Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Podsumowanie

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Streszczenie

W tym protokole szczegółowo opisano produkcję, eksperymentalną konfigurację i podstawowe działanie niedawno wprowadzonego mikroprzepływowego bioreaktora pikoliterowego (PLBR). PLBR może być wykorzystany do analizy pojedynczych bakterii i mikrokolonii w celu zbadania kwestii biotechnologicznych i mikrobiologicznych dotyczących np. wzrostu komórek, morfologii, reakcji na stres oraz produkcji metabolitów lub białek na poziomie pojedynczej komórki. Urządzenie charakteryzuje się ciągłym przepływem mediów, co zapewnia stałe warunki środowiskowe do badań perturbacji, ale dodatkowo umożliwia szybką zmianę medium, a także warunki oscylacyjne, aby naśladować dowolną pożądaną sytuację środowiskową. Aby wytworzyć urządzenia jednorazowego użytku, płytka krzemowa zawierająca struktury SU-8 o rozmiarach submikrometrowych posłużyła jako forma replikacyjna do szybkiego odlewania polidimetylosiloksanu. Chipy zostały pocięte, złożone, połączone i umieszczone w wysokiej rozdzielczości, w pełni zautomatyzowanym mikroskopie przystosowanym do obrazowania poklatkowego, które jest potężnym narzędziem do czasoprzestrzennej analizy komórek. W tym przypadku organizm platformy biotechnologicznej Corynebacterium glutamicum został zasiew do PLBR, a wzrost komórek i fluorescencja wewnątrzkomórkowa były śledzone przez kilka godzin, odkrywając zależną od czasu heterogeniczność populacji na poziomie pojedynczej komórki, co nie jest możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod analizy, takich jak cytometria przepływowa. Oprócz wglądu w produkcję urządzeń, zademonstrowano przygotowanie hodowli wstępnej, ładowanie, wychwytywanie bakterii oraz hodowlę pojedynczych komórek i kolonii metodą PLBR. Urządzenia te dodadzą nowy wymiar w badaniach mikrobiologicznych do analizy zależnych od czasu zjawisk pojedynczych bakterii pod ścisłą kontrolą środowiska. Ze względu na prosty i stosunkowo krótki proces produkcji, technologia może być łatwo zaadaptowana w każdym laboratorium mikrofluidycznym i po prostu dostosowana do konkretnych potrzeb.

Wprowadzenie

Mikroskopia poklatkowa to potężne narzędzie do badania żywych komórek in vivo¹. Tymczasem dostępne na rynku, w pełni zautomatyzowane platformy mikroskopowe, w tym termicznie indukowana kompensacja dryfu ogniska, są powszechnie stosowane w badaniach biologicznych do badania zjawisk zależnych od czasu, począwszy od badań nad rakiem i komórkami neuronalnymi, poprzez inżynierię tkankową, aż po badania dynamiczne z pojedynczymi komórkami drożdży lub bakterii^2-6.

Zazwyczaj stosuje się przezroczyste płytki dołkowe, podkładki agarowe lub po prostu szkiełka mikroskopowe, aby zapewnić środowisko hodowli komórkowej podczas obrazowania poklatkowego⁷. Mimo że te proste systemy nadają się do niektórych badań, mają bardzo ograniczoną kontrolę nad warunkami środowiskowymi i nie pozwalają na bardziej złożone perturbacje lub dobrze zdefiniowane i szybkie zmiany ośrodka. Jednorazowe chipy mikroprzepływowe produkowane w masowej produkcji zostały niedawno wprowadzone na rynek, ale są one w większości dostosowane do większych typów komórek eukariotycznych⁴. Chociaż wzrost można śledzić, dobrze zdefiniowane badania wzrostu dotyczące np. precyzyjnego wychwytywania komórek, wielkości kolonii, kierunku wzrostu i zdolności do usuwania komórek są ograniczone. Siedliska mikroprzepływowe i reaktory, w których komórki bakteryjne są hodowane w środowiskach 3D, zostały opracowane^8-10, mają wady, gdy mamy do czynienia z badaniami ilościowymi na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż można analizować ogólną heterogeniczność populacji, wielu parametrów komórek nie można dokładnie określić w rozdzielczości pojedynczej komórki, ponieważ wzrost nie jest ograniczony do monowarstw.

To ograniczenie spowodowało rozwój mikrosystemów umożliwiających hodowlę komórek w dobrze zdefiniowanych kanałach i siedliskach, z komórkami rosnącymi w płaskich monowarstwach z rozdzielczością pojedynczej komórki i szczególnie ścisłą kontrolą nad dostarczaniem pożywki i warunkami środowiskowymi^6,11,12. Pokazano kilka przykładów systemów mikroprzepływowych do hodowli komórek bakteryjnych^12-14. Bakterie zazwyczaj wykazują bardzo szybkie tempo wzrostu i wymagają struktur mikroprzepływowych w zakresie kilku mikrometrów i poniżej, zwłaszcza gdy do mikroskopii pożądane są monowarstwy komórek. Keymer i wsp. wykazano wzrost i rozprzestrzenianie się szczepów E. coli w mikrofabrykowanych krajobrazach^15,16. Ponieważ interesowała ich dynamika populacji, nie prowadzili badań z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Opracowaliśmy bioreaktor pikolitrowy (PLBR)¹³, który jest obecnie stosowany do badania różnych wskaźników wydajności biotechnologicznej, takich jak wzrost¹⁷ i analiza produktywności sprzężonej z fluorescencją na poziomie pojedynczej komórki^18,19. Obecne urządzenie mikroprzepływowe umożliwia sterowanie reaktorem środowiskowym przy określonej objętości hodowli wynoszącej około jednego pikolitra i ciągłą obserwację pojedynczych komórek jednocześnie. W porównaniu z otwartymi jednowarstwowymi systemami skrzynkowymi^11,14, w których jedna lub dwie strony są otwarte na kanał doprowadzający pożywkę, PLBR pozwala na kontrolowane odłowy i hodowlę. Konstrukcja pozwala na długotrwałą hodowlę bakterii bez ryzyka, że kilka sąsiadujących ze sobą kolonii utworzy jedną dużą populację. Ponadto system obejmuje obszary hodowli o wysokości 1 μm (w kolejności średnicy komórki), aby ograniczyć wzrost bakterii do monowarstw komórkowych. Natomiast kanały zasilające są 10 razy głębsze, aby zminimalizować opór hydrauliczny.

W porównaniu do zminiaturyzowanych systemów uprawy wsadowej²⁰, obecny system pozwala na uprawę o stałych parametrach środowiskowych dzięki ciągłemu przepływowi pożywki. Co więcej, parametry środowiskowe, takie jak skład medium, temperatura, natężenie przepływu i wymiana gazowa, można łatwo kontrolować i zmieniać w ciągu kilku sekund. Pozwala to na szczegółowe badania odpowiedzi komórek na zmiany środowiskowe, dotyczące np. dostępności składników odżywczych czy bodźców stresowych. Zapotrzebowanie na zmniejszone objętości pożywek, a mianowicie w zakresie zaledwie kilku mikrolitrów, umożliwia naukowcom przeprowadzanie nowatorskich badań, np. zaburzeń komórek podczas obrazowania poklatkowego z supernatantem w eksperymentach na dużą skalę odkrywających odpowiedź komórki w tych specyficznych warunkach środowiskowych¹⁷. Bioreaktor pikoliterowy zapewnia naukowcom solidny system, który ściśle kontroluje warunki biofizyczne i jest obsługiwany przy użyciu precyzyjnych pomp strzykawkowych oraz zautomatyzowanej mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiamy kompletny protokół, w tym projekt urządzenia, produkcję i przykładowe zastosowania.

Protokół

1. Produkcja wafli

1. Zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe zawierające wloty, wyloty, kanały główne i PLBR (rysunek 1A) za pomocą oprogramowania CAD.
2. Konstrukcja przedstawiona w tym protokole (rysunek 2) składa się z dwóch wlotów wysiewu, generatora gradientu do mieszania dwóch różnych substratów, jednego wylotu i sześciu układów PLBR. Każda tablica zawiera 5 PLBR, co daje 30 równoległych PLBR wewnątrz jednego urządzenia mikroprzepływowego.
3. Utwórz fotomaskę litograficzną zawierającą żądane układy chipów (rysunek 1B). Fotomaska została wyprodukowana we własnym zakresie metodą zapisu wiązką elektronów z rozdzielczością submikronową. Zastosowana maska składała się z warstwy chromu na szklanej płycie 5 w².
   Uwaga: wszystkie poniższe kroki należy wykonać w warunkach pomieszczenia czystego klasy 100 lub wyższej (schemat blokowy procesu pokazano na rysunkach 3A i 3B).
4. Wyczyść 4-calową płytkę krzemową piranią (stosunek 10:1 kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru) i kwasem fluorowodorowym przez kilka minut (Uwaga: niebezpieczne chemikalia). Płukać wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.
5. Odwadniać wafel przez 20 minut w temperaturze 200 °C.
6. Przędzić 1 μm SU-8 2000.5 fotorezystu na płytce (1 warstwa) (4 ml rezystu, wirować 10 sekund z, v = 500 obr./min i a = 100 obr./min, wirować 30 sek. przy v = 1 000 obr./min i a = 300 obr./min).
7. Umieść powlekaną płytkę na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (1,5 minuty w 65 °C, 1,5 minuty w 95 °C i 1 minutę w 65 °C; najlepiej użyć dwóch płyt grzewczych).
8. Włóż 1^warstwę fotomaski (tutaj obszary pułapki reaktorów pikolitrowych) i wafel do wyrównywacza maski i wystawiaj płytkę na działanie 350-400 nm (kontakt z podciśnieniem, 64 mJ/cm², t = 3 sekundy, I = 7 mW/cm²).
9. Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zainicjować polimeryzację SU-8 (1 min w 65 °C, 1 min w 95 °C i 1 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.
10. Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 1 minutę i przenieść go na kilka sekund do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8.
11. Opłucz wafel w izopropanolu, aby usunąć wywoływacz SU-8 i wysusz wafel za pomocą przepływu azotu z przędzarki waflowej.
12. Wafelek pieczemy na twardo przez 10 minut w temperaturze 150°C.
Na płytkę nanieść powłokę
13. fotorezystową 9 μm SU-8 2010 (2 warstwa) (dozować 4 ml rezystu, wirować 10 sekund z v = 500 obr./min, a = 100 obr./min i wirować 30 s z v = 4 000 obr./min, a = 300 obr./min).
14. Umieścić wafel z SU-8 na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika (15 minut w 65 °C, 45-60 minut w 95 °C i 10 minut w 65 °C). Uwaga: należy zwrócić uwagę na zmarszczki i pęcherzyki. Jeśli płytka zostanie podgrzana do temperatury 95 °C, odparowany rozpuszczalnik może być zamknięty w maleńkich pęcherzykach gazu.
15. Włóż fotomaskę o pożądanym układzie (tutaj główne kanały do dostarczania składników odżywczych) i wafel do nakładki maski i naświetl na 350-400 nm (twardy kontakt, 64 mJ/cm², t = 10 sek, I = 7 mW/cm²)
16. Przeprowadzić pieczenie po ekspozycji na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C, aby zakończyć polimeryzację SU-8 (5 min w 65 °C, 3:30 min w 95 °C, 3 min w 65 °C). Uwaga: po tym kroku można zobaczyć struktury w warstwie SU-8.
17. Umieścić wafel w kąpieli wywoływacza SU-8 na 45 sekund, przenieść płytkę do drugiego pojemnika ze świeżym wywoływaczem SU-8 i wywoływać przez 60 sekund.
18. Przepłukać wafel przez 20 sekund izopropanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości wywoływacza SU-8 i wysuszyć wafel za pomocą sprężonego azotu.
19. Na koniec upiecz wafelek na twardo w temperaturze 150 °C. W rezultacie uzyskuje się końcową płytkę (rysunek 1C), która zostanie wykorzystana jako forma wzorcowa do formowania PDMS.
20. Wykonaj pomiary profilometryczne (Rysunek 3C), aby zweryfikować wysokość konstrukcji SU-8. Uwaga: niedokładności w wysokości struktury mogą skutkować nieefektywnym uwięzieniem komórek lub utratą komórek podczas hodowli.

2. Produkcja chipów z polidimetylosiloksanu

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki powinny być idealnie wykonane w warunkach przepływu laminarnego, aby zapobiec zakłóceniu procedury produkcji przez cząsteczki pyłu (schemat blokowy procesu jest pokazany na rysunku 4).

1. Przygotować mieszaninę bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacza w stosunku 10:1. Dokładnie wymieszaj, aż uzyskasz jednorodny roztwór, który wygląda na nieprzezroczysty. Przygotuj tyle, ile jest to wymagane dla żądanej wysokości warstwy (tutaj 3 mm).
2. Odgazowywać mieszaninę PDMS przez około 30 minut w lekkim podciśnieniu, aż wszystkie pęcherzyki znikną.
3. Przygotować urządzenie formujące (lub szalkę Petriego) z odpowiednią płytką SU-8 i wlać do niej mieszaninę PDMS (rysunek 1D).
4. Piecz PDMS przez 3 godziny w temperaturze 80 °C w piekarniku.
5. Ostrożnie oderwij płytę PDMS od wafla. Pokrój płytę na pojedyncze wióry za pomocą czystego i ostrego skalpela.
6. Umyj frytki w kąpieli n-pentanowej przez 90 minut, a następnie w dwóch kąpielach acetonowych (90 minut każda). Wysuszyć wióry przez noc, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika. Uwaga: mycie PDMS należy wykonać pod wyciągiem. Uwaga: podczas mycia n-pentanem monomery i dimery są usuwane z utwardzonego PDMS, a rozmiar wióra może tymczasowo podwoić się podczas procedury prania.
7. Przechowuj mikroprzepływowe chipy PDMS w zamkniętych pojemnikach do czasu końcowego eksperymentu.
8. Tuż przed eksperymentem należy przebić otwory wlotowe i wylotowe w chipie PDMS za pomocą igły (lub dziurkacza) o nieco mniejszej średnicy niż złącza, które są używane do łączenia rurek z chipem PDMS.
9. Ostrożnie wyczyść mikroprzepływowy chip PDMS izopropanolem i użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, które mogą przykleić się do strukturalnej strony PDMS. Użyj taśmy klejącej kilka razy, aż na chipie nie będzie widać żadnych cząstek.
10. Szkiełko podstawowe o grubości 170 μm należy czyścić kolejno acetonem i izopropanolem. Na koniec oczyść wodą dejonizowaną i osusz azotem pod ciśnieniem.
11. Przed aktywacją plazmową należy rozgrzać myjkę plazmową i uruchomić plazmę na około 300 sek. Szkiełko proszkowane plazmowo i chip PDMS (moc 50 W, czas = 25 sekund, natężenie przepływu tlenu = 20 sccm).
12. Wyrównaj PDMS i szklany chip przed klejeniem. Na koniec ostrożnie umieść chip PDMS na szklanym szkiełku (Rysunek 1E). PDMS i szkło połączą się w ciągu kilku sekund. Uwaga: nie należy wciskać pęsetą na górną część chipa PDMS podczas procesu łączenia. Może to prowadzić do tzw. zawalania się dachów kanałów i małych konstrukcji.
13. W celu wzmocnienia wiązania, piecz ostatni wiór szklany PDMS przez 10 sekund w temperaturze 80 °C.

3. Przygotowanie kultury bakteryjnej

Uwaga: Wszystkie uprawy powinny być przygotowywane w sterylnym, filtrowanym podłożu, aby zapobiec gromadzeniu się niepożądanych cząstek, które mogą przeszkadzać podczas uprawy.

1. Użyj płytki agarowej zawierającej pożądane organizmy (tutaj C. glutamicum ATCC 13032) i zaszczepij jedną kolonię w 20 ml świeżej pożywki BHI, inkubuj przez noc (≈ 8-14 godzin) w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).
2. Przenieść 10 μl kultury wstępnej do żądanego podłoża (tutaj CGXII²¹), które będzie używane podczas hodowli mikroprzepływowej i pozostawić komórkę na noc do wzrostu w temperaturze 30 °C na wytrząsarce obrotowej (120 obr./min).
3. Przenieś żądaną ilość zawiesiny komórkowej (od 10 do 500 μl, w zależności od rozpoczęcia eksperymentu) do żądanej pożywki (tutaj CGXII²¹), która będzie używana podczas mikroprzepływowej hodowli komórek. Uwaga: najlepiej jest użyć komórek z wczesnej fazy logarytmicznej do wysiewu. Dla hodowli C. glutamicum najlepsza gęstość optyczna (OD₆₀₀) do wysiewu wynosiła 0,5-2.
4. Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 2 ml. Uwaga: należy to zrobić zaraz po zmontowaniu mikroprzepływowego chipa PDMS, aby zminimalizować czas transferu między kolbą wstrząsową a uprawą mikroprzepływową. Zazwyczaj czas transferu wynosi około 15 minut i powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wpływowi na metabolizm spowodowanemu ograniczeniem tlenu i zmianami temperatury.

4. Konfiguracja eksperymentalna

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane za pomocą odwróconego mikroskopu.

1. Uruchom inkubator mikroskopowy na 2 godziny przed eksperymentem, aby rozgrzać system. Uwaga: mikroskopia powinna być wyposażona w pełnowymiarowy inkubator do kontrolowania temperatury i, w razie potrzeby, przepływu gazu. Dodatkowa kontrola wilgotności nie jest konieczna, ponieważ system chipowy jest stale zasilany mediami.
2. Otwórz system inkubatora, wybierz żądany cel i w razie potrzeby dodaj olejek immersyjny na obiektyw.
3. Zamontuj chip wewnątrz uchwytu na wióry. W razie potrzeby przymocuj szklaną płytę taśmą klejącą, aby uniknąć ruchu wiórów podczas pracy stage.
4. Wyśrodkuj próbkę na mikroskopie i skup się na matrycach PLBR.
5. Podłącz wloty i wyloty za pomocą odpowiednich przewodów (Rysunek 1F). Podłącz rurkę do zbiornika na odpady. Reprezentatywny chip można zobaczyć na rysunku 4D.
6. Włóż strzykawki do pomp i rozpocznij przepływ mediów. Użyć pożywki, buforu lub w razie potrzeby roztworu powlekającego i płukać kanały mikroprzepływowe przez około 1 godzinę. Uwaga: roztwór powlekający służy do powlekania ścianek kanałów, aby zapobiec niespecyficznemu przyleganiu komórek.
7. W przypadku E. coli do pokrycia ścian kanału stosuje się 0,1% roztwór BSA. W przypadku C. glutamicum nie jest konieczne powlekanie. Po zakończeniu powlekania należy przepłukać wiór podłożem przed wysiewem komórek.
8. Przed wysiewem i uprawą komórek sprawdź, czy nie ma wycieków i czy temperatura jest stała.

5. Wprowadzanie komórek bakteryjnych do urządzenia mikroprzepływowego

1. Upewnij się, że żądane roztwory bakterii są dostępne w odpowiednich strzykawkach podłączonych do rurki.
2. Odłącz bufor lub roztwór powlekający i podłącz zawiesinę ogniw do chipa. Aby zminimalizować objętość śmierci, niepożądane pęcherzyki powietrza i skrócić czas eksperymentu, należy wymienić całą igłę, a także rurkę, a nie tylko strzykawki.
3. Wlej zawiesinę komórkową do kanałów z objętościowym natężeniem przepływu 200 nl/min, aż większość PLBR zostanie wypełniona żądaną ilością komórek (Figura 5A). Uwaga: optymalne wyniki siewu zależą od szczepu bakterii, OD₆₀₀ i pożywki wstępnej hodowli. Parametry te muszą być dostosowane w celu zwiększenia skuteczności wychwytywania i czasu, aż wystarczająca liczba ogniw zostanie uwięziona w strukturach reaktora. W przypadku C. glutamamicum zazwyczaj stosuje się zawiesinę komórkową OD₆₀₀ 0,5-2; dla E. coli OD₆₀₀ wynosił od 0,5-1.
4. Jeśli napełniana jest tylko niewielka liczba PLBR, należy zwiększyć natężenie przepływu do 800-1 200 nl/min.
5. Odłącz zawiesinę ogniw i podłącz pożywkę wzrostową do chipa (Rysunek 5B). Upewnij się, że podczas wymiany pożywki nie zostaną wprowadzone żadne pęcherzyki powietrza. Perfuzja ze świeżą pożywką wzrostową przy 100 nl/min.

6. Obrazowanie poklatkowe

1. Wybierz określone PLBR do obrazowania poklatkowego. Zazwyczaj wybiera się PLBR, które zawierają pojedynczą komórkę macierzystą na początku eksperymentu. Liczba obszarów zainteresowania, które można zbadać w jednym eksperymencie, zależy od pożądanej liczby klatek na sekundę i konfiguracji mikroskopowej.
2. Wybierz odpowiednią liczbę klatek na sekundę w zależności od liczby PLBR. Upewnij się, że mikroskop poradzi sobie z żądaną liczbą zwrotów z inwestycji w interwale poklatkowym.
3. Wybierz odpowiednie zestawy filtrów (tutaj YFP). Automatycznie zamykaj migawkę podczas ruchu sceny i po każdym pomiarze poklatkowym, aby zapobiec wybielaniu chromoforu.
4. Skonfiguruj sekwencję mikroskopii poklatkowej i rozpocznij eksperyment.
5. Po przerośnięciu wszystkich PLBR eksperyment można zatrzymać, mikroprzepływowy chip PDMS można wyrzucić, a eksperyment można ocenić.

7. Analiza

Uwaga: Następujące kroki lub części procedury mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą programów do analizy obrazu, takich jak ImageJ, itp.

1. Określ interesujące PLBR, w których hodowla spełnia wszystkie pożądane kryteria, np. liczbę komórek macierzystych, położenie komórek macierzystych itp.
2. Aby określić tempo wzrostu jednej mikrokolonii, policz liczbę komórek w każdym przedziale czasowym.
3. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu, wykreślając czas w funkcji ln (liczba komórek). Nachylenie wykresu reprezentuje tempo wzrostu w [1/h] (patrz Rysunek 6).
4. Analiza danych fluorescencyjnych jest silnie uzależniona od przeprowadzonego eksperymentu. W niniejszym raporcie wybrano przykład, aby zilustrować niejednorodność między koloniami i między komórkami między różnymi mikrokoloniami izogenicznymi (patrz rysunek 7).

Wyniki

Wytwarzanie urządzenia

Mikrofluidyczny system PLBR jest wytwarzany poprzez połączenie jednej warstwy PDMS z cienkim szklanym chipem przystosowanym do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Proces wytwarzania składa się z dwóch głównych etapów: po pierwsze, wykonania matrycy replikacyjnej (ryc. 1A, 1B i 1C), a po drugie, wykonania chipa (ryc. 1D, 1E i 1F). Zgodnie z protokołem, do stworzenia formy matrycowej wykorzystuje się standardowe techniki fotolitograficznego mikrofabrykowania. Laboratoria nieposiadające zaplecza typu clean room mogą nabyć komercyjnie dostępne, dostosowane matryce SU-8. Dzięki wielokrotnemu odlewnictwu z PDMS (ryc. 1A, 1B i 1C) można wyprodukować setki jednorazowych chipów. Odlewanie z PDMS oraz montaż chipa mogą być przeprowadzane w każdym laboratorium i nie wymagają zaplecza clean room, choć zaleca się stosowanie stanowisk z laminarnym przepływem powietrza.

Proces rozpoczyna się od zaprojektowania systemu chipu mikrofluidycznego. Do projektowania chipu mikrofluidycznego zazwyczaj wykorzystuje się oprogramowanie CAD (Rysunek 1A). Po etapie CAD za pomocą litografii wiązką elektronów (e-beam writer) generowana jest maska o rozdzielczości submikronowej (Rysunek 1B). W niniejszym badaniu stworzono maskę chromową o grubości 5 nm, która została wykorzystana do litografii wafla SU-8. Końcowy wafel krzemowo-SU-8 służy do formowania PDMS (Rysunek 1D). Po etapie wypalania płyta PDMS jest cięta na chipy, które są nieodwracalnie wiązane z szkiełkami przedmiotowymi (Rysunek 1E). Na koniec podłączane są rurki (Rysunek 1F).

Rycina 2 przedstawia szczegółową budowę układu mikroprzepływowego. Składa się on z dwóch wlotów do wysiewu, generatora gradientu do mieszania różnych podłoży lub mediów oraz jednego wylotu. Główne kanały mają wymiary 50 µm x 10 µm (S x W). Każde urządzenie składa się z sześciu macierzy PLBR, z których każda zawiera 5 PLBR. Daje to łącznie 30 zrównoleglonych reaktorów wewnątrz jednego urządzenia mikroprzepływowego.

Rysunek 3 przedstawia produkcję matrycy do replikacji. Zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole, pierwsza warstwa SU-8 jest wytwarzana za pomocą litografii SU-8 (Rysunek 3A). Analogiczna procedura jest stosowana w przypadku drugiej warstwy (Rysunek 3B). Aby sprawdzić geometrię kanałów, zbadano wysokość PLBR oraz kanałów głównych przy użyciu profilometru. Na przykładzie pokazanym na Rysunku 3C zmierzono pierwszą warstwę (warstwę hodowlaną). Wykazuje ona tutaj stałą wysokość 1 200 nm, odpowiednią do hodowli C. glutamicum w pożywce BHI.

Rysunek 4 przedstawia procedurę formowania z PDMS, rozpoczynając od mieszania PDMS (Rysunek 4A), następnie proces formowania (Rysunek 4B) i kończąc na etapie wiązania (Rysunek 4C). Rysunek 4D przedstawia gotowy chip mikrofluidyczny zawierający szklaną płytkę o grubości 170 µm, chip z PDMS (o wysokości 3 mm) z wlotami i wylotami oraz stalowe igły połączone z rurkami. Po zakończeniu eksperymentu chip można wyrzucić i nie jest wymagane gruntowne czyszczenie. Ponadto jest on łatwy w montażu i obsłudze. Nie jest konieczna skomplikowana i trudna procedura napełniania.

Zasada działania urządzenia

Rysunek 5 przedstawia zasadę działania systemu reaktora. Komórki są wprowadzane do urządzenia mikroprzepływowego, a poszczególne komórki zostają uwięzione wewnątrz PLBR dzięki oddziaływaniom ze ścianami. Ze względu na różnicę w oporze hydrodynamicznym kanału i PLBR, wewnątrz PLBR występuje jedynie minimalny przepływ. Po zasiewie PLBR (Rysunek 5A), fazę wzrostu i obserwacji rozpoczyna się poprzez zmianę roztworu bakterii na pożywkę wzrostową (Rysunek 5B). Gdy PLBR zostaną całkowicie przerostem (Rysunek 5C), eksperyment jest zazwyczaj kończony, a obrazy time-lapse mogą zostać poddane analizie. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat mechanizmów uwięzienia i profilu przepływu wewnątrz PLBR, czytelnika odsyła się do pracy Grünberger et al.¹³ .

Analiza szybkości wzrostu

Obecny system można zastosować do badania różnych gatunków bakterii pod kątem różnych parametrów biologicznych, takich jak wzrost, morfologia lub sygnał fluorescencyjny. W pierwszym przykładzie C. glutamicum, organizm produkcyjny istotny przemysłowo, był hodowany w standardowych warunkach hodowli (T=30 °C, medium CGXII²¹). Rysunek 6A przedstawia krzywe wzrostu uzyskane z trzech izogenicznych mikrokolonii. Wzrost wykładniczy jest utrzymywany aż do wypełnienia PLBR, co wskazuje na brak ograniczeń w dostępie do składników odżywczych. Rysunek 6B prezentuje cztery obrazy z mikroskopii poklatkowej DIC rosnącej kolonii C. glutamicum.

Analiza fluorescencji

W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek badacze często wykorzystują specyficzne białka fluorescencyjne, na przykład GFP lub ich pochodne, aby powiązać konkretny interesujący fenotyp z mierzalnym wynikiem (sygnałem fluorescencyjnym). Aby zademonstrować przydatność PBLR do badań time-lapse opartych na fluorescencji, zbadaliśmy emisję fluorescencji szczepu C. glutamicum produkującego kodowane plazmidowo białko fuzyjne YFP-TetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. W obecności niskich stężeń induktora (IPTG) wiadomo, że ekspresja z Ptac prowadzi do znacznej zmienności międzykomórkowej w izogenicznych populacjach bakteryjnych. Wykorzystując jedną prekulturę, śledzono wzrost i fluorescencję pojedynczych komórek w kilku izogenicznych mikrokoloniach. Jak widać na Rysunku 7, zaobserwowano heterogeniczność fenotypową pomiędzy różnymi mikrokoloniami oraz heterogeniczność na poziomie pojedynczych komórek w obrębie kolonii wywodzących się od jednej komórki macierzystej. Jedna kolonia (Rysunek 7B, PLBR 1) nie wykazywała niemal żadnej emisji fluorescencji, podczas gdy komórki PLBR 2 wykazywały niską emisję fluorescencji wynikającą z bazowej ekspresji yfp-tetR z promotora Ptac. W przypadku PLBR 3 emisja fluorescencji była znacznie silniejsza w porównaniu z innymi koloniami i zaobserwowano szeroki rozkład populacji. Przykład ten demonstruje przydatność PBLR do badań mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse. W porównaniu z cytometrią przepływową, w której fluorescencję pojedynczych komórek można określić w jednym punkcie czasowym, obecny system pozwala na śledzenie komórek i badanie fluorescencji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym przez wiele pokoleń.

Rycina 1. Przegląd procesu produkcji chipów PLBR. Wytwarzanie formy matki: rozpoczynając od (A) Projektowania, (B) Wytwarzania maski litograficznej oraz (C) Produkcji wafla. Produkcja chipów PDMS-szkło: rozpoczynając od (D) Formowania PDMS, a następnie (E) Wiązania szkła i PDMS oraz (F) Końcowego montażu chipa.

Rysunek 2. Konstrukcja chipa PLBR. (A) Rysunek CAD całego chipa mikrofluidycznego; (B) Powiększenie wybranych pozycji układu: Układ zawiera dwa wloty medium (a1), generator gradientu z kanałami mieszania (a2) oraz 6 równoległych macierzy PLBR (b1). b2 przedstawia pojedynczy PLBR, który jest osadzony w kanale płynnym o szerokości 100 µm. PLBR ma średnicę wewnętrzną 40 µm oraz kanały odżywcze o szerokości 2 µm. Wlot do zasiewu ma długość 40 µm. Kolor różowy reprezentuje pierwszą warstwę (obszar wychwytywania i hodowli), a kolor niebieski reprezentuje drugą warstwę (transport płynu).

Rycina 3. Ilustracja procesu dwuwarstwowej fabrykacji wafla. (A) Fabrykacja pierwszej warstwy zawierającej struktury pułapkowe; (B) Fabrykacja drugiej warstwy zawierającej kanały płynowe, wloty i wyloty; (C) Reprezentatywne profile powierzchni pierwszej warstwy. W tym przypadku wysokość pierwszej warstwy wynosiła 1,200 nm i została ona wykorzystana do hodowli C. glutamicum w pożywce złożonej.

Rysunek 4. Wytwarzanie urządzenia i reprezentatywny chip. Ilustracja procesu formowania PDMS: (A) mieszanie i odpowietrzanie PDMS; (B) formowanie PDMS; (C) uwalnianie z formy, wycinanie i bonding chipa. Finalny chip (Reprodukowano za zgodą Royal Society of Chemistry¹³): (D) fotografia chipa PDMS z 2 wlotami i 1 wylotem; (E) obraz CAD sześciu równoległych macierzy zawierających po 5 PLBR; (F) obraz SEM jednego PLBR.

Rysunek 5. Zasada działania systemu PLBR. (A) Faza zasiewania; (B) Faza wzrostu mikrokolonii bakteryjnych; (C) Faza przelewania. Powielono za zgodą Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Rysunek 6. Wyznaczanie tempa wzrostu mikrokolonii C. glutamicum WT. (A) Wykres wzrostu trzech hodowli PLBR i wynikające z nich krzywe wykładnicze (części reprodukowane za zgodą Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Obrazy time-lapse z rosnącej kolonii C. glutamicum.

Rysunek 7. Analiza heterogeniczności populacji oparta na PBLR. Przedstawiono szczep C. glutamicum wykazujący ekspresję fuzji yfp-tetR pod kontrolą promotora Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) w obecności induktora IPTG. (A) Schemat procedury eksperymentalnej; (B) Trzy izogeniczne mikrokolonie wykazujące heterogeniczność międzykolonialną oraz heterogeniczność międzykomórkową; (C) Rozkład fluorescencji pojedynczych komórek w odpowiednich mikrokoloniach.

Rysunek 8. Obrazy z powychowego mikroskopu elektronowego różnych PLBR.** Obrazy SEM przedstawiające wloty zasiewu w celu optymalizacji wydajności wychwytywania. (A) Większe wloty zasiewu (B) Mniejsze wloty zasiewu (C) Większe „otwarte” wloty zasiewu (D) Dwa wloty zasiewu.

Krok	Problem	Możliwa przyczyna	Roztwór
Produkcja wafli krzemowych	Uwięzione pęcherzyki powietrza w SU-8 podczas wstępnego wypiekania	Zbyt szybki wzrost temperatury	Piec w temperaturze 95 °C i 65 °C kilka razy
Produkcja wafli krzemowych	Znikające i uszkodzone struktury z SU-8	Nieoptymalna procedura wykonania; naprężenia mechaniczne w strukturach z SU-8	Optymalizacja parametrów, takich jak czas wypiekania, czas ekspozycji
Wytwarzanie wafli krzemowych	Warstwy SU-8 zbyt cienkie, zbyt grube lub o nierównomiernej grubości	Problem podczas nanoszenia warstwy metodą spin coatingu	Sprawdź parametry urządzenia do nanoszenia warstw wirowych oraz uchwyt wafla
Bondowanie i montaż chipów	Kollaps PLBR	Parametry wiązania PDMS nie są optymalne	Dostosuj moc, czas ekspozycji na plazmę oraz czas wygrzewania po procesie wiązania.
Bondowanie i montaż układów scalonych	Zanieczyszczenia strukturalne i cząstki w PLBRach	Chip nie został odpowiednio oczyszczony	Zastosuj taśmę klejącą do oczyszczenia powierzchni
Łączenie i montaż układów scalonych	Niewystarczające wiązanie PDMS-szkło	Nieoptymalne parametry wiązania lub niewystarczające oczyszczenie	Sprawdź ustawienia plazmy tlenowej
Eksperyment mikrofluidyczny	Wyciek płynu	Otwór wlotowy/wylotowy nie został prawidłowo wykonany	Optymalizacja procesu dziurkowania
Eksperyment mikroprzepływowy	Wiele małych cząstek PDMS podczas napełniania	Otwór nie został prawidłowo wykonany	Optymalizacja procesu wybijania otworów
Eksperyment mikrofluidyczny, aspekt biologiczny	Brak wzrostu komórek	Pozostałości rozpuszczalnika po procedurze czyszczenia	Należy dokładniej przepłukać chip przed załadowaniem komórek lub pozwolić rozpuszczalnikowi odparować przed procesem wiązania.
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekt biologiczny	Zmiana tempa wzrostu	Różne przyczyny	Sprawdzenie prekultury i temperatury
Eksperyment mikrofluidyczny, aspekt biologiczny	Zmiany morfologii komórek podczas hodowli	Ograniczenia składników odżywczych lub zmiana temperatury	Sprawdź inkubator i przepływ
Eksperyment mikrofluidyczny, aspekty techniczne	Dryft pozycji podczas mikroskopii pokadrowej (time-lapse)	Wahania temperatury	Sprawdź profil temperatury przed rozpoczęciem eksperymentów, aż do ustąpienia oscylacji
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekty techniczne	Utrata komórek podczas hodowli	Nieco powyżej wysokości reaktora	Optymalizacja wysokości reaktora
Eksperyment mikroprzepływowy, aspekty techniczne	Brak pułapkowania	Zbyt mała wysokość reaktora	Optymalizacja wysokości reaktora

Tabela 1. Rozwiązywanie problemów. Tabela ta podsumowuje krytyczne aspekty, częste błędy i możliwe rozwiązania podczas pracy eksperymentalnej.

Dyskusja

Opisaliśmy wytwarzanie, konfigurację eksperymentalną i powiązane procedury operacyjne mikroprzepływowego urządzenia PDMS zawierającego kilka (PLBR) do analizy pojedynczych komórek bakterii.

Mikrofabrykacja z wykorzystaniem technik miękkiej litografii pozwala na szybkie dostosowanie wymiarów urządzenia do różnych rozmiarów i morfologii bakterii. Obecnie optymalizujemy bioreaktor pikolitrowy pod kątem hodowli różnych organizmów mikrobiologicznych i przepustowości uprawy. W celu zwiększenia wydajności odłowu, optymalizowana jest również geometria reaktora. Rysunek 8 przedstawia cztery nowe urządzenia PLBR, które są obecnie walidowane. Na wszystkich rysunkach kanał wysiewający został przeprojektowany pod względem szerokości i kształtu. W praktyce wydaje się, że ma to wpływ na liczbę uwięzionych komórek, ale wymaga dalszych badań. Znaczną poprawę w zakresie skuteczności odłowu osiągnięto również dzięki zastosowaniu dodatkowych kanałów przelewowych, co doprowadziło do zwiększenia przepływu konwekcyjnego przez reaktor i uwięzienia większej liczby komórek. Jednak jednocześnie zwiększa się ryzyko wypłukania komórek podczas hodowli.

Urządzenie stanowi ciekawą alternatywę dla upraw w makroskali, które są wykorzystywane od dziesięcioleci do badania procesów wzrostu i produkcji na poziomie pojedynczych komórek. Ma jednak kilka ważnych wymagań: do równoległego monitorowania kilku bioreaktorów pikolitrowych obowiązkowa jest w pełni zmotoryzowana konfiguracja mikroskopowa o wysokiej rozdzielczości z kompensacją dryfu ostrości. Ponadto potrzebny jest system inkubacji, aby utrzymać pożądaną temperaturę uprawy na stałym poziomie przez cały czas trwania pomiarów.

Osiągamy 95% wskaźnik sukcesu w produkcji urządzeń. Główne problemy są związane z nieefektywnym klejeniem PDMS ze szkłem, zawaleniem się dachu PDMS lub wyciekiem płynu (patrz Tabela 1 , aby zapoznać się z rozwiązywaniem najczęściej występujących problemów). Chociaż prace eksperymentalne są wykonywane częściowo w warunkach niesterylnych, rzadko obserwujemy zanieczyszczenie podczas eksperymentów, ze względu na zamknięty układ płynowy. Urządzenia mikroprzepływowe PDMS są optycznie przezroczyste, dlatego mogą być używane do obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości. Chociaż PDMS wydaje się być idealny do tego zastosowania, ma wysokie powinowactwo do cząsteczek hydrofobowych, co sprawia, że stosowanie rozpuszczalników, które są szeroko stosowane w procesach biokatalitycznych całych komórek, jest ograniczone. Dostępne są jednak odpowiednie powłoki, które pozwalają dostosować protokół do tego rodzaju zastosowań.

Proponowany PLBR doskonale nadaje się do czasoprzestrzennej analizy zdarzeń komórkowych, a nawet subkomórkowych różnych rodzajów bakterii. Główną zaletą obecnego podejścia jest możliwość bezpośredniego ilościowego określenia wzrostu mikrokolonii w przeciwieństwie do metod konwencjonalnych. Ponadto PLBR pozwala na hodowlę w określonych i stałych warunkach. Ponieważ system ułatwia użycie niewielkich ilości odczynników lub materiałów, ma tę zaletę, że jest niedrogi, konfigurowalny i podatny na wysoką przepustowość. W tradycyjnych metodach przy analizie hodowli drobnoustrojów uwzględnia się średnie wartości dla całej populacji. Ponadto istniejące metody wymagają ręcznego pobierania próbek, co może prowadzić do degradacji próbek, a tym samym do błędów w pomiarze. PLBR oferuje nowe perspektywy rozwoju bioprocesów i analizy heterogeniczności populacji w mikrobiologii. PLBR jest obiecującym narzędziem do różnych zastosowań w rozwoju bioprocesów i może być stosowany w różnych dziedzinach badań, np. w analizie heterogeniczności między komórkami, analizie określonych klastrów komórkowych w obrębie linii komórkowych, badaniach przesiewowych szczepów produkcyjnych drobnoustrojów i badaniu fenotypów komórek w czasie rzeczywistym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka krzemowa o średnicy 100 mm, P/BOR < 100>	Si-MAT, Materiały silikonowe, Niemcy
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Projektant SU-8 Pan DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Niemcy
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS) Sylgard 184 Zestaw	elastomerów silikonowychDow Corning; Farnell GmbH, Niemcy
Igły dozujące Precyzyjne końcówki  27 g; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Niemcy
Płytki szklane D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Niemcy
Dziurkacz AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Niemcy
Strzykawki jednorazowe – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Niemcy	552-183143
Strzykawki, 1 ml sterylne szklane strzykawki	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Niemcy
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Mocznik	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Biotyna	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Kwas prokatechowy	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
Jednowodny glukozy	Carl Roth GmbH + Co. KG, Niemcy
BHI	Becton, Dickinson
Komórki
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Niemcy
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Mask Aligner MA-6	Suess
Płyta grzejna HP30A - 2	Torrey Pines
Memmert UN 200	Memmert
FEMTO	Diener Electronics, Niemcy
Pompy strzykawkowe neMESYS	Cetoni GmbH, Niemcy
Mieszadło magnetyczne CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Mikroskop Nikon Eclipse Ti	Mikroskopia Nikon
Inkubator mikroskopowy	Pecon GmbH, Niemcy
Wirówka minispin plus " linia"	Eppendorf	9776501
Fotometr BioPhotometer plus	Eppendorf	6132000008
Wytrząsaczka/inkubator do wytrząsania kolb 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Niemcy
Profilometr, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco

Karl Piec laboratoryjny Myjka plazmowa