Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56203

⸱

12 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, 3Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, 4Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 5Department of Pediatrics, University of Iowa, 6Department of Neurology, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), 8Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), 9Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Streszczenie

Ludzka siatkówka składa się z neurosiatkówki czuciowej i leżącego pod nią nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), który jest mocno połączony z warstwą naczyniówki. Różne obszary siatkówki różnią się anatomicznie i molekularnie, co ułatwia unikalne funkcje i wykazuje różną podatność na choroby. Analiza proteomiczna każdego z tych regionów i warstw może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu molekularnego wielu chorób, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), cukrzycy i jaskry. Jednak oddzielenie obszarów i warstw siatkówki jest niezbędne przed przeprowadzeniem ilościowej analizy proteomicznej. W tym miejscu opisujemy metodę preparacji i pobierania obszarów dołka, plamki żółtej i obwodowej siatkówki oraz leżącego pod nimi kompleksu RPE-naczyniówka, obejmującą regionalne biopsje punktowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka. Jednowymiarowa SDS-PAGE, jak również dalsza analiza proteomiczna, taka jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS), mogą być wykorzystane do identyfikacji białek w każdej wypreparowanej warstwie siatkówki, ujawniając molekularne biomarkery choroby siatkówki.

Wprowadzenie

Siatkówka, RPE i naczyniówka to złożone tkanki, które wykazują istotne regionalne różnice w ekspresji białek, funkcjach fizjologicznych i patologicznej podatności1,2. Na przykład choroby takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i centralna retinopatia surowicza wykazują charakterystyczną lokalizację w obrębie dołka żółtego, plamki żółtej lub obwodu siatkówki1,3,4,6. W tym miejscu przedstawiamy metodę pokazującą, w jaki sposób można niezależnie pobrać próbki z różnych obszarów siatkówki. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie wiarygodnego przewodnika do pobierania próbek tkanek z dołka, plamki żółtej i obwodowych obszarów ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE do analizy proteomicznej. Uzasadnieniem dla rozwoju i stosowania tej techniki jest to, że dzięki analizie proteomicznej tych specyficznych regionów siatkówki można uzyskać ważne informacje molekularne na temat fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji tych regionów.

To podejście obiecuje odkryć proteomiczne podstawy względnej regionalnej podatności na choroby i ułatwić identyfikację nowych specyficznych celów terapeutycznych. Rzeczywiście, badania proteomiczne ciała szklistego i jego interakcji z siatkówką dostarczyły kluczowych informacji na temat składu molekularnego i funkcji zdrowej i chorej tkanki5,7,8,9,10,11,12,13. Brakuje jednak jasnych porównawczych analiz proteomicznych różnych regionów siatkówki. Technika ta pomoże wesprzeć te bardzo potrzebne badania, zapewniając przewagę nad innymi metodami, demonstrując wiarygodne i powtarzalne podejście do pobierania tkanek. Co więcej, podejście to jest bardzo przystępne, wykorzystując standardowe i łatwo dostępne narzędzia do biopsji tkankowej. Nasza technika kładzie nacisk na odpowiednie pobieranie i przechowywanie tkanek do przetwarzania proteomicznego, biorąc pod uwagę ważne czynniki dotyczące stabilności i degradacji białek. W związku z tym metoda ta jest najbardziej odpowiednia dla badaczy rozważających dalszą analizę molekularną czynników proteomicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Iowa i jest zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej.

1. Biopsja dołka i plamki żółtej

  1. Otwórz i motylkować ludzkie oko, tak aby składało się z 4 oddzielnych płatów tkanki, jak opisano w poprzedniej publikacji. 5
  2. Zaczynając od ludzkiego oka umieszczonego w kształcie matyla na szalce Petriego, wyśrodkuj 4-milimetrowe narzędzie do biopsji dziurkacza nad dołkiem środkowym, dociśnij i delikatnie przetocz, aż zostanie wykonane nacięcie wokół dołka.
  3. Następnie wygeneruj nacięcie wokół plamki żółtej, centrując i dociskając 8-milimetrowe narzędzie do biopsji skóry w arkadach plamki żółtej, wywierając delikatny nacisk i tocząc. W ten sposób powstanie drugi, zewnętrzny pierścień tkanki otaczający pierwszy.

2. Dziurkacz do biopsji siatkówki obwodowej

  1. Użyj 4-milimetrowego narzędzia do biopsji dziurkacza skóry, aby wykonać serię uderzeń w siatkówkę obwodową, tuż za arkadą. Tutaj wykonaj dwa stemple na każdą klapę ćwiartki.
    UWAGA: Po wykonaniu wszystkich ciosów, oko będzie miało dwa koncentryczne stemple w środku, reprezentujące dołek i plamkę żółtą, oraz dwa stemple u podstawy każdej klapy - w sumie 8 ciosów w siatkówkę obwodową.

3. Kolekcja biopsji dołka i plamki żółtej

  1. Ponieważ tkanka jest teraz gotowa do pobrania, należy zebrać wszystkie biopsje tkanek w oddzielnych probówkach do mikrofug i zamrozić przy użyciu ciekłego azotu do dalszego przetwarzania. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu utylizacji.
  2. Użyj zakrzywionych kleszczyków Colibri 0,12, aby chwycić krawędzie półprzezroczystej tkanki dołka siatkówkowego. Aby zebrać, podnieść i oddzielić tkankę dołka od leżącego poniżej naczyniówki RPE.
  3. Podobnie użyj kleszczyków Colibri 0,12, aby chwycić zewnętrzny pierścień półprzezroczystej tkanki plamki żółtej. Jeśli tkanka jest nadal przyczepiona do tkanki leżącej pod spodem lub sąsiedniej, użyj nożyczek Westcotta, aby ostrożnie przyciąć krawędź, chwytając tylko element siatkówki i wycinając tkankę nerwu wzrokowego zawartą w stemplu.

4. Kolekcja siatkówki peryferyjnej

  1. Użyj zakrzywionych kleszczyków Colibri 0,12, aby delikatnie oddzielić krążki obwodowej tkanki siatkówki od leżącego poniżej naczyniówki RPE i umieścić w indywidualnych probówkach do mikrofugi.
  2. W przypadku resztkowego żelu szklistego należy użyć kleszczyków, aby podnieść i oddzielić żel tak bardzo, jak to możliwe przed pobraniem tkanki siatkówki. Po usunięciu siatkówki pigmentowany naczyniówka RPE pozostaje poniżej.

5. Kolekcja dołka i plamki żółtej RPE-Naczyniówka

  1. Użyj kleszczyków Colibri 0,12, aby chwycić krawędzie ciemnej tkanki naczyniówkowej RPE, która znajduje się pod obszarem usuniętego dołka środkowego. Ostrożnie oddziel tę tkankę od twardówki i zbierz.
  2. Za pomocą tych samych kleszczy chwyć krawędzie zewnętrznego pierścienia ciemnej tkanki naczyniówki RPE leżącej pod usuniętym obszarem plamki żółtej. Ostrożnie oddziel tę tkankę od twardówki, chwytając krawędzie w różnych punktach wokół pierścienia i lekko pociągając. W końcu pierścień tkanki naczyniówki RPE zostanie przemieszczony i może zostać pobrany.
    UWAGA: Kleszcze wtórne w przeciwnej ręce mogą być pomocne w manipulowaniu tkanką naczyniówki RPE podczas usuwania. Podobnie jak tkanka siatkówki, nożyczki Wescott mogą być używane do usuwania wszelkich tkanek, które nie zostały w pełni nacięte za pomocą narzędzia do dziurkowania.

6. Kolekcja RPE-Choroid siatkówki obwodowej

  1. Użyj kleszczyków Colibri 0,12, aby odkleić naczyniówkę RPE w 8 obwodowych obszarach stempla
    2. .
  2. Tak jak poprzednio, umieść tkankę naczyniówki RPE w probówkach do mikrofug i zamroź przy użyciu ciekłego azotu do dalszego przetwarzania. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu utylizacji.

7. Rozwarstwienie nożycowe

UWAGA: Jeśli ostrze do biopsji dziurkacza jest lub narzędzie do biopsji nie jest wystarczająco mocno naciskane, może to oznaczać, że tkanka nie jest dokładnie nacięta.

  1. W takich przypadkach odciągnij tkankę tak bardzo, jak to możliwe, a następnie użyj nożyczek Westcotta do przycięcia i oddzielenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tkankę siatkówki oraz nabłonka uparstkowego siatkówki (RPE) i naczyniówki można przetwarzać na różne sposoby, dostosowując je do konkretnych celów badawczych. Po pobraniu badacz dysponuje próbkami tkanki siatkówki oraz RPE-naczyniówki z obszaru dołka środkowego, zewnętrznej plamki oraz obwodowej siatkówki (Rycina 1). W szczególności wycinek z obszaru dołka środkowego obejmuje dołek, parafovea oraz niewielką część sąsiadującej perifovea. Wycinek plamki obejmuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Po pobraniu tkanek kluczowe znaczenie ma postępowanie z próbką i jej obróbka14. Konserwacja w ciekłym azocie jest preferowana w stosunku do wiązania chemicznego, ponieważ to ostatnie może spowodować uszkodzenie struktury białka, co może zniekształcić dalszą analizę. Ponadto konserwacja ciekłym azotem jest preferowana w stosunku do metod, które nie obejmują zamrażania próbek. Warto zauważyć, że Ferrer i in. wykazali znaczące różnice w poziomach białka między próbkami mózgu zachowanymi w te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

VBM jest wspierany przez granty NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 i R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103, oraz Research to Prevent Blindness (RPB), Nowy Jork, NY. MT i GV są wspierane przez T32GM007337 grantów NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzie do biopsji skóry 4 mmMiltexREF 33-34
8-milimetrowe narzędzie do biopsji skóryMiltexREF 33-37
0,12 Kleszcze ColibriStephens InstrumentsS5-1145
Nożyczki WescottSklar Instrumenty chirurgiczne64-3146
Probówki do mikrofugeEppendorf#0223641111,5 ml
Ciekły azotPraxair, Inc.7727-37-9 [R]

Bibliografia

  1. Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
  2. Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
  3. Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759(2016).
  4. Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
  5. Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
  7. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
  8. Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
  9. Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140(2013).
  10. Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
  11. Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567(2015).
  12. Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
  13. Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
  14. Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
  15. Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
  16. Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
  17. Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
  18. Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
  19. Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405(2011).
  20. Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
  21. Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wycięcie siatkówkiizolacja RPE i naczyniówkibiopsja wycinanapobieranie tkanekLC-MS/MSSDS-PAGEsiatkówka dołkowatkanka plamkisiatkówka obwodowa
Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.