Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), postępująca i śmiertelna choroba mięśni, jest spowodowana mutacjami w genie DMD, które skutkują brakiem białka dystrofiny. Do tej pory zakończyliśmy zainicjowane przez badaczy pierwsze badanie na ludziach w Narodowym Centrum Neurologii i Psychiatrii oparte na ogólnoustrojowym wstrzykiwaniu oligonukleotydów morfolino, które są podatne na przeskakiwanie egzonu-53. Uważa się, że dla skutecznego leczenia DMD niezbędne są badania in vitro z mioblastami pochodzącymi od pacjentów z DMD w celu badania przesiewowego leków i oceny kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych. Całkiem niedawno opisaliśmy nową komórkę pochodzącą z moczu (UDC) przekształconą w MYOD1 leczoną inhibitorem metylotransferazy histonowej (chlorowodorek 3-deazaneplanocyny A), jako model komórkowy DMD. Nowy autologiczny UDC może wykazywać fenokopię specyficznych dla choroby fenotypów DMD, prowadząc do zastosowania medycyny precyzyjnej w różnych chorobach związanych z mięśniami. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania komórek mięśniowych DMD przy użyciu UDC przekształconych w MYOD1 wraz z reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR), Western blotting i immunocytochemią w celu oceny przywrócenia poziomów mRNA i białka dystrofiny po pominięciu eksonów.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), postępująca, śmiertelna choroba mięśni, jest spowodowana mutacjami w genie DMD, które skutkują brakiem białka dystrofiny¹. Uważa się, że terapia egzonów oparta na oligonukleotydach antysensownych jest obiecująca dla DMD. Terapia ta opiera się na konwersji cięższego fenotypu DMD na łagodniejszy fenotyp podobny do dystrofii mięśniowej Beckera poprzez zmianę splicingu pre-mRNA w celu przywrócenia ramki odczytu DMD². Niedawno zakończyliśmy pierwsze badanie z udziałem ludzi oparte na wielokrotnym podawaniu dożylnym viltolarsenu fosforodiamidanu morfolinooligomeru (PMO), który może indukować pomijanie eksonu 53 w DMD i wykazało doskonały profil bezpieczeństwa, obiecującą skuteczność i akceptowalne parametry farmakokinetyczne (zarejestrowane jako UMIN: 000010964 i ClinicalTrials.gov: NCT02081625)³.

Jednakże, aby opracować opłacalne i skuteczne metody leczenia choroby, testy in vitro z wykorzystaniem pierwotnych komórek mięśniowych uzyskanych od pacjentów z DMD są niezbędne do badań przesiewowych leków i weryfikacji kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych, a także biomarkery, które odzwierciedlają skuteczność terapii z pominięciem eksonów podczas badań na ludziach⁴. Całkiem niedawno informowaliśmy o nowatorskiej technologii rozwoju specyficznych dla pacjenta komórek pochodzących z moczu (UDC) przekształconych w MYOD1^5,6 jako podstawowy model mioblastów DMD⁷. Tak więc, aby wytworzyć mioblasty, wymagane jest tylko pobranie moczu od pacjentów i nie jest potrzebna żadna inwazyjna procedura. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół skutecznego modelowania mięśni DMD przy użyciu UDC z konwersją MYOD1 traktowanych chlorowodorkiem 3-deazaneplanocyny A w celu oceny przywróconego mRNA i białka dystrofiny po pominięciu eksonu.

Protokół

Komisja Etyki Narodowego Centrum Neurologii i Psychiatrii zatwierdziła to badanie (ID zatwierdzenia: A2017-018, A2018-029). Wszystkie osoby wyraziły świadomą zgodę przed oddaniem moczu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Izolacja i pierwotna kultura UDC

UWAGA: UDC zostały odizolowane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem^8,9^,10 z pewnymi modyfikacjami.

1. Próbki moczu należy pobierać podczas spontanicznego oddawania moczu do wysterylizowanych plastikowych butelek.
   UWAGA: Sterylizacja zewnętrznego ujścia cewki moczowej nie jest konieczna. Oddawanie moczu w środkowym strumieniu jest pożądane w celu zmniejszenia ryzyka zakażenia wirusowego. Jeżeli czas przygotowania do następnej procedury wynosi >1 godzinę, próbki moczu należy przenieść do temperatury 4 °C w celu zachowania żywotności komórek. Należy jednak unikać temperatury <4 °C, ponieważ mogą pojawić się nierozpuszczalne osady.
2. Odwirować całą próbkę moczu o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Odessać supernatant, pozostawiając 1 ml w probówce.
4. Ponownie zawiesić granulki pojedynczo w pozostałym 1 ml moczu, a następnie zebrać je w jednej probówce o pojemności 50 ml.
5. Dodać 10 ml buforu płuczącego składającego się z 99 ml PBS bez wapnia i magnezu, 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,5 μg/ml amfoterycyny B i odwirować próbki przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odessać supernatant, pozostawiając 0,2 ml w probówce.
7. Zawiesić osady komórkowe w 4,5 ml pożywki pierwotnej składającej się z mieszaniny 1:1 zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu i mieszanki składników odżywczych F-12 Hama uzupełnionej rekombinowanym ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), insuliną, hydrokortyzonem, epinefryną, T3, transferyną, 10% surowicą płodową (FBS) wolną od tetracykliny, 1% P/S, i 0,5 μg/ml amfoterycyny B.
8. Wysiewaj komórki w trzech dołkach pokrytych żelatyną sześciodołkowych płytek (całkowita objętość każdej studzienki: 1,5 ml). Kultura nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
9. Dodawaj 1,5 ml pożywki podstawowej dziennie przez następne 3 dni.
10. W 4 dniu zastąp pożywkę 1,5 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej rekombinowanym ludzkim EGF, insuliną, hydrokortyzonem, epinefryną, T3, transferyną, 15% FBS bez tetracykliny, 0,5% L-alaniny-L-glutaminy, 0,5% aminokwasów endogennych i 2,5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF), EGF i 1% P/S.
11. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
    UWAGA: Kolonie UDC pojawiają się w ciągu tygodnia.
12. Gdy hodowla UDC stanie się zlewająca w 80−90%, usuń pożywkę i umyj komórki PBS, podziel wszystkie komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i wysiew w 3,000-5,000 komórek/^cm2 na nowym, pokrytym żelatyną naczyniu o średnicy 60 mm (przejście 1).
    UWAGA: UDC mogą być przechowywane w ciekłym azocie. UDC są zwykle dzielone przy zbieganiu 60−70% w naczyniu hodowlanym 60 mm na trzy probówki podstawowe.

2. Konstrukt retrowirusowy

1. Amplifikuj region kodujący plazmidu MYOD1 (NM_002478.4) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
   UWAGA: Mieszanina do amplifikacji MYOD1 i warunki dla termocyklera są pokazane odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2.
2. Wykryj pojedyncze pasmo o wielkości około 1,000 pz za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o 0,7% przy użyciu 1 μl amplifikowanego produktu PCR, aby potwierdzić, że sekwencja MYOD1 została pomyślnie amplifikowana.
3. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu czyszczącego i określ jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
4. Mieszaninę inkubować w sposób przedstawiony w tabeli 3 w temperaturze 37 °C przez noc w celu wytrawienia wektora retrowirusowego z systemem Tet-on i genem opornym na puromycynę w regionach docelowych dla enzymów restrykcyjnych w miejscu wielokrotnego klonowania.
5. Wykryj pojedyncze prążek za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,7%, używając 1 μl strawionego produktu, aby potwierdzić, że wektor retrowirusowy został pomyślnie strawiony.
6. Oczyścić strawiony produkt za pomocą zestawu do czyszczenia i oznaczyć jego stężenie za pomocą spektrofotometru.
7. Aby sklonować amplifikowany fragment MYOD1 (wytwarzany przez kroki 2.1−2.3) do strawionego wektora retrowirusowego (wytwarzanego przez etapy 2.4−2.6), należy przeprowadzić reakcję klonowania w fuzji. Ustawić reakcję zgodnie z tabelą 4, inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 50 °C, a następnie umieścić na lodzie.
8. Przeprowadzić transformację przy użyciu komórek kompetentnych dla E. coli zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
9. Wybrać przekształcone kompetentne komórki, hodując je na płytce hodowlanej LB składającej się z 10 g/l baktotryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego bakto, 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru baktonowego i 50 mg/l ampicyliny.
10. Pobrać wybraną kolonię i kulturę w pożywce hodowlanej LB bez agaru baktonowego z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc.
11. Oczyść wektory retrowirusowe wprowadzone przez MYOD1 za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu (tabela materiałów) i oznacz ilościowo za pomocą spektrofotometru.
12. Potwierdzić, że MYOD1 jest prawidłowo wprowadzony do wektora retrowirusowego poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie produktu PCR amplifikowanego przez startery do przodu i do tyłu skierowane odpowiednio po obu stronach w poprzek wstawionej sekwencji MYOD1.
    UWAGA: Sekwencję MYOD1 można wykryć umieszczoną pomiędzy sekwencjami wektorów retrowirusowych, gdy klonowanie w fuzji zakończy się sukcesem.
13. W przypadku produkcji retrowirusowej wysiewaj komórki opakowania w ilości 50 000 komórek/^cm2 na 10-centymetrowych płytkach pokrytych kolagenem i hoduj w DMEM z 10% FBS nawilżonym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
14. Gdy komórki opakowania rozmnożą się do 80% konfluencji, wymieszaj 30 μg wektorów retrowirusowych z wprowadzoną MYOD1, 30 μg wektorów opakowaniowych i odczynnika do transfekcji zawierającego peptyd penetrujący komórki (tabela materiałów) przez wirowanie i inkubuj je przez 10 minut.
15. Dodać inkubowaną mieszaninę do pożywki komórek opakowaniowych i kultury zwilżonej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
    UWAGA: Konieczne jest powlekanie kolagenem. Transfekcja może być lepsza po 24 godzinach lub więcej po wysiewie, ponieważ komórki pakujące łatwo odrywają się od płytki hodowlanej.
16. Po 4 godzinach lub nocy zmień podłoże na świeże.
17. Zebrać supernatant wirusa i zastąpić go świeżą pożywką po 24 i 48 godzinach od kotransfekcji i połączyć supernatant.
18. Aby zagęścić supernatant wirusa, należy go zmieszać z odczynnikiem koncentratora i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie odwirować w temperaturze 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
19. Przefiltrować supernatant retrowirusa przez filtr PVDF z porami 0,45 μm.
20. Sprawdź miano wektora retrowirusowego za pomocą ilościowego zestawu do PCR i systemu termocyklera zgodnie z instrukcjami producenta.
21. Podzielić supernatant wirusa na małe porcje i umieścić je w temperaturze -80 °C.

3. Zakażenie wektorem retrowirusowym MYOD1 w UDC

1. Wysiewaj UDC w ilości 3 000-5 000 komórek/^cm2 na pokrytej żelatyną szalce o średnicy 60 mm.
2. Po 24 godzinach od wysiewu zainfekować rozmrożonego retrowirusa (krok 2.21) przy wielokrotności infekcji 200, dodając bromek heksadimetryny o stężeniu 8 μg/ml.
3. Po 24 godzinnej inkubacji nawilżonej w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 należy} zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą 1 μg/ml puromycyny, aby wybrać komórki transdukowane MYOD1. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
   UWAGA: Podczas selekcji komórek MYOD1-dodatnich do selekcji zwykle używa się puromycyny 1 μg / ml. Należy ustalić odpowiednią dawkę. Użyj płytki zawierającej nietransfekowane komórki i wybierz dawkę, która zabije wszystkie komórki w ciągu 3-5 dni. Komórki MYOD1-dodatnie należy wybrać w ciągu 7-10 dni po dodaniu puromycyny. UDC transdukowane przez MYOD1 mogą być przechowywane w ciekłym azocie.

4. Miogenne różnicowanie UDC transdukowanych przez MYOD1 leczonych chlorowodorkiem 3-deazaneplanociny A (DZNep)

UWAGA: Ostatnio doniesiono, że DZNep, inhibitor metylotransferazy histonowej, może znacząco promować ekspresję MYOGENINY, jednego z późnych czynników regulujących mięśnie, a także prowadzić do różnicowania miotube⁷.

1. Płytkowe UDC transdukowane MYOD1 w studzienkach pokrytych kolagenem o gęstości 3,5 x 10⁴ komórek/cm². Kultura nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Po 24 godzinach zmień pożywkę wzrostową na pożywkę różnicującą składającą się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-alaniną-L-glutaminą, 5% surowicy końskiej, suplementu ITS, 1 μg/ml doksycykliny i 5 μM DZNep.
   UWAGA: Roztwór 10 mM DZNep można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 miesiące. Używaj zamrażarki do rozmrażania i unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Zarówno MYOD1 aktywowany przez doksycyklinę, jak i DZNep hamują proliferację i promują miogenne różnicowanie UDC. Dlatego zaleca się dodanie doksycykliny i DZNep po indukcji różnicowania miogennego. DZNep wspomaga miogenne różnicowanie MYOD1-UDC w sposób zależny od dawki. Z drugiej strony wykazuje cytotoksyczność w wysokim stężeniu. Dlatego należy określić odpowiednie stężenie DZNep, w zakresie od 1−10 μM w zależności od jego wpływu na różnicowanie miogenne i biodostępność komórkową.
3. Po 3 dniach zmień pożywkę różnicującą na świeżą pożywkę różnicującą bez DZNep. Następnie zmieniaj podłoże co 3 dni.
   UWAGA: UDC łączą się ze sobą i tworzą rurki mięśniowe w ciągu 1-2 tygodni po różnicowaniu.

5. Przeskakiwanie eksonów w UDC konwersji MYOD1

UWAGA: Tutaj opisane są trzy protokoły oceny pomijania eksonów w komórkach pochodzących od pacjentów: 1) reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) mRNA dystrofiny; 2) półkwantyfikacja przywróconego sygnału białkowego dystrofiny za pomocą Western blot; oraz 3) półkwantyfikacja przywróconego sygnału fluorescencji dystrofiny za pomocą immunocytochemii. Wszystkie metody mogą wykrywać przeskakiwanie eksonów w sposób zależny od dawki.

1. Ocena skuteczności pomijania eksonów metodą RT-PCR
   1. Aby transfekować oligonukleotyd antysensowny (ASO) do UDC przekształconych w MYOD1 uzyskanych od pacjentów z DMD w 7 dniu po różnicowaniu, należy zmieszać ASO, odczynnik do transfekcji (tabela materiałów) i pożywkę różnicującą do końcowego stężenia 1−10 μM. Hodowla nawilżana w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Po 72 godzinach inkubacji z ASO zmienić pożywkę na świeżą pożywkę różnicującą bez ASO.
   3. Od 3−7 dni po transfekcji ASO usunąć pożywkę różnicującą i przemyć 1x PBS. Dodaj bufor do lizy komórek, zlizuj UDC i zbierz całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
   4. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
   5. Połączyć wymagane odczynniki do jednoetapowej reakcji RT-PCR w probówkach PCR zgodnie z tabelą 5.
   6. Umieść probówki PCR z mieszaniną w termocyklerze. Uruchom termocykler zgodnie z Tabelą 6.
   7. Wykonaj elektroforezę mikroczipową i oblicz efektywność przeskakiwania eksonów, korzystając ze stężenia molowego, jak poniżej.
      Efektywność pomijania eksonów (%) = pominięte pasmo / (pominięte pasmo + niepominięte pasmo) x 100
      UWAGA: Produkt PCR należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
2. Wykrywanie dystrofiny po przeskakiwaniu eksonów przez Western blotting
   1. Transfekcyjna ASO i hodowla MYOD1-UDC zgodnie z krokami 5.1.1 i 5.1.2.
   2. Zmieniaj podłoże co 3 dni.
   3. Po 2 tygodniach różnicowania należy wyekstrahować całkowite białko z hodowanych komórek za pomocą buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) zawierającego inhibitory proteazy.
   4. Sonikować lizaty na lodzie i odwirowywać przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Zebrać supernatant i oznaczyć stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
   6. Dodać 15 μg białka całkowitego do probówki o pojemności 0,5 ml i rozcieńczyć, dodając bufor RIPA zawierający inhibitory proteazy do całkowitej objętości 10 μl. Uruchomić 15 μg białka całkowitego na pas
   .
   7. Dodać bufor próbki, środek redukujący i wodę dejonizowaną, jak pokazano w tabeli 7. Denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze 70 °C przez 10 min.
   8. Przygotować bufor tris-acetatowy zawierający 8,95 g/l trycyny, 6,06 g/l zasady tris, 1,0 g/l dodecylosiarczanu sodu (SDS).
   9. Załadować próbkę (20 μl) na 3-8% żel tris-acetat i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 150 V przez 75 minut.
   10. Przygotować bufor do bibuły bez metanolu.
   11. Namocz membranę PVDF przez 20 s w metanolu, a następnie w buforze do bibuły do użycia (co najmniej 10 min). Przytnij membranę PVDF do rozmiaru 6 x 8 cm za pomocą mini żeli i 8 x 12 cm za pomocą żeli midi.
   12. Pokrój bibułę do tego samego rozmiaru, co membrana PVDF i namocz je w buforze bibułkowym do czasu użycia.
   13. Po elektroforezie pokrój żel do tego samego rozmiaru, co membrana PVDF i namocz żel w wodzie destylowanej.
   14. Umieść bibuły, membranę PVDF i żel na półsuchym aparacie transferowym (Rysunek 1). Przenoszenie przy 4 mA/^cm2 przez 30 min.
   15. Przepłukać membranę 2x wodą destylowaną.
   16. Przygotuj przeciwciało anty-dystrofiny (1:500) i przeciwciało anty-α-tubuliny (1:1,200) jako przeciwciała pierwszorzędowe.
   17. Przygotuj przeciwciało anty-mysie sprzężone z HRP (1:100) jako przeciwciało drugorzędowe.
   18. Inkubować błony z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przemyć buforem do przemywania wodą, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przy użyciu zautomatyzowanego zachodniego urządzenia do przetwarzania (Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej.
       UWAGA: Przeciwciało anty-α-tubuliny jest zwykle stosowane jako kontrola obciążenia. Mieszane roztwory przeciwciał pierwotnych, w tym przeciwciała anty-dystrofiny 1:500 i 1:1,200 przeciwciała anty-α-tubuliny, działają dobrze, gdy reakcja przeciwciał jest wykonywana jednocześnie.
   19. Przepłucz membranę w wodzie destylowanej.
   20. Wykrywanie białek za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika detekcyjnego i kamery, opartej na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
   21. Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
3. Wykrywanie dystrofiny po pominięciu eksonu za pomocą immunocytochemii
   1. Bezpośrednio przeprogramuj UDC do miotub w pokrytej kolagenem płytce 96-dołkowej zgodnie z krokami 4.1−4.3.
   2. Przetransfekować ASO i hodowlę MYOD1-UDC zgodnie z krokami 5.1.2 i 5.1.3.
   3. Po 2 tygodniach różnicowania przemyć komórki PBS i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Przepuszczalność MYOD1-UDC w 0,1% niejonowym detergencie przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zablokowanie tych 10% koziej surowicy na 15 minut w temperaturze 37 °C.
   5. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C.
   6. Umyj komórki PBS i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W tym przypadku mysia anty-dystrofina (1:30) jest używana jako przeciwciało pierwszorzędowe, anty-mysie IgG jest używana jako przeciwciało drugorzędowe, a Hoechst (1:10 000) jest używany do barwienia jąder.
   7. Zobrazuj płytki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i użyj analizatora, aby automatycznie określić ilościowo sygnał fluorescencji w każdym dołku w tych samych warunkach.

Wyniki

Moglibyśmy łatwo i bezinwazyjnie zbierać UDC. UDC utworzyły kolonie w ciągu tygodnia od rozpoczęcia pierwotnej hodowli komórek, zaobserwowaliśmy wyraźną zdolność proliferacyjną. Posiew UDC był prosty, a zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze było rzadkie, jeśli procedura została wykonana prawidłowo.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym kolonii UDC tydzień po hodowli podstawowej (Rysunek 2A) i MYOD1-UDC tydzień po różnicowaniu (Rysunek 2B). Rysunek 3 pokazuje udane wykrycie przeskakiwania eksonów w UDC uzyskanych od pacjentów z DMD za pomocą RT-PCR. Rysunek 3A przedstawia analizę RT-PCR dystrofiny po leczeniu antysensownym oligonukleotydem w MYOD1-UDC pochodzącym od 6-letniego mężczyzny z delecją eksonu 45-54 w genie DMD. Otwarta ramka odczytu została przywrócona przez przeskakiwanie eksonu 44. W 14 dniu po różnicowaniu potwierdziliśmy indukcję pomijania eksonów w sposób zależny od dawki (Figura 3B). Górne pasma oznaczają produkty rodzime, a dolne pasma oznaczają produkty pominięte w eksonie 44, które przywróciły otwartą ramkę odczytu.

Rysunek 4 pokazuje skuteczne wykrycie dystrofiny po pominięciu eksonu w UDC uzyskanych od pacjentów z DMD metodą Western blotting w sposób zależny od dawki. Wykryliśmy również przywróconą ekspresję dystrofiny za pomocą immunocytochemii (Ryc. 5). Zmierzyliśmy intensywność dystrofiny za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 1 tydzień po transfekcji oligonukleotydu antysensownego (ASO) na 96-dołkowej płytce (Rysunek 5A). Znacznie wyższe sygnały fluorescencyjne zaobserwowano u MYOD1-UDC traktowanych ASO niż u MYOD1-UDC leczonych kontrolnym ASO (Figura 5B).

Te wyniki sugerują, że nasz nowy test może skutecznie ocenić przeskakiwanie eksonów w MYOD1-UDC uzyskanych od pacjentów z DMD na poziomie mRNA i białka.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie stosu transferowego dla półsuchego Western blot. Dwie papiery nasączone buforem bibułkowym zostały ułożone na ujemnym końcu, a dwie papiery namoczone w buforze zostały ułożone na wierzchu. Żel, który został nasączony w buforze, został delikatnie ułożony na membranie PVDF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy UDC. (A) Obraz z kontrastem fazowym UDC tydzień po posiewie pierwotnym. Podziałka = 200 μm. Wstawka: Powiększony obraz obszaru w białym prostokącie. (B) Obraz z kontrastem fazowym MYOD1-UDC tydzień po różnicowaniu. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Takizawa et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Pomyślna ocena pomijania eksonów w komórkach pochodzących z moczu (UDC) uzyskanych od pacjentów z DMD metodą RT-PCR. (A) Analiza RT-PCR dystrofiny po leczeniu oligonukleotydem antysensownym w MYOD1-UDC traktowanych chlorowodorkiem 3-deazaneplanociny A (DZNep) pochodzących od pacjenta z dystrofią mięśniową Duchenne'a (DMD) z delecją eksonu 45-54. MYOD1-UDC traktowane DZNep traktowano również antysensem kontrolnym w stężeniu 1-10 μM jako kontrole. Górne pasma były produktami niepominiętymi (usunięcie Ex 45-54), które pozostały poza ramką odczytu. Dolne pasma były produktami z pominięciem eksonu 44 (delecja Ex 44-54 i pominięcie Ex 44), które przywracały otwartą ramkę odczytu. (B) Efektywność pomijania obliczono jako (molarność transkryptu z pominięciem eksonu 44)/(molarność transkryptu z pominięciem eksonu 44 [oznaczona strzałkami]) x 100% przy użyciu systemu elektroforezy mikroprocesorowej. Do porównania efektywności przeskakiwania wykorzystano jednoczynnikową ANOVA, a następnie test post hoc Bonferroniego (n = 3 dla każdej grupy, ****P < 0,0001). Dane są wyrażone jako średnia ± SEM. Ten rysunek został zmodyfikowany z Takizawa et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Skuteczna ocena pomijania eksonów w komórkach pochodzących z moczu (UDC) od pacjentów z DMD za pomocą Western blot. (A) Reprezentatywny Western blot dla dystrofiny w MYOD1-UDC leczonych DZNep od pacjenta z DMD z delecją eksonu 45-54 po pominięciu eksonu 44. Do wykrywania dystrofiny stosowano antydystrofinę (przeciwko C-końcowemu). (B) Względne intensywności prążków znormalizowanych do ekspresji α-tubuliny porównano w komórkach pochodzących od pacjentów z antysensownym leczeniem oligonukleotydami i bez niego, wykonując jednoczynnikową ANOVA, a następnie test post hoc Bonferroniego (n = 3 dla każdej grupy, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI = zdrowa osoba). Ten rysunek został zmodyfikowany z Takizawa et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Mapy cieplne immunocytochemii dystrofiny po leczeniu oligonukleotydem antysensownym w MYOD1-UDC traktowanych DZNep uzyskanych od pacjenta z DMD z delecją eksonu 45-54. (A) Usunięcie eksonu 45-54 przywróciło otwartą ramkę odczytu w oparciu o pominięcie eksonu 44. (B) Intensywność sygnału określono ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego po 1 tygodniu transfekcji antysensownych oligonukleotydów na 96-dołkowej płytce. Do porównania wykorzystano jednoczynnikową ANOVA, a następnie test post hoc Bonferroniego (n = 3-4 dla każdej grupy, ****P < 0,0001). Ten rysunek został zmodyfikowany z Takizawa et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnik	głośność	Końcowe stężenie
2x premiks PCR	12,5 μl	1x
Podkład do przodu	5 pmol	0,2 μM
Odwrócony podkład	5 pmol	0,2 μM
szablon	80 ng
Sterylizowana woda destylowana	do 25 μL
Całkowita objętość na reakcję	25 μL

Tabela 1: Mieszanina do amplifikacji MYOD1 metodą RT-PCR.

98 °C	10 sekund
55 °C	10 sekund	} 35 cykli
72 °C	10 sekund

Tabela 2: Warunki dla termocyklera dla wzmocnienia MYOD1.

Odczynnik	głośność
10x bufor K	2 μl
Wektor retrowirusowy (500 ng/μL)	2 μl
Enzym restrykcyjny 1 (2−15 U)	1 μL
Enzym restrykcyjny 2 (2−15 U)	1 μL
Sterylizowana woda destylowana	14 μL
Całkowita objętość	20 μL

Tabela 3: Mieszanina do probówki do trawienia wektora retrowirusowego.

Odczynnik	głośność
Oczyszczony fragment MYOD1	100 ng
Strawiony wektor retrowirusowy	100 ng
5x Premiks enzymatyczny	4 μl
Sterylizowana woda destylowana	do 20 μL
Całkowita objętość	20 μL

Tabela 4: Mieszanina do reakcji klonowania w fuzji.

rozwiązanie	Objętość/reakcja (μL)	Końcowe stężenie
Woda wolna od RNaz	zmienna	-
Jednoetapowy bufor RT-PCR	4	1x
Mieszanina dNTP (zawierająca 10 mM każdego dNTP)	0,8	400 mM każdego dNTP
Podkład do przodu (10 mM)	Rozdział 1.2	0,6 mM
Podkład odwrotny (10 mM)	Rozdział 1.2	0,6 mM
Jednoetapowa mieszanina enzymów RT-PCR	0,8	-
Inhibitor RNazy (opcjonalnie)	zmienna	5−10 jednostek/reakcję
Matryca RNA	50−400 ng
Całkowita objętość	20

Tabela 5: Niezbędne związki do jednej reakcji jednoetapowego RT-PCR.

1 cykl	Odwrotna transkrypcja	Czas trwania: 30 min	50 °C
1 cykl	Wstępny etap aktywacji PCR	Czas trwania: 15 min	95 °C
1 cykl	denaturacja	1 min	94 °C
	Wyżarzanie	1 min	60 °C
	rozszerzenie	1 min	72 °C
1 cykl	Końcowe przedłużenie	Czas trwania: 7 min	72 °C
trzymać		∞	4 °C

Tabela 6: Stan termocyklera dla jednoetapowego RT-PCR.

Odczynnik	głośność
Białko (15 μg)	10 μL
Bufor próbki (4x)	5 μL
Środek redukujący (10x)	2 μl
Dejonizowana	3 μL
Całkowita objętość	20 μL

Tabela 7: Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomijania eksonów w UDC przekształconych w MYOD1 uzyskanych od pacjentów z DMD. Korzystając z systemu testowego, skutecznie przesiewaliśmy optymalne sekwencje antysensowne. Zakładamy, że UDC przekształcone w MYOD1 mogą być przydatne do badania patofizjologii choroby.

Ocena pomijania eksonów przy użyciu komórek pochodzących od pacjenta na poziomie mRNA jest niezbędna do badań przesiewowych nowych leków i oceny kwalifikowalności pacjenta przed podjęciem badań klinicznych. Obliczenie efektywności pomijania eksonów można ocenić tylko na poziomie mRNA.

Ocena pomijania eksonów na poziomie białka jest również ważna, ponieważ odbudowa dystrofiny jest ważna jako zastępczy biomarker do przewidywania korzyści z pomijania eksonów. Do tej pory badania przesiewowe antysensownych sekwencji oligonukleotydowych są często wykonywane przy użyciu pierwotnych linii komórek mięśniowych lub nieśmiertelnych linii komórkowych mioblastów, w tym ludzkich komórek mięsaka prążkowanokomórkowego (RD), ale nie możemy zmierzyć odzyskiwania poziomów dystrofiny za pomocą linii komórek mięśniowych lub linii komórkowych RD, ponieważ wyrażają one to białko endogennie. Możemy wyraźnie wykryć przywrócenie dystrofiny w MYOD1-UDC pochodzących od pacjentów z DMD w sposób zależny od dawki. W naszym nowym teście uważamy, że ocena przywróconego białka za pomocą Western blotting jest lepsza pod względem kwantyfikowalności. Z drugiej strony, ocena za pomocą immunocytochemii przy użyciu 96-dołkowych płytek jest idealna do jednoczesnego badania przesiewowego wielu potencjalnych związków.

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół skutecznego modelowania mięśnia DMD przy użyciu UDC przekształconych w MYOD1 wraz z RT-PCR, Western blotting i immunocytochemią w celu oceny przywróconej dystrofiny na poziomie mRNA i białka po pominięciu eksonów. UDC można zbierać nieinwazyjnie i łatwo. Dlatego zakładamy, że zupełnie nowy test in vitro może być zastosowany w szerokim zakresie badań podstawowych i translacyjnych, niezależnie od rodzaju zaburzeń mięśniowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% Stabilizowany roztwór P / S	Thermo Fisher	15070-063	Hodowla komórkowa
Amfoterycyna B	Sigma Aldrich	A2942
Anty-dystrofina	Abcam	ab15277	Western blot (WB)
Anty-dystrofina	Leica	NCL-DYS1	Immunocytochemia (ICC)
Anty-mysia IgG, Dylight 488	Vector Laboratories	DK-2488	ICC
Anty-&alfa-tubulina	Sigma	T6199	Western bot i ICC
BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	Mikroskop fluorescencyjny
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	Zapas komórek w ciekłym azocie
ChemiDoc MP System obrazowania	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR premix	Clontech	639298	Produkcja retrowirusowa
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001	Ekstrakcja białka dla WB
E.coli DH5 i alfa; Kompetentne komórki	TAKARA	9057
ECL Prime Western Blotting Detection Odczynnik	GE healthcare	RPN2232	WB
EGF	Peprotech	AF-100-15	Hodowla komórkowa
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	transfekcja ASO
Bibuła filtracyjna o bardzo grubej plamie	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Czynnik wzrostu fibroblastów Atto	AE-1460	WB-zasadowy
	Sigma-Aldrich	F0291	Hodowla komórkowa
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Hodowla komórkowa
GP2-293 Komórki pakujące	Clontech	631458	Produkcja retrowirusowa
Mieszanka składników odżywczych Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	11765-054	Hodowla komórkowa
DMEM o wysokiej zawartości glukozy z GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	Hodowla komórkowa
DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu	GE Healthcare	SH30022.01	Zestaw
do oczyszczania plazmidu HiSpeed	QIAGEN	12643	Produkcja retrowirusowa
Histofine Simple Stain MAX PO	NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
Human PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	Hodowla komórkowa
iBind Flex Solution	Thermo Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex Western Device	Thermo Fisher Scientific	SLF2000	WB (Automatyczne urządzenie do przetwarzania mesterny)
Membrana transferowa Immobilon-P (PVDF)	MERCK	IPVH304F0	WB
Zestaw do klonowania HD In-Fusion	Clontech	639648	Produkcja retrowirusowa
ITS Płynny suplement pożywki	Sigma-Aldrich	I3146	Hodowla komórkowa
MILTEX HV 0,45 μ m filtr	MERCK	SLHV033RS	Produkcja retrowirusowa
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Elektroforeza mikroprocesorowa
MYOD1 (oznaczona GFP)	ORIGENE	RG209108	Produkcja retrowirusowa
NanoDrop	Thermo Fisher	Spektrofotometr	ND-ONE-W
Aminokwasy endogenne	Thermo Fisher	11140-050	Hodowla komórkowa
NucleoSpin Żel i zestaw do czyszczenia PCR	Clontech	740986.20	Czyszczenie PCR
NuPAGE 3-8% Żele białkowe Tris-Acetate	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE Przeciwutleniacz	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS Bufor do próbek	Invitrogen	NP0007	WB
NuPAGE Środek redukujący próbki	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041	WB
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit	TAKARA	RR066A	Sprawdzenie miana wektora retrowirusowego
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Scientific	23227	WB
Zakażenie / Transfekcja polibrenu Odczynnik	Sigma-Aldrich	TR-1003	Infekcja retrowirusowa
pRetroX-TetOne-Puro Vector	Clontech	634307	Retrowirusowy vecor
Puromycin	Clontech	631305	Hodowla komórkowa
Zestaw QIAGEN OneStep RT-PCR	Qiagen	210212	PCR
REGM Bullet Kit	Lonza	CC-3190	Materiał do podłoża wzrostowego UDC
REGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	Materiał do podłoża pierwotnego UDC
Zestaw mian retrowirusów	TAKARA	6166	Kontrola miana wektora retrowirusowego
Koncentrator Retro-X	Clontech	631455	Produkcja retrowirusowa
Bufor RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901	WB
RNeasy kit	Qiagen	74104	Ekstrakcja RNA do PCR
Surowica bydlęca bez tetracyklin	Clontech	631106	Hodowla komórkowa
Triton-X	MP Biomedicals	9002-93-1	ICC
Trypsyna-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054	Hodowla komórkowa
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001
Odczynnik do transfekcji WB Xfect	Clontech	631317	Transfekcja plazmidów do komórek pakujących