Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56067

⸱

29 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3The Department of Medicine, Section of Rheumatology, The Knapp Center for Lupus and Immunology Research, The University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Streszczenie

Wirusy grypy wykazują niezwykłą zdolność do adaptacji i unikania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednym ze sposobów są zmiany antygenowe, które zachodzą na powierzchni glikoprotein wirusa. Generowanie wariantów ucieczki jest potężną metodą w wyjaśnianiu, w jaki sposób wirusy unikają wykrycia immunologicznego i w identyfikacji krytycznych pozostałości wymaganych do wiązania przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół generowania wariantów ucieczki wirusa grypy A za pomocą ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych przeciwko wirusowej hemaglutyniny (HA). Korzystając z naszej techniki, wcześniej scharakteryzowaliśmy krytyczne reszty wymagane do wiązania przeciwciał skierowanych przeciwko głowie lub łodydze nowego ptasiego H7N9 HA. Protokół można łatwo dostosować do innych systemów antywirusowych. Analizy wariantów ucieczki są ważne dla modelowania dryfu antygenowego, określania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) nadających oporność i przydatność wirusa, a także w projektowaniu szczepionek i/lub środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Podobnie jak inne wirusy RNA, wirusy grypy A posiadają podatną na błędy polimerazę, która pozwala na generowanie wielu wariantów antygenowych w każdej rundzie replikacji1,2,3. Wirus grypy A ma zadziwiającą zdolność adaptacji i unikania ludzkiej odpowiedzi immunologicznej poprzez dryf antygenowy, co osiąga się poprzez akumulację mutacji na powierzchni glikoprotein, co prowadzi do utraty wiązania przeciwciał. Dryf antygenowy glikoprotein powierzchniowych wirusa, HA i neuraminidazy (NA), wymaga corocznej zmiany składu i podawania szczepionki.

Postęp technologiczny w izolacji i generowaniu przeciwciał specyficznych dla antygenu zaowocował dużą liczbą przeciwciał mAb wywołanych szczepionką4,5,6,7,8. Z kolei charakterystyka epitopów mAb, które szeroko neutralizują wirusy grypy A, znacznie pomogła w opracowaniu kilku uniwersalnych kandydatów na szczepionki przeciw grypie9,10,11,12,13,14. Wyjaśnienie śladu antygenowego mAb ujawnia strukturalne uwarunkowania neutralizacji i pozwala na świadome podejście do projektowania szczepionek. Jednak nie jest ani realistyczne, ani opłacalne, aby laboratoria strukturalnie charakteryzowały rozległe panele mAb za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej w celu mapowania epitopów na antygenie wirusowym 15,16,17,18.

Krystalografia rentgenowska lub mikroskopia krioelektronowa wymagają drogiego sprzętu, specjalistycznych technik i potencjalnie dużej ilości czasu na generowanie danych. Alternatywnym i szybszym podejściem jest wykorzystanie szybkiego generowania zróżnicowanych populacji wirusów za pomocą podatnej na błędy polimerazy RNA zależnej od RNA do generowania mutantów ucieczki w celu określenia epitopów mAbs19,20,21,22,23. Generowanie wariantów ucieczkowych nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani techniki i może być wykonywane przy użyciu konwencjonalnych odczynników i sprzętu laboratoryjnego.

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na mapowanie krytycznych pozostałości wymaganych do wiązania mAb, które rozpoznają wirusa grypy.

Protokół

UWAGA: Liczne wirusy grypy krążące w populacji ludzkiej (np. H1, H3) są patogenami klasy 2 poziomu bezpieczeństwa biologicznego, z którymi należy obchodzić się ostrożnie i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej. Praca z wirusami musi zostać zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną w Mount Sinai.

UWAGA: Przeciwciała specyficzne dla HA, które hamują replikację wirusa, można ogólnie podzielić na: i) te, które wiążą się w obrębie lub w sąsiedztwie miejsca wiązania receptora na szczycie globularnej głowy oraz ii) te, które wiążą się w obszarze dystalnym względem domeny wiążącej receptor, co obejmuje boczną stronę globularnej głowy oraz region łodyżki HA. Przeciwciała celujące w miejsce wiązania receptora zapobiegają angażowaniu motywów kwasu sialowego na powierzchni komórek docelowych i mogą być mierzone za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HI). Przeciwciała HI-ujemne, takie jak przeciwciała specyficzne dla łodyżki, mogą nadal hamować replikację wirusa, jednak można je ocenić wyłącznie za pomocą testów neutralizacji.

1. Kategoryzacja przeciwciał na podstawie aktywności HI i neutralizującej

  1. Test HI
    1. Do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodać 25 µL 1x PBS do kolumn od 2 do 12.
    2. Przecież mAb 7B2 (specyficzne dla głowy), 6F12 (specyficzne dla trzonu)23 oraz kontrolę izotypową do stężenia 100 µg/mL w 1x PBS, a następnie nanieść 50 µL rozcieńczonych preparatów przeciwciał do kolumny 1. Należy również uwzględnić kontrolę bez mAb, dodając 50 µL 1x PBS (Rysunek 1A).
    3. Wykonać 2-krotne rozcieńczenia seryjne przeciwciał poprzez przenoszenie 25 µL z kolumny 1 do kolumny 2 i tak dalej. Odrzucić ostatnie 25 µL z kolumny 12 (Rysunek 1A).
      UWAGA: Należy pamiętać o uwzględnieniu rzędu kontroli bez przeciwciał.
    4. Rozcieńczyć zapas wirusa (wirus reasortant wykazujący HA i NA A/California/04/09 z segmentami wewnętrznymi A/Puerto Rico/8/34) do 8 jednostek hemaglutynacji/25 µL rozcieńczonego zapasu wirusa. Dodać 25 µL rozcieńczonego zapasu wirusa (8 jednostek hemaglutynacji) do każdego dołka (rzędy A do G).
      UWAGA: Mieszanina przeciwciała i wirusa powinna mieć objętość końcową 50 µL z początkowym stężeniem końcowym 50 µg/mL.
    5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 45 min.
    6. Dla rzędu miareczkowania zwrotnego (H) dodać 50 µL 1x PBS do dołków od H2 do H12. Dodać 100 µL roztworu 8 jednostek hemaglutynacji/25 µL do dołka H1. Wykonać rozcieńczenie seryjne dwukrotne, przenosząc 50 µL z H1 do H2 i tak dalej. Odrzucić ostatnie 50 µL z dołka H12. Na koniec dodać 50 µL 0,5% zawiesiny erytrocytów kurzych (RBC) do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.
      UWAGA: Próbki mAb w teście powinny mieć objętość końcową 100 µL: mAb (25 µL), wirus (25 µL) i RBC (50 µL). Objętość końcowa kontroli bez mAb powinna zawierać 25 µL 1x PBS, 25 µL wirusa i 50 µL RBC.
    7. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 h.
    8. Odczytać wizualnie płytki pod kątem aktywności HI. Jeśli odczyt dla konkretnego przeciwciała jest dodatni, przejść do kroku 2.1 w celu wygenerowania wariantów ucieczki. Jeśli przeciwciało jest HI-ujemne, przejść poniżej do kroku 1.2, aby ocenić, czy przeciwciało wykazuje aktywność neutralizującą w teście na hodowli komórkowej.
      UWAGA: Dodatni odczyt mAb aktywnego w teście HI objawia się ciemnoczerwonym osadem RBC w centrum dołka (Rysunek 1B; 7B2), który utworzy kształt kropli, gdy płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery V zostanie trzymana pod kątem 45°. Odczyt ujemny nie utworzy ciemnoczerwonego osadu RBC w dołku (Rysunek 1B; 6F12 oraz kontrola bez mAb). Kontrola izotypowa również nie utworzy ciemnoczerwonego osadu RBC i powinna wyglądać identycznie jak przeciwciało specyficzne dla trzonu 6F12 lub próbka kontrolna bez mAb (Rysunek 1B)23.
  2. Test mikroneutralizacji
    1. Wysiać komórki nerki psa rasy Madin Darby (MDCK) z gęstością 2 x 104 komórek/dołek na płytce 96-dołkowej traktowanej do hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 17 do 19 h.
      UWAGA: Komórkom można również pozwolić na przywieranie do dna dołka przez minimum 4 h przed użyciem.
    2. Na oddzielnej płytce 96-dołkowej wykonać siedem 3-krotnych rozcieńczeń seryjnych ludzkich mAb 4D055, CR911417 lub kontroli IgG izotypowej, przy stężeniu początkowym 200 µg/mL w 1X Minimal Essential Medium (MEM) uzupełnionym trypsyną traktowaną tosylfenyloalanilochlorometyloketonem (TPCK) (1 µg/mL) (Rysunek 2).
      UWAGA: Rząd A powinien zawierać 75 µL rozcieńczonego przeciwciała (stężenie początkowe 200 µg/mL). Rozcieńczać seryjnie (3-krotnie) w dół płytki, przenosząc 25 µL z rzędu A do rzędu B i tak dalej. Rzędy od A do H powinny mieć objętość końcową 50 µL. Nie ma potrzeby zmiany końcówek między przeniesieniami rozcieńczeń.
    3. Rozcieńczyć zapas wirusa (wirus reasortant wykazujący HA i NA A/Shanghai/1/13 z segmentem wewnętrznym A/Puerto Rico/8/34) do 100 50% zakaźnej dawki tkankowej (TCID50)/50 µL w 1x MEM uzupełnionym trypsyną traktowaną TPCK (1 µg/mL)24. Dodać 50 µL/dołek rozcieńczonego wirusa do preparatów przeciwciał (krok 1.2.2). Dodać 50 µL 1X MEM do dołków kontrolnych z niezinfekowanymi komórkami.
    4. Inkubować mieszaniny wirus-przeciwciało w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2) przez 1 h.
      UWAGA: Mieszaniny wirus-przeciwciało powinny mieć całkowitą objętość 100 µL: 50 µL rozcieńczenia przeciwciała (krok 1.1.2) i 50 µL wirusa zawierającego 100 TCID50 (krok 1.2.3).
    5. Odssać medium z dołków i dodać całe 100 µL mieszanin wirus-przeciwciało do odpowiadających im dołków.
      UWAGA: Odsysanie wykonuje się za pomocą 8-kanałowego adaptera aspiratora podłączonego do próżni. Alternatywnie można użyć 8- lub 12-kanałowej mikropipety wielokanałowej do ręcznego odsysania. Wszystkie operacje odsysania podczas usuwania inokulum lub przemywania wykonuje się od najwyższego do najniższego stężenia przeciwciała, bez konieczności zmiany końcówek.
    6. Przemyć monowarstwę 200 µL 1x PBS. Odssać 200 µL 1x PBS (jak w kroku 1.2.5). Powtórzyć przemywanie jeszcze raz, aby w sumie wykonać dwa przemycia.
    7. Zainfekować monowarstwę komórek MDCK, dodając całe 100 µL/dołek mieszanin wirus-przeciwciało (z kroku 1.2.4) na monowarstwę i inkubować/zainfekować w temperaturze 37 °C (z 5% CO2) przez 1 h.
    8. Podczas infekcji, na oddzielnej płytce 96-dołkowej, przygotować kolejny zestaw rozcieńczeń przeciwciał. Dodać 150 µL przeciwciała o stężeniu 100 µg/mL w rzędzie A oraz 100 µL 1x MEM uzupełnionego trypsyną traktowaną TPCK (1 µg/mL) w rzędach od B do H. Wykonać 3-krotne rozcieńczenia, przenosząc 50 µL z rzędu A do rzędu B i tak dalej, aż do rzędu H. Odrzucić ostatnie 50 µL z rzędu H. Całkowita objętość dla każdego dołka powinna wynosić 100 µL. Odstawić.
      UWAGA: Przeciwciała są rozcieńczane w 1x MEM uzupełnionym trypsyną traktowaną TPCK (1 µg/mL).
    9. Odssać inokulum wirus-przeciwciało z monowarstwy z kroku 1.2.7 i uzupełnić całą objętością 100 µL/dołek odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciała przygotowanego w kroku 1.2.8.
      UWAGA: Jeśli dołek zawierał końcowe stężenie przeciwciała 100 µg/mL podczas infekcji (krok 1.2.7), to medium uzupełniające powinno również zawierać końcowe stężenie przeciwciała 100 µg/mL (krok 1.2.8).
    10. Inkubować przez 24 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2).
    11. Odssać medium z płytek 96-dołkowych i przemyć 200 µL/dołek 1x PBS trzy razy.
    12. Utrwalić komórki 100 µL zimnego 80% acetonu przez 1 h w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwór 80% acetonu jest rozcieńczany w podwójnie destylowanej (dd) H2O (np. 80 mL 100% acetonu plus 20 mL ddH2O). Roztwór 80% acetonu można schłodzić na lodzie przed użyciem.
    13. Przemyć komórki 200 µL/dołek 1X PBS trzy razy.
    14. Zablokować płytki za pomocą 200 µL/dołek 5% mleka rozcieńczonego w 1X PBS i inkubować płytki w RT przez 1 h.
    15. Dodać 100 µL biotynilowanego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko nukleoproteinie (NP) wirusa grypy A, rozcieńczonego 1:2 000 w 1x PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować płytki w RT przez 1 h.
      UWAGA: W przypadku wirusów grypy B należy użyć przeciwciała anty-NP specyficznego dla wirusa grypy B.
    16. Przemyć płytki 1x PBS trzy razy.
    17. Dodać 100 µL przeciwciała sprzężonego z streptawidyną i peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonego 1:3 000 w 1x PBS/1% BSA i inkubować płytki w RT przez 1 h.
    18. Przemyć płytki 200 µL 1x PBS trzy razy.
    19. Dodać odczynnik substratowy HRP w ilości 100 µL/dołek i inkubować w ciemności w RT.
      UWAGA: Czas inkubacji należy zoptymalizować przed dodaniem kwaśnego buforu zatrzymującego (poniżej). Zazwyczaj wystarcza 15 do 30 min.
    20. Zatrzymać reakcję za pomocą 50 µL/dołek 5 M HCl.
      OSTROŻNIE: 5 M HCl jest silnie żrącym odczynnikiem, który może spowodować uszkodzenie oczu, skóry i błon śluzowych. Dodawanie tego odczynnika powinno odbywać się pod dygestorium przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
    21. Odczytać płytki przy 492 nm i odjąć tło z dołków z niezinfekowanymi komórkami.
    22. Obliczyć procent inhibicji za pomocą następującego wzoru:
      Wzór na procent inhibicji; analiza danych z badań wirusologicznych, zastosowanie edukacyjne.
    23. Jeśli przeciwciało wykazuje aktywność neutralizującą (i brak aktywności HI), przejść do kroku 2.2.
      UWAGA: Przeciwciała pozbawione aktywności neutralizującej in vitro będą pozbawione aktywności HI.

2. Generowanie wariantów mutantów ucieczki

UWAGA: Przeciwciała neutralizujące, które wykazują lub nie wykazują aktywności HI, są poddawane dalszej analizie zgodnie ze szczegółowymi protokołami opisanymi poniżej.

  1. Protokół 1: Przeciwciała HI-dodatnie/neutralizacyjne-dodatnie (Rycina 3A)
    1. Przygotować stok wirusa o mianie 106 jednostek tworzących plaki na mililitr (PFU/mL) w 1x PBS w objętości 400 µL.
    2. Przygotować cztery rozcieńczenia badanego przeciwciała w rosnących stężeniach (np. 0, 0,5, 0,05 i 0,005 mg/mL) w 1x PBS w objętości 100 µL na każde rozcieńczenie.
      UWAGA: Wirus typu dzikiego powinien być zawsze pasażowany równolegle i w obecności przeciwciała. Sekwencje tych pasażowanych wirusów pomogą odróżnić adaptację do warunków hodowli komórkowej od mutacji ucieczki.
    3. Wymieszać 100 µL wirusa o mianie 106 PFU/mL ze 100 µL każdego rozcieńczenia przeciwciała lub ze 100 µL 1x PBS.
    4. Inkubować przez 1 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2). Krótko wymieszać wirówkowo. Wstrzyknąć 200 µL każdej mieszaniny do zarodkowych jaj kurzych wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
    5. Inkubować jaja w temperaturze 37 °C (bez CO2) przez 40-44 h.
    6. Uśmiercić zainfekowane wirusem zarodki jaj poprzez inkubację w temperaturze 4 °C przez minimum 6 h.
    7. Zebrać płyn allantoisowy z jaj, zgodnie z wcześniejszym opisem24,25.
    8. Wykonać test hemaglutynacji, zgodnie z powyższym opisem24,26. Jeśli w żadnych preparatach płynu allantoisowego nie stwierdzono mian hemaglutynacji, powtórzyć procedurę od kroku 2, stosując rozcieńczenia przeciwciała w zakresie od 0,005 mg/mL do 0,00005 mg/mL.
      UWAGA: Nasycające stężenie przeciwciała HI-dodatniego może zneutralizować wszystkie obecne cząsteczki wirusa. W związku z tym może być konieczne zmniejszenie ilości przeciwciała stosowanego podczas pasażowania.
    9. Potwierdzić obecność wariantów ucieczki, wykonując test HI24 (krok 1.1).
      UWAGA: Przeciwciała aktywne w teście HI blokują wiązanie HA z motywami kwasu sialowego na komórkach docelowych. W związku z tym wirus w obecności odpowiadającego mu przeciwciała traci zdolność do aglutynacji erytrocytów (obecność osadu erytrocytów). Teoretycznie warianty ucieczki przeciwciał aktywnych w teście HI mogą nadal wiązać motywy kwasu sialowego nawet w obecności odpowiadającego im przeciwciała, a zatem mogą aglutynować erytrocyty (brak osadu erytrocytów). Jeśli HI badanego przeciwciała jest nadal wykrywalne, powtórzyć protokół od kroku 2.1.2 z wyższym stężeniem początkowym przeciwciała.
  2. Protokół 2: Przeciwciała HI-ujemne/neutralizacyjne-dodatnie (Rycina 3B)
    UWAGA: Aby wygenerować warianty ucieczki przeciwko przeciwciałom neutralizującym, które nie wykazują aktywności HI, wirus musi być pasażowany w obecności rosnących ilości przeciwciała.
    1. Wysiać komórki MDCK na płytkę 6-dołkową w gęstości 1 x 106 komórek/dołek i inkubować przez minimum 4 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2).
    2. Rozcieńczyć stok wirusa do 106 PFU/mL lub wirusa z poprzedniego pasażu w 1x MEM z trypsyną traktowaną TPCK (1 µg/mL) w objętości 500 µL.
    3. Przygotować pojedyncze rozcieńczenie przeciwciała (0,02 mg/mL dla pasażu pierwotnego lub wyższe dla wszystkich kolejnych pasaży) w 1x MEM z trypsyną traktowaną TPCK w objętości 250 µL.
    4. Wymieszać 250 µL rozcieńczonego wirusa z 250 µL rozcieńczonego przeciwciała (+przeciwciało) lub z 250 µL 1x MEM (kontrola bez przeciwciała).
    5. Inkubować mieszaninę wirusa i przeciwciała przez 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2).
    6. Odssać medium za pomocą szklanej pipety Pasteura i przemyć monowarstwę komórek 1 mL 1X PBS.
    7. Dodać 500 µL mieszanin do dołków i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2) przez 1 h.
    8. Po 1 h uzupełnić dołki 2 mL 1x MEM z trypsyną traktowaną TPCK (1 µg/mL).
    9. Sprawdzić komórki 48 h po infekcji pod kątem objawów efektu cytopatycznego (CPE) pod mikroskopem lub wykonać test hemaglutynacji w celu wykrycia wzrostu wirusa26.
    10. W przypadku wystąpienia wyraźnego CPE w kulturach uzupełnionych przeciwciałem, zebrać nadsącz do wielu probówek kriogenicznych, opisać numerem pasażu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    11. Zachować 100 µL nadsączu do zainfekowania nowej monowarstwy komórek MDCK w 2 mL 1x MEM uzupełnionego trypsyną TPCK i przeciwciałem. Należy pamiętać o dołączeniu kontroli bez przeciwciała dla każdego pasażu.
      UWAGA: Zwiększyć stężenie przeciwciała dwukrotnie (lub według uznania badacza) w kolejnym pasażu (co dwa dni).
    12. Zwiększać stężenie przeciwciała w każdym kolejnym pasażu, aż wzrost wirusa będzie nadal możliwy nawet przy końcowym stężeniu przeciwciała 0,6 mg/mL. Zamrozić wiele fiolek nadsączu z każdego pasażu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Kontrola bez przeciwciała jest kluczowa dla weryfikacji wzrostu wirusa z pasażu na pasaż. Jeśli w kontroli bez przeciwciała występuje wyraźne CPE, a w grupie +przeciwciało brak CPE, oznacza to, że stężenie przeciwciała było zbyt wysokie i nie wygenerowano wariantów ucieczki. Jeśli w kontroli bez przeciwciała występuje wyraźne CPE, a w grupie +przeciwciało jedynie umiarkowane CPE, wskazuje to na obecność potencjalnych wariantów ucieczki. W kolejnym pasażu zwiększyć objętość pasażu do 200 µL nadsączu i utrzymać stężenie przeciwciała, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wygenerowania wariantów ucieczki.

3. Izolacja wariantów ucieczki poprzez oczyszczanie plackowe

  1. Wysiać komórki MDCK na płytkę 6-dołkową z gęstością 1 x 106 komórek/dołek i inkubować przez minimum 4 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2).
  2. Rozcieńczyć przeciwciała w 1x MEM z trypsyną traktowaną TPCK, zaczynając od stężenia 300 µg/mL w objętości 250 µL, a następnie zmieszać z 250 µL odpowiedniego wirusa mutantu ucieczki. Wirus pasażowany w obecności przeciwciał również powinien zostać oczyszczony metodą płytek.
  3. Odssać medium z komórek, przemyć 1x PBS trzy razy i dodać całe 500 µL mieszaniny wirus-przeciwciało (krok 3.2).
  4. Inkubować płytki przez 1 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2), pamiętając o delikatnym kołysaniu płytką co 10 min, aby zapobiec wysychaniu monowarstwy.
  5. Odssać mieszaniny wirus-przeciwciało i uzupełnić dołki medium z agarem nakładkowym zawierającym odpowiednie ilości przeciwciał (300 µg/mL; krok 3.2).
  6. Inkubować płytkę przez 40-44 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (z 5% CO2).
  7. Obrysować widoczne płytki niebieskim lub czarnym markerem, aby ułatwić ich pobieranie.
  8. Pobrać cztery płytki dla każdej kombinacji wirusa mutantu ucieczki i przeciwciała, a także wirusy typu dzikiego, które były pasażowane w komórkach MDCK lub jajach w obecności przeciwciał.
  9. Resuspendować płytkę w 100 µL 1x PBS.
  10. Wstrzyknąć całe 100 µL oczyszczonego metodą płytek wirusa mutantu ucieczki do 10-dniowych SPF zapłodnionych jaj kurzych.
  11. Inkubować jaja przez 40-44 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (bez 5% CO2).
  12. Przeprowadzić test hemaglutynacji w celu potwierdzenia obecności wirusa (krok 1.1).

4. Izolacja wirusowego RNA i analiza zmienności sekwencji HA

  1. Wyizolować viralne RNA z 200 µL płynu alantoicznego wirusa z mutacją ucieczki, stosując jednofazowy roztwór fenolu i izotiocyjanianu guanidyny.
    OSTRZEŻENIE: Fenol jest lotnym odczynnikiem w formie cieczy, który może powodować kaszel, duszności oraz umiarkowane podrażnienie skóry w przypadku kontaktu.
  2. Amplifikować segment HA z viralnego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy oraz starterów specyficznych dla segmentu HA grypy A27.
    UWAGA: Uniwersalne startery dla wirusów grypy B opisane w Tabeli 2 amplifikują zarówno HA (~1,800 bp), jak i NA (~ 1,500 bp)28.
  3. Rozdzielić produkt RT-PCR w 1% żelu agarozowym i wyciąć prążek o prawidłowej wielkości (~1,800 bp).
  4. Wyizolować produkt PCR z żelu, stosując procedurę oczyszczania opartą na membranie krzemionkowej, a następnie przekazać cDNA do sekwencjonowania.
  5. Zidentyfikować resztę aminokwasową niezbędną do wiązania przeciwciał poprzez odróżnienie mutacji znalezionych w domniemanych wariantach ucieczki od mutacji w pasażowanym wirusie typu dzikiego, wynikających z adaptacji do hodowli komórkowej lub selekcji immunologicznej.
  6. Sklonować produkt PCR zawierający HA typu dzikiego lub wariantu ucieczki do wektora ekspresyjnego pCAGGs (NotI i NheI).
  7. Wiązanie przeciwciała z HA wariantu ucieczki można ocenić za pomocą jednej z dwóch opisanych poniżej opcji (lub obu).

5. Analizy wiązania przeciwciał do wariantów ucieczki

  1. Immunofluorescencja
    1. Wysiać komórki 293T z gęstością 2 x 104 komórek/dołek na płytce 96-dołkowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C (przy 5% CO2) przez 24 h.
    2. Przeprowadzić transfekcję komórek plazmidami pCAGGS kodującymi mutant ucieczki HA, HA z pasażowanego wirusa oraz HA typu dzikiego (niepasażowanego) w ilości 0,10 µg/dołek, przy użyciu odczynnika do transfekcji.
    3. Inkubować płytki 96-dołkowe przez 48 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C (przy 5% CO2).
    4. Utrwalić 100 µL 0,5% paraformaldehydu przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest lotnym odczynnikiem w formie cieczy, który może powodować kaszel, duszności i umiarkowane podrażnienie skóry w przypadku kontaktu. Został on uznany za potencjalny kancerogen ludzki. Dodawanie odczynnika należy przeprowadzać w wentylowanym dygestorium chemicznym.
    5. Przemyć trzy razy PBS 1x. Zablokować 5% mlekiem w 1x PBS przez 1 h w RT.
    6. Przemyć trzy razy 1x PBS. Inkubować z przeciwciałami docelowymi w stężeniu 5 µg/mL przez 1 h w RT.
    7. Inkubować z 100 µL przeciwciała wtórnego (anty-ludzkiego lub anty-mysiego Alexa 488) w rozcieńczeniu 1:2000 w 1x PBS/1% BSA przez 1 h w RT w ciemności.
    8. Przemyć trzy razy 1x PBS. Obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem obecności barwienia pozytywnego lub negatywnego.
  2. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
    1. Wysiać komórki 293T z gęstością 2 x 105 komórek/dołek na płytce 6-dołkowej i inkubować w 37 °C (przy 5% CO2) przez 24 h.
    2. Przeprowadzić transfekcję komórek plazmidami pCAGGS kodującymi mutant ucieczki HA, HA z pasażowanego wirusa oraz HA typu dzikiego w ilości 0,50 µg/dołek, przy użyciu odczynnika do transfekcji.
    3. Inkubować płytki 6-dołkowe przez 48 h w 37 °C (przy 5% CO2).
    4. Po 48 h odessać pożywkę wzrostową i przemyć delikatnie dwa razy 1x PBS (dbając o to, aby nie naruszyć monowarstwy).
    5. Zebrać transfektowane komórki 293T za pomocą 500 µL buforu FACS (1x PBS/2% płodowej surowicy cielęcej).
      UWAGA: Bufor FACS powinien być schłodzony do 4 ºC przed użyciem.
    6. Odwirować zebrane komórki 293T przy 300 x g przez 5 min w 4 °C.
    7. Odessać bufor FACS i resuspendować w 200 µL buforu FACS zawierającego przeciwciała mAb w stężeniu docelowym od 1 do 5 µg/mL. Inkubować w RT przez 20 min.
    8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min w 4 °C. Przemyć dwa razy 500 µL buforu FACS. Odessać ostrożnie szklaną pipetą Pasteura, aby nie naruszyć osadu.
    9. Resuspendować w 200 µL buforu FACS zawierającego przeciwciało wtórne sprzężone z Alexa 488 (rozcieńczenie końcowe 1:1000). Inkubować w ciemności w 4 °C przez 20 min.
    10. Odwirować komórki przy 300 g przez 5 min w 4 °C. Przemyć dwa razy 500 µL buforu FACS i ostrożnie odessać bufor płuczący.
    11. Resuspendować w 500 µL buforu FACS i ocenić za pomocą FACS wiązanie przeciwciał mAb i/lub surowic poliklonalnych do komórek transfektowanych HA.
      UWAGA: Pamiętać o uwzględnieniu w eksperymencie kontroli bez przeciwciał mAb/surowic poliklonalnych oraz próbki nietransfektowanej.

Wyniki

Wcześniej stosowaliśmy modyfikacje tej metody do generowania wariantów ucieczki od ludzkich i mysich mAbs indukowanych przez sezonową szczepionkę przeciwko wirusowi grypy, szczepienie H7N9 lub sekwencyjne szczepienie DNA/rekombinowanym białkiem HA4,5,6,7. Jak opisano powyżej, przeciwciała scharakteryzowano najpierw za pomocą testów HI oraz mikroneutralizacji, aby ustalić, który konkretny protokół należy zastosować w dalszej kolejności4,5. Stwierdzono, że przeciwciała 07-5D03, 07-5F01, 07-5G01, 07-4B03, 07-4E02 i 07-4D05 wykazują aktywność HI i neutralizacyjną przeciwko ptasiemu wirusowi H7N9 (A/Shanghai/1/2013) (Tabela 1), w związku z czym wykorzystano protokół 1 (krok 2.1). W przypadku mAbs neutralizujących, które nie wykazują aktywności HI, takich jak 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 i S6-B01 (Tabela 1), do generowania wariantów ucieczki zastosowano protokół 2 (krok 2.2). Mapowanie mutantów ucieczki wykazało, że wiele przeciwciał rozpoznaje krytyczne reszty w różnych miejscach wirusowego HA4,5 (Rycina 4). Podczas gdy większość przeciwciał HI-dodatnich posiada reszty mutantów ucieczki w pobliżu wcześniej opisanych miejsc antygenowych H7 HA, przeciwciała HI-ujemne wygenerowały mutanty ucieczki z mutacjami punktowymi w regionie trzonka4,5.

PrzeciwciałoAktywność HIaktywność NEUT
07-5D03++
07-5F01++
07-5G01++
07-4B03++
07-4E02++
07-4D05++
41-5E04-+
045-051310-2B06-+
042-100809-2F04-+
S6-B01-+

Tabela 1: Tabela aktywności HI i neutralizacyjnej przeciwciał. Dziesięć specyficznych dla H7 przeciwciał monoklonalnych (mAbs), wyizolowanych od osób zaszczepionych eksperymentalną szczepionką przeciw H7N9, wykazuje różną aktywność przeciwwirusową in vitro5.

Starter forward (5' do 3')Starter odwrotny (5' do 3')Warunki termocyklera
IAVTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT42 ºC przez 60 min, 94 ºC przez 2 min/5 cykli: 94 ºC przez 20 s, 50 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s, a następnie 40 cykli: 94 ºC przez 20 s, 58 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s z końcową elongacją w temperaturze 68 ºC przez 10 min
IBVGGGGGGAGCAGAAGCAGAGCCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC45 ºC przez 60 min, 55 ºC przez 30 min, 94 ºC przez 2 min/5 cykli: 94 ºC przez 20 s, 40 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s, a następnie 40 cykli: 94 ºC przez 20 s, 58 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s z końcową elongacją w 68 ºC przez 10 min

Tabela 2: Uniwersalne startery do wirusa grypy. Pary starterów do amplifikacji segmentów HA wirusów grypy A27 i B28 oraz odpowiadające im warunki termocyklera.

Test inhibicji hemaglutynacji; miareczkowanie przeciwciał; schemat mikropłytki; wyniki serii rozcieńczeń.
Rycina 1: Test HI. (A) Schemat przygotowania testu HI w celu sprawdzenia aktywności dwóch mysich przeciwciał mAb specyficznych dla H1: 7B2 (specyficznych dla głowy) i 6F12 (specyficznych dla trzonu) z użyciem płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V oraz (B) przykład wyników testu HI23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat testu mikroneutralizacji przedstawiający 3-krotne rozcieńczenie przeciwciał 4D05, CR9114; analiza wirusa.
Rycina 2: Test mikroneutralizacji. Schemat przygotowania testu mikroneutralizacji w celu zbadania aktywności dwóch ludzkich przeciwciał monoklonalnych 4D055 oraz CR911417. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat przeciwciał hamujących hemaglutynację; interakcja wirus-przeciwciało, przedstawiono pasażowanie seryjne.
Rycina 3: Generowanie mutantów ucieczki. Sugerowana metodologia będzie zależeć od aktywności HI i mikroneutralizacyjnej wykazanej przez przeciwciało. Generowanie mutantów ucieczki przeciwko (A>) neutralizującym przeciwciałom HI-dodatnim może wymagać pojedynczego pasażowania w jajach, podczas gdy (B>) neutralizujące przeciwciała HI-ujemne mogą wymagać wielokrotnych pasaży z rosnącymi ilościami przeciwciał w hodowli tkankowej komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Diagram mutacji struktury białka wyróżniający zmiany aminokwasowe wraz z 3D modelem molekularnym.
Rycina 4: Przykład mapy epitopów nowego ptasiego HA H7N9 wygenerowanej przy użyciu wariantów mutantów ucieczki. Przeciwciała indukowane szczepionką, wyizolowane od osób zaszczepionych kandydacką szczepionką przeciwko wirusowi grypy A H7N9, zostały wykorzystane do wygenerowania wariantów mutantów ucieczki. Każdy pozostały aminokwas zaznaczony na czerwono reprezentuje miejsce krytycznych aminokwasów niezbędnych do wydajnego wiązania przeciwciała mAb. Dane zostały zaadaptowane z Dunand-Henry et al., 20154. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Chociaż większość reszt zidentyfikowanych za pomocą mutantów ucieczki była dokładna, jednym z głównych zastrzeżeń tego podejścia jest to, że mutacje punktowe wariantów ucieczki niekoniecznie muszą być mapowane w obrębie śladu molekularnego przeciwciała, jak określono na podstawie analiz strukturalnych. Wynika to ze zdolności mutacji na określonej reszcie do prowadzenia do zmiany konformacyjnej dystalnie do lokalizacji zmutowanej reszty, analogicznie do efektu allosterycznego. Innym ograniczeniem jest to, że ta metodologia może być stosowana tylko do przeciwciał neutralizujących; przeciwciała, które nie mają ciśnienia selekcyjnego in vitro , nie doprowadzą do ucieczki mutantów. Ograniczenie to można jednak przezwyciężyć za pomocą panelu wariantów ucieczki generowanych przez wcześniej scharakteryzowane przeciwciała neutralizujące. Tan i in. wykorzystali wariant ucieczki neutralizującego mAb do wirusa H7N9 do mapowania epitopu przeciwciała nieneutralizującego7.

Niemniej jednak wyjaśnienie epitopów przeciwciał poprzez generowanie wariantów ucieczki stanowi realną alternatywę dla krystalografii i mikroskopii krioelektronowej, które wymagają znacznych inwestycji w sprzęt. Inne alternatywy to określenie minimalnego regionu wiązania mAb za pomocą skanowania alaniny lub mutantów skanowania/obcinania peptydów. Skaningowa mutageneza alaninowa może wymagać znacznego nakładu pracy w celu wygenerowania dużej liczby wariantów podczas badania przesiewowego29, podczas gdy skanowanie peptydowe jest ograniczone do epitopów liniowych30. Metoda opisana w tym protokole nie wymaga specjalnego sprzętu ani techniki i w rzeczywistości wykorzystuje istniejące testy neutralizacji in vitro zmodyfikowane w celu wygenerowania wariantów ucieczki badanych przeciwciał.

Protokół generowania wariantów ucieczki, które wymagają wielu pasaży (np. przeciwciała specyficzne dla łodygi) jest w dużym stopniu zależny od początkowego stężenia przeciwciała w pasażu 0. Lepiej jest zachować ostrożność i zacząć od logarytmu do pół logarytmu niższego niż połowa maksymalnego stężenia hamującego przeciwciała i pozwolić na silny wzrost wirusa. Badacz może spekulować, że hodowla wirusa o wysokim mianie w obecności niskiego ciśnienia immunologicznego będzie miała dużą zmienność genetyczną w populacji wirusa. Warianty ucieczki można wybrać, stopniowo zwiększając stężenie przeciwciał w kolejnych przejściach. W przypadku, gdy wzrost wirusa zmniejszy się, ilość supernatantu wirusa może zostać zwiększona w następnym pasażu, przy zachowaniu tego samego stężenia przeciwciał w poprzednim pasażu.

Celem większości uniwersalnych szczepionek przeciw grypie jest wywołanie silnej odpowiedzi przeciwciał w kierunku łodygi kwasu hialuronowego. Analizy wariantów ucieczki przeciwciał specyficznych dla łodygi są ważne dla określenia związku między zdolnością wirusa grypy a ciśnieniem immunologicznym. Co ciekawe, zmutowane wirusy ucieczki wynikające z mAb specyficznych dla łodygi zostały wszystkie osłabione in vivo w mysich badaniach LD50 4. Badania te dostarczają mocnych argumentów za platformami szczepień opartymi na łodygach. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji mutantów ucieczki do innych związków przeciwwirusowych, takich jak inhibitory małocząsteczkowe. Wreszcie, metodologia ta nie ogranicza się do glikoprotein powierzchniowych wirusa grypy, ale może być również szerzej stosowana do określania epitopów innych glikoprotein wirusowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten projekt został częściowo sfinansowany z funduszy federalnych z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, na podstawie umowy CEIRS HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); oraz P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Falcon 96-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka hodowlana poddana działaniu TC z pokrywką Corning, Inc.353072Zastosowanie płytki testowej do testu mikroneutralizacji
Falcon 96-well clear V-bottom plateCorning, Inc.353263Zastosowanie płytki testowej do testu hamowania hemaglutynacji
1X Minimal Essential Medium (MEM)Gibco11095080Pożywka infekcyjna
Trypsyna poddana działaniu tozylofenyloalanylu chlorometylowego (TPCK)Sigma-AldrichT8802Rozszczepia niedojrzałe przeciwciało pierwotne anty-NP (IAV) 0 do HA1 i HA2
Biotynylowane przeciwciało anty-NP (IAV)EMD MilliporeMAB8258BPrzeciwciało, które rozpoznaje białko NP wirusów grypy A
Biotynylowane przeciwciało pierwotne anty-NP (IBV)EMD MilliporeMAB8260B-5Przeciwciało, które rozpoznaje białko NP wirusów grypy B
Przeciwciało Streptawidyna-HRPEMD Millipore18-152Jest stosowane jako przeciwciało drugorzędowe dla biotynylowanego substratu przeciwciała anty-NP
HRP (SIGMAFAST-OPD)Sigma-AldrichP9187-5SETdichlorowodorek o-fenylenodiaminy rozpuszczalny w wodzie substrat do HRP
96-dołkowa płytka V-dolnaNunc249662testowa używana do testu hemaglutynacji
Czerwone krwinki kurczakaLampire Biological Laboratories7201403Służy do oceny zdolności wirusa grypy do aglutynacji
TRIzolAmbion15596026Ekstrakcja RNA
Indeks górny IIIInvitrogen12574018z odwrotną transkryptazą
Qiagen28704Izolacja amplifikowanego produktu PCR
Lipofectamina 2000Invitrogen11668027Odczynnik do transfekcji
Anty-ludzka IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA-11013Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe dla ludzi przeciwciała
Anty-mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciał mysich
6-dołkowa mikropłytka polistyrenowaCorning, Inc.
UltraPureAgarose Invitrogen16500500
Nalgene długotrwałe przechowywanie KrioprobówkiThermoFisher Scientific5012-0020Zamrażanie reasortantu supernatantu kultur wirusowych
A/California/04/09 (H1)Palese Laboratoryreasortant wirusa eksprymującego HA i NA A/California/04/09 (H1N1) z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
reasortant A/Shanghai/1/13 (H7)Palese Laboratoryreasortant virus wykazujący ekspresję HA i NA A/Shanghai/1/13 (H7N9) z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (35%)Sigma-AldrichA7979
Zestaw do ekstracji żelu QiagenQiagen28704Oczyszczanie fragmentów DNA za pomocą membrany krzemionkowej
Płytka Zestaw do ekstrakcji żelem 353934

Bibliografia

  1. Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
  2. Nelson, M. I., Holmes, E. C. The evolution of epidemic influenza. Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).
  3. Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005(2010).
  4. Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
  5. Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
  6. Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
  7. Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578(2016).
  8. Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  9. Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
  10. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
  11. Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
  12. Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
  13. Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
  14. Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
  15. Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  16. Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  17. Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
  18. Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257(2016).
  19. Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
  20. Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
  21. Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
  22. Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
  23. Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
  24. Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
  25. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421(2015).
  26. Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057(2010).
  27. Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
  28. Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
  29. Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
  30. Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Warianty ucieczki wirusa grypyneutralizuj ce przeciwcia a monoklonalnetest hamowania hemaglutynacjitechnika pasa owania wirusahodowla kom rek MDCKzarodowane jaja kurzejednostki tworz ce plackianaliza mapowania epitop wmodelowanie dryftu antygenowegoprotok projektowania szczepionek

Powiązane artykuły