Artykuł metodologiczny

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

DOI:

10.3791/55442

⸱

10 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak dokładnie mierzyć żywotność neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) w hodowanych ziarnistych neuronach móżdżku, pierwotnej hodowli neuronalnej używanej jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne hodowane neurony ziarniste móżdżku (CGN) były szeroko stosowane jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych. Jednak współistnienie komórek glejowych i neuronów w hodowli CGN może prowadzić do błędów w dokładnej ocenie żywotności neuronów. Podwójne barwienie dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) zastosowano do pomiaru żywotności komórek poprzez jednoczesną ocenę komórek żywotnych i martwych. Zastosowaliśmy podwójne barwienie FDA-PI, aby poprawić czułość testów kolorymetrycznych i ocenić żywotność neuronów w CGN. Ponadto dodaliśmy niebieskie fluorescencyjne barwniki DNA (np. Hoechst), aby poprawić dokładność. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można poprawić dokładność oceny żywotności neuronów przy użyciu tych metod w hodowli CGN. Korzystając z tego protokołu, można wykluczyć liczbę komórek glejowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podobną strategię można zastosować do odróżnienia niechcianych komórek glejowych od neuronów w różnych mieszanych kulturach komórkowych, takich jak pierwotna hodowla korowa i hodowla hipokampa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorymetryczne testy cytotoksyczności, takie jak test bromku 3- (4, 5-dimetylo-2-tiazolylu)-2, 5-difenylo-2-H-tetrazoliowego (MTT), są powszechnie używane do pomiaru żywotności komórek in vitro. Pierwotne neurony ziarniste móżdżku (CGN) szczurów są wrażliwe na różne neurotoksyny, w tym jon 1-metylo-4-fenylopirydyniowy, nadtlenek wodoru i glutaminian1,2. Dlatego kultury CGN mogą być wykorzystywane jako model in vitro w dziedzinie neuronauki. Hodowle CGN mogą zawierać różne komórki, w tym neurony i komórki glejowe, które mogą stanowić około 1% wszystkich komórek w hodowli CGN. Jednak komórki glejowe reagują inaczej na neurotoksyny w porównaniu z neuronami, co prowadzi do odchylenia żywotności neuronów mierzonej za pomocą testów kolorymetrycznych3.

W żywotnych komórkach, dioctan fluoresceiny (FDA) może być przekształcony we fluoresceinę przez esterazy. Jodek propidyny (PI) może wchodzić w interakcje z DNA po wniknięciu do martwych komórek i może być stosowany do wskazania apoptozy w hodowli. W związku z tym podwójne barwienie FDA-PI może jednocześnie oceniać żywe komórki i martwe komórki, co sugeruje, że żywotność komórek można dokładniej zmierzyć, łącząc obie metody kolorymetryczne. Co więcej, dodanie Hoechst, niebieskiego barwnika fluorescencyjnego dla jąder, można jeszcze bardziej poprawić dokładność żywotności komórek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje podwójne barwienie FDA-PI i potrójne barwienie FDA-PI-Hoechst, które można wykorzystać do dokładnej analizy żywotności neuronów w pierwotnych hodowlanych CGN.

Ten protokół wykorzystuje do wizualizacji i rozróżniania CGN-ów i komórek glejowych według ich różnych rozmiarów i kształtów. Po barwieniu liczba żywotnych neuronów i martwych neuronów jest liczona na podstawie reprezentatywnych obrazów wykonanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Duże komórki glejowe są wykluczone przez porównanie typowych CGN pobranych w trybie fluorescencyjnym z tymi pobranymi w trybie kontrastu fazowego. Podobną strategię można zastosować do pomiaru żywotności neuronów w mieszanych kulturach komórkowych zawierających neurony i komórki glejowe, takich jak pierwotne kultury korowe i hodowle hipokampa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80-23, poprawione w 1996 roku) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Ningbo (SYXK-2008-0110).

1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych

Uwaga: Odczynniki i zapasy muszą być przygotowywane w sterylnych warunkach. Sterylizować przez filtrowanie za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm.

  1. Przygotować roztwór podstawowy poli-L-lizyny (PLL), dodając 5 mg PLL do 10 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Sterylizować przez filtrowanie. Porcję roztworu podstawowego PLL należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  2. Przygotować bufor Krebsa, dodając 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2PO4, 2,6 g D-glukozy i 5,94 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Roztwór buforowy Krebsa należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  3. Przygotować roztwór 3,82% Mg2SO4, dodając 3,82 g Mg2SO4 do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. RoztwórMg2SO4 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  4. Przygotować 1,2% roztwór CaCl2 dodając 1,2 g CaCl2 do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Przechowywać roztwór CaCl2 w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  5. Przygotować 2M roztwór KCl, dodając 15 g KCl do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Przechowywać roztwór KCl w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  6. Przygotować roztwór podstawowy D-glukozy, dodając 1,8 g D-glukozy do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Porcję i przechowywać roztwór D-glukozy w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  7. Przygotować roztwór podstawowy cytozyny β-D-Arabinofuranozydu (Ara-C), dodając 0,24 g Ara-C do 10 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Podwielokrotnić i przechowywać roztwór podstawowy Ara-C w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  8. Przygotuj 250 ml pożywki hodowlanej (dla 25-30 młodych) przy użyciu 25 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2,5 ml 100x glutaminy, 2,78 ml roztworu 2M KCl i 2,5 ml 100x antybiotyków w Basal Medium Eagle (BME). Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie.
  9. Przygotuj pożywkę 25K, używając 2,5 ml 100x glutaminy, 2,78 ml roztworu 2M KCl i 2,5 ml 100x antybiotyków w BME. Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie.
  10. Przygotuj pożywkę 5K, używając 2,5 ml 100x glutaminy i 2,5 ml 100x antybiotyków w BME. Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie.
    UWAGA: Pożywka hodowlana, pożywka 25K i pożywka 5K muszą być świeżo przygotowane
  11. Przygotować roztwór podstawowy FDA, dodając 5 mg FDA do 1 ml acetonu. Przechowywać roztwór podstawowy FDA w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
  12. Przygotować roztwór podstawowy PI, dodając 1 mg PI do 1 ml ddH2O. Przechowywać roztwór podstawowy PI w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  13. Przygotować roztwór podstawowy Hoechsta, dodając 5 mg Hoechst 33342 do 1 ml ddH2O. Roztwór podstawowy Hoechst należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.

2. Przygotowanie roztworów preparacyjnych

UWAGA: Zrób to 1 dzień przed sekcją.

  1. Przygotować roztwór preparacyjny, dodając 15 ml buforu Krebsa, 1,2 ml 3,82% roztworu 2SO4 i 0,45 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 150mlddH2O. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH.
  2. Oznacz 5 probówek po 50 ml w następujący sposób: 1, 2, 3, 4 i 5.
  3. Umieścić 40 ml roztworu preparacyjnego w strzykawce o pojemności 50 ml z filtrem. Przefiltrować 30 ml roztworu rozwarstwiającego do probówki 1 i po 2 ml do kilku szalek do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm, które zostaną użyte do przetwarzania tkanek.
  4. Do probówki 2 dodać 12,5 mg trypsyny w 50 ml roztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.
  5. Do probówki 3 dodać 1,2 mg DNAzy I, 7,8 mg inhibitora trypsyny sojowej i 150 μl 3,82% roztworu 2 SO4 w 15 mlroztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.
  6. Do probówki 4 dodać 5 ml roztworu z probówki 3. Dodać 10,5 ml roztworu preparacyjnego. Sterylizować przez filtrowanie.
  7. Do probówki 5 dodać 100 μl roztworu 3,82% Mg2SO4 i 15 μl 1,2% roztworu CaCl2 w 12,5 ml roztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.
  8. Przed użyciem przechowywać wszystkie probówki w temperaturze 4 °C.

3. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych

UWAGA: Zrób to 1 dzień przed sekcją.

  1. Dodać 1 ml roztworu podstawowego PLL do 100 ml ddH2O (stężenie końcowe: 5 μg/ml). Pokryj plastikowe 6-dołkowe lub 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (2 ml na dołek w przypadku 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 1 ml na dołek w przypadku 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych), dodając 5 μg/ml roztworu poli-L-lizyny.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 dzień (lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny). 1-2 godziny przed sekcją usunąć roztwór za pomocą pipety. Przemyć raz za pomocą ddH2O i wysuszyć w kapturze do hodowli komórkowych.

4. Przetwarzanie tkanek dla 8-dniowych szczurów Sprague-Dawley.

  1. Połóż naczynie o średnicy 100 mm na lodzie. Odetnij głowy szczeniętom szczura do naczynia za pomocą wysterylizowanych nożyczek.
  2. Włóż nożyczki do otworu wielkiego i odetnij dwie strony czaszki, od uszu do oczu. Podnieś czaszkę za pomocą kleszczy. Upewnij się, że cały mózg znajduje się w czaszce. Odizoluj móżdżek i umieść go w wyżej wymienionym naczyniu o średnicy 35 mm za pomocą kleszczy.
  3. Pracuj pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne za pomocą dwóch par kleszczy.
  4. Posiekaj chusteczki ostrzem. Włóż chusteczki do probówki 1. Wirować przez 5 minut przy temperaturze pokojowej i 1 500 x g.
  5. Odessać supernatant. Zachowaj pellet.
  6. Dodać roztwór z probówki 2 do osadu. Zawiesić, delikatnie potrząsając.
  7. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Delikatnie wstrząsaj co 3 minuty.
  8. Dodać roztwór z probówki 4 do tego roztworu. Wstrząsać i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g.
  9. Odessać supernatant. Zachowaj pellet.
  10. Dodać roztwór do probówki 3 w celu ponownego zawieszenia osadu.
  11. Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml. Umieść połowę komórek w każdej probówce. Pipetuj w górę i w dół 60-70 razy za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką, aby homogenizować komórki.
  12. Dodać 3 ml roztworu w probówce 5 do każdej probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw je w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką. Umieścić supernatant w nowych probówkach o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g.
  13. Odessać supernatant. Zachowaj pellet.
  14. Dodaj pożywkę hodowlaną do osadu, aby uzyskać gęstość komórek około 1,5 x 106 komórek/ml (około 100 ml na 10 młodych).
  15. Umieścić komórki na płytkach hodowlanych i hodować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

5. Dodatek Ara-C i D-glukozy podczas hodowli

  1. Po 24 godzinach dodać roztwór podstawowy Ara-C (10 μl/basenik dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 20 μl/basenik dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; końcowe stężenie: 1 mM) w celu zahamowania wzrostu komórek glejowych.
  2. W dniu 7 dodać 50 μl roztworu podstawowego D-glukozy na dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 100 μl na basenik dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 mM.

6. Podwójne barwienie FDA-PI i potrójne barwienie FDA-PI-Hoechst w hodowli CGN

  1. Przygotować roztwór roboczy FDA-PI, dodając 20 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe: 10 μg/ml) i 50 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe: 50 μg/ml) w 10 ml PBS. Wymieszaj przez wirowanie i umieść to na lodzie.
    1. Do roztworu roboczego FDA-PI-Hoechst dodać 20 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe: 10 μg/ml), 50 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe: 50 μg/ml) i 10 μl roztworu podstawowego Hoechst (stężenie końcowe: 5 μg/ml) w 10 ml PBS. Wymieszaj przez wirowanie i umieść to na lodzie.
      UWAGA: Świeżo przygotowany roztwór roboczy FDA-PI i roztwór roboczy FDA-PI-Hoechst tuż przed użyciem.
  2. Wyjąć płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora. Połóż go na lodzie.
  3. Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją zimnym PBS.
    UWAGA: Zmiana roztworu musi być wykonywana powoli i ostrożnie. Unikaj dotykania komórek końcówkami pipet.
  4. Odessać zimny PBS i zastąpić go zimnym roztworem roboczym FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst (500 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 1 ml/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych). Pozostaw na lodzie na 5 minut.
  5. Odessać roztwór roboczy FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst i dodać zimny PBS (100 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 50 μl/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych).
    UWAGA: Nie należy dopuścić do wyschnięcia komórek podczas robienia zdjęć.
  6. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stosować filtr wzbudzenia o paśmie przepustowym 450 - 490 nm. Wykrywanie emisji fluorescencji dla FDA, PI i Hoechst odpowiednio przy 520, 620 i 460 nm. W tych samych warunkach wykonaj zdjęcie w normalnym świetle, korzystając z trybu kontrastu fazowego mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: Rób zdjęcia w ciągu 15 minut po barwieniu FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst. Czas naświetlania wynosi 100-300 ms, a wzmocnienie analogowe 2,8x.

7. Ocena żywotności neuronów

  1. W przypadku podwójnego barwienia FDA-PI nałóż obrazy komórek wykrytych po przefiltrowaniu przez różne filtry fluorescencyjne, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki.
    1. Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy". Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa". Ustaw kontrast obrazów nakładki, wpisując "50" w polu "Kontrast" w sekcji "Obraz"| "Korekty" | "Jasność/Kontrast". Upewnij się, że na obrazach nakładki nie ma podwójnie dodatnich komórek FDA i PI.
  2. W przypadku potrójnego barwienia FDA-PI-Hoechst nałóż obrazy komórek wykrytych po przefiltrowaniu różnych filtrów fluorescencyjnych, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki. Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy".
    1. Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa". Przeciągnij warstwę Hoechst-dodatni na scaloną warstwę. Dostosuj krycie warstwy dodatniej Hoechst, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy". Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa".
  3. Wizualnie odróżnij duże, nieregularne komórki glejowe od CGN, porównując obrazy wykonane w trybie fluorescencyjnym z tymi wykonanymi w trybie kontrastu fazowego - komórki o średnicach trzy razy większych niż CGN są uważane za komórki glejowe i powinny być wykluczone.
  4. Policz liczbę żywotnych neuronów i martwych neuronów, odpowiednio, za pomocą wtyczki licznika komórek w programie do przetwarzania obrazów (np. ImageJ)4.
    1. W przypadku podwójnego barwienia FDA-PI należy ręcznie oznaczyć małe komórki dodatnie dla FDA jako żywotne neurony. Ręcznie oznacz komórki PI-dodatnie jako martwe neurony. W przypadku potrójnego barwienia FDA-PI-Hoechst należy ręcznie oznaczyć małe podwójnie dodatnie komórki FDA i Hoechsta jako żywotne neurony. Ręcznie oznacz podwójnie dodatnie komórki PI i Hoechst jako martwe neurony.
  5. Oblicz procent żywotności neuronów, używając następującego równania: % żywotności neuronów = [liczba żywotnych neuronów / (liczba martwych neuronów + liczba żywotnych neuronów)] x 100%. Dla każdej studzienki wybierz pięć losowych pól i uśrednij procent żywotności neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podwójne barwienie immunologiczne GAP43 (czerwony) i GFAP (zielony) użyto do analizy kształtu neuronów i komórek glejowych, odpowiednio2,5. W hodowli CGN obecne są zarówno neurony, jak i komórki glejowe. Komórki glejowe GFAP-dodatnie są duże i mają nieregularny kształt, jak wskazują strzałki na obrazach (ryc. 1). Tradycyjne testy żywotności komórek nie są w stanie odróżnić komórek glejowych od neuronów, gdy są uży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został zmodyfikowany w stosunku do procedur, które zostały opisane wcześniej 6,7. Naukowcy poświęcili czas na próby zmniejszenia wzrostu komórek nieneuronalnych poprzez poprawę warunków podczas hodowli neuronów pierwotnych in vitro8. Jednak nawet przy poprawie warunków hodowli niektóre komórki glejowe pozostają. Co więcej, komórki nieneuronalne są niezbędne w pierwotnych kulturach neuronalnych, ponieważ pomagają we wz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LY15H310007), Projektu Badań Stosowanych nad Technologią Non-Profit Prowincji Zhejiang (2016C37110), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (U1503223, 81673407), Międzynarodowego Projektu Współpracy Naukowej i Technologicznej w Ningbo (2014D10019), Zespołu ds. Innowacji Miejskich w Ningbo w dziedzinie nauk przyrodniczych i zdrowia (2015C110026), Współpracy Międzynarodowej Prowincji Guangdong Projekt Nauki i Technologii (nr 2013B051000038), Program Badań Podstawowych w Shenzhen (JCYJ20160331141459373), Program Finansowania Współpracy Technologicznej Guangdong-Hongkong (GHP/012/16GD), Rada ds. Grantów Badawczych Hongkongu (15101014), Politechnika w Hongkongu (G-YBGQ) oraz K. C. Wong Magna Fund na Uniwersytecie Ningbo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli-L-lizyna (PLL)SigmaP2636
D-glukozaSigmaG8270
Cytozyna β-D-ArabinofuranozydSigmaC1768
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10099141wysokiej jakości FBS jest niezbędny do hodowli
100x glutaminaGibco25030081
100x antybiotykiGibco15240062
Basal Medium Eagle (BME)Gibco21010046
Dioctan fluoresceiny (FDA)SigmaF7378
Jodek propidyny (PI)SigmaP4170
Hoechst 33342Yesen40731ES10
królik Przeciwciało anty-GAP43Abcamab75810
mysie przeciwciało anty-GFAPSygnalizacja komórkowa3670
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sangon BiotechA602440
TrypsynaSigmaT4665
DNAzySigmaD5025
Inhibitor trypsyny sojowejSigmaT9003
Pipeta PasteuraVolacZ310727spalić końcówkę przed używać
12-dołkowych płytek do hodowli komórkowychTPPZ707783
6-dołkowych płytek do hodowli komórkowychTPPZ707759wysokiej jakości płytka do hodowli komórkowej jest niezbędna do hodowli
FiltrPipeta MilliporeSLGP033RB
5 mlExcell BioCS017-0003
Pipeta 10 mlExcell BioCS017-0004
Rozkrój mikroskopSzanghaj CaikangXTL2400
CO2 InkubatorThermo Scientific311
Mikroskop fluorescencyjnyNikonTI-S
Filtr fluorescencyjny i kostki emmisyjneNikonB-2A, G-2A, UV-2A
Oprogramowanie fotograficzneNikonNIS-Elements
Edytor graficzny softewareAdobePhotoshop CS
Oprogramowanie do przetwarzania obrazówNIHImageJ

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983(2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572(2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990(2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143(2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena ywotno ci neuron wbarwienie fluorescein diacetykiembarwienie jodkiem propidynywykluczanie kom rek glejowychmikroskopia fluorescencyjnapodw jne barwienie FDA PIbarwienie DNA barwnikiem Hoechstpomiar ywotno ci kom rekpierwotna kultura neuron w

Powiązane artykuły