W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.
Artykuł metodologiczny
Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), postępująca i śmiertelna choroba mięśni, jest spowodowana mutacjami w genie DMD, które skutkują brakiem białka dystrofiny. Do tej pory zakończyliśmy zainicjowane przez badaczy pierwsze badanie na ludziach w Narodowym Centrum Neurologii i Psychiatrii oparte na ogólnoustrojowym wstrzykiwaniu oligonukleotydów morfolino, które są podatne na przeskakiwanie egzonu-53. Uważa się, że dla skutecznego leczenia DMD niezbędne są badania in vitro z mioblastami pochodzącymi od pacjentów z DMD w celu badania przesiewowego leków i oceny kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych. Całkiem niedawno opisaliśmy nową komórkę pochodzącą z moczu (UDC) przekształconą w MYOD1 leczoną inhibitorem metylotransferazy histonowej (chlorowodorek 3-deazaneplanocyny A), jako model komórkowy DMD. Nowy autologiczny UDC może wykazywać fenokopię specyficznych dla choroby fenotypów DMD, prowadząc do zastosowania medycyny precyzyjnej w różnych chorobach związanych z mięśniami. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania komórek mięśniowych DMD przy użyciu UDC przekształconych w MYOD1 wraz z reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR), Western blotting i immunocytochemią w celu oceny przywrócenia poziomów mRNA i białka dystrofiny po pominięciu eksonów.
Wprowadzenie
Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), postępująca, śmiertelna choroba mięśni, jest spowodowana mutacjami w genie DMD, które skutkują brakiem białka dystrofiny1. Uważa się, że terapia egzonów oparta na oligonukleotydach antysensownych jest obiecująca dla DMD. Terapia ta opiera się na konwersji cięższego fenotypu DMD na łagodniejszy fenotyp podobny do dystrofii mięśniowej Beckera poprzez zmianę splicingu pre-mRNA w celu przywrócenia ramki odczytu DMD2. Niedawno zakończyliśmy pierwsze badanie z udziałem ludzi oparte na wielokrotnym podawaniu dożylnym viltolarsenu fosforodiamidanu morfolinooligomeru (PMO), który może indukować pomijanie eksonu 53 w DMD i wykazało doskonały profil bezpieczeństwa, obiecującą skuteczność i akceptowalne parametry farmakokinetyczne (zarejestrowane jako UMIN: 000010964 i ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Jednakże, aby opracować opłacalne i skuteczne metody leczenia choroby, testy in vitro z wykorzystaniem pierwotnych komórek mięśniowych uzyskanych od pacjentów z DMD są niezbędne do badań przesiewowych leków i weryfikacji kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych, a także biomarkery, które odzwierciedlają skuteczność terapii z pominięciem eksonów podczas badań na ludziach4. Całkiem niedawno informowaliśmy o nowatorskiej technologii rozwoju specyficznych dla pacjenta komórek pochodzących z moczu (UDC) przekształconych w MYOD15,6 jako podstawowy model mioblastów DMD7. Tak więc, aby wytworzyć mioblasty, wymagane jest tylko pobranie moczu od pacjentów i nie jest potrzebna żadna inwazyjna procedura. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół skutecznego modelowania mięśni DMD przy użyciu UDC z konwersją MYOD1 traktowanych chlorowodorkiem 3-deazaneplanocyny A w celu oceny przywróconego mRNA i białka dystrofiny po pominięciu eksonu.
Protokół
Komisja Etyki Narodowego Centrum Neurologii i Psychiatrii zatwierdziła to badanie (ID zatwierdzenia: A2017-018, A2018-029). Wszystkie osoby wyraziły świadomą zgodę przed oddaniem moczu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
1. Izolacja i pierwotna kultura UDC
UWAGA: UDC zostały odizolowane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem8,9,10 z pewnymi modyfikacjami.
- Próbki moczu należy pobierać podczas spontanicznego oddawania moczu do wysterylizowanych plastikowych butelek.
UWAGA: Sterylizacja zewnętrznego ujścia cewki moczowej nie jest konieczna. Oddawanie moczu w środkowym strumieniu jest pożądane w celu zmniejszenia ryzyka zakażenia wirusowego. Jeżeli czas przygotowania do następnej procedury wynosi >1 godzinę, próbki moczu należy przenieść do temperatury 4 °C w celu zachowania żywotności komórek. Należy jednak unikać temperatury <4 °C, ponieważ mogą pojawić się nierozpuszczalne osady. - Odwirować całą próbkę moczu o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant, pozostawiając 1 ml w probówce.
- Ponownie zawiesić granulki pojedynczo w pozostałym 1 ml moczu, a następnie zebrać je w jednej probówce o pojemności 50 ml.
- Dodać 10 ml buforu płuczącego składającego się z 99 ml PBS bez wapnia i magnezu, 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,5 μg/ml amfoterycyny B i odwirować próbki przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant, pozostawiając 0,2 ml w probówce.
- Zawiesić osady komórkowe w 4,5 ml pożywki pierwotnej składającej się z mieszaniny 1:1 zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu i mieszanki składników odżywczych F-12 Hama uzupełnionej rekombinowanym ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), insuliną, hydrokortyzonem, epinefryną, T3, transferyną, 10% surowicą płodową (FBS) wolną od tetracykliny, 1% P/S, i 0,5 μg/ml amfoterycyny B.
- Wysiewaj komórki w trzech dołkach pokrytych żelatyną sześciodołkowych płytek (całkowita objętość każdej studzienki: 1,5 ml). Kultura nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
- Dodawaj 1,5 ml pożywki podstawowej dziennie przez następne 3 dni.
- W 4 dniu zastąp pożywkę 1,5 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej rekombinowanym ludzkim EGF, insuliną, hydrokortyzonem, epinefryną, T3, transferyną, 15% FBS bez tetracykliny, 0,5% L-alaniny-L-glutaminy, 0,5% aminokwasów endogennych i 2,5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF), EGF i 1% P/S.
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
UWAGA: Kolonie UDC pojawiają się w ciągu tygodnia. - Gdy hodowla UDC stanie się zlewająca w 80−90%, usuń pożywkę i umyj komórki PBS, podziel wszystkie komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i wysiew w 3,000-5,000 komórek/cm2 na nowym, pokrytym żelatyną naczyniu o średnicy 60 mm (przejście 1).
UWAGA: UDC mogą być przechowywane w ciekłym azocie. UDC są zwykle dzielone przy zbieganiu 60−70% w naczyniu hodowlanym 60 mm na trzy probówki podstawowe.
2. Konstrukt retrowirusowy
- Amplifikuj region kodujący plazmidu MYOD1 (NM_002478.4) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
UWAGA: Mieszanina do amplifikacji MYOD1 i warunki dla termocyklera są pokazane odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2. - Wykryj pojedyncze pasmo o wielkości około 1,000 pz za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o 0,7% przy użyciu 1 μl amplifikowanego produktu PCR, aby potwierdzić, że sekwencja MYOD1 została pomyślnie amplifikowana.
- Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu czyszczącego i określ jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
- Mieszaninę inkubować w sposób przedstawiony w tabeli 3 w temperaturze 37 °C przez noc w celu wytrawienia wektora retrowirusowego z systemem Tet-on i genem opornym na puromycynę w regionach docelowych dla enzymów restrykcyjnych w miejscu wielokrotnego klonowania.
- Wykryj pojedyncze prążek za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,7%, używając 1 μl strawionego produktu, aby potwierdzić, że wektor retrowirusowy został pomyślnie strawiony.
- Oczyścić strawiony produkt za pomocą zestawu do czyszczenia i oznaczyć jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
- Aby sklonować amplifikowany fragment MYOD1 (wytwarzany przez kroki 2.1−2.3) do strawionego wektora retrowirusowego (wytwarzanego przez etapy 2.4−2.6), należy przeprowadzić reakcję klonowania w fuzji. Ustawić reakcję zgodnie z tabelą 4, inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 50 °C, a następnie umieścić na lodzie.
- Przeprowadzić transformację przy użyciu komórek kompetentnych dla E. coli zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
- Wybrać przekształcone kompetentne komórki, hodując je na płytce hodowlanej LB składającej się z 10 g/l baktotryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego bakto, 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru baktonowego i 50 mg/l ampicyliny.
- Pobrać wybraną kolonię i kulturę w pożywce hodowlanej LB bez agaru baktonowego z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc.
- Oczyść wektory retrowirusowe wprowadzone przez MYOD1 za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu (tabela materiałów) i oznacz ilościowo za pomocą spektrofotometru.
- Potwierdzić, że MYOD1 jest prawidłowo wprowadzony do wektora retrowirusowego poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie produktu PCR amplifikowanego przez startery do przodu i do tyłu skierowane odpowiednio po obu stronach w poprzek wstawionej sekwencji MYOD1.
UWAGA: Sekwencję MYOD1 można wykryć umieszczoną pomiędzy sekwencjami wektorów retrowirusowych, gdy klonowanie w fuzji zakończy się sukcesem. - W przypadku produkcji retrowirusowej wysiewaj komórki opakowania w ilości 50 000 komórek/cm2 na 10-centymetrowych płytkach pokrytych kolagenem i hoduj w DMEM z 10% FBS nawilżonym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
- Gdy komórki opakowania rozmnożą się do 80% konfluencji, wymieszaj 30 μg wektorów retrowirusowych z wprowadzoną MYOD1, 30 μg wektorów opakowaniowych i odczynnika do transfekcji zawierającego peptyd penetrujący komórki (tabela materiałów) przez wirowanie i inkubuj je przez 10 minut.
- Dodać inkubowaną mieszaninę do pożywki komórek opakowaniowych i kultury zwilżonej w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
UWAGA: Konieczne jest powlekanie kolagenem. Transfekcja może być lepsza po 24 godzinach lub więcej po wysiewie, ponieważ komórki pakujące łatwo odrywają się od płytki hodowlanej. - Po 4 godzinach lub nocy zmień podłoże na świeże.
- Zebrać supernatant wirusa i zastąpić go świeżą pożywką po 24 i 48 godzinach od kotransfekcji i połączyć supernatant.
- Aby zagęścić supernatant wirusa, należy go zmieszać z odczynnikiem koncentratora i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie odwirować w temperaturze 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
- Przefiltrować supernatant retrowirusa przez filtr PVDF z porami 0,45 μm.
- Sprawdź miano wektora retrowirusowego za pomocą ilościowego zestawu do PCR i systemu termocyklera zgodnie z instrukcjami producenta.
- Podzielić supernatant wirusa na małe porcje i umieścić je w temperaturze -80 °C.
3. Zakażenie wektorem retrowirusowym MYOD1 w UDC
- Wysiewaj UDC w ilości 3 000-5 000 komórek/cm2 na pokrytej żelatyną szalce o średnicy 60 mm.
- Po 24 godzinach od wysiewu zainfekować rozmrożonego retrowirusa (krok 2.21) przy wielokrotności infekcji 200, dodając bromek heksadimetryny o stężeniu 8 μg/ml.
- Po 24 godzinnej inkubacji nawilżonej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą 1 μg/ml puromycyny, aby wybrać komórki transdukowane MYOD1. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
UWAGA: Podczas selekcji komórek MYOD1-dodatnich do selekcji zwykle używa się puromycyny 1 μg / ml. Należy ustalić odpowiednią dawkę. Użyj płytki zawierającej nietransfekowane komórki i wybierz dawkę, która zabije wszystkie komórki w ciągu 3-5 dni. Komórki MYOD1-dodatnie należy wybrać w ciągu 7-10 dni po dodaniu puromycyny. UDC transdukowane przez MYOD1 mogą być przechowywane w ciekłym azocie.
4. Miogenne różnicowanie UDC transdukowanych przez MYOD1 leczonych chlorowodorkiem 3-deazaneplanociny A (DZNep)
UWAGA: Ostatnio doniesiono, że DZNep, inhibitor metylotransferazy histonowej, może znacząco promować ekspresję MYOGENINY, jednego z późnych czynników regulujących mięśnie, a także prowadzić do różnicowania miotube7.
- Płytkowe UDC transdukowane MYOD1 w studzienkach pokrytych kolagenem o gęstości 3,5 x 104 komórek/cm2. Kultura nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 24 godzinach zmień pożywkę wzrostową na pożywkę różnicującą składającą się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-alaniną-L-glutaminą, 5% surowicy końskiej, suplementu ITS, 1 μg/ml doksycykliny i 5 μM DZNep.
UWAGA: Roztwór 10 mM DZNep można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 miesiące. Używaj zamrażarki do rozmrażania i unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Zarówno MYOD1 aktywowany przez doksycyklinę, jak i DZNep hamują proliferację i promują miogenne różnicowanie UDC. Dlatego zaleca się dodanie doksycykliny i DZNep po indukcji różnicowania miogennego. DZNep wspomaga miogenne różnicowanie MYOD1-UDC w sposób zależny od dawki. Z drugiej strony wykazuje cytotoksyczność w wysokim stężeniu. Dlatego należy określić odpowiednie stężenie DZNep, w zakresie od 1−10 μM w zależności od jego wpływu na różnicowanie miogenne i biodostępność komórkową. - Po 3 dniach zmień pożywkę różnicującą na świeżą pożywkę różnicującą bez DZNep. Następnie zmieniaj podłoże co 3 dni.
UWAGA: UDC łączą się ze sobą i tworzą rurki mięśniowe w ciągu 1-2 tygodni po różnicowaniu.
5. Przeskakiwanie eksonów w UDC konwersji MYOD1
UWAGA: Tutaj opisane są trzy protokoły oceny pomijania eksonów w komórkach pochodzących od pacjentów: 1) reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) mRNA dystrofiny; 2) półkwantyfikacja przywróconego sygnału białkowego dystrofiny za pomocą Western blot; oraz 3) półkwantyfikacja przywróconego sygnału fluorescencji dystrofiny za pomocą immunocytochemii. Wszystkie metody mogą wykrywać przeskakiwanie eksonów w sposób zależny od dawki.
- Ocena skuteczności pomijania eksonów metodą RT-PCR
- Aby transfekować oligonukleotyd antysensowny (ASO) do UDC przekształconych w MYOD1 uzyskanych od pacjentów z DMD w 7 dniu po różnicowaniu, należy zmieszać ASO, odczynnik do transfekcji (tabela materiałów) i pożywkę różnicującą do końcowego stężenia 1−10 μM. Hodowla nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 72 godzinach inkubacji z ASO zmienić pożywkę na świeżą pożywkę różnicującą bez ASO.
- Od 3−7 dni po transfekcji ASO usunąć pożywkę różnicującą i przemyć 1x PBS. Dodaj bufor do lizy komórek, zlizuj UDC i zbierz całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
- Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
- Połączyć wymagane odczynniki do jednoetapowej reakcji RT-PCR w probówkach PCR zgodnie z tabelą 5.
- Umieść probówki PCR z mieszaniną w termocyklerze. Uruchom termocykler zgodnie z Tabelą 6.
- Wykonaj elektroforezę mikroczipową i oblicz efektywność przeskakiwania eksonów, korzystając ze stężenia molowego, jak poniżej.
Efektywność pomijania eksonów (%) = pominięte pasmo / (pominięte pasmo + niepominięte pasmo) x 100
UWAGA: Produkt PCR należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
- Wykrywanie dystrofiny po przeskakiwaniu eksonów przez Western blotting
- Transfekcyjna ASO i hodowla MYOD1-UDC zgodnie z krokami 5.1.1 i 5.1.2.
- Zmieniaj podłoże co 3 dni.
- Po 2 tygodniach różnicowania należy wyekstrahować całkowite białko z hodowanych komórek za pomocą buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) zawierającego inhibitory proteazy.
- Sonikować lizaty na lodzie i odwirowywać przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Zebrać supernatant i oznaczyć stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
- Dodać 15 μg białka całkowitego do probówki o pojemności 0,5 ml i rozcieńczyć, dodając bufor RIPA zawierający inhibitory proteazy do całkowitej objętości 10 μl. Uruchomić 15 μg białka całkowitego na pas .
- Dodać bufor próbki, środek redukujący i wodę dejonizowaną, jak pokazano w tabeli 7. Denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze 70 °C przez 10 min.
- Przygotować bufor tris-acetatowy zawierający 8,95 g/l trycyny, 6,06 g/l zasady tris, 1,0 g/l dodecylosiarczanu sodu (SDS).
- Załadować próbkę (20 μl) na 3-8% żel tris-acetat i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 150 V przez 75 minut.
- Przygotować bufor do bibuły bez metanolu.
- Namocz membranę PVDF przez 20 s w metanolu, a następnie w buforze do bibuły do użycia (co najmniej 10 min). Przytnij membranę PVDF do rozmiaru 6 x 8 cm za pomocą mini żeli i 8 x 12 cm za pomocą żeli midi.
- Pokrój bibułę do tego samego rozmiaru, co membrana PVDF i namocz je w buforze bibułkowym do czasu użycia.
- Po elektroforezie pokrój żel do tego samego rozmiaru, co membrana PVDF i namocz żel w wodzie destylowanej.
- Umieść bibuły, membranę PVDF i żel na półsuchym aparacie transferowym (Rysunek 1). Przenoszenie przy 4 mA/cm2 przez 30 min.
- Przepłukać membranę 2x wodą destylowaną.
- Przygotuj przeciwciało anty-dystrofiny (1:500) i przeciwciało anty-α-tubuliny (1:1,200) jako przeciwciała pierwszorzędowe.
- Przygotuj przeciwciało anty-mysie sprzężone z HRP (1:100) jako przeciwciało drugorzędowe.
- Inkubować błony z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przemyć buforem do przemywania wodą, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przy użyciu zautomatyzowanego zachodniego urządzenia do przetwarzania (Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Przeciwciało anty-α-tubuliny jest zwykle stosowane jako kontrola obciążenia. Mieszane roztwory przeciwciał pierwotnych, w tym przeciwciała anty-dystrofiny 1:500 i 1:1,200 przeciwciała anty-α-tubuliny, działają dobrze, gdy reakcja przeciwciał jest wykonywana jednocześnie. - Przepłucz membranę w wodzie destylowanej.
- Wykrywanie białek za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika detekcyjnego i kamery, opartej na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
- Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
- Wykrywanie dystrofiny po pominięciu eksonu za pomocą immunocytochemii
- Bezpośrednio przeprogramuj UDC do miotub w pokrytej kolagenem płytce 96-dołkowej zgodnie z krokami 4.1−4.3.
- Przetransfekować ASO i hodowlę MYOD1-UDC zgodnie z krokami 5.1.2 i 5.1.3.
- Po 2 tygodniach różnicowania przemyć komórki PBS i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przepuszczalność MYOD1-UDC w 0,1% niejonowym detergencie przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zablokowanie tych 10% koziej surowicy na 15 minut w temperaturze 37 °C.
- Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj komórki PBS i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: W tym przypadku mysia anty-dystrofina (1:30) jest używana jako przeciwciało pierwszorzędowe, anty-mysie IgG jest używana jako przeciwciało drugorzędowe, a Hoechst (1:10 000) jest używany do barwienia jąder. - Zobrazuj płytki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i użyj analizatora, aby automatycznie określić ilościowo sygnał fluorescencji w każdym dołku w tych samych warunkach.
Wyniki
Komórki UDC mogliśmy pobierać w sposób łatwy i nieinwazyjny. UDC tworzyły kolonie w ciągu tygodnia od rozpoczęcia pierwotnej hodowli komórkowej, co wskazywało na wyraźną zdolność do proliferacji. Hodowla UDC była prosta, a kontaminacje bakteryjne lub grzybicze występowały rzadko, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym kolonii UDC tydzień po pierwotnej hodowli (Rysunek 2A) oraz MYOD1-UDC tydzień po różnicowaniu (Rysunek 2B). Rysunek 3 pokazuje pomyślną detekcję pominięcia eksonu w UDC uzyskanych od pacjentów z DMD za pomocą RT-PCR. Rysunek 3A przedstawia analizę RT-PCR dystrofiny po zastosowaniu oligosominu antysensownego w MYOD1-UDC traktowanych DZNep, wyhodowanych od 6-letniego chłopca z delecją eksonów 45-54 w genie DMD. Rama odczytu została przywrócona poprzez pominięcie eksonu 4. W 14. dniu po różnicowaniu potwierdzono indukcję pominięcia eksonu w sposób zależny od dawki (Rysunek 3B). Górne prążki oznaczają produkty natywne, a dolne prążki oznaczają produkty z pominięciem eksonu 4, które przywróciły ramę odczytu.
Rysunek 4 przedstawia pomyślną detekcję dystrofiny po pominięciu eksonu w komórkach UDC uzyskanych od pacjentów z DMD za pomocą metody Western blotting w sposób zależny od dawki. Wykryliśmy również przywróconą ekspresję dystrofiny przy użyciu immunocytochemii (Rysunek 5). Intensywność sygnału dystrofiny zmierzono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 1 tydzień po transfekcji oligonukleotydem antysensownym (ASO) na płytce 96-dołkowej (Rysunek 5A). Znacznie silniejsze sygnały fluorescencyjne zaobserwowano w komórkach MYOD1-UDC traktowanych ASO niż w komórkach MYOD1-UDC traktowanych kontrolnym ASO (Rysunek 5B).
Wyniki te sugerują, że nasz nowy test pozwala na efektywną ocenę pomijania eksonów w MYOD1-UDC uzyskanych od pacjentów z DMD na poziomie mRNA i białka.
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie układu warstw transferu dla semisuchego Westernu. Dwa arkusze papieru nasączone buforem do transferu ułożono przy ujemnej elektrodzie, a na nich ułożono dwa kolejne arkusze papieru nasączone buforem. Żel, uprzednio namoczony w buforze, ułożono delikatnie na membranie PVDF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy UDC. (AObraz w kontraście fazowym UDC tydzień po hodowli pierwotnej. Pasek skali = 200 µmWstawka: Powiększony obraz obszaru zaznaczonego białym prostokątem. (B) Obraz w kontraście fazowym przedstawiający MYOD1-UDC tydzień po różnicowaniu. Pasek skali = 50 µmRycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Takizawa et al.7. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Pomyślna ocena pomijania eksonów w komórkach pochodzących z moczu (UDCs) pobranych od pacjentów z DMD za pomocą metody RT-PCR. (AAnaliza RT-PCR dystrofiny po zastosowaniu oligonukleotydów antysensownych w próbkach traktowanych chlorowodorkiem 3-deazaneplanocyny A (DZNep) MYOD1-UDCs pochodzące od pacjenta z dystrofią mięśniową Duchenne'a (DMD) z delecją egzonów 45-54. Potraktowane DZNep MYOD1– Komórki UDC poddano również działaniu kontrolnego antysensu w stężeniu 1-10 µM koncentracje jako kontrole. Górne prążki stanowiły produkty bez pominięcia (delecja eksonów 45-54), które pozostały poza ramką odczytu. Dolne prążki stanowiły produkty z pominięciem eksonu 4 (delecja eksonów 4-54 oraz pominięcie eksonu 4), które przywróciły otwartą ramkę odczytu.BWydajność pominięcia obliczono jako (moli transkryptu z pominiętym eksonem 4) / (moli transkryptu natywnego + moli transkryptu z pominiętym eksonem 4 [oznaczonych strzałkami]) x 100% przy użyciu systemu elektroforezy mikroczipowej. Do porównania wydajności pominięcia zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Bonferroniego (n = 3 dla każdej grupy, ****P < 0,01). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Schemat został zmodyfikowany na podstawie pracy Takizawa i wsp.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Pomyślna ocena pominięcia eksonu w komórkach pochodzących z moczu (UDCs) pacjentów z DMD za pomocą Western blot. (A) Reprezentatywny wynik analizy Western blot dla dystrofiny po zastosowaniu DZNep MYOD1-UDC od pacjenta z DMD z delecją eksonów 45-54 po pominięciu eksonu 44. Do detekcji dystrofiny użyto przeciwciała antydystrofinowego (przeciwko końcowi C). (BWzględne intensywności prążków, znormalizowane względem ekspresji α-tubuliny, porównano w komórkach pochodzących od pacjentów z zastosowaniem i bez zastosowania terapeutycznych oligonukleotydów antysensownych, przeprowadzając jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Bonferroniego (n = 3 dla każdej grupy, **P < 0,01, ***P < 0,01, HI = zdrowa osoba). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Takizawy i współpracowników.7. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Mapy ciepła immunocytochemii dla dystrofiny po leczeniu oligosukcewnidami antysensownymi w grupie traktowanej DZNep MYOD1-UDC uzyskane od pacjenta z DMD z delecją eksonów 45-54. (A) Delecja eksonów 45–54 przywróciła otwartą ramkę odczytu w oparciu o pominięcie eksonu 4. (BIntensywność sygnału określono ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego po upływie 1 tygodnia od transfekcji oligonukleotydów antysensownych na płytce 96-dołkowej. Do porównania zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem post hoc Bonferroniego (n = 3-4 dla każdej grupy, ****P < 0,01). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Takizawy i wsp.7. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Odczynnik | Objętość | Stężenie końcowe |
| premix do PCR 2x | 12.5 μL | 1x |
| Starter forward | 5 pmol | 0.2 μM |
| Starter odwrotny | 5 pmol | 0.2 μM |
| Szablon | 80 ng | |
| Sterylna woda destylowana | do 25 μL | |
| Całkowita objętość na jedną reakcję | 25 μL |
Tabela 1: Mieszanina do amplifikacji MYOD1 metodą RT-PCR.
| 98 °C | 10 s | |
| 55 °C | 10 s | } 35 cykli |
| 72 °C | 10 s |
Tabela 2: Parametry termocyklera dla amplifikacji MYOD1.
| Odczynnik | Objętość |
| bufor 10x K | 2 μL |
| Wektor retrowirusowy (50 ng/μL) | 2 μL |
| Enzym restrykcyjny 1 (2−15 U) | 1 μL |
| Enzym restrykcyjny 2 (2−15 U) | 1 μL |
| Sterylizowana woda destylowana | 14 μL |
| Objętość całkowita | 20 μL |
Tabela 3: Mieszanina do probówki do trawienia wektora retrowirusowego.
| Odczynnik | Objętość |
| Oczyszczony fragment MYOD1 | 10 ng |
| Przetrawiony wektor retrowirusowy | 10 ng |
| 5x premiks enzymatyczny | 4 μL |
| Sterylizowana woda destylowana | do 20 μL |
| Objętość całkowita | 20 μL |
Tabela 4: Mieszanina do reakcji klonowania In-Fusion.
| Roztwór | Objętość/Reakcja (μL) | Stężenie końcowe |
| woda wolna od RNaz | Zmienna | - |
| Bufor do jednokrokowej RT-PCR | 4 | 1x |
| mieszanina dNTP (zawierająca 10 mM każdego dNTP) | 0.8 | 40 mM każdego dNTP |
| Starter forward (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Starter odwrotny (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| mieszanina enzymatyczna do jednokrokowego RT-PCR | 0.8 | - |
| inhibitor RNazy (opcjonalnie) | Zmienna | 5–10 jednostek/reakcja |
| RNA matrycowe | 50–40 ng | |
| Objętość całkowita | 20 |
Tabela 5: Związki niezbędne do przeprowadzenia jednej reakcji jednokrokowego RT-PCR.
| 1 cykl | Transkrypcja odwrotna | 30 min | 50 °C |
| 1 cykl | Wstępny etap aktywacji PCR | 15 min | 95 °C |
| 1 cykl | Denaturacja | 1 min | 94 °C |
| Przyłączanie (annealing) | 1 min | 60 °C | |
| Rozszerzenie | 1 min | 72 °C | |
| 1 cykl | Ostateczna elongacja | 7 min | 72 °C |
| Przytrzymać | ∞ | 4 °C |
Tabela 6: Warunki termocyklera dla jednokrokowego RT-PCR.
| Odczynnik | Tom |
| Białko (15 μg) | 10 μL |
| Bufor do próbek (4x) | 5 μL |
| Reduktor (10x) | 2 μL |
| Woda dejonizowana | 3 μL |
| Objętość całkowita | 20 μL |
Tabela 7: Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomijania eksonów w UDC przekształconych w MYOD1 uzyskanych od pacjentów z DMD. Korzystając z systemu testowego, skutecznie przesiewaliśmy optymalne sekwencje antysensowne. Zakładamy, że UDC przekształcone w MYOD1 mogą być przydatne do badania patofizjologii choroby.
Ocena pomijania eksonów przy użyciu komórek pochodzących od pacjenta na poziomie mRNA jest niezbędna do badań przesiewowych nowych leków i oceny kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych. Obliczenie efektywności pomijania eksonów można ocenić tylko na poziomie mRNA.
Ocena pomijania eksonów na poziomie białka jest również ważna, ponieważ odbudowa dystrofiny jest ważna jako zastępczy biomarker do przewidywania korzyści z pomijania eksonów. Do tej pory badania przesiewowe antysensownych sekwencji oligonukleotydowych są często wykonywane przy użyciu pierwotnych linii komórek mięśniowych lub nieśmiertelnych linii komórkowych mioblastów, w tym ludzkich komórek mięsaka prążkowanokomórkowego (RD), ale nie możemy zmierzyć odzyskiwania poziomów dystrofiny za pomocą linii komórek mięśniowych lub linii komórkowych RD, ponieważ wyrażają one to białko endogennie. Możemy wyraźnie wykryć przywrócenie dystrofiny w MYOD1-UDC pochodzących od pacjentów z DMD w sposób zależny od dawki. W naszym nowym teście uważamy, że ocena przywróconego białka za pomocą Western blotting jest lepsza pod względem kwantyfikowalności. Z drugiej strony, ocena za pomocą immunocytochemii przy użyciu 96-dołkowych płytek jest idealna do jednoczesnego badania przesiewowego wielu potencjalnych związków.
W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół skutecznego modelowania mięśnia DMD przy użyciu UDC przekształconych w MYOD1 wraz z RT-PCR, Western blotting i immunocytochemią w celu oceny przywróconej dystrofiny na poziomie mRNA i białka po pominięciu eksonów. UDC można zbierać nieinwazyjnie i łatwo. Dlatego zakładamy, że zupełnie nowy test in vitro może być zastosowany w szerokim zakresie badań podstawowych i translacyjnych, niezależnie od rodzaju zaburzeń mięśniowych.
Oświadczenia
Narodowe Centrum Neurologii i Psychiatrii opracowuje obecnie NS-065/NCNP-01, lek pomijający ekson 53 na DMD, we współpracy z Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [grant nr 18K07544 dla Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [grant nr 28-6 dla Y.A.] oraz Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego [granty nr 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 i 18lm0203069h0001 dla Y.A.].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% Stabilizowany roztwór P / S | Thermo Fisher | 15070-063 | Hodowla komórkowa |
| Amfoterycyna B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anty-dystrofina | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anty-dystrofina | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemia (ICC) |
| Anty-mysia IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anty-&alfa-tubulina | Sigma | T6199 | Western bot i ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Mikroskop fluorescencyjny |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Zapas komórek w ciekłym azocie |
| ChemiDoc MP System obrazowania | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Produkcja retrowirusowa |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Ekstrakcja białka dla WB |
| E.coli DH5 i alfa; Kompetentne komórki | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Odczynnik | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Hodowla komórkowa |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | transfekcja ASO |
| Bibuła filtracyjna o bardzo grubej plamie | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Czynnik wzrostu fibroblastów Atto | AE-1460 | WB-zasadowy |
| Sigma-Aldrich | F0291 | Hodowla komórkowa | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Hodowla komórkowa |
| GP2-293 Komórki pakujące | Clontech | 631458 | Produkcja retrowirusowa |
| Mieszanka składników odżywczych Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Hodowla komórkowa |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy z GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Hodowla komórkowa |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu | GE Healthcare | SH30022.01 | Zestaw |
| do oczyszczania plazmidu HiSpeed | QIAGEN | 12643 | Produkcja retrowirusowa |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Hodowla komórkowa |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automatyczne urządzenie do przetwarzania mesterny) |
| Membrana transferowa Immobilon-P (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| Zestaw do klonowania HD In-Fusion | Clontech | 639648 | Produkcja retrowirusowa |
| ITS Płynny suplement pożywki | Sigma-Aldrich | I3146 | Hodowla komórkowa |
| MILTEX HV 0,45 μ m filtr | MERCK | SLHV033RS | Produkcja retrowirusowa |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Elektroforeza mikroprocesorowa |
| MYOD1 (oznaczona GFP) | ORIGENE | RG209108 | Produkcja retrowirusowa |
| NanoDrop | Thermo Fisher | Spektrofotometr | ND-ONE-W |
| Aminokwasy endogenne | Thermo Fisher | 11140-050 | Hodowla komórkowa |
| NucleoSpin Żel i zestaw do czyszczenia PCR | Clontech | 740986.20 | Czyszczenie PCR |
| NuPAGE 3-8% Żele białkowe Tris-Acetate | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Przeciwutleniacz | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Bufor do próbek | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Środek redukujący próbki | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Sprawdzenie miana wektora retrowirusowego |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Zakażenie / Transfekcja polibrenu Odczynnik | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Infekcja retrowirusowa |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retrowirusowy vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Hodowla komórkowa |
| Zestaw QIAGEN OneStep RT-PCR | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Materiał do podłoża wzrostowego UDC |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Materiał do podłoża pierwotnego UDC |
| Zestaw mian retrowirusów | TAKARA | 6166 | Kontrola miana wektora retrowirusowego |
| Koncentrator Retro-X | Clontech | 631455 | Produkcja retrowirusowa |
| Bufor RIPA | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | Ekstrakcja RNA do PCR |
| Surowica bydlęca bez tetracyklin | Clontech | 631106 | Hodowla komórkowa |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsyna-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300054 | Hodowla komórkowa |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Odczynnik do transfekcji WB Xfect | Clontech | 631317 | Transfekcja plazmidów do komórek pakujących |
Bibliografia
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906(2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807(2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32(2016).
Przedruki i uprawnienia
