Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Summary

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Abstract

W tym protokole szczegółowo opisano produkcję, eksperymentalną konfigurację i podstawowe działanie niedawno wprowadzonego mikroprzepływowego bioreaktora pikoliterowego (PLBR). PLBR może być wykorzystany do analizy pojedynczych bakterii i mikrokolonii w celu zbadania kwestii biotechnologicznych i mikrobiologicznych dotyczących np. wzrostu komórek, morfologii, reakcji na stres oraz produkcji metabolitów lub białek na poziomie pojedynczej komórki. Urządzenie charakteryzuje się ciągłym przepływem mediów, co zapewnia stałe warunki środowiskowe do badań perturbacji, ale dodatkowo umożliwia szybką zmianę medium, a także warunki oscylacyjne, aby naśladować dowolną pożądaną sytuację środowiskową. Aby wytworzyć urządzenia jednorazowego użytku, płytka krzemowa zawierająca struktury SU-8 o rozmiarach submikrometrowych posłużyła jako forma replikacyjna do szybkiego odlewania polidimetylosiloksanu. Chipy zostały pocięte, złożone, połączone i umieszczone w wysokiej rozdzielczości, w pełni zautomatyzowanym mikroskopie przystosowanym do obrazowania poklatkowego, które jest potężnym narzędziem do czasoprzestrzennej analizy komórek. W tym przypadku organizm platformy biotechnologicznej Corynebacterium glutamicum został zasiew do PLBR, a wzrost komórek i fluorescencja wewnątrzkomórkowa były śledzone przez kilka godzin, odkrywając zależną od czasu heterogeniczność populacji na poziomie pojedynczej komórki, co nie jest możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod analizy, takich jak cytometria przepływowa. Oprócz wglądu w produkcję urządzeń, zademonstrowano przygotowanie hodowli wstępnej, ładowanie, wychwytywanie bakterii oraz hodowlę pojedynczych komórek i kolonii metodą PLBR. Urządzenia te dodadzą nowy wymiar w badaniach mikrobiologicznych do analizy zależnych od czasu zjawisk pojedynczych bakterii pod ścisłą kontrolą środowiska. Ze względu na prosty i stosunkowo krótki proces produkcji, technologia może być łatwo zaadaptowana w każdym laboratorium mikrofluidycznym i po prostu dostosowana do konkretnych potrzeb.

Introduction

Mikroskopia poklatkowa to potężne narzędzie do badania żywych komórek in vivo¹. Tymczasem dostępne na rynku, w pełni zautomatyzowane platformy mikroskopowe, w tym termicznie indukowana kompensacja dryfu ogniska, są powszechnie stosowane w badaniach biologicznych do badania zjawisk zależnych od czasu, począwszy od badań nad rakiem i komórkami neuronalnymi, poprzez inżynierię tkankową, aż po badania dynamiczne z pojedynczymi komórkami drożdży lub bakterii^2-6.

Zazwyczaj stosuje się przezroczyste płytki dołkowe, podkładki agarowe lub po prostu szkiełka mikroskopowe, aby zapewnić środowisko hodowli komórkowej podczas obrazowania poklatkowego⁷. Mimo że te proste systemy nadają się do niektórych badań, mają bardzo ograniczoną kontrolę nad warunkami środowiskowymi i nie pozwalają na bardziej złożone perturbacje lub dobrze zdefiniowane i szybkie zmiany ośrodka. Jednorazowe chipy mikroprzepływowe produkowane w masowej produkcji zostały niedawno wprowadzone na rynek, ale są one w większości dostosowane do większych typów komórek eukariotycznych⁴. Chociaż wzrost można śledzić, dobrze zdefiniowane badania wzrostu dotyczące np. precyzyjnego wychwytywania komórek, wielkości kolonii, kierunku wzrostu i zdolności do usuwania komórek są ograniczone. Siedliska mikroprzepływowe i reaktory, w których komórki bakteryjne są hodowane w środowiskach 3D, zostały opracowane^8-10, mają wady, gdy mamy do czynienia z badaniami ilościowymi na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż można analizować ogólną heterogeniczność populacji, wielu parametrów komórek nie można dokładnie określić w rozdzielczości pojedynczej komórki, ponieważ wzrost nie jest ograniczony do monowarstw.

To ograniczenie spowodowało rozwój mikrosystemów umożliwiających hodowlę komórek w dobrze zdefiniowanych kanałach i siedliskach, z komórkami rosnącymi w płaskich monowarstwach z rozdzielczością pojedynczej komórki i szczególnie ścisłą kontrolą nad dostarczaniem pożywki i warunkami środowiskowymi^6,11,12. Pokazano kilka przykładów systemów mikroprzepływowych do hodowli komórek bakteryjnych^12-14. Bakterie zazwyczaj wykazują bardzo szybkie tempo wzrostu i wymagają struktur mikroprzepływowych w zakresie kilku mikrometrów i poniżej, zwłaszcza gdy do mikroskopii pożądane są monowarstwy komórek. Keymer i wsp. wykazano wzrost i rozprzestrzenianie się szczepów E. coli w mikrofabrykowanych krajobrazach^15,16. Ponieważ interesowała ich dynamika populacji, nie prowadzili badań z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Opracowaliśmy bioreaktor pikolitrowy (PLBR)¹³, który jest obecnie stosowany do badania różnych wskaźników wydajności biotechnologicznej, takich jak wzrost¹⁷ i analiza produktywności sprzężonej z fluorescencją na poziomie pojedynczej komórki^18,19. Obecne urządzenie mikroprzepływowe umożliwia sterowanie reaktorem środowiskowym przy określonej objętości hodowli wynoszącej około jednego pikolitra i ciągłą obserwację pojedynczych komórek jednocześnie. W porównaniu z otwartymi jednowarstwowymi systemami skrzynkowymi^11,14, w których jedna lub dwie strony są otwarte na kanał doprowadzający pożywkę, PLBR pozwala na kontrolowane odłowy i hodowlę. Konstrukcja pozwala na długotrwałą hodowlę bakterii bez ryzyka, że kilka sąsiadujących ze sobą kolonii utworzy jedną dużą populację. Ponadto system obejmuje obszary hodowli o wysokości 1 μm (w kolejności średnicy komórki), aby ograniczyć wzrost bakterii do monowarstw komórkowych. Natomiast kanały zasilające są 10 razy głębsze, aby zminimalizować opór hydrauliczny.

W porównaniu do zminiaturyzowanych systemów uprawy wsadowej²⁰, obecny system pozwala na uprawę o stałych parametrach środowiskowych dzięki ciągłemu przepływowi pożywki. Co więcej, parametry środowiskowe, takie jak skład medium, temperatura, natężenie przepływu i wymiana gazowa, można łatwo kontrolować i zmieniać w ciągu kilku sekund. Pozwala to na szczegółowe badania odpowiedzi komórek na zmiany środowiskowe, dotyczące np. dostępności składników odżywczych czy bodźców stresowych. Zapotrzebowanie na zmniejszone objętości pożywek, a mianowicie w zakresie zaledwie kilku mikrolitrów, umożliwia naukowcom przeprowadzanie nowatorskich badań, np. zaburzeń komórek podczas obrazowania poklatkowego z supernatantem w eksperymentach na dużą skalę odkrywających odpowiedź komórki w tych specyficznych warunkach środowiskowych¹⁷. Bioreaktor pikoliterowy zapewnia naukowcom solidny system, który ściśle kontroluje warunki biofizyczne i jest obsługiwany przy użyciu precyzyjnych pomp strzykawkowych oraz zautomatyzowanej mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiamy kompletny protokół, w tym projekt urządzenia, produkcję i przykładowe zastosowania.

Protocol

1. Produkcja wafli

1. Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe zawierające wloty, wyloty, kanały główne i PLBR (rysunek 1A) za pomocą oprogramowania CAD.
2. Konstrukcja przedstawiona w tym protokole (rysunek 2) składa się z dwóch wlotów wysiewu, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu i sześciu układów PLBR. Każda tablica zawiera 5 PLBR, co daje 30 równoległych PLBR wewnątrz jednego urządzenia mikroprzepływowego.
3. Utwórz fotomaskę litograficzną zawierającą żądane układy chipów (rysunek 1B). Fotomaska została wyprodukowana we własnym zakresie metodą zapisu wiązką elektronów z rozdzielczością submikronową. Zastosowana maska składała się z warstwy chromu na szklanej płycie 5 w².
   Uwaga: wszystkie poniższe kroki należy wykonać w warunkach pomieszczenia czystego klasy 100 lub wyższej (schemat blokowy procesu pokazano na rysunkach 3A i 3B).
4. Wyczyść 4-calową płytkę krzemową piranią (stosunek 10:1 kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru) i kwasem fluorowodorowym przez kilka minut (Uwaga: niebezpieczne chemikalia). Płukać wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.
5. Odwadniać wafel przez 20 minut w temperaturze 200 °C.
6. Przędzić 1 μm SU-8 2000.5 fotorezystu na płytce (1 warstwa) (4 ml rezystu, wirować 10 sekund z, v = 500 obr./min i a = 100 obr./min, wirować 30 sek. przy v = 1 000 obr./min i a = 300 obr./min).
7. Umieść powlekaną płytkę na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (1,5 minuty w 65 °C, 1,5 minuty w 95 °C i 1 minutę w 65 °C; najlepiej użyć dwóch płyt grzewczych).
8. Włóż 1^warstwę fotomaski (tutaj obszary pułapki reaktorów pikolitrowych) i wafel do wyrównywacza maski i wystawiaj płytkę na działanie 350-400 nm (kontakt z podciśnieniem, 64 mJ/cm², t = 3 sekundy, I = 7 mW/cm²).
9. Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zainicjować polimeryzację SU-8 (1 min w 65 °C, 1 min w 95 °C i 1 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.
10. Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 1 minutę i przenieść go na kilka sekund do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8.
11. Opłucz wafel w izopropanolu, aby usunąć wywoływacz SU-8 i wysusz wafel za pomocą przepływu azotu z przędzarki waflowej.
12. Wafelek pieczemy na twardo przez 10 minut w temperaturze 150°C.
Na płytkę nanieść powłokę
13. fotorezystową 9 μm SU-8 2010 (2 warstwa) (dozować 4 ml rezystu, wirować 10 sekund z v = 500 obr./min, a = 100 obr./min i wirować 30 s z v = 4 000 obr./min, a = 300 obr./min).
14. Umieścić wafel z SU-8 na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (15 minut w 65 °C, 45-60 minut w 95 °C i 10 minut w 65 °C). Uwaga: należy zwrócić uwagę na zmarszczki i pęcherzyki. Jeśli płytka zostanie podgrzana do temperatury 95 °C, odparowany rozpuszczalnik może być zamknięty w maleńkich pęcherzykach gazu.
15. Włóż fotomaskę o pożądanym układzie (tutaj główne kanały do dostarczania składników odżywczych) i wafel do nakładki maski i naświetl na 350-400 nm (twardy kontakt, 64 mJ/cm², t = 10 sek, I = 7 mW/cm²)
16. Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zakończyć polimeryzację SU-8 (5 min w 65 °C, 3:30 min w 95 °C, 3 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.
17. Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 45 sekund, przenieść płytkę do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8 i wywoływać przez 60 sekund.
18. Przepłukać wafel przez 20 sekund izopropanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości wywoływacza SU-8 i wysuszyć wafel za pomocą sprężonego azotu.
19. Na koniec upiecz wafelek na twardo w temperaturze 150 °C. W rezultacie uzyskuje się końcową płytkę (rysunek 1C), która zostanie wykorzystana jako forma wzorcowa do formowania PDMS.
20. Wykonaj pomiary profilometryczne (Rysunek 3C), aby zweryfikować wysokość konstrukcji SU-8. Uwaga: niedokładności w wysokości struktury mogą skutkować nieefektywnym uwięzieniem komórek lub utratą komórek podczas hodowli.

2. Produkcja chipów z polidimetylosiloksanu

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki powinny być idealnie wykonane w warunkach przepływu laminarnego, aby zapobiec zakłóceniu procedury produkcji przez cząsteczki pyłu (schemat blokowy procesu jest pokazany na rysunku 4).

1. Przygotować mieszaninę bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacza w stosunku 10:1. Dokładnie wymieszaj, aż uzyskasz jednorodny roztwór, który wygląda na nieprzezroczysty. Przygotuj tyle, ile jest to wymagane dla żądanej wysokości warstwy (tutaj 3 mm).
2. Odgazowywać mieszaninę PDMS przez około 30 minut w lekkim podciśnieniu, aż wszystkie pęcherzyki znikną.
3. Przygotować urządzenie formujące (lub szalkę Petriego) z odpowiednią płytką SU-8 i wlać do niej mieszaninę PDMS (rysunek 1D).
4. Piecz PDMS przez 3 godziny w temperaturze 80 °C w piekarniku.
5. Ostrożnie oderwij płytę PDMS od wafla. Pokrój płytę na pojedyncze wióry za pomocą czystego i ostrego skalpela.
6. Umyj frytki w kąpieli n-pentanowej przez 90 minut, a następnie w dwóch kąpielach acetonowych (90 minut każda). Wysuszyć wióry przez noc, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika. Uwaga: mycie PDMS należy wykonać pod wyciągiem. Uwaga: podczas mycia n-pentanem monomery i dimery są usuwane z utwardzonego PDMS, a rozmiar wióra może tymczasowo podwoić się podczas procedury prania.
7. Przechowuj mikroprzepływowe chipy PDMS w zamkniętych pojemnikach do czasu końcowego eksperymentu.
8. Tuż przed eksperymentem należy przebić otwory wlotowe i wylotowe w chipie PDMS za pomocą igły (lub dziurkacza) o nieco mniejszej średnicy niż złącza, które są używane do łączenia rurek z chipem PDMS.
9. Ostrożnie wyczyść mikroprzepływowy chip PDMS izopropanolem i użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, które mogą przykleić się do strukturalnej strony PDMS. Użyj taśmy klejącej kilka razy, aż na chipie nie będzie widać żadnych cząstek.
10. Szkiełko podstawowe o grubości 170 μm należy czyścić kolejno acetonem i izopropanolem. Na koniec oczyść wodą dejonizowaną i osusz azotem pod ciśnieniem.
11. Przed aktywacją plazmową należy rozgrzać myjkę plazmową i uruchomić plazmę na około 300 sek. Szkiełko proszkowane plazmowo i chip PDMS (moc 50 W, czas = 25 sekund, natężenie przepływu tlenu = 20 sccm).
12. Wyrównaj PDMS i szklany chip przed klejeniem. Na koniec ostrożnie umieść chip PDMS na szklanym szkiełku (Rysunek 1E). PDMS i szkło połączą się w ciągu kilku sekund. Uwaga: nie należy wciskać pęsetą na górną część chipa PDMS podczas procesu łączenia. Może to prowadzić do tzw. zawalania się dachów kanałów i małych konstrukcji.
13. W celu wzmocnienia wiązania, piecz ostatni wiór szklany PDMS przez 10 sekund w temperaturze 80 °C.

3. Przygotowanie kultury bakteryjnej

Uwaga: Wszystkie uprawy powinny być przygotowywane w sterylnym, filtrowanym podłożu, aby zapobiec gromadzeniu się niepożądanych cząstek, które mogą przeszkadzać podczas uprawy.

1. Użyj płytki agarowej zawierającej pożądane organizmy (tutaj C. glutamicum ATCC 13032) i zaszczepij jedną kolonię w 20 ml świeżej pożywki BHI, inkubuj przez noc (≈ 8-14 godzin) w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).
2. Przenieść 10 μl kultury wstępnej do żądanego podłoża (tutaj CGXII²¹), które będzie używane podczas hodowli mikroprzepływowej i pozostawić komórkę na noc do wzrostu w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).
3. Przenieś żądaną ilość zawiesiny komórkowej (od 10 do 500 μl, w zależności od rozpoczęcia eksperymentu) do żądanej pożywki (tutaj CGXII²¹), która będzie używana podczas mikroprzepływowej hodowli komórek. Uwaga: najlepiej jest użyć komórek z wczesnej fazy logarytmicznej do wysiewu. Dla hodowli C. glutamicum najlepsza gęstość optyczna (OD₆₀₀) do wysiewu wynosiła 0,5-2.
4. Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 2 ml. Uwaga: należy to zrobić zaraz po zmontowaniu mikroprzepływowego chipa PDMS, aby zminimalizować czas transferu między kolbą wstrząsową a uprawą mikroprzepływową. Zazwyczaj czas transferu wynosi około 15 minut i powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wpływowi na metabolizm spowodowanemu ograniczeniem tlenu i zmianami temperatury.

4. Konfiguracja eksperymentalna

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane za pomocą odwróconego mikroskopu.

1. Uruchom inkubator mikroskopowy na 2 godziny przed eksperymentem, aby rozgrzać system. Uwaga: mikroskopia powinna być wyposażona w pełnowymiarowy inkubator do kontrolowania temperatury i, w razie potrzeby, przepływu gazu. Dodatkowa kontrola wilgotności nie jest konieczna, ponieważ system chipowy jest stale zasilany mediami.
2. Otwórz system inkubatora, wybierz żądany cel i w razie potrzeby dodaj olejek immersyjny na obiektyw.
3. Zamontuj chip wewnątrz uchwytu na wióry. W razie potrzeby przymocuj szklaną płytę taśmą klejącą, aby uniknąć ruchu wiórów podczas pracy stage.
4. Wyśrodkuj próbkę na mikroskopie i skup się na matrycach PLBR.
5. Podłącz wloty i wyloty za pomocą odpowiednich przewodów (Rysunek 1F). Podłącz rurkę do zbiornika na odpady. Reprezentatywny chip można zobaczyć na rysunku 4D.
6. Włóż strzykawki do pomp i rozpocznij przepływ mediów. Użyć pożywki, buforu lub w razie potrzeby roztworu powlekającego i płukać kanały mikroprzepływowe przez około 1 godzinę. Uwaga: roztwór powlekający służy do powlekania ścianek kanałów, aby zapobiec niespecyficznemu przyleganiu komórek.
7. W przypadku E. coli do pokrycia ścian kanału stosuje się 0,1% roztwór BSA. W przypadku C. glutamicum nie jest konieczne powlekanie. Po zakończeniu powlekania należy przepłukać wiór podłożem przed wysiewem komórek.
8. Przed wysiewem i uprawą komórek sprawdź, czy nie ma wycieków i czy temperatura jest stała.

5. Wprowadzanie komórek bakteryjnych do urządzenia mikroprzepływowego

1. Upewnij się, że żądane roztwory bakterii są dostępne w odpowiednich strzykawkach podłączonych do rurki.
2. Odłącz bufor lub roztwór powlekający i podłącz zawiesinę ogniw do chipa. Aby zminimalizować objętość śmierci, niepożądane pęcherzyki powietrza i skrócić czas eksperymentu, należy wymienić całą igłę, a także rurkę, a nie tylko strzykawki.
3. Wlej zawiesinę komórkową do kanałów z objętościowym natężeniem przepływu 200 nl/min, aż większość PLBR zostanie wypełniona żądaną ilością komórek (Figura 5A). Uwaga: optymalne wyniki siewu zależą od szczepu bakterii, OD₆₀₀ i pożywki wstępnej hodowli. Parametry te muszą być dostosowane w celu zwiększenia skuteczności wychwytywania i czasu, aż wystarczająca liczba ogniw zostanie uwięziona w strukturach reaktora. W przypadku C. glutamamicum zazwyczaj stosuje się zawiesinę komórkową OD₆₀₀ 0,5-2; dla E. coli OD₆₀₀ wynosił od 0,5-1.
4. Jeśli napełniana jest tylko niewielka liczba PLBR, należy zwiększyć natężenie przepływu do 800-1 200 nl/min.
5. Odłącz zawiesinę ogniw i podłącz pożywkę wzrostową do chipa (Rysunek 5B). Upewnij się, że podczas wymiany pożywki nie zostaną wprowadzone żadne pęcherzyki powietrza. Perfuzja ze świeżą pożywką wzrostową przy 100 nl/min.

6. Obrazowanie poklatkowe

1. Wybierz określone PLBR do obrazowania poklatkowego. Zazwyczaj wybiera się PLBR, które zawierają pojedynczą komórkę macierzystą na początku eksperymentu. Liczba obszarów zainteresowania, które można zbadać w jednym eksperymencie, zależy od pożądanej liczby klatek na sekundę i konfiguracji mikroskopowej.
2. Wybierz odpowiednią liczbę klatek na sekundę w zależności od liczby PLBR. Upewnij się, że mikroskop poradzi sobie z żądaną liczbą zwrotów z inwestycji w interwale poklatkowym.
3. Wybierz odpowiednie zestawy filtrów (tutaj YFP). Automatycznie zamykaj migawkę podczas ruchu sceny i po każdym pomiarze poklatkowym, aby zapobiec wybielaniu chromoforu.
4. Skonfiguruj sekwencję mikroskopii poklatkowej i rozpocznij eksperyment.
5. Po przerośnięciu wszystkich PLBR eksperyment można zatrzymać, mikroprzepływowy chip PDMS można wyrzucić, a eksperyment można ocenić.

7. Analiza

Uwaga: Następujące kroki lub części procedury mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą programów do analizy obrazu, takich jak ImageJ, itp.

1. Określ interesujące PLBR, w których hodowla spełnia wszystkie pożądane kryteria, np. liczbę komórek macierzystych, położenie komórek macierzystych itp.
2. Aby określić tempo wzrostu jednej mikrokolonii, policz liczbę komórek w każdym przedziale czasowym.
3. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, wykreślając czas w funkcji ln (liczba komórek). Nachylenie wykresu reprezentuje tempo wzrostu w [1/h] (patrz Rysunek 6).
4. Analiza danych fluorescencyjnych jest silnie uzależniona od przeprowadzonego eksperymentu. W niniejszym raporcie wybrano przykład, aby zilustrować niejednorodność między koloniami i między komórkami między różnymi mikrokoloniami izogenicznymi (patrz rysunek 7).

Results

Produkcja urządzeń

Mikroprzepływowy system PLBR składa się z jednej warstwy PDMS połączonej na cienkim szklanym chipie nadającym się do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Produkcja składa się z dwóch głównych etapów: po pierwsze, produkcji wzorca replikacji (rysunki 1A, 1B i 1C), a po drugie, produkcji chipa (rysunki 1D, 1E i 1F). Zgodnie z protokołem do stworzenia formy wzorcowej stosuje się standardowe techniki mikrowytwarzania fotolitograficznego. Laboratoria bez pomieszczenia czystego mogą nabyć dostępne na rynku niestandardowe formy wzorcowe SU-8. Za pomocą powtarzalnego formowania PDMS (rysunki 1A, 1B i 1C) można wyprodukować setki jednorazowych chipów. Formowanie PDMS i montaż chipów można wykonać w dowolnym laboratorium i nie wymagają pomieszczeń czystych, jednak miejsca pracy z laminarnym przepływem powietrza są korzystne.

Proces zaczyna się od zaprojektowania mikroprzepływowego systemu chipowego. Zazwyczaj do projektowania układu mikroprzepływowego używa się oprogramowania CAD (rysunek 1A). Po CAD maska jest generowana przez moduł zapisujący wiązkę elektroniczną (rysunek 1B) z rozdzielczością submikronową. W niniejszym badaniu stworzono maskę chromową o grubości 5 cali, która została wykorzystana do litografii wafli SU-8. Końcowa płytka krzemowa — SU — 8 jest używana do formowania PDMS (rysunek 1D). Po etapie wypalania płyta PDMS jest cięta na wióry, które są nieodwracalnie przyklejane do szkiełek podstawowych (rysunek 1E). Na koniec rurka jest podłączona (Rysunek 1F).

Rysunek 2 pokazuje szczegółowo projekt systemu mikroprzepływowego. Składa się z dwóch wlotów wysiewających, generatora gradientu do mieszania różnych substratów lub pożywek oraz jednego wylotu. Kanały główne mają wymiary 50 μm x 10 μm (szer. x wys.). Każde urządzenie składa się z sześciu tablic PLBR, z których każda zawiera 5 PLBR. W ten sposób powstaje 30 równoległych reaktorów w jednym urządzeniu mikroprzepływowym.

Rysunek 3 ilustruje produkcję wzorca replikacji. Jak szczegółowo opisano w protokole, pierwsza warstwa SU-8 jest wytwarzana za pomocą litografii SU-8 (rysunek 3A). Podobną procedurę stosuje się w przypadku drugiej warstwy (rysunek 3B). Aby sprawdzić geometrię kanału, zbadaliśmy wysokość kanałów PLBR i głównych kanałów za pomocą profilometru. W przykładzie pokazanym na rysunku 3C zmierzono pierwszą warstwę (warstwę uprawy). W tym przypadku warstwa wykazuje stałą wysokość 1 200 nm, odpowiednią do uprawy C. glutamicum w pożywce BHI.

Rysunek 4 ilustruje procedurę formowania PDMS, zaczynając od mieszania PDMS (Rysunek 4A), następnie procesu formowania (Rysunek 4B) i na końcu etapu klejenia (Rysunek 4C). Rysunek 4D przedstawia końcowy chip mikroprzepływowy zawierający szklaną płytkę o grubości 170 μm, chip PDMS (o wysokości 3 mm) z wlotami i wylotami oraz stalowymi igłami podłączonymi do rurek. Po eksperymencie chip można wyrzucić i nie jest konieczne dokładne czyszczenie. Ponadto jest łatwy w montażu i obsłudze. Nie jest konieczna żadna skomplikowana i trudna procedura napełniania.

Zasada urządzenia

Rysunek 5 pokazuje zasadę działania systemu reaktora. Komórki są wprowadzane do urządzenia mikroprzepływowego, a poszczególne komórki pozostają uwięzione w PLBR po prostu przez interakcje między ścianą komórkową. Ze względu na różnicę w oporach hydrodynamicznych kanału i PLBR, wewnątrz PLBR występuje tylko minimalny przepływ. Po wysiewie PLBR (ryc. 5A) rozpoczyna się faza wzrostu i obserwacji od zmiany roztworu bakteryjnego na podłoże wzrostowe (ryc. 5B). Po przerośnięciu PLBR (ryc. 5C) eksperyment jest zwykle zatrzymywany i można analizować obrazy poklatkowe. W celu zapoznania się z mechanizmami wychwytywania i profilem przepływu w PLBR odsyłamy do Grünberger et al.¹³, aby uzyskać więcej informacji.

Analiza tempa wzrostu

Obecny system może być stosowany do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia czy sygnał fluorescencyjny. W pierwszym przykładzie C. glutamicum, organizm produkcyjny o znaczeniu przemysłowym, został wyhodowany w standardowych warunkach uprawy (T=30 °C, podłoże CGXII²¹). Rysunek 6A przedstawia krzywe wzrostu wyprowadzone z trzech mikrokolonii izogenicznych. Wzrost wykładniczy jest utrzymywany do momentu wypełnienia PLBR, co wskazuje, że nie występuje ograniczenie składników odżywczych. Rysunek 6B przedstawia cztery obrazy z mikroskopii poklatkowej DIC rosnącej kolonii C. glutamicum.

Analiza fluorescencji

Dla mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek, badacze często wykorzystują specyficzne białka fluorescencyjne, na przykład GFP lub pochodne, aby połączyć konkretny fenotyp zainteresowania z mierzalnym wyjściem (sygnałem fluorescencyjnym). Aby wykazać przydatność PBLR do badań poklatkowych opartych na fluorescencji, zbadaliśmy emisję fluorescencyjną szczepu C. glutamicum wytwarzającego kodowane plazmidem białko fuzyjne YFP-TetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. Wiadomo, że w obecności niskich stężeń induktora (IPTG) ekspresja Ptac prowadzi do znacznej zmienności między komórkami w populacjach bakterii izogenicznych. Zaczynając od jednej kultury wstępnej, obserwowano wzrost i fluorescencję pojedynczych komórek dla kilku mikrokolonii izogenicznych. Jak widać na rycinie 7, zaobserwowaliśmy niejednorodność fenotypową między różnymi mikrokoloniami i niejednorodność na poziomie pojedynczej komórki w koloniach, zaczynając od jednej komórki macierzystej. Jedna kolonia (Figura 7B, PLBR 1) wykazywała prawie zerową emisję fluorescencji, podczas gdy komórki PLBR 2 wykazywały niską emisję fluorescencji z powodu podstawowej ekspresji yfp-tetR z promotora Ptac. W PLBR 3 emisja fluorescencji była znacznie silniejsza w porównaniu z innymi koloniami i zaobserwowano szerokie rozmieszczenie populacji. Ten przykład pokazuje możliwość zastosowania PBLR do badań poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, w której fluorescencję pojedynczych komórek można określić w jednym punkcie czasowym, obecne systemy umożliwiają śledzenie komórek i badanie fluorescencji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym przez wiele pokoleń.

Rysunek 1.Przegląd procesu produkcji chipów PLBR. Opanuj produkcję form: zaczynając od (A) projektowania, (B) wytwarzania masek litograficznych i (C) produkcji wafli. Produkcja chipów szklanych PDMS: począwszy od (D) formowania PDMS, a następnie (E) klejenie szkła i PDMS oraz (F) końcowy montaż chipów.

Rysunek 2. Konstrukcja układu PLBR. (A) Rysunek CAD całego chipa mikroprzepływowego; (B) Powiększenie wybranych pozycji układu: Układ zawiera dwa wloty medium (a1), generator gradientu z kanałami mieszającymi (a2) oraz 6 równoległych tablic PLBR (b1). b2 pokazuje jeden PLBR, który jest osadzony w kanale płynu o szerokości 100 μm. PLBR ma średnicę wewnętrzną 40 μm i kanały odżywcze o szerokości 2 μm. Wlot wysiewu ma długość 40 μm. Kolor różowy reprezentuje pierwszą warstwę (region odłowu i uprawy), a kolor niebieski reprezentuje drugą warstwę (transport płynów).

Rysunek 3.Ilustracja procesu wytwarzania dwuwarstwowych płytek. (A) Wytwarzanie pierwszej warstwy zawierającej struktury pułapkowe; (B) Wytwarzanie drugiej warstwy zawierającej kanały, wloty i wyloty płynu; (C) Reprezentatywne profile powierzchni pierwszej warstwy. W tym przypadku wysokość pierwszej warstwy wynosiła 1 200 mil morskich i jest wykorzystywana do uprawy C. glutamicum w złożonym podłożu.

Rysunek 4.Produkcja urządzenia i reprezentatywny chip. Ilustracja procesu formowania PDMS: (A) mieszanie i odgazowywanie PDMS; (B) formowanie PDMS; (C) uwalnianie formy, cięcie i klejenie wiórów. Końcowy chip (reprodukowany za zgodą Royal Society of Chemistry¹³): (D) zdjęcie chipa PDMS z 2 wlotami i 1 wylotem; (E) Obraz CAD sześciu równoległych tablic zawierających 5 PLBR każdy; (F) Obraz SEM jednego PLBR.

Rysunek 5. Zasada działania systemu PLBR. A) Faza wysiewu; (B) Faza wzrostu mikrokolonii bakteryjnych; (C) Faza przelewu. Przedruk za zgodą Królewskiego Towarzystwa Chemicznego13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Rysunek 6.Oznaczanie tempa wzrostu mikrokolonii C. glutamicum WT. (A) Wykres wzrostu trzech upraw PLBR i wynikające z nich krzywe wykładnicze (Części odtworzone za zgodą Królewskiego Towarzystwa Chemicznego)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Zdjęcia poklatkowe rosnącej kolonii C. glutamicum.

Rysunek 7. Analiza heterogeniczności populacji oparta na PBLR. Pokazano C. glutamicum wykazujący ekspresję fuzji yfp-tetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) pod nieobecność induktora IPTG. (A) Eksperymentalny przepływ pracy; (B) Trzy mikrokolonie izogeniczne wykazujące niejednorodność między koloniami i między komórkami; (C) Rozkład fluorescencji pojedynczych komórek w odpowiednich mikrokoloniach.

Rysunek 8. Skaningowe obrazy elektronowe różnych PLBR. Obrazy SEM przedstawiające wloty wysiewu w celu optymalizacji wydajności wysiewu. (A) Wloty wysiewu lagerów (B) Mniejsze wloty wysiewu (C) Większe "otwarte" wloty wysiewu (D) Dwa wloty wysiewu.

krok	problem	Możliwa przyczyna	rozwiązanie
Produkcja wafli	Uwięzione pęcherzyki powietrza w SU-8 podczas miękkiego pieczenia	Szybki wzrost temperatury	Piec kilkakrotnie w temperaturze 95 °C i 65 °C
Produkcja wafli	Znikające i zniszczone struktury SU-8	Nieoptymalna procedura wytwarzania; naprężenia mechaniczne w konstrukcjach SU-8	Zoptymalizuj parametry, takie jak czas pieczenia, czas ekspozycji
Produkcja wafli	Warstwy SU-8 do niskiej, wysokiej lub nierównej grubości warstwy	Problem podczas powlekania wirowego	Sprawdź parametry wirownicy i uchwytu waflowego
Klejenie i montaż chipów	Zwijanie PLBR	Parametry klejenia PDMS nie są optymalne	Dostosuj moc, czas naświetlania plazmy. i czas pieczenia po klejeniu
Klejenie i montaż chipów	Brudne struktury i cząstki w PLBR	Chip nie został odpowiednio oczyszczony	Zastosuj taśmę klejącą do czyszczenia powierzchni
Klejenie i montaż chipów	Niewystarczające połączenie PDMS ze szkłem	Nieoptymalne parametry klejenia lub niewystarczające czyszczenie	Sprawdź ustawienia plazmy tlenowej
Eksperyment mikroprzepływowy	Wyciek płynu	Otwór wlotowy/wylotowy nie został prawidłowo wybity	Zoptymalizuj proces dziurkowania
Eksperyment mikroprzepływowy	Wiele małych cząstek PDMS podczas napełniania	Otwór nie został prawidłowo wybity	Zoptymalizuj proces dziurkowania
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt biologiczny	Brak wzrostu komórek	Pozostałość rozpuszczalnika po procesie czyszczenia	Dokładniej przepłukać wióry przed załadowaniem ogniwa lub pozwolić rozpuszczalnikowi odparować przed wiązaniem
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt biologiczny	Zmieniające się tempo wzrostu	Różne powody	Sprawdź prekulturę i temperaturę
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt biologiczny	Morfologia komórek zmienia się podczas hodowli	Ograniczenia składników odżywczych lub zmiana temperatury	Sprawdź inkubator i przepływ
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt techniczny	Dryf w pozycji podczas mikroskopii poklatkowej	Wahania temperatury	Sprawdź profil temperatury przed eksperymentami, aż do momentu, gdy nie ma oscylacji
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt techniczny	Utrata komórek podczas hodowli	Nieznacznie za duża wysokość reaktora	Zoptymalizuj wysokość reaktora
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt techniczny	Brak pułapek	Zbyt niska wysokość reaktora	Zoptymalizuj wysokość reaktora

Tabela 1. Rozwiązywanie problemów. Poniższa tabela podsumowuje krytyczne aspekty, typowe błędy i możliwe rozwiązania podczas prac eksperymentalnych.

Discussion

Opisaliśmy wytwarzanie, konfigurację eksperymentalną i powiązane procedury operacyjne mikroprzepływowego urządzenia PDMS zawierającego kilka (PLBR) do analizy pojedynczych komórek bakterii.

Mikrofabrykacja z wykorzystaniem technik miękkiej litografii pozwala na szybkie dostosowanie wymiarów urządzenia do różnych rozmiarów i morfologii bakterii. Obecnie optymalizujemy bioreaktor pikolitrowy pod kątem hodowli różnych organizmów mikrobiologicznych i przepustowości uprawy. W celu zwiększenia wydajności odłowu, optymalizowana jest również geometria reaktora. Rysunek 8 przedstawia cztery nowe urządzenia PLBR, które są obecnie walidowane. Na wszystkich rysunkach kanał wysiewający został przeprojektowany pod względem szerokości i kształtu. W praktyce wydaje się, że ma to wpływ na liczbę uwięzionych komórek, ale wymaga dalszych badań. Znaczną poprawę w zakresie skuteczności odłowu osiągnięto również dzięki zastosowaniu dodatkowych kanałów przelewowych, co doprowadziło do zwiększenia przepływu konwekcyjnego przez reaktor i uwięzienia większej liczby komórek. Jednak jednocześnie zwiększa się ryzyko wypłukania komórek podczas hodowli.

Urządzenie stanowi ciekawą alternatywę dla upraw w makroskali, które są wykorzystywane od dziesięcioleci do badania procesów wzrostu i produkcji na poziomie pojedynczych komórek. Ma jednak kilka ważnych wymagań: do równoległego monitorowania kilku bioreaktorów pikolitrowych obowiązkowa jest w pełni zmotoryzowana konfiguracja mikroskopowa o wysokiej rozdzielczości z kompensacją dryfu ostrości. Ponadto potrzebny jest system inkubacji, aby utrzymać pożądaną temperaturę uprawy na stałym poziomie przez cały czas trwania pomiarów.

Osiągamy 95% wskaźnik sukcesu w produkcji urządzeń. Główne problemy są związane z nieefektywnym klejeniem PDMS ze szkłem, zawaleniem się dachu PDMS lub wyciekiem płynu (patrz Tabela 1 , aby zapoznać się z rozwiązywaniem najczęściej występujących problemów). Chociaż prace eksperymentalne są wykonywane częściowo w warunkach niesterylnych, rzadko obserwujemy zanieczyszczenie podczas eksperymentów, ze względu na zamknięty układ płynowy. Urządzenia mikroprzepływowe PDMS są optycznie przezroczyste, dlatego mogą być używane do obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości. Chociaż PDMS wydaje się być idealny do tego zastosowania, ma wysokie powinowactwo do cząsteczek hydrofobowych, co sprawia, że stosowanie rozpuszczalników, które są szeroko stosowane w procesach biokatalitycznych całych komórek, jest ograniczone. Dostępne są jednak odpowiednie powłoki, które pozwalają dostosować protokół do tego rodzaju zastosowań.

Proponowany PLBR doskonale nadaje się do czasoprzestrzennej analizy zdarzeń komórkowych, a nawet subkomórkowych różnych rodzajów bakterii. Główną zaletą obecnego podejścia jest możliwość bezpośredniego ilościowego określenia wzrostu mikrokolonii w przeciwieństwie do metod konwencjonalnych. Ponadto PLBR pozwala na hodowlę w określonych i stałych warunkach. Ponieważ system ułatwia użycie niewielkich ilości odczynników lub materiałów, ma tę zaletę, że jest niedrogi, konfigurowalny i podatny na wysoką przepustowość. W tradycyjnych metodach przy analizie hodowli drobnoustrojów uwzględnia się średnie wartości dla całej populacji. Ponadto istniejące metody wymagają ręcznego pobierania próbek, co może prowadzić do degradacji próbek, a tym samym do błędów w pomiarze. PLBR oferuje nowe perspektywy rozwoju bioprocesów i analizy heterogeniczności populacji w mikrobiologii. PLBR jest obiecującym narzędziem do różnych zastosowań w rozwoju bioprocesów i może być stosowany w różnych dziedzinach badań, np. w analizie heterogeniczności między komórkami, analizie określonych klastrów komórkowych w obrębie linii komórkowych, badaniach przesiewowych szczepów produkcyjnych drobnoustrojów i badaniu fenotypów komórek w czasie rzeczywistym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka krzemowa o średnicy 100 mm, P/BOR < 100>	Si-MAT, Materiały silikonowe, Niemcy
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Projektant SU-8 Pan DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS) Sylgard 184 Zestaw	elastomerów silikonowychDow Corning; Farnell GmbH, Niemcy
Igły dozujące Precyzyjne końcówki  27 g; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Niemcy
Płytki szklane D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Niemcy
Dziurkacz AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Niemcy
Strzykawki jednorazowe – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Niemcy	552-183143
Strzykawki, 1 ml sterylne szklane strzykawki	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Niemcy
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Mocznik	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Biotyna	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Kwas prokatechowy	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Jednowodny glukozy	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
BHI	Becton, Dickinson
Komórki
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Mask Aligner MA-6	Suess
Płyta grzejna HP30A - 2	Torrey Pines
Memmert UN 200	Memmert
FEMTO	Diener Electronics, Niemcy
Pompy strzykawkowe neMESYS	Cetoni GmbH, Niemcy
Mieszadło magnetyczne CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Mikroskop Nikon Eclipse Ti	Mikroskopia Nikon
Inkubator mikroskopowy	Pecon GmbH, Niemcy
Wirówka minispin plus " linia"	Eppendorf	9776501
Fotometr BioPhotometer plus	Eppendorf	6132000008
Wytrząsaczka/inkubator do wytrząsania kolb 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Niemcy
Profilometr, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco