Artykuł metodologiczny

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52610

⸱

4 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Streszczenie

Testy dopasowania in vitro są niezbędnymi narzędziami do określania zdolności replikacji wirusów takich jak HIV-1. Do ekstrapolacji dopasowania replikacji wirusa wykorzystano różne pomiary, począwszy od liczby cząstek wirusa na jednostkę zakaźną, szybkości wzrostu w hodowli komórkowej i względnej dopasowania uzyskanej z wielocyklowych testów konkurencji wzrostu. Testy konkurencji wzrostu zapewniają szczególnie czuły pomiar dopasowania, ponieważ wirusy konkurują o cele komórkowe w identycznych warunkach wzrostu. Istnieje kilka czynników eksperymentalnych, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania testów konkurencji wzrostu, w tym mnogość infekcji (MOI), czas pobierania próbek oraz metody wykrywania wirusa i obliczania przystosowania. Każdy czynnik może mieć wpływ na wynik końcowy i dlatego musi być dokładnie rozważony podczas projektowania eksperymentalnego. Przedstawiony tutaj protokół obejmuje kroki od skonstruowania nowego rekombinowanego klonu HIV-1 do przeprowadzenia testów konkurencji wzrostu i analizy wyników eksperymentalnych. Protokół ten wykorzystuje wcześniej pokazane wartości parametrów eksperymentalnych w celu uzyskania spójnych i solidnych wyników. Omówiono alternatywy, ponieważ niektóre parametry należy dostosować w zależności od typu komórki i badanych wirusów. Protokół zawiera dwie alternatywne metody wykrywania wirusów, aby zapewnić elastyczność, ponieważ dostępność instrumentów, odczynników i wiedzy specjalistycznej różni się w zależności od laboratorium.

Wprowadzenie

Zdolność replikacji wirusa jest definiowana jako zdolność wirusa do produkcji zakaźnego potomstwa w danym środowisku1 i jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do określenia rozpowszechnienia wariantu wirusa na poziomie populacji w czasie2. Ponieważ badania sprawności in vivo nie są możliwe w przypadku chorobotwórczych wirusów ludzkich, takich jak HIV-1, opracowano różne testy zdolności replikacji in vitro i ex vivo w celu zbadania wpływu na dopasowanie wynikające z oporności na leki i mutacji ucieczki immunologicznej, epistazy i ewolucji populacji wirusów3-6. Wśród różnych testów dopasowania, uznaje się, że testy konkurencji wzrostu dają bardziej czułe i ważne pomiary różnic w dopasowaniu, ponieważ dwa lub więcej wariantów wirusa konkuruje o tę samą populację komórek w dokładnie tych samych warunkach środowiskowych, jak ma to miejsce in vivo1,7,8. Przed rozpoczęciem eksperymentów z konkurencją wzrostu należy określić kilka zmiennych, w tym wykorzystanie różnych wielokrotności infekcji (MOI), współczynnik wejściowy wirusa i czas pobierania próbek do analizy. Badaliśmy wpływ tych parametrów na kinetykę wzrostu wirusa i na wyniki eksperymentów konkurencyjnych, a także zidentyfikowaliśmy kluczowe czynniki niezbędne do solidnych pomiarów dopasowania HIV-1 w hodowli komórkowej9.

Oprócz zmiennych testowych, istnieje wiele metod ilościowego oznaczania wariantów wirusa w eksperymentach dotyczących konkurencji wzrostu. Sekwencjonowanie masowe10,11 lub sekwencjonowanie klonalne12,13 zastosowano w celu określenia stosunku konkurujących wirusów na podstawie częstości występowania nukleotydów w miejscu (miejscach) zainteresowania. Dopasowanie względne wynika ze zmian tego stosunku w czasie. Ta metoda jest wygodna, ponieważ usługi sekwencjonowania DNA są powszechnie dostępne. Metoda sekwencjonowania swoistego dla alleli równoległych (PASS) umożliwia sekwencjonowanie w wielu miejscach i wykrywanie rekombinantów14, ale wymaga również specjalnie opracowanych odczynników i systemów detekcji. Zasadniczo metody te zostały opracowane w celu badania szczepów wirusowych z niewielką liczbą różnic nukleotydowych w regionie będącym przedmiotem zainteresowania. Inne metody wykorzystują mały gen reporterowy15 lub synonimiczne mutacje4,16-18 jako znaczniki do rozróżniania konkurujących wirusów za pomocą sekwencjonowania, testów śledzenia heterodupleksu (HTA)4,7,17,19 lub odwrotnej transkrypcji - ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)15,16,18,20, z których wszystkie można zastosować do badania konkurencyjnych szczepów niezależnie od podobieństwa sekwencji. Dodatkowy etap jest wymagany do wprowadzenia znaczników do genomów wirusa, a test RT-qPCR wymaga również specjalnych odczynników i oprzyrządowania. Odkryliśmy, że masowe sekwencjonowanie Sangera daje porównywalne wyniki9.

Po konkurencji wzrostu, zdolność replikacji wirusa jest przedstawiana jako względna sprawność, czyli stosunek dopasowania między dwoma wariantami wirusa. Względne dopasowanie wirusa można zdefiniować jako końcową proporcję wariantu wirusa znormalizowaną przez jego początkową proporcję w inokulum lub jako różnicę tempa wzrostu netto między dwoma konkurującymi wirusami. Stwierdziliśmy, że ta druga metoda, wykorzystująca podłużne punkty danych tylko w fazie wzrostu wykładniczego, przyniosła najbardziej wiarygodne wyniki9,20.

Testy sprawności in vitro są używane głównie do badania biologicznych klonów6-8 i zakaźnych klonów molekularnych HIV-1. Te ostatnie, podatne na manipulacje genetyczne, są często wykorzystywane do badania wpływu na dopasowanie poszczególnych mutacji lub określonych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania3-5,21,22. Poniższe protokoły opisują przebieg pracy od punktu konstruowania nowych zakaźnych klonów molekularnych HIV-1 o pełnej długości przy użyciu wektorów HIV-1 zawierających znacznik sekwencji, wprowadzania interesujących mutacji, tworzenia zapasów wirusów i ustalania kinetyki wzrostu wirusa, do wykonania testu konkurencji wzrostu i obliczenia względnej dopasowania (ryc. 1).

Korzystając z naszych zoptymalizowanych procedur, stworzyliśmy trzy rekombinowane mutanty HIV-1 i określiliśmy ich zdolność do replikacji. Rekombinowany klon molekularny został po raz pierwszy skonstruowany poprzez zastąpienie regionu genu HIV-1 gag-p24 pNL4-3, plazmidu zawierającego pełnej długości zakaźnego genomu laboratoryjnego szczepu HIV-1 NL4-3, syntetyczną sekwencją COTB (Center-Of-Tree, podtyp B) gag-p24 23 w celu stworzenia prototypowego szczepu. Następnie wprowadzono pojedyncze zmiany aminowe (T186M, T242N i I256V) w celu stworzenia trzech zmutowanych klonów. Każdy mutant rywalizował z prototypem wirusa, aby zaobserwować wpływ każdej mutacji na dopasowanie w danym tle genetycznym. Trzy mutanty wykazywały różne poziomy odporności replikacji, od niewielkiego do znacznie niższego niż w przypadku prototypu wirusa. Wcześniej zgłaszano, że mutacja T242N ma umiarkowany koszt sprawności24-26, podobny do wyniku pokazanego w tym badaniu. Koszt dopasowania pozostałych dwóch mutacji nie był wcześniej zgłaszany.

Protokół

UWAGA: Opisany poniżej protokół nie zawiera żadnych informacji umożliwiających identyfikację pacjenta i dlatego nie jest uznawany za badania na ludziach przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Waszyngtońskiego lub Wydział Badań na Ludziach.

1. Budowa chimerycznych klonów molekularnych HIV-1 NL4-3

1.1) Amplifikuj Wstaw fragment DNA

  1. Zaprojektuj chimeryczne podkłady. Połówki 5' starterów zarówno do przodu, jak i do tyłu zawierają sekwencję wektorową HIV-1, w której fragment zostanie wstawiony. Połowa 3' starterów musi zawierać koniec sekwencji wstawiania (rysunek 2). Upewnij się, że sekwencja chimerycznego startera zachowuje oryginalne otwarte ramki odczytu.
    1. Stosować podkłady o długości co najmniej 20 zasad, o temperaturze topnienia większej lub równej 60 °C, zawartości GC ~50% i niskiej tendencji do tworzenia dimerów podkładowych, heterodimerów i/lub struktur spinki do włosów. Oceń te właściwości za pomocą narzędzia internetowego OligoAnalyzer (https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).
  2. Użyj PCR27 i chimerycznych starterów do amplifikacji insercji DNA (ryc. 2). Do każdej reakcji PCR użyj 1X buforu o wysokiej wierności, 0,2 mM dNTP, 1 U polimerazy DNA o wysokiej wierności, 0,5 μM startera chimerycznego do przodu, 0,5 μM startera odwrotnej chimerycznej i 1 pg0 ng próbki DNA przenoszącej region wstawienia. Dodać dH2O do końcowej objętości 50 μl.
  3. Ustaw kroki cykli termicznych w następujący sposób: Wykonaj początkowy etap denaturacji DNA w temperaturze 98 °C przez 10 sekund. Amplifikuj za pomocą 30 cykli denaturacji DNA w temperaturze 98 °C przez 10 sekund i wyżarzania DNA w temperaturze 3 °C powyżej najniższej temperatury topnienia dwóch starterów przez 20 sekund. Wykonaj końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Weź 5 μl produktów PCR z poprzedniego kroku i uruchom elektroforezę w żelu agarozowym28.
    1. Użyj 0,7% żelu agarozowego, 1x bufor TAE (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA), 0,5 μg/ml bromku etydyny (EtBr) o końcowym stężeniu i drabince 1 kb jako markera wielkości DNA. Ustaw napięcie źródła zasilania na odległość 5 V/cm między elektrodami. Przerwij elektroforezę, gdy barwnik obciążający migruje przez około 2/3 długości żelu. Wizualizacja żelu za pomocą systemu dokumentacji żelu28.
      UWAGA: EtBr jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i musi być odpowiednio zutylizowany, zgodnie z przepisami instytucji. Podczas pracy z żelami zawierającymi EtBr należy zawsze nosić rękawice. Zmienić rękawice na nowe po zakończeniu pracy z materiałem zawierającym EtBr oraz przed przystąpieniem do pracy z innymi materiałami lub sprzętem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  5. Jeśli zostanie wykryty tylko jeden prążek DNA o rozmiarze odpowiadającym pożądanemu produktowi PCR, należy oczyścić resztę produktu PCR za pomocą komercyjnego zestawu, takiego jak QIAquick PCR Purification Kit, zgodnie z protokołami producenta.
    1. Jeśli obecne są również inne, niespecyficzne prążki, należy użyć pozostałej części produktu PCR do przeprowadzenia preparatywnej elektroforezy żelowej. Należy użyć tych samych parametrów i warunków, które określono w kroku 1.1.4. Upewnij się, że studzienka żelu jest wystarczająco duża, aby załadować ~45 μl produktów PCR. Wytnij interesujący Cię pasek i wyekstrahuj DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick zgodnie z protokołami producenta.

1.2) Wprowadź fragment wstawki do pełnowymiarowego wektora zakaźnego HIV-1 podtypu B (pNL4-3)

  1. Użyj oczyszczonych produktów PCR z kroku 1.1.5 jako starterów PCR. Użyj pNL4-3VifA20 jako matrycy DNA w jednej reakcji PCR i użyj pNL4-3VifB20 jako matrycy w drugiej reakcji (Figura 2). Do każdej reakcji PCR należy użyć 1x buforu o wysokiej wierności, 0,2 mM dNTP, 2 U polimerazy DNA o wysokiej wierności, 500 ng startera DNA i 50 ng matrycy DNA w końcowej objętości 50 μl. Ustaw parametry cykli termicznych na: 98 °C przez 30 sekund, 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, 48 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 10 minut, a następnie 72 °C przez 10 minut.
  2. Dodać 10 j. DpnI do 50 μl reakcji PCR i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wytrawienia matrycowego DNA. Upewnij się, że plazmidowe DNA jest wyizolowane ze szczepu bakteryjnego kompetentnego do metylacji, np. TOP10 chemicznie kompetentnego Escherichia coli.
  3. Użyj produktu strawionego DpnI, aby przekształcić kompetentne komórki bakteryjne. Użyj transformacji szoku cieplnego z TOP10 chemicznie kompetentnymi E. coli, zgodnie z protokołem producenta. Aby wybrać komórki bakteryjne zawierające rekombinowany plazmid, należy użyć płytek hodowlanych Luria Bulth (LB) zawierających 100 mg/l karbenicyliny.
    1. Wybierz ~ 10 dobrze oddzielonych kolonii i hoduj każdą osobno w 3 ml płynnego podłoża LB zawierającego 100 mg / L karbenicyliny i inkubuj w temperaturze 30 °C w wytrząsarce O/N.
    2. Użyj zestawu QIAprep Spin Miniprep, aby wyizolować plazmidowe DNA z płynnej kultury bakteryjnej, zgodnie z protokołem producenta.
  4. Użyj trawienia z podwójnym restrykcyjnym29, aby określić, czy plazmidowe DNA zawiera właściwą wkładkę. Upewnij się, że jedno z miejsc restrykcyjnych istnieje tylko w regionie wstawienia, a drugie miejsce ograniczenia istnieje tylko raz w wektorze HIV-1, poza regionem wstawiania.
    1. Roztrawić co najmniej 300 ng plazmidowego DNA w końcowej objętości reakcyjnej 10 μl. Wybierz restrykcyjne, temperaturę inkubacji i czas inkubacji zgodnie z protokołem producenta wybranych enzymów restrykcyjnych. Pobrać 9 μl strawionego DNA i przeprowadzić elektroforezę żelową zgodnie z opisem w kroku 1.1.4. Wybierz rekombinowane plazmidy, które mają prążki DNA o przewidywanych rozmiarach.
  5. Potwierdź integralność sekwencji rekombinowanych plazmidów za pomocą sekwencjonowania Sangera. Chociaż rzadko, niepożądane mutacje mogą zostać wprowadzone podczas reakcji PCR.
    1. Zsekwencjonuj obie nici plazmidowego DNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 1.1.1.1, aby zaprojektować startery sekwencjonowania. Ponadto należy upewnić się, że startery sekwencjonowania do przodu i do tyłu wyżarzają się odpowiednio o co najmniej 50 pz przed i za obszarem wstawienia w rekombinowanym plazmidzie.
    2. Prześlij plazmidowe DNA i startery sekwencjonowania do komercyjnego dostawcy usług sekwencjonowania DNA. Przygotuj próbkę DNA i startery zgodnie z zaleceniami usługodawcy.
  6. Zrób wolny od endotoksyn zapas zmutowanego plazmidowego DNA za pomocą zestawu plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn zgodnie z protokołem producenta. Przygotować co najmniej 1 μg plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn do transfekcji w następnym kroku.

1.3) Wprowadzenie mutacji na małą skalę poprzez mutagenezę kierowaną przez stronę

  1. Zaprojektuj startery mutagenne z nakładającymi się starterami do przodu i do tyłu, zawierającymi pożądaną mutację (mutacje). Umieść zasady (zasady), które mają być podstawione, wstawione lub usunięte, w środku starterów, otoczonych 10-15 homologicznymi zasadami. Postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 1.1.1.1.
  2. Użyj PCR do syntezy zmutowanych plazmidów. Do każdej reakcji PCR należy użyć 1x buforu o wysokiej wierności, 10 mM dNTP, 2 U polimerazy DNA o wysokiej wierności, 0,5 μM przedniego startera mutagennego, 0,5 μM odwróconego startera mutagennego i 50 ng chimerycznego pNL4-3VifB, z kroku 1.2.6, w końcowej objętości 50 μl. Ustaw parametry cykli termicznych na: 98 °C przez 30 sekund, 25 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, 48 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 10 minut, a następnie 72 °C przez 10 minut.
  3. Powtórz kroki od 1.2.2 do 1.2.6.

2. Generowanie wirusa za pomocą transfekcji

  1. Oblicz pożądaną ilość zapasu wirusa i wymagane plazmidowe DNA. Przy mianie wirusa wynoszącym 104 j.m./ml lub wyższym, 1,8 ml zapasu wirusa wystarcza do przeprowadzenia dwóch zestawów testów konkurencji wzrostu, w tym monoinfekcji, z których każdy jest wykonywany w trzech egzemplarzach. W przypadku transfekcji wykonanej na płytce 6-dołkowej pobiera się około 1,8 ml supernatantu z dołka. Jeden μg plazmidowego DNA jest potrzebny do każdej transfekcji wykonanej na płytce 6-dołkowej.
  2. Dla każdego dołka na płytce 6-dołkowej przygotować 100 μl mieszaniny transfekcyjnej, np. składającej się z 1 μl odczynnika do transfekcji X-tremeGENE 9 (lub porównywalnego produktu), 1 μg plazmidowego DNA i DMEM bez surowicy.
    1. Określ potrzebną objętość plazmidowego DNA, używając 1 μg plazmidowego DNA na studzienkę. Upewnij się, że końcowe stężenie plazmidowego DNA wynosi co najmniej 50 ng/μl.
    2. Określ, ile pożywki wolnej od surowicy (DMEM) jest potrzebne na studzienkę, korzystając ze wzoru: Całkowita objętość DMEM w μl = 100 μl - objętość DNA w μl.
  3. Dodać 106 komórek/basenik HEK 293T-17 (ATCC) w 2 ml pożywki do rozmnażania (DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) do płytki 6-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Wysiewaj tyle dołków, ile potrzeba (określone w kroku 2.1).
  4. Aby przygotować mieszaninę do transfekcji, należy poddzielić odpowiednią objętość DMEM bez surowicy, jak obliczono powyżej, do probówki mikrowirówkowej z polipropylenu o pojemności 1,8 ml, a następnie dodać odczynnik do transfekcji.
    1. Odczynnik pipetować bezpośrednio do roztworu pożywki, nie dodawać go do plastikowej powierzchni probówki mikrowirówki. Na końcu dodaj plazmidowe DNA. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać roztwór. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (15–25 °C), aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcyjnych.
    2. Dodaj mieszaninę kroplami do komórek wysianych na płytce 6-dołkowej. Delikatnie potrząśnij lub zakręć studzienkami, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcyjnych.
    3. Uszczelnij płyty folią.
  5. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin.
  6. Za pomocą pipety ostrożnie zebrać i przenieść supernatant do probówki o pojemności 15 ml przez pokrywę filtra 0,22 μm.
  7. Za pomocą pipety przenieś 250 μl lub więcej przefiltrowanego supernatantu do probówek do mikronasycenia o pojemności 1,8 ml z gumowymi uszczelkami w pokrywkach.
  8. Przefiltrowane supernatanty przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Określ zakaźne miano szczepów wirusowych na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

  1. Stymuluj PBMC za pomocą fitohemaglutyniny (PHA). Na jeden szczep wirusa, wysiew 2 x 106 PBMC w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Iscove'a (cIMDM; IMDM uzupełniony 20 j./ml ludzkiej interleukiny 2 (hIL-2), 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) uzupełniony PHA (1,5 μg/ml). Wysiewaj PBMC w ilości 2 x 106 komórek/ml. Inkubować PBMC w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny.
  2. Zebrać PBMC stymulowane przez PHA. Przenieś nieprzylegające PHA-PBMC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować rurkę przy 228 x g przez 10 min. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy do końcowego stężenia 2 x 105 PBMCs/ml w cIMDM.
  3. Nasiona 2 x 104 PBMC stymulowane przez PHA w 100 μl/studzienka cIMDM na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem.
  4. Wykonać rozcieńczenie wirusa w stosunku 1:10. Następnie, z pierwszego rozcieńczonego wywaru, wykonać dwanaście 3-krotnych seryjnych rozcieńczeń w 96-dołkowej płytce wzorcowej. Ten schemat rozcieńczania jest zalecany do wykrywania miana wirusa w zakresie 10,4 do 10,6 jednostek zakaźnych (j.m.) na ml.
    1. Na przykład dodać 20 μl preparatu wirusowego do 180 μl pożywki w probówce o pojemności 1,5 ml. Wymieszać rozcieńczony roztwór ostrożnie pipetując. Następnie przenieść 90 μl rozcieńczonego bulionu do 180 μl pożywki z pierwszego dołka i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    2. Kontynuować serię rozcieńczania, przenosząc 90 μl z obecnej pożywki do pożywki o objętości 180 μl w następnym dołku jeszcze jedenaście razy. Zwiększyć lub zmniejszyć początkowe rozcieńczenie, jeżeli spodziewane są miana odpowiednio wyższe niż 106 j.m./ml lub niższe niż 104 j.m./ml.
  5. Dodać 40 μl seryjnie rozcieńczonego wywaru wirusowego z płytki rozcieńczającej do rozcieńczania głównego na płytkę PBMCs z nasionami (od kroku 3.3) w poczwórnym powiększeniu. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 16-24 godziny.
  6. Ostrożnie usunąć 100 μl supernatantu z każdej studzienki i zastąpić 160 μl świeżego cIMDM do całkowitej objętości 200 μl/studzienkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 (dzień 1).
  7. W dniach 4, 7, 10 i 13 przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki do 100 μl buforu rozrywającego (2% TritonX-100 w PBS) i zastąpić 100 μl świeżego cIMDM. Przechowywać supernatanty w temperaturze -20 °C.
    1. Kontynuuj pobieranie próbek i dodawanie nowego cIMDM co trzy dni, aż miano się ustabilizuje.
  8. Oznaczyć 50% dawkę zakaźną w hodowli tkankowej (TCID50) stada wirusa za pomocą testu ELISA p24, używając próbek z dnia 7 i 13, jak opisano w kroku 4.
    1. Jeśli TCID50 uzyskany w dniu 13 jest wyraźnie wyższy niż miano z dnia 7, zasób wirusa może potrzebować więcej czasu na ekspansję. Powtórz test ELISA p24 przy użyciu późniejszych próbek, aż miana zakaźne z dwóch punktów czasowych pobierania próbek ustabilizują się (lub zmniejszą). Wybierz stada z próbek o najwyższych mianach.

4. ELISA (test immunoabsorbantu sprzężony z enzymem) Wykrywanie HIV-1 p24 w celu określenia miana zakaźnego wirusa

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany przy użyciu płytek do wychwytywania antygenu p24 przygotowanych w naszym laboratorium30. Można również stosować komercyjne płytki/zestawy ELISA HIV-1 p24, zgodnie z protokołem producenta.

  1. Przed rozpoczęciem pracy z próbkami należy przygotować zapasy robocze przeciwciała pierwszorzędowego (surowica królicza anty-HIV-1 SF2 p24).
    1. Rozmrozić surowicę p24 w temperaturze pokojowej.
    2. Wymieszać 2,5 ml glicerolu z 2 ml 10% FBS w roztworze soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS).
    3. Dodać 0,5 ml surowicy odpornościowej i wymieszać.
    4. Przechowywać 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  2. Rozmrozić próbki z etapu 3.7 w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Umyj płytkę wychwytującą p24 5 razy buforem do przemywania (1x PBS z 0,05% Tween-20).
  4. Dodać 50 μl/basenik rozcieńczalnika do próbek (1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,2% Tween-20 w RPMI-1640), a następnie dodać 50 μl próbki do odpowiednich studzienek. Włączyć co najmniej trzy studzienki z rozcieńczalnikiem do próbek tylko jako kontrolę próbną/ujemną. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Roztwór przeciwciał pierwszorzędowych należy przygotować na świeżo przed użyciem. Wykonaj 1:2,000-krotne rozcieńczenie podstawowych zapasów roboczych przeciwciał za pomocą pierwszorzędowego rozcieńczalnika przeciwciał (12% FBS w RPMI-1640). Upewnij się, że przygotowałeś wystarczającą ilość do użycia 100 μl roztworu na każdą próbkę/studzienkę kontrolną na 96-dołkowej płytce.
    1. Na przykład, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu na jedną 96-dołkową płytkę, dodaj 5 μl podstawowych zapasów roboczych przeciwciał do pierwszorzędowego rozcieńczalnika przeciwciał w celu uzyskania końcowej objętości 10 ml.
  6. Umyj płytkę przechwytującą 5 razy buforem do mycia.
  7. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
    8. .
  8. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych na świeżo przed użyciem. Wykonać 1:14 400-krotne rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego (1 mg/ml koziego anty-króliczego HRP) za pomocą rozcieńczalnika przeciwciał drugorzędowych (7% FBS, 0,01% Tween-20 w RPMI-1640). Aby zmniejszyć liczbę błędów pipetowania, należy przeprowadzić dwuetapowe rozcieńczanie szeregowe. Upewnij się, że przygotowałeś wystarczającą ilość do użycia 100 μl roztworu na każdą próbkę/studzienkę kontrolną na 96-dołkowej płytce.
    1. Na przykład, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu na jedną 96-dołkową płytkę, najpierw dodaj 1 μl przeciwciała drugorzędowego do 99 μl rozcieńczalnika przeciwciał drugorzędowych. Następnie dodać 70 μl pierwszego rozcieńczalnika do drugorzędowego rozcieńczalnika przeciwciał do uzyskania końcowej objętości 10 ml.
  9. Umyj płytkę przechwytującą 5 razy buforem do mycia.
  10. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  11. Umyj płytkę 5 razy buforem do mycia.
  12. Dodać 100 μl substratu RT TMB. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w zamkniętym pojemniku w celu ochrony przed światłem.
  13. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego RT (1 N H2SO4).
  14. Odczytać absorbancję przy 450-650 nm w każdym dołku za pomocą czytnika mikropłytek. Użyj wartości absorbancji, aby ocenić każdą studzienkę jako zakażoną lub niezainfekowaną. Należy rozważyć, że studzienka zawiera zakaźnego wirusa, jeśli wartość absorbancji jest co najmniej trzy razy wyższa niż wartość odczytana z dołków symulowanych / kontroli ujemnej. Obliczyć TCID50 stada wirusowego przy użyciu metody Reeda-Meuncha31.

5. Ustal kinetykę wzrostu wirusa

5.1) Monoinfekcja

  1. Wysiew 3 x 105 PBMC/basenik stymulowany przez PHA na płytkach 48-dołkowych o łącznej objętości 500 μl/basenik. Przechowywać płytki hodowlane w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 do momentu inokulacji.
  2. Dla każdego wirusa należy przygotować inokulum zawierające 6 000 j.m. w 2 ml cIMDM.
  3. Zaszczepić studzienki w trzech egzemplarzach, dodając 500 μl inokulum (1500 IU) do wysianych komórek. Ostateczna objętość zakażonej hodowli komórkowej wynosi 1 ml/basenik, a MOI wynosi 0,005.
  4. Porcję 200 μl pozostałego inokulum do każdej z dwóch 96-dołkowych płytek do izolacji RNA, z których jedna jest zapisywana jako kopia zapasowa.
  5. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 16-24 godziny.
  6. Przemyć kultury 16-24 godziny po inokulacji.
    1. Usunąć i wyrzucić 750 μl supernatantu hodowlanego.
    2. Dodać 750 μl świeżego cIMDM. Zawiń talerze w folię spożywczą i wiruj przez 10 minut w temperaturze 300 x g. Usunąć i wyrzucić 750 μl supernatantu.
    3. Dodać 750 μl świeżego cIMDM. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 (dzień 1).
  7. Pobieraj próbki kultur codziennie od dnia 2 do dnia 7.
    1. Przenieść 500 μl supernatantu do hodowli do probówki wirówkowej o pojemności 1,8 ml. Wirować przez 1 minutę przy 3,000 x g.
    2. Przenieś 200 μl bezkomórkowego supernatantu na dwie 96-dołkowe płytki z próbkami w celu izolacji RNA, ponownie zachowując jedną płytkę jako kopię zapasową. Przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C do czasu izolacji RNA.
    3. Dodaj 500 μl świeżego cIMDM do każdej kultury. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
      4. .
    4. Odrzuć kultury do Wescodyne pod koniec eksperymentu.
    5. Wyizoluj RNA z 200 μl supernatantu (użyj komercyjnych zestawów, takich jak QIAamp Viral RNA Mini Kit) zgodnie ze standardowym protokołem producenta. W przypadku dużej liczby próbek użyj Qiagen QIAxtractor.
    6. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu syntezy cDNA.

5.2) Synteza cDNA (odwrotna transkrypcja)

  1. Do każdej próbki RNA dodaj 1,2 nmol dNTP i 1,2 pmol startera syntezy cDNA (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3', nukleotyd HXB2 7968 do 7995) do 10 μl wirusowego RNA. Dodać wodę do końcowej objętości 14 μl. Przesuń rurkę, aby wymieszać i krótko obrócić, aby zebrać płyn na dnie tuby.
  2. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 65 °C, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania mieszanki wzorcowej.
  3. Przygotować mieszankę wzorcową, używając 5x buforu pierwszej nici (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 5 mM DTT, 120 U SuperScriptIII i 240 U inhibitora Rnazy. Dodać wodę do końcowej objętości 10 μl.
  4. Dodaj 10 μl mieszanki wzorcowej do mieszaniny RNA, przesuń do wymieszania i odkręć, aby zebrać.
  5. Inkubować mieszaninę przez 90 minut w temperaturze 50 °C, aby umożliwić syntezę cDNA. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 70 °C w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy. W razie potrzeby utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  6. Dodaj 2 U Rnase H, przesuń, aby wymieszać, a następnie zakręć, aby zebrać.
  7. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.

5.3) Kwantyfikacja cDNA za pomocą systemu qPCR

  1. Przygotować wzorcową serię rozcieńczeń. Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczanie pNL4-3VifA, od 3 x 106 kopii/μl do 30 kopii/μl. Do rozcieńczeń należy używać wody destylowanej. Przygotować serię rozcieńczeń wzorcowych na świeżo przed użyciem lub przygotować małe partie i przechowywać w temperaturze -20 °C. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj wzorców więcej niż trzy razy.
  2. Ustawić 96-dołkową płytkę reakcyjną qPCR. Upewnij się, że każda płytka zawiera co najmniej jedną studzienkę z kontrolami ujemnymi, trzykrotną próbkę serii rozcieńczeń wzorcowych oraz co najmniej duplikat każdej próbki cDNA.
  3. Dla każdej reakcji qPCR należy użyć 12,5 μl głównej mieszaniny qPCR, sondy 0,2 μM, 0,8 μM każdego ze starterów do przodu i do tyłu oraz 1 μl cDNA lub serii rozcieńczeń wzorcowych lub wody/buforu (dla studzienki kontroli ujemnej). Dodać wodę do końcowej objętości 25 μl. Sonda qPCR jest wrażliwa na światło. Przechowywać w zamkniętym pojemniku.
    1. Aby wykryć cDNA pochodzące z klonu molekularnego opartego na pNL4-3VifA, użyj startera-sondy VifA: startera do przodu VifAB (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), startera odwrotnego VifA (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTTT-3') i sondy VifAB (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3'-MGBNFQ). W przypadku cDNA pochodzącego z klonu opartego na pNL4-3VifB należy użyć startera-sondy VifB: startera do przodu VifAB, sondy VifAB i startera odwrotnego VifB (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3').
  4. Ustaw parametry cykliczne PCR na 50 °C na 2 min, 95 °C na 10 min i 40 cykli 95 °C na 15 sekund i 60 °C na 1 min. Zapoznaj się z dokumentem pomocy technicznej producenta dotyczącym obsługi maszyny qPCR.
  5. Obliczyć krzywą wzorcową, korzystając z danych z potrójnej serii rozcieńczeń wzorcowych. Porównaj dane amplifikacji próbki cDNA z krzywą wzorcową, aby określić liczbę kopii. Zapoznaj się z dokumentem pomocy technicznej producenta w celu uzyskania informacji na temat przetwarzania danych.

5.4) Określ fazę wykładniczego wzrostu wirusa

  1. Wykreśl kinetykę wzrostu wirusa z dniem pobierania próbek wzdłuż osi X i liczbą kopii cDNA wzdłuż osi Y i zidentyfikuj fazę wykładniczego wzrostu wirusa, tj. Kiedy liczba kopii cDNA wirusa wzrasta w postępie wykładniczym.
  2. Użyj narzędzia internetowego GRC (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/), aby obliczyć tempo wzrostu wirusa (g). W tym zastosowaniu narzędzie GRC przyjmuje jako dane wejściowe liczbę kopii cDNA z co najmniej dwóch punktów czasowych i generuje szybkość wzrostu wirusa (g). Używaj tylko danych punktu czasowego w fazie wzrostu wykładniczego (patrz krok 5.4.1 powyżej), aby uzyskać dokładne tempo wzrostu. Szczegółowy opis modelu matematycznego używanego w narzędziu internetowym GRC znajduje się wpunkcie 20.

6. Test konkurencji wzrostu

  1. Zasiać 3 x 105 stymulowanych PHA PBMC (lub 1 x 105 komórek CEMx174) w całkowitej objętości 500 μl na studzienkę na 48-dołkowej płytce płaskodennej.
  2. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 do momentu zaszczepienia.
  3. Dla każdego wirusa należy przygotować 3 ml inokulum zawierające 6 000 j.m.
  4. Przenieś 1,5 ml każdego inokulum wirusa do sterylnej probówki, aby utworzyć inokulum podwójnej infekcji. Dodać 500 μl podwójnego inokulum (1,500 j.m.) do 3 x 105 komórek na 48-dołkowej płytce. Ostateczna objętość kultury wynosi 1 ml/basenik. Podwielokrotność 200 μl inokulum na dwie 96-dołkowe płytki w celu izolacji RNA; Zapisz jedną płytę jako kopię zapasową.
  5. Inkubować zaszczepione komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 16-24 godziny.
  6. Przemyć kultury 16-24 godziny po inokulacji.
    1. Usunąć i wyrzucić 750 μl supernatantu hodowlanego.
    2. Dodać 750 μl świeżego cIMDM. Zawiń talerze w folię spożywczą i wiruj przez 10 minut przy 300 x g. Usunąć i wyrzucić 750 μl supernatantu.
    3. Dodać 750 μl świeżego cIMDM. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 (dzień 1).
  7. Wybierz czasy próbkowania, aby uwzględnić co najmniej 3 punkty czasowe w fazie wzrostu wykładniczego zaobserwowanej w kroku 5.4.1.
    1. Dla każdego pobierania próbek należy postępować zgodnie z krokiem 5.1.7.
  8. Przeprowadzić syntezę cDNA zgodnie z opisem w punkcie 5.2.
  9. Określ stosunek wariantów wirusa za pomocą qPCR.
    1. Przygotować wzorcową serię rozcieńczeń seryjnych w trzech powtórzeniach, rozcieńczając 10-krotnie w każdym kroku od 3 x 106 kopii/μl do 30 kopii/μl pNL4-3VifA.
    2. Ustawić 96-dołkową płytkę reakcyjną qPCR. Upewnij się, że każda płytka zawiera co najmniej jedną kontrolę ujemną, serię wzorcowych rozcieńczeń w trzech egzemplarzach oraz duplikaty każdej próbki cDNA.
    3. Do każdej reakcji qPCR należy użyć 12,5 μl qPCR Master Mix, sondy 0,2 μM, 0,8 μM każdego ze starterów do przodu i do tyłu oraz 1 μl cDNA lub standardowej serii rozcieńczeń lub wody/buforu (dla studzienek kontroli ujemnej). Dodać wodę do końcowej objętości 25 μl. Sonda qPCR jest wrażliwa na światło, należy ją przechowywać w zamkniętym pojemniku.
      1. Użyj sondy starterowej VifA do wykrywania sygnałów w kontrolach ujemnych i serii rozcieńczeń wzorcowych oraz z jednym duplikatem próbki cDNA. Użyj startera-sondy VifB z drugim duplikatem próbki cDNA.
    4. Ustaw parametry cykliczne PCR na 50 °C przez 2 minuty, następnie 95 °C na 10 minut, a następnie 40 cykli 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę. Zapoznaj się z dokumentem pomocy technicznej producenta dotyczącym obsługi maszyny qPCR.
    5. Obliczyć krzywą wzorcową, wykorzystując dane dotyczące amplifikacji z serii rozcieńczeń wzorcowych. Porównaj dane amplifikacji próbek cDNA z krzywą wzorcową, aby określić liczbę kopii. Zapoznaj się z dokumentem pomocy technicznej producenta w celu uzyskania informacji na temat przetwarzania danych.
    6. Użyj narzędzia internetowego GRC (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/), aby obliczyć względną zdolność wirusa (d).
      UWAGA: Narzędzie GRC przyjmuje jako dane wejściowe liczbę kopii cDNA lub wysokości pików chromatogramu z co najmniej dwóch punktów czasowych i wyprowadza różnicę szybkości wzrostu netto (d) między dwoma wirusami. Chociaż narzędzie może obliczyć stopę wzrostu netto na podstawie danych z dwóch punktów czasowych, zdecydowanie zaleca się wprowadzanie danych z trzech lub więcej punktów czasowych. Używaj wyłącznie danych uzyskanych z punktów czasowych w fazie wzrostu wykładniczego (patrz krok 5.4), aby uzyskać dokładne tempo wzrostu. Szczegółowy opis modelu matematycznego używanego w narzędziu internetowym GRC znajduje się wpunkcie 20.
  10. Określanie proporcji wirusów za pomocą wysokości pików chromatogramu
    1. PCR amplifikuje fragmenty vif HIV-1 zawierające znacznik sekwencji VifAB za pomocą VifFwd (5′-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3′; HXB2 pozycje 5266–5291) i startery VifRev (5′-GTCTTCTGGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3′; HXB2 pozycje 5579–5553).
      1. Do każdej reakcji PCR użyj 1 μl cDNA, 1x bufor NH4, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U polimerazy Taq i 0,45 μM każdego startera. Dodać wodę do końcowej objętości 50 μl.
      2. Ustaw parametry cykliczne PCR na 3 cykle w temperaturze 94 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 minutę i 70 °C przez 1 minutę, a następnie 34 cykle w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 58 °C przez 30 sekund i 70 °C przez 1 minutę, a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
    2. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR zgodnie z protokołem producenta.
    3. Prześlij oczyszczone produkty PCR do dostawcy usług sekwencjonowania DNA w celu sekwencjonowania Sangera.
    4. Sprawdź średni wynik jakości odczytu, który powinien być dostarczony przez usługę sekwencjonowania. Jeśli średnia podstawowa dokładność wywołania jest mniejsza niż 85%, powtórz kroki od 6.10.1 do 6.10.3
    5. Użyj narzędzia internetowego ChromatQuan (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi), aby obliczyć współczynnik wirusów w każdym punkcie czasowym. Narzędzie wymaga pliku śledzenia sekwencji (*.ab1) i sekwencji 5' do interesującego miejsca nukleotydu. Narzędzie mierzy szczytową intensywność w określonym miejscu. Stosunek intensywności piku odpowiada stosunkowi dwóch wirusów (ryc. 4B).
    6. Użyj narzędzia internetowego GRC (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) i zarejestrowanych intensywności szczytów jako danych wejściowych do obliczenia względnej sprawności wirusa (d). Patrz krok 6.10.6. 20

Wyniki

Aby zbadać wpływ pojedynczych zmian aminokwasowych w białku HIV-1 Gag-p24 na przystosowanie wirusa, zastosowano ukierunkowaną mutogenezę oligonukleotydową w celu wprowadzenia mutacji do plazmidu pNL4-3 zawierającego gen HIV-1 COTB-p2423,32,33. Materiały wirusowe uzyskano poprzez transfekcję komórek 293T i zebrano po 48 hr. 50% zakaźną dawkę tkankową (TCID50) każdego materiału wirusowego oszacowano metodą Reeda-Muencha31. Wartości TCID50 dla wirusa prototypowego oraz mutantów mieściły się w zakresie od 104 do 105 IU/ml (Rysunek 3A).

Kinetykę wzrostu wirusów rekombinowanych ustalono w PBMC od pojedynczego dawcy przy MOI wynoszącym 0,005. Do codziennego pomiaru liczby kopii cDNA wirusa przez sześć dni wykorzystano RT-qPCR. Wszystkie wirusy mutanty i prototypowe rosły wykładniczo między 2. a 4. dniem, po czym wzrost wirusów spowolnił, co wskazywało zmniejszone nachylenie krzywej wzrostu liczby kopii RNA wirusa (Rysunek 3B). Spadek liczby kopii cDNA między dniem 0 (odpowiadającym inokulum) a dniem 2 wynika z absorpcji wirusa przez komórki oraz usunięcia niezwiązanych wirionów podczas płukania w 1. dniu (krok 5.1.6). W fazie wzrostu wykładniczego wszystkie trzy mutanty wykazywały wolniejszy tempo wzrostu (g) niż wirus prototypowy (Rysunek 3C).

Wszystkie trzy mutanty poddano testom konkurencji wzrostowej z wirusem prototypowym przy całkowitym MOI wynoszącym 0.005. Kinetyka wzrostu wirusa w kulturach z podwójną infekcją była podobna do kinetyki w przypadku monoinfekcji; faza wykładniczego wzrostu wirusa przypadała między 2. a 4. dniem, a wzrost wirusa osiągnął plateau około 5. dnia (Rysunek 4A).

Różnice w tempie wzrostu wirusów wyznaczono na podstawie zmiany stosunku wirusów w czasie. Stosunek wirusów obliczono na podstawie liczby kopii cDNA wirusa referencyjnego i mutantów za pomocą RT-qPCR oraz poprzez porównanie wysokości pików na chromatogramach sekwencyjnych w miejscach nukleotydowych różniących oba wirusy (Rycina 4B). Różnice w tempie wzrostu określone metodą wysokości pików oraz metodą liczby kopii RNA wirusa dały podobne wyniki (Rycina 4C). Wszystkie trzy mutanty wykazywały niższą sprawność replikacyjną niż wirusy prototypowe, przy czym mutant I256V charakteryzował się najniższą sprawnością (Rycina 4C).

Schemat przygotowania wirusa; wektory plazmidowe, mutogeneza, transfekcja, analiza kinetyki wzrostu wirusa.
Rycina 1: Schemat blokowy protokołów przedstawionych w niniejszej pracy. Protokoły przygotowania wirusa dotyczą konstrukcji rekombinowanych klonów HIV-1 oraz generowania zapasów wirusowych. Protokoły testów sprawności (fitness assays) służą do ustalenia kinetyki wzrostu wirusa i określenia względnej sprawności wirusa. Linie przerywane reprezentują alternatywne ścieżki protokołów. Na przykład mutację można wprowadzić bezpośrednio do klonu molekularnego HIV-1 NL4-3 bez generowania klonu rekombinowanego.

Schemat edycji genów metodą PCR; pokazuje startery, fragmenty wstawek oraz etapy tworzenia plazmidu rekombinowanego.
Rysunek 2: Konstrukcja rekombinowanych klonów molekularnych HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 z wykorzystaniem PCR z przedłużeniem nakładającym (overlap extension PCR). (A) Projektowanie starterów chimerycznych. Połowy 5’ starterów zawierają sekwencję wektora NL4-3, a połowy 3’ zawierają końce sekwencji wstawki. (B) Startery chimeryczne są wykorzystywane do amplifikacji fragmentu wstawki, COTB Gag-p24. (C) Fragmenty wstawek służą jako startery w drugiej reakcji PCR w celu wytworzenia nowego plazmidu rekombinowanego.

Badanie mutacji wirusa; wykresy słupkowe i liniowe; porównanie TCID50, cDNA, tempa wzrostu; wpływ mutacji.
Rycina 3: Charakterystyka wzrostu wirusa w PBMC. (A) Log10 TCID50 zapasów wirusa. (B) Kinetyka wzrostu wirusa w monoinfekcjach rozpoczętych przy MOI = 0,005. (C) Tempo wzrostu wirusa w ciągu sześciu dni, w tym faza wzrostu wykładniczego (dni 2-4) wyznaczona na podstawie panelu (B). Przedstawione wartości stanowią średnią z trzech powtórzeń z jednego eksperymentu. Słupki błędów reprezentują 95% przedziały ufności.

Schemat syntezy cDNA i PCR; proces izolacji RNA; wykres tempa wzrostu szczepu wirusa; analiza danych.
Rycina 4: Oznaczenia wzrostu wirusa i względnej sprawności. (A) Wzrost wirusa w kulturach PBMC z podwójną infekcją. (B) Stosunki wirusów T242N i prototypowych określone za pomocą RT-qPCR lub metody wysokości szczytów sekwencjonowania. (C) Różnice w całkowitym tempie wzrostu wirusa (d) pomiędzy wirusem mutantem a prototypowym w kulturach z podwójną infekcją, przedstawione w (A). Wartości d obliczono na podstawie danych dotyczących stosunku wirusów przedstawionych w (B). Przedstawione wartości stanowią średnią z trzech powtórzeń z jednego eksperymentu. Słupki błędów reprezentują 95% przedziały ufności.

Dyskusja

Przedstawione protokoły składały się z dwóch głównych części: budowy rekombinowanych klonów molekularnych HIV-1 oraz testów konkurencji wzrostu. Aby odróżnić dwa wirusy w podwójnie zakażonej hodowli komórkowej, ważne jest, aby konkurujące ze sobą klony molekularne zawierały znaczniki sekwencji, które można wykryć za pomocą testu starterowego RT-qPCR lub sekwencjonowania Sangera. Protokół ten wykorzystuje znaczniki VifA i VifB, które zajmują ten sam region HIV-1 NL4-3 vif i kodują tę samą sekwencję aminokwasów, ale różnią się sześcioma synonimicznymi mutacjami. Wykazano, że mutacje te nie wpływają na zdolność replikacji wirusa20. Metoda klonowania oparta na PCR stosowana w tym protokole zapewnia większą elastyczność w wyborze miejsc klonowania w porównaniu z klonowaniem opartym na ośrodkach ograniczających. Jednak skuteczność klonowania PCR spada wraz ze wzrostem rozmiaru wkładki. Aktualny limit wielkości wkładki wynosi ~5 kb34. W przypadku klonowania opartego na PCR i mutagenezy ukierunkowanej zastosowanie polimerazy DNA o wysokiej wierności ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia dodatkowych mutacji. Zaleca się również stosowanie minimalnej liczby cykli PCR potrzebnych do uzyskania odpowiedniej ilości produktów. Z naszego doświadczenia wynika, że nie wykryliśmy żadnych dodatkowych mutacji po opisanych tutaj etapach klonowania opartego na PCR i mutagenezie ukierunkowanej na miejsce. Niemniej jednak produkty PCR powinny być sekwencjonowane w celu sprawdzenia, czy nie ma żadnych niepożądanych mutacji. Idealnie byłoby, gdyby cały region kodujący HIV został zsekwencjonowany.

W fazie wzrostu wykładniczego9 należy zbadać co najmniej trzy punkty czasowe pobierania próbek. Kinetykę wzrostu wirusa należy najpierw ustalić przy użyciu codziennego pobierania próbek w celu określenia odpowiedniego okresu hodowli i punktów czasowych pobierania próbek dla konkurencji wzrostu. Jednym z czynników wpływających na kinetykę wzrostu wirusa jest wielość infekcji (MOI). Protokół ten wykorzystuje całkowity MOI wynoszący 0,005 zarówno dla monoinfekcji, jak i konkurencji wzrostu, ponieważ wykazano, że daje bardziej solidne wyniki niż niższe MOI9. Niemniej jednak, niższe MOI mogą być wykorzystane do uzyskania dłuższej fazy wzrostu wykładniczego, jeśli to konieczne, ale kosztem spójności wyników. Protokół ten sugeruje początkowy stosunek infekcji wynoszący 50:50, zakładając, że różnice w dopasowaniu wirusów są na ogół nieznane z góry. Jednak stosowanie nierównych współczynników wejściowych jest właściwe, gdy istnieją wstępne dane sugerujące znaczące różnice w kinetyce replikacji wirusa. W takich przypadkach zaleca się stosunek infekcji wynoszący 70:30, aby umożliwić wykrycie dużej różnicy w sprawności, w której wirus o mniejszej sprawności jest umieszczony w nadmiarze9.

Protokół określania TCID50, kinetyki wzrostu wirusa i wykonywania testów konkurencji wzrostu został zoptymalizowany przy użyciu HIV-1 podtypu B, NL4-3 COTB-p24 i PBMC od jednego dawcy, którego PBMC wykazały stałą podatność na zakażenie HIV-1 in vitro. Okres hodowli i punkty czasowe pobierania próbek przedstawione w tym protokole mogą być odpowiednie do badania wirusów HIV-1 grupy M w ludzkich PBMC. Zdecydowanie zaleca się stosowanie PBMC z jednego źródła w celu uzyskania spójnych wyników, ponieważ replikacja wirusa może się różnić w różnych komórkach dawcy35. Chociaż mniej pożądane, PBMC zebrane od wielu dawców mogą być używane jako substytucja, pod warunkiem, że ta sama pula jest używana we wszystkich eksperymentach. Inną alternatywą jest wykorzystanie linii komórkowych. Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem zastosowany w przypadku linii komórek T CEMx17423,36. Jednak ważne jest, aby liczba wysiewanych komórek została ponownie zoptymalizowana w celu osiągnięcia stałego wzrostu komórek. Kinetyka wzrostu wirusa musi również zostać ponownie ustanowiona, ponieważ może się ona różnić w różnych liniach komórkowych, aby określić odpowiednie punkty czasowe pobierania próbek na etapach konkurencji wzrostu.

W protokole zawarto dwie różne metody określania współczynnika wirusów do obliczania przystosowania. Pierwszy z nich wykorzystuje RT-qPCR do pomiaru liczby kopii cDNA wirusa w każdym punkcie czasowym pobierania próbek. Sprawność replikacji wirusa obliczono następnie na podstawie współczynnika wirusa, na podstawie liczby kopii cDNA. Alternatywnie, stosunek wirusów można określić na podstawie stosunku wysokości piku chromatogramu w miejscach znaczników VifAB. Obie metody przyniosły porównywalne wyniki (rys. 4). Metoda wysokości piku chromatogramu może być stosowana do innych szczepów HIV-1 bez zmodyfikowanego znacznika sekwencji. W przypadku RT-qPCR należy najpierw dokładnie ocenić użycie starterów lub sond do rozróżnienia wariantów wirusa (patrz20). Niemniej jednak RT-qPCR zapewnia lepszą czułość dla próbek z niewielką ilością wirusowego RNA, takich jak te z pierwszego punktu czasowego w fazie wzrostu wykładniczego. Bezpośredni pomiar cDNA wirusa pozwala również na wykrycie problemów technicznych, które mogą wyniknąć z ekstrakcji RNA i syntezy cDNA. Wykorzystanie klonów molekularnych ze znacznikami sekwencji stanowi opłacalne rozwiązanie dla metod RT-qPCR, ponieważ do badania wielu wirusów potrzebne są tylko dwie pary starterów i sond. Strategia ta pozwala również uniknąć problemu zmienności wysokości piku w chromatogramach sekwencji ze względu na sąsiednie zasady37, ponieważ sekwencjonowanie odbywa się w tym samym miejscu u wszystkich wirusów w badaniu. Produkty PCR wytwarzane do sekwencjonowania RT-qPCR i Sangera mogą być również stosowane z innymi metodami do określania stosunku wirusów, takimi jak sekwencjonowanie masowe pojedynczych klonów12,13, HTA4,7,17,19 lub test ligacji oligonukleotydów (OLA)38.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Opinie wyrażone w niniejszym dokumencie są opiniami autorów i nie powinny być interpretowane jako oficjalne lub reprezentujące poglądy Departamentu Obrony USA lub Departamentu Wojska Lądowego.

Podziękowania

Te badania zostały sfinansowane przez granty US Public Health Services P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 oraz Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington's Center for AIDS Research (P30 AI027757).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Budowa rekombinowanych klonów
Starter chimeryczny/mutagenny/sekwencjonującystartery IDTNiestandardowe oligonukleotydy DNA
plazmidy pNL4-3VifA i pNL4-3VifBProsimy o kontakt Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
Thermo ScientificF-549S
dNTPBiolineBio-39026
Thermal CyclerLife TechnologiesApplied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
Barwnik ładujący DNAThermo ScientificR0631
1 kb Plus Drabinka DNAInvitrogen10787-018
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
QIAquick zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Enzym DpnINew England BiolabsR0176S
TOP10 chemicznie kompetentnych Escherichia coliInvitrogenC4040-10
Luria Bulion w proszku w proszkuInvitrogen12795-084
CarbenicillinResearch Products InternationalC46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen27104
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
Transfekcja
X-tremeGENE 9 Odczynnik do transfekcji DNARoche6365787001
HEK 293T-17ATCCCRL-11268http://www.atcc.org/
0,22 i #956; m górna rura filtraVWR International89220-716 
Hodowla
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy DulbeccoTechnologie życia10566016
Iscove′ s Zmodyfikowany Dulbecco′ s Medium (IMDM)Life Technologies31980-030
RPMI-1640 MediaMedia Life Technologies61870-036
Fitohemaglutynina (PHA)Thermo ScientificR30852801
Ludzka interleukina-2Roche11147528001
Płodowa surowica bydlęcaJR Scientific43640
Penicylina i streptomycynaCorning Cellgro30-001-CI
Płytka 6-dołkowaVWR Scientific73520-906
Płytka 48-dołkowaVWR Scientific62407-338
96-dołkowa płytka płaskodennaISC BioexpressT-3015-4
96-dołkowa płytka okrągłodennaBD Falcon353077
1,5 ml Probówka do mikrowirówekMt. Baker BioMBD-1500
Probówka 1,5 ml z O-ringiemVWR Scientific89004-290
Probówka stożkowa 50 mlISC BioexpressC-3317-6
ELISA
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Invitrogen14190-250
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma-AldrichF0392
glicerolSigma-AldrichG5516
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153
Królik anty-HIV-1 SF2 p24 surowicaprzeciw AIDS NIH Programodczynników 4250
Koza anty-królik HRPKPL474-1516
Podłoże peroksydazy mikrostudzienkowej TMBKPL52-00-01
H2SO4Fisher ScientificA300-500Powoduje poważne oparzenia wszystkimi drogami narażenia. Stosować środki ochrony osobistej. Używać tylko pod wyciągiem chemicznym. Natychmiast zmyć dużą ilością wody przez co najmniej 15 minut.
Standardowy program HIV p24AIDS and Cancer Virus (NCI-Frederick)W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zamówienia prosimy o kontakt z Julianem Bessem, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Czytnik mikropłytekUrządzeniaVMax Kinetic ELISA Czytnik mikropłytek
Izolacja RNA Synteza
QIAxtractorQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
dNTPBiolineBio-39026
SuperscriptIIIInvitrogen18080-085
Bufor pierwszej nici Invitrogen18080-085
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen18080-085
Inhibitor rnazyRoche3335402001
RnaseHInvitrogen18021-071
qPCR
Maszyna do qPCR w czasie rzeczywistymLife TechnologiesApplied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression MasterMix Life Technologies4369016
Starter do przodu, do tyłuIDTTechnologie
sondyzamówienie Niestandardowa
optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaLife TechnologiesI19N3Q216
PCR+sekwencjonowanie
Polimeraza DNA Taq (Biolase)BiolineBio-21043
Bufor NH4 BiolineBio-21043
MgCl2BiolineBio-21043
Podkład do sekwencjonowaniaIDTNa zamówienie
QIAxcelQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
dostawca usług sekwencjonowania DNAhttp://www.htseq.org/
Narzędzie internetowe GRChttp://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
Narzędzie internetowe ChromatQuanhttp://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi
Polimeraza DNA High-Fidelity Bufor o wysokiej wierności Thermo Scientific F-549S komórkowa molekularne cDNA żywotności na

Bibliografia

  1. Domingo, E., Holland, J. J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).
  2. Domingo, E. Mechanisms of viral emergence. Veterinary research. 41 (6), 38(2010).
  3. Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo. Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).
  4. Troyer, R. M. Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).
  5. Rolland, M. Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics. PLoS One. 5 (9), e12463(2010).
  6. Abraha, A. CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic. J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).
  7. Quinones-Mateu, M. E. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).
  8. Ball, S. C. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes. B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).
  9. Lanxon-Cookson, E. C. Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses. J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).
  10. Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine. J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).
  11. Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation. J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).
  12. Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).
  13. Wang, J. The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency. Virology. 348 (2), 462-474 (2006).
  14. Song, H. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome. Retrovirology. 9 (89), (2012).
  15. Ali, A., Yang, O. A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay. Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).
  16. Maarseveen, N. M. A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants. J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).
  17. Liu, Y. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape. J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).
  18. Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).
  19. Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness. Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).
  20. Liu, Y. A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture. J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).
  21. Brumme, Z. L. Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers. J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).
  22. Nomura, S. Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in. Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).
  23. Rolland, M. HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity. J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).
  24. Martinez-Picado, J. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).
  25. Brockman, M. A. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).
  26. Miura, T. HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).
  27. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction (2014).
  28. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).
  29. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests (2014).
  30. McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density. J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).
  31. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimatingfifty percent endpoints. Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).
  32. Nickle, D. C. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).
  33. Rolland, M. Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).
  34. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  35. Spira, A. I., Ho, D. D. Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro. J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).
  36. Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface. PLoS One. 8 (6), e66065(2013).
  37. Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing. Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).
  38. Lalonde, M. S. Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies. J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Konkurencja wzrostu HIV 1sprawno replikacji wirusaanaliza RT qPCRwysoko piku chromatogramukonstrukcja klon w molekularnychgenerowanie zapas w wirusafaza wzrostu wyk adniczegomononuklearne kom rki krwi obwodowejmutageneza celowanasekwencjonowanie metod Sangera
Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.