Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Thiago Cabral; Marcus A. Toral; Gabriel Velez; James E. DiCarlo; Anuradha M. Gore; MaryAnn Mahajan; Stephen H. Tsang; Alexander G. Bassuk; Vinit B. Mahajan

doi:10.3791/56203

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56203

⸱

12 listopada 2017

Thiago Cabral^*¹^,²^,⁷^,⁸ , Marcus A. Toral^*³^,⁴ , Gabriel Velez³^,⁴ , James E. DiCarlo¹^,² , Anuradha M. Gore³ , MaryAnn Mahajan³ , Stephen H. Tsang¹^,² , Alexander G. Bassuk⁵^,⁶ , Vinit B. Mahajan³^,⁹

¹Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ²Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, ³Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, ⁴Medical Scientist Training Program, University of Iowa, ⁵Department of Pediatrics, University of Iowa, ⁶Department of Neurology, University of Iowa, ⁷Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), ⁸Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), ⁹Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Streszczenie

Ludzka siatkówka składa się z neurosiatkówki czuciowej i leżącego pod nią nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), który jest mocno połączony z warstwą naczyniówki. Różne obszary siatkówki różnią się anatomicznie i molekularnie, co ułatwia unikalne funkcje i wykazuje różną podatność na choroby. Analiza proteomiczna każdego z tych regionów i warstw może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu molekularnego wielu chorób, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), cukrzycy i jaskry. Jednak oddzielenie obszarów i warstw siatkówki jest niezbędne przed przeprowadzeniem ilościowej analizy proteomicznej. W tym miejscu opisujemy metodę preparacji i pobierania obszarów dołka, plamki żółtej i obwodowej siatkówki oraz leżącego pod nimi kompleksu RPE-naczyniówka, obejmującą regionalne biopsje punktowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka. Jednowymiarowa SDS-PAGE, jak również dalsza analiza proteomiczna, taka jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS), mogą być wykorzystane do identyfikacji białek w każdej wypreparowanej warstwie siatkówki, ujawniając molekularne biomarkery choroby siatkówki.

Wprowadzenie

Siatkówka, RPE i naczyniówka to złożone tkanki, które wykazują istotne regionalne różnice w ekspresji białek, funkcjach fizjologicznych i patologicznej podatności^1,². Na przykład choroby takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i centralna retinopatia surowicza wykazują charakterystyczną lokalizację w obrębie dołka żółtego, plamki żółtej lub obwodu siatkówki1^,³^,⁴^,⁶. W tym miejscu przedstawiamy metodę pokazującą, w jaki sposób mo....