodysekcji, który umożliwia szybką identyfikację i pobranie komórek docelowych, jest niezbędny w tym kontekście, aby skrócić czas obsługi tkanki, a w konsekwencji zapewnić zachowanie RNA.

Tutaj opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich komórek beta trzustki z próbek chirurgicznych, które mają być wykorzystane do badań transkryptomicznych 5. Małe kawałki trzustki o wielkości około 0,5-1cm3 wycięto ze zdrowych wyglądających brzegów wyciętych próbek trzustki, zatopiono w związku Tissue-Tek O.C.T., natychmiast zamrożono w schłodzonym 2-metylobutanie i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu cięcia. Czterdzieści seryjnych odcinków o grubości 10 μm wycięto na kriostacie w temperaturze -20 °C, przeniesiono pojedynczo na szkiełka podstawowe, suszono wewnątrz kriostatu przez 1-2 minuty i przechowywano w temperaturze -80 °C.

Bezpośrednio przed procedurą mikrodysekcji laserowej, sekcje były utrwalane w lodowato zimnym, świeżo przygotowanym 70% etanolu przez 30 sekund, myte przez 5-6 zanurzeń w lodowatej wodzie uzdatnionej przez DEPC, a następnie odwodnione przez dwie jednominutowe inkubacje w lodowatym 100% etanolu, a następnie ksylenie (które jest używane do odwadniania tkanek) przez 4 minuty; skrawki tkanek były następnie suszone na powietrzu przez 3-5 minut. Co ważne, Wszystkie etapy, z wyjątkiem inkubacji w ksylenie, zostały przeprowadzone przy użyciu lodowatych odczynników - modyfikacja w stosunku do wcześniej opisanego Protokołu 6. Zastosowanie lodowatych odczynników spowodowało wyraźny wzrost wewnętrznej autofluorescencji komórek beta i ułatwiło ich rozpoznanie. W przypadku mikrodysekcji cztery skrawki były za każdym razem odwadniane: dwie umieszczano w owiniętej folią probówce o pojemności 50 ml, aby chronić tkankę przed wilgocią i bieleniem; Pozostałe dwa zostały natychmiast poddane mikrosekcji. Zabieg ten został wykonany przy użyciu instrumentu PALM MicroBeam (Zeiss) wykorzystującego tryb Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC). Zakończenie wypreparowania komórek beta/wysp trzustkowych z czterech kriosekcji wymagało nie więcej niż 40-60 minut. Komórki zebrano do jednego AdhesiveCap i poddano lizie z 10 μl buforu do lizy. Każda pojedyncza próbka RNA do analizy transkryptomicznej została uzyskana przez połączenie 10 mikrowypreparowanych próbek komórkowych, a następnie ekstrakcję RNA przy użyciu zestawu do izolacji Pico Pure RNA (Arcturus). Protokół ten poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich szybkie i dokładne rozpoznawanie i zbieranie. Dalsze udoskonalenie tej procedury może umożliwić preparację fenotypowo różnych komórek beta, co może mieć wpływ na lepsze zrozumienie zmian związanych z cukrzycą typu 2.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zamrażanie ludzkiej tkanki trzustki

  1. Za pomocą skalpela i pęsety usunąć tkankę tłuszczową, naczynia krwionośne, nerwy i tkankę niemiąższową, a tkankę trzustki pokroić na kawałki (kostkę ~0,5-1 cm).
  2. Umieść jeden kawałek tkanki trzustki na środku Cryomold i przykryj go całkowicie zimnym związkiem Tissue-Tek OCT. Włóż Cryomold do słoika, którego dno pokryte jest wstępnie schłodzonym 2-metylobutanem i zamroź w ciekłym azocie. Zamrożoną próbkę należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie zamrożonych sekcji

  1. Nosić rękawiczki na wszystkich etapach, aby uniknąć denaturacji RNA.
  2. Wyczyść nóż do kriostatu, uchwyt próbki i pędzel zimnym 100% etanolem i RNase Away. Umieść zamrożoną tkankę w kriostacie.
  3. Poczekaj, aż chusteczka, nóż i szczoteczka osiągną temperaturę -20 °C. Oznacz szkiełka SuperFrost Plus i wstępnie schłódź je w komorze kriostatu, czekając, aż chusteczka osiągnie temperaturę -20 °C.
  4. Nałóż związek Tissue-Tek O.C.T. na uchwyt próbki i umieść zamrożoną tkankę na wierzchu.
  5. Po zamrożeniu związku Tissue-Tek O.C.T. przytnij krioblok i usuń nadmiar związku Tissue-Tek O.C.T. za pomocą żyletki.
  6. Wytnij w sumie 40 kolejnych plastrów o wielkości 10 μm z bloku tkanki trzustkowej. Dodatkowo zalecamy wycięcie pierwszego i środkowego plasterka, który zostanie zapisany w celu uzyskania rysunków poglądowych sekcji trzustki, które mogą ułatwić identyfikację wysepek w obrębie plastrów podczas procesu mikrodysekcji.
  7. Przenieś sekcje z ostrza noża na środek szkiełka SuperFrost Plus, dotykając tylnej części szkiełka palcem (pokrytym rękawicą), aby rozgrzać tylko obszar, do którego ma przylegać sekcja.
  8. Wysuszyć skrawki przez 1-2 minuty w kriostacie w temperaturze -20 °C, po czym umieścić je w pojemniku na szkiełka umieszczonym na suchym lodzie. Przechowywać sekcje w temperaturze -80 °C.
  9. W razie potrzeby wyczyść ostrze noża ręcznikami papierowymi i zimnym 100% etanolem.

3. Odwodnienie zamrożonych sekcji

  1. Przygotuj odczynniki: wlej 30 ml świeżo przygotowanego 70% etanolu, 30 ml wody uzdatnionej DEPC, 2x30 ml 100% etanolu i 30 ml ksylenu do 50 ml probówek Cellstar (Falcons); schłodzić i przechowywać wszystkie odczynniki (z wyjątkiem ksylenu) na lodzie.
  2. Wyczyść przestrzeń roboczą pod maską za pomocą 100% etanolu i RNaseZAP.
  3. Przeprowadzić dwie kriosekcje w następujący sposób: utrwalić w lodowatym 70% etanolu przez 30 sekund, przemyć 5-6 szybkimi zanurzeniami w lodowatej wodzie uzdatnionej DEPC, odwodnić dwukrotnie przez 1 minutę w lodowatym 100% etanolu, inkubować przez 4 minuty w ksylenie w temperaturze pokojowej (25 °C) i wysuszyć na powietrzu przez 3-5 minut. Powtórz ten krok z kolejną parą kriosekcji.
  4. Włóż dwie wysuszone kriosekcje tyłem do siebie do 50 ml probówki Cellstar owiniętej folią aluminiową, aby chronić je przed światłem i wilgocią.

4. Laserowa mikrodysekcja komórek beta za pomocą PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Wyczyść mikroskop za pomocą RNaseZAP i zamontuj nasadkę samoprzylepną w RoboMover.
  2. Ustaw następujące ustawienia: Zestaw filtrów 09 (wzbudzenie: 450-490 nm, emisja > 515 nm), tryb AutoLPC, 50% energii lasera, 65% ostrości lasera, 100% prędkości lasera, odległość 5 μm między ujęciami AutoLPC, odległość 6 μm do linii, wysokość robocza: -10,100.
  3. Wstaw jeden slajd do stołu montażowego.
  4. Zlokalizuj autofluorescencyjne komórki beta pod wizualizacją mikroskopową (soczewka 5x lub 10x).
  5. Przełącz się na obiektyw 40x, wybierz komórki beta za pomocą narzędzia do zaznaczania "Freehand" i dokonaj ich mikropreparacji za pomocą lasera.
  6. Uchwyć tkankę czterech odwodnionych kriosekcji do jednej nasadki AdhesiveCap.
    Komentarz 1: czas na wypreparowanie komórek beta jednej odwodnionej kriosekcji nie powinien być dłuższy niż 10-20 minut, aby uniknąć ponownego nawodnienia skrawków tkanki, co spowodowałoby degradację RNA.
    Komentarz 2: sprawdź powodzenie procesu mikrodysekcji poprzez oględziny po przeniesieniu etapu do punktu kontrolnego.

5. Liza mikrowypreparowanej tkanki wzbogaconej komórkami beta

  1. Usuń AdhesiveCap z RoboMover.
  2. Odpipetować 10 μl buforu ekstrakcyjnego (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) do pokrywki AdhesiveCap i inkubować go do góry nogami w temperaturze 42 °C przez 30 minut.
  3. Odwiruj przy 10 000 x g i umieść lizat na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA.
  4. Powtórz kroki 3.) do 5.) ze wszystkimi innymi sekcjami.

6. Ekstrakcja RNA

  1. Połącz wszystkie dziesięć lizatów o pojemności 10 μl
  2. Kontynuuj izolację RNA, pracując w temperaturze pokojowej zgodnie z protokołem zestawu do izolacji RNA PicoPure, Arcturus, przy użyciu buforu ekstrakcyjnego (XB) w stosunku 1:1 do 70% etanolu (w tym traktowanie DNazą).

7. Analiza RNA

  1. Użyj 1 μl RNA do analizy jakości i ilości za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 (PicoChip). Ocena ilościowa jest przeprowadzana w odniesieniu do standardowego RNA załadowanego równolegle na chipie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano na rysunku 1, zmodyfikowany protokół odwadniania doprowadził do poprawy autofluorescencji komórek beta w porównaniu z poprzednio opublikowanym protokołem 6. Stosując opisany protokół, każda z 39 próbek chirurgicznych trzustki została wykorzystana do wygenerowania 40 seryjnych kriosekcji dla średnio 31'544'704 μm3 tkanki/próbki trzustki (zakres: 8'742'390 - 81'522'153 μm3), jak pokazano w tabeli 1. Odpowiada to objętości około 18 wysp trzustko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy niezawodne podejście do mikrodysekcji laserowej (LMD) ludzkich wysp trzustkowych z chirurgicznego wycinka trzustki. Zakładając, że dostępny jest mikroskop LMD, procedura ta może być wdrożona w każdej instytucji badawczej wykonującej częściową pankreatektomię, zwiększając w ten sposób dostęp do materiału z ludzkich wysp trzustkowych zarówno u osób bez cukrzycy, jak i z cukrzycą typu 2. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę niedostatek trzustki oferowanej do izolacji wysp trzustkowych. Korzystnymi aspekta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcemy podziękować wszystkim naszym kolegom, którzy udzielili pomocy, rady i krytycznego wkładu na różnych etapach tego projektu. Produkcja tego artykułu wideo została wsparta funduszami IMIDIA (http://www.imidia.org), niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) do Niemieckiego Centrum Badań nad Diabetologią (DZD, http://www.dzd-ev.de) oraz Szpitala Uniwersyteckiego Carl Gustav Carus na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. Prace, które doprowadziły do powstania niniejszej publikacji, otrzymały wsparcie ze strony Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy w zakresie Leków Innowacyjnych na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 155005 (IMIDIA), której środki pochodzą z wkładu finansowego z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) oraz wkładu rzeczowego przedsiębiorstw EFPIA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-metylobutan (izopentan)ROTH3927.1
AdhesiveCap (nieprzezroczysty, 500 μ l)ZEISS415190-9201-000
Rurki Cellstar (50 ml)greiner bio-one210 261z osłoną nośną
Rurki Cellstar (50 ml)greiner bio-one227.261
Pirowęglan dietylu (DEPC)SIGMAD 5758
Suchy lód
Absolut etanoluVWR20821.310
Pędzel
ciekłego azotu
PALM MicroBeamZEISS
Peel-a-Way (ścięte), 12 x 12 mmProSciTechRR12Góra wewnętrzna 22x22 mm, głębokość 21 mm
Zestaw do izolacji mrożonego RNA Arcturus PicoPureApplied BiosystemsZESTAW 0204
Zacisk
Zestaw
DNaz bez RNazQiagen79254
RNaseZAPSIGMAR 2020
Skalpel / ostrze chirurgiczneTechno Cut2800111
Szkiełka mikroskopowe adhezyjne SuperFrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ25x75x1,0 mm
Tissue-Tek OCT CompoundSakura4583 lub 0807000022
pęsetaBRAUNBD168R
XyleneVWR28975.291
do Formy do zatapiania z tworzywa sztucznego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionPancreatic IsletsHuman TissueTissue PreparationCryosectioningAutofluorescence DetectionRNA PreservationTranscriptomic AnalysisPALM MicroBeamAdhesiveCap Collection

Related Articles