Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różne ograniczenia systemów hodowli komórkowych 2D wzbudziły zainteresowanie platformami do hodowli i analizy komórek 3D, które lepiej naśladowałyby przestrzenną i chemiczną złożoność żywych tkanek i naśladowały funkcje tkanek in vivo. Ostatnie postępy w technologiach mikrowytwarzania ułatwiły opracowanie środowisk 3D in vitro, w których komórki mogą być zintegrowane z dobrze zdefiniowaną macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i zdefiniowanym zestawem rozpuszczalnych lub związanych z matrycą biomolekuł. Bariery technologiczne ograniczyły jednak ich powszechne zastosowanie w laboratoriach badawczych. W tym miejscu opisujemy metodę konstruowania prostych urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi w mikrośrodowiskach 3D o określonym gradieniu chemoatraktantu. Ilustrujemy wykorzystanie tej platformy do analizy odpowiedzi komórek nabłonkowych i organoidów na gradienty czynników wzrostu, takich jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Gradienty EGF były stabilne w urządzeniach przez kilka dni, co prowadziło do ukierunkowanego tworzenia się gałęzi w organoidach piersi. Ta analiza pozwoliła nam stwierdzić, że zbiorowe wykrywanie gradientu przez grupy komórek jest bardziej czułe w porównaniu z pojedynczymi komórkami. Opisano również metodę wytwarzania, która nie wymaga zaplecza fotolitograficznego ani zaawansowanych technik miękkiej litografii. Metoda ta będzie pomocna w badaniu zachowań komórkowych 3D w kontekście analizy rozwoju i stanów patologicznych, w tym nowotworów.
Wprowadzenie
W środowisku fizjologicznym, komórki są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i wystawione na działanie mnóstwa biomolekuł. Interakcje między komórkami a otaczającym je mikrośrodowiskiem regulują procesy wewnątrzkomórkowe kontrolujące różne fenotypy, w tym migrację, wzrost, różnicowanie i przetrwanie1,2. Wiele dowiedziano się o zachowaniach komórkowych w konwencjonalnej hodowli komórkowej 2D. Jednak wraz z pojawieniem się obrazowania przyżyciowego i eksperymentów z komórkami osadzonymi w hydrożelach 3D, zauważono ważne różnice w zachowaniu komórek w uproszczonych kulturach 2D in vitro vs. 3D środowiskach tkankopodobnych. Podczas gdy komórki oddziałują z włóknami ECM i wyczuwają ich właściwości mechaniczne w matrycy 3D, sztywność materiału żelu nie jest w pełni niezależną zmienną w systemie 2D in vitro. Wymiarowość zmienia tworzenie się zrostów ogniskowych, co skutkuje różną morfologią i zachowaniem komórek. Co więcej, komórki na powierzchni 2D są narażone na mniej sygnałów sygnalizacyjnych niż komórki otwarte na wszystkie kierunki w 3D.
Te ograniczenia zwiększyły zainteresowanie systemami 3D, które reprezentują przestrzenną i chemiczną złożoność żywych tkanek i lepiej przewidują funkcje tkanek in vivo. Zostały one opracowane w wielu formach, od organoidów jako samoorganizujących się mikrostruktur komórkowych po komórki losowo przeplatane w ECM3,4. Ostatnie postępy w technologiach mikroprodukcji ułatwiły pojawienie się różnych typów systemów hodowli 3D5,6,7,8,9 do badania zmian fenotypowych i odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne; Bariery technologiczne ograniczają jednak powszechne zastosowanie w laboratoriach badawczych. W wielu przypadkach procesy produkcyjne wymagają technik fotolitografii i podstawowej wiedzy w zakresie miękkiej litografii. Co więcej, różne czynniki muszą być kontrolowane, aby pomyślnie zbudować urządzenie i osiągnąć optymalną funkcję urządzenia przez długi okres czasu.
Nasza metoda opisuje, jak skonstruować urządzenie 3D PDMS do włączania komórek i organoidów wielokomórkowych do mikrośrodowiska 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu, a następnie analizować odpowiedzi nabłonkowe na EGF10. Nasze dane pokazują, że zdolność organoidów do reagowania na płytkie gradienty EGF wynika z międzykomórkowego sprzężenia chemicznego poprzez połączenia szczelinowe. Sugeruje to potencjał organoidów w zakresie bardziej precyzyjnego wykrywania słabych i hałaśliwych, przestrzennie stopniowanych danych wejściowych. Proces produkcji nie wymaga pomieszczenia czystego ani technik fotolitografii. Jednak urządzenie 3D PDMS zawiera niezbędne czynniki środowiska fizjologicznego 3D. Ta metoda będzie pomocna w badaniu zachowań komórkowych 3D i ma ogromny potencjał badawczy z różnymi typami komórek, chemoatraktantami i kombinacjami ECM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie prace nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. Produkcja urządzenia mezofluidycznego
- Zaprojektuj maskę formy do urządzenia PDMS za pomocą oprogramowania CAD 3D.
- Wydrukuj formę za pomocą sprzętu stereolitograficznego z żywicą odporną na wysoką temperaturę.
UWAGA: Opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone przez komercyjną usługę druku 3D. - Dokładnie wymieszaj roztwór monomeru PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1. Do wytworzenia urządzenia potrzebne były 3 ml mieszaniny PDMS. Całkowita objętość zależy od liczby form do wyprodukowania.
- Odgazować mieszaninę poprzez zastosowanie próżni przy użyciu własnej laboratoryjnej pompy próżniowej lub pompy próżniowej w eksykatorze próżniowym przez 1 godzinę.
- Przetrzyj powierzchnię formy taśmą klejącą, aby usunąć kurz, a następnie wlej mieszaninę PDMS do formy. Jeśli w procesie zostaną wprowadzone pęcherzyki, należy powtórzyć odgazowanie w eksykatorze próżniowym. Bąbelki uwięzione między filarami formy można usunąć, kłując je ostrą igłą.
UWAGA: Proces odgazowywania w temperaturze pokojowej powinien nastąpić w ciągu 1 godziny lub krócej. - Utwardzać PDMS przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Pozwól formie ostygnąć w temperaturze pokojowej.
- Przetnij granicę między formą a PDMS za pomocą ostrza, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od formy.
- Przytnij część PDMS tak, aby pasowała do szkiełka nakrywkowego 22 mm x 22 mm i wybij otwór na wlocie.
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. - Wyczyść część PDMS i szkiełko nakrywkowe 22 mm x 22 mm, przecierając powierzchnie chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków i 70% etanolem. Następnie usuń duże cząsteczki kurzu, przecierając je taśmą klejącą.
- Wysterylizuj część PDMS i szkiełko nakrywkowe przez autoklawowanie (121 °C przez 8 minut na mokro, 15 minut na sucho) lub przez wystawienie na działanie światła UV przez 1 godzinę.
- Poddaj dolną powierzchnię części PDMS i szkiełko nakrywkowe pistoletem do wyładowań koronowych przez 5 minut w kapturze do hodowli tkankowych, a następnie połącz je ze sobą.
UWAGA: Połóż na dnie dowolny materiał nieprzewodzący, taki jak pianka polistyrenowa, i usuń wszystkie materiały przewodzące podczas tego procesu. Natychmiast po zabiegu, w ciągu 5 minut, wstrzyknąć kolagen do urządzenia, aby zwiększyć wiązanie między żelem kolagenowym a szkiełkiem nakrywkowym.
2. Przygotowanie komórek: pierwotna izolacja organoidów sutkowych
UWAGA: Szczegóły dotyczące izolacji organoidów sutkowych można znaleźć w poprzednim worku11. Każdy rodzaj pojedynczej komórki lub organoidu może być przygotowany zgodnie z własnymi protokołami izolacji/odłączenia.
- Tkankę gruczołu sutkowego myszy rozdrobnić skalpelem, aż tkanka się rozluźni i potrząsać nią przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 50 ml roztworu kolagenazy/trypsyny (10 ml na mysz) w DEME/F12 uzupełnionym 0,1 g trypsyny, 0,1 g kolagenazy, 5 ml FBS, 250 μl 1 μg/ml insuliny, i 50 μl 50 μg/ml gentamycyny.
- Odwirować roztwór kolagenazy/trypsyny o stężeniu 1,250 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant przez aspirację. Rozproszyć komórki w 10 ml DMEM/F12 i odwirować przy 1 250 x g przez 10 minut. Po usunięciu DMEM/F12 przez aspirację, ponownie zawiesić komórki w 4 ml DMEM/F12 uzupełnionym 40 μl DNazy (2 jednostki/μL).
- Potrząsać roztworem DNazy ręcznie przez 2-5 minut, a następnie odwirowywać przy 1 250 x g przez 10 minut.
- Oddzielić organoidy od pojedynczych komórek za pomocą czterech wirowań różnicowych (impuls do 1 250 x g i zatrzymanie wirówki na 3-4 s po osiągnięciu zamierzonej prędkości). Pomiędzy każdym impulsem odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM/F12.
- Ponownie zawiesić końcowy osad w żądanej ilości pożywki wzrostowej DMEM/F12 z 1% penicyliny/streptomycyny i 1% insulinotransferyny-selenu-X do przygotowania kolagenu.
3. Przygotowanie i iniekcja kolagenu
UWAGA: Inne rodzaje żeli ECM mogą być przygotowane zgodnie z własnymi protokołami żelowania.
- Przygotować roztwór kolagenu typu I (3,78 mg / ml), 10x DMEM, 1 N roztwór NaOH, normalne podłoże wzrostowe na lodzie.
UWAGA: Trzymaj na lodzie do momentu zakończenia procedury. - Dodać 6 μl 1 N roztworu NaOH, 200 μl pożywki wzrostowej i 50 μl 10x DMEM do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i dokładnie wymieszać roztwór.
- Dodać 425 μl kolagenu do wstępnie zmieszanego roztworu i dokładnie wymieszać pipetując.
- Odwiruj mieszaninę kolagenu przez krótki czas (mniej niż 5 sekund), aby oddzielić i usunąć pęcherzyki z mieszaniny.
- Trzymaj zneutralizowany roztwór kolagenu na lodzie przez 1 godzinę, aby wywołać tworzenie się błonnika.
- Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do mieszaniny kolagenowej i dokładnie wymieszać.
UWAGA: Końcowe stężenie kolagenu wynosi 2 mg/mL. - Wstrzyknąć roztwór za pomocą pipety o pojemności 200 μl przez wlot urządzenia PDMS, aż cała komora zostanie wypełniona. Jeśli mieszanina kolagenu przelewa się przez szczeliny filarów, po żelowaniu wytnij nadmiar żelu kolagenowego ostrym ostrzem chirurgicznym.
- Przechowywać urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę w celu wywołania żelowania.
- Napełnij zbiorniki po obu stronach pożywką wzrostową i utrzymuj urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu wykonania obrazowania konfokalnego.
4. 3D obrazowanie i kwantyfikacja
- Zainstalować komorę do obrazowania żywych komórek do mikroskopu konfokalnego i wstępnie ustawić temperaturę i CO2 do 37 °C i 5%. Aby uzyskać wilgotność, dodaj wodę do zbiornika komory i w razie potrzeby umieść w komorze wilgotne chusteczki.
- Umieścić urządzenie PDMS w komorze i dodać EGF do jednego ze zbiorników jako "źródło" EGF w formacji gradientowej. Drugi zbiornik będzie służył jako "pochłaniacz" niezbędny do opracowania przestrzennie stopniowanej dystrybucji EFG. W tym badaniu do zlewu dodano 2,5 nM EGF, aby uzyskać gradient 0,5 nM/mm.
- Ustaw zakres stosu Z obejmujący objętość interesujących organoidów i rozpocznij obrazowanie.
UWAGA: Aby uniknąć fototoksyczności, wypróbuj niższą intensywność lasera w obrazowaniu konfokalnym lub użyj technik obrazowania wielofotonowego. - Zrekonstruuj obraz 3D ze stosów obrazów 2D za pomocą komercyjnego oprogramowania lub niestandardowego programu. Zmierz długość i kąt gałęzi wystających z organoidów lub migracji poszczególnych komórek. Tutaj wykonaj kwantyfikację, rysując odręczny kontur wokół ciała organoidu za pomocą ImageJ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
EGF jest niezbędnym regulatorem morfogenezy rozgałęzionej w gruczołach mlekowych oraz krytycznym chemoatraktantem kierującym migrację komórek nabłonkowych piersi podczas inwazyjnego wzrostu nowotworu. Wykorzystaliśmy opisane powyżej mezoskopowe urządzenia mikroprzepływowe do badania odpowiedzi komórek na określone gradienty EGF (Rycina 1A,B)10. Urządzenie tworzy obszar hodowlany o szerokości 5 mm, długości 10 mm i wyso...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Produkcja form PDMS została wykonana przy użyciu komercyjnej usługi druku 3D, ale może być również wykonana przez wysokiej klasy drukarkę 3D we własnym zakresie. Wśród różnych metod wytwarzania 3D, stereolitografia jest zalecana do generowania form w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ utwardzanie PDMS odbywa się w wysokiej temperaturze (80 °C), materiały powinny być wystarczająco odporne termicznie, co powinno być wyraźnie określone, jeśli druk jest zlecany na zewnątrz. Termiczne utwardzanie końcowe można omówić z firmą p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty dla AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), oraz NCI U54 CA210173) i AL (U54CA209992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełko nakrywkowe 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Kolagen I, Szczur | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Kolagen | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Służy do symulacji dynamiki dyfuzji | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Rekombinowane białko myszy | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Technologie życia | 16140-071 | |
| Fidżi-ImageJ | Służy do pomiaru długości i kątów rozgałęzień | ||
| Gentamycyna | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulina | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulina-Transferyna-Selen-X | GIBCO | 51500 | |
| Chusteczka | Kimberly-Clark Professional | Kimtech | |
| Materiał formy | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Sprzęt do drukowania form | Proto labs | Stereolithogrphy | Maksymalny wymiar: 127 mm x 127 mm x 63,5 mm, Grubość warstwy: 0,0254 mm |
| Usługa drukowania form | Proto labs | Niestandardowe | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicylina/Streptomycyna | VWR | 16777-164P | |
| Konfokalny wirujący dysk mikroskop | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Mikroskopia elektronowa Nauki | 184 SIL ELAST KIT | Zestaw PDMS |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T9935 |
Bibliografia
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720(2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
