Artykuł metodologiczny

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

DOI:

10.3791/61776

⸱

6 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja uwalniania wapnia indukowana przez wapń (CICR) odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych. Każda aktywność komórkowa, od proliferacji i apoptozy komórek, rozwoju i starzenia się, po plastyczność i regenerację synaps neuronów, jest związana z receptorami Ryanodine (RyR). Pomimo znaczenia sygnalizacji wapniowej, dokładny mechanizm jej funkcji we wczesnym rozwoju jest niejasny. Jako organizm o krótkim okresie ciąży, zarodki Drosophila melanogaster są głównymi obiektami badań nad dystrybucją i lokalizacją białek związanych z CICR i ich regulatorów podczas rozwoju. Jednak ze względu na ich bogate w lipidy zarodki i bogatą w chitynę kosmówkę, ich użyteczność jest ograniczona przez trudność montażu zarodków na szklanych powierzchniach. W tej pracy przedstawiamy praktyczny protokół, który znacznie poprawia przyczepianie zarodka Drosophila do szkiełek i szczegółowe metody udanej histochemii, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ. Metoda powlekania szkiełka z żelatyny chromowo-alumnowej i metoda wstępnego zatapiania zarodków znacznie zwiększa wydajność badania ekspresji białka zarodka Drosophila i RNA. Aby zademonstrować to podejście, zbadaliśmy DmFKBP12 / Calstabin, dobrze znany regulator RyR podczas wczesnego rozwoju embrionalnego Drosophila melanogaster. Zidentyfikowaliśmy DmFKBP12 już w stadium blastodermy syncytialnej i opisujemy dynamiczny wzorzec ekspresji DmFKBP12 podczas rozwoju: początkowo jako równomiernie rozmieszczone białko w blastodermie syncytialnej, następnie wstępnie lokalizujące się w warstwie podstawnej kory podczas blastodermy komórkowej, zanim rozprowadza się w prymitywnej architekturze neuronalnej i trawiennej podczas fazy warstwy trzech klejnotów we wczesnej gastrulacji. Ten rozkład może wyjaśniać krytyczną rolę, jaką RyR odgrywa w ważnych układach narządów, które wywodzą się z tych warstw: zwoju podprzełykowym i nadprzełykowym, brzusznym układzie nerwowym i układzie mięśniowo-szkieletowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja uwalniania wapnia indukowana wapniem (CICR) odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, takich jak funkcjonowanie mięśni szkieletowych/gładkich i naczyń sercowych, proliferacja i apoptoza komórek, rozwój, starzenie się, plastyczność synaptyczna neuronów i regeneracja1,2,3,4,5,6. Receptory ryanodyny (RyRs) i receptory 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3Rs) są głównymi graczami w szlaku sygnałowym wapnia kontrolowanym przez ich regulatory: kinazę białkową A (PKA), kinazę białkową Ca2+/kinazę białkową zależną od kalmoduliny II (CaMKII), białka wiążące FK506 (FKBPs), kalsekwestrynę (CSQ), triadynę i junctin1,2,3,4,5,6. Nieprawidłowa ludzka ekspresja i mutacje w tych białkach mogą prowadzić do patologicznej fizjologii, takiej jak arytmie7 i proliferacja onkogenna8,9.

FKBPs regulują uwalnianie wapnia z siatkowatej komórki endoplazmatycznej (ER) przez RyRs. Proces ten jest niezbędny dla mechanizmu skurczu, a tym samym odpowiada za wszystkie ruchy mechaniczne generowane przez skurcz miozyny-aktyny poprzez indukowane wapniem uwalnianie wapnia wraz z embrionalnym RyRs1,2. W modelach mysich brak RyR2 i jego regulatora FKBP12/Calstabin jest niezmiennie śmiertelny, zarówno podczas rozwoju embrionalnego, jak i we wczesnym okresie poporodowym10,11,12. Myszy z nokautem FKBP12/Calstabin wykazują krytyczne wady serca z nieregularnym sprzężeniem pobudzenie-skurcz (EC) i obrzękiem mózgu podczas rozwoju embrionalnego. Wskazuje to, że FKBP12/Calstabin odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji kanału RyR2, co jest ważne zarówno dla rozwoju serca, jak i mózgu10.

RyR przewodzone iskry wapnia zostały początkowo odkryte w fazie tworzenia zygoty zapłodnionych jaj Medaka13,14. Przeprowadzono jednak niewiele badań nad funkcją sygnalizacji wapniowej we wczesnym rozwoju embrionalnym. U Drosophila melanogaster wyniki uzyskane z mutantów DmFKBP12 S107 dostarczają mocnych dowodów potwierdzających znaczenie tego genu dla rozwoju larw i zdrowej długości życia, co przypisuje się jego funkcji przeciwko stresowi oksydacyjnemu15,16. Niedawno zidentyfikowaliśmy dynamiczną lokalizację białka FKBP12/Calstabin i informacyjnego RNA podczas wczesnego rozwoju Drosophila melanogaster17. Korzystając z podejść opisanych w tej metodologii, byliśmy w stanie śledzić ekspresję FKBP12 / Calstabin w D. melanogaster podczas blastodermy syncytialnej (0-2 h), blastodermy komórkowej (2-3 h), wczesnej gastruli (3-12 h) i późnej gastruli (12-24 h). W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły każdego podejścia w poprzednim badaniu, w tym osadzanie pre-embrionu w celu klasycznego cięcia parafinowego, leczenie szkiełkami przed powlekaniem skrawków embrionalnych, barwienie histochemiczne i barwienie immunologiczne oraz hybrydyzację mRNA in-situ w celu identyfikacji ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie talerzy agarowych z sokiem winogronowym

  1. Dodać 5 g agaru i 5 g sacharozy do 150 ml wody destylowanej. Gotuj w kuchence mikrofalowej, aż agar i sacharoza całkowicie się rozpuszczą. Wymieszaj ze sobą 50 ml 100% soku winogronowego i roztwór.
  2. Dodaj 1 ml 100% kwasu propionowego, aby uzyskać końcowe stężenie do 0,5% kwasu propionowego. Wlej 25 ml przygotowanego roztworu do każdej płytki. Po zestaleniu się agaru przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C.

2. Szkiełka do powlekania

  1. Wstępnie potraktuj szkiełka detergentem. Umyj szkiełka 3 razy wodą z kranu i raz wodą destylowaną. Następnie suszyć szkiełka w piekarniku o temperaturze 45 °C przez 2 godziny.
  2. Zanurz szkiełka w około 450 ml roztworu dichromianu potasu i kwasu siarkowego (20 g dichromianu potasu, 40 ml wody destylowanej i 400 ml stężonego kwasu siarkowego) na 24 godziny. Umyj szkiełka 3 razy wodą z kranu i raz wodą destylowaną.
    1. Suszyć szkiełka w piekarniku o temperaturze 45 °C przez dwie godziny. Zanurz w 95% etanolu na ponad 2 godziny.
  3. Dodać 0,5 g siarczanu chromowo-potasowego i 5 g żelatyny do 1 l wody destylowanej. Przed użyciem rozpuścić w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Żelatyna chromowo-ałunowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez długi czas.
  4. Upuść 10 μl żelatyny chromowo-ałunowej na szkiełko podstawowe i całkowicie i równomiernie pokryj roztworem całą powierzchnię szkiełka. Umieścić szkiełko żelatynową stroną do góry w suszarce nagrzanej do 42 °C na 48 godzin. Tak przygotowane szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok. Konieczna jest pełna powłoka. W przypadku muszki owocowej i jej zarodka to podejście do powlekania szkiełkowego wydaje się bardziej skuteczne niż powlekanie polilizyną.

3. Osadzanie zarodków Drosophila

  1. Kolekcja zarodków Drosophila
    UWAGA: Pobraliśmy zarodki Drosophila w czterech okresach 0-2 godzin (blastoderma syncytialna), 2-3 godzin (blastoderma komórkowa), 3-12 godzin (wczesna gastrula) i 12-24 godziny (późna gastrula)18. Proporcje głównych typów zarodków w każdym okresie przedstawiono w tabeli 1.
    1. Umieść 400-500 much w plastikowej butelce do zbierania i przykryj butelkę talerzem agarowym z sokiem winogronowym zawierającym ekstrakt drożdżowy. Zarodki Drosophila układa się na agarze z sokiem winogronowym w temperaturze pokojowej.
    2. Zebrać cztery okresy zarodków, delikatnie dodając 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) do każdej płytki, aby unosić zarodki. Przenieś około 200 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i trzymaj ją na lodzie przez 2 minuty, aby uspokoić zarodki.
  2. Wstępne osadzanie
    1. Przenieś 200 zarodków Drosophila do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę na lodzie przez 2 minuty, aby uspokoić zarodki, a następnie ostrożnie wyrzuć supernatant pipetą. Dodaj 1 ml 50% wybielacza do probówki i delikatnie potrząsaj przez 2 min.
      UWAGA: Wybielacz powinien być przygotowany na świeżo, a ilość wybielacza może się różnić w zależności od ilości zebranych zarodków.
    2. Delikatnie zbierz zarodki, wylewając je na bibułę filtracyjną i umyj je 3 razy 1 ml PBS za każdym razem.
    3. Przenieść zarodki za pomocą bibuły filtracyjnej do około 5 ml n-heptanu.
    4. Przenieść mieszaninę do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 1 ml metanolu i delikatnie nim wstrząśnij. Zbieraj zarodki po sedymentacji.
    5. Usunąć supernatant i przemyć zarodki w 1 ml PBS 3-5 razy.
    6. Utrwalić zarodki 400 μl roztworu Bouina (71% nasyconego kwasu pikrynowego, 24% formaliny, 5% kwasu octowego) przez 30 minut. Utrwalone zarodki myć 3 razy w 1 ml PBS przez 5 minut za każdym razem.
    7. Aby zagregować zarodki, należy przenieść próbki do gumowego korka i usunąć PBS.
    8. Przygotować 1,2% roztwór agarozy-PBS i utrzymywać roztwór w temperaturze 60 °C. Dodać 200 μl 1,2% roztworu agarozy-PBS na zarodki, aby umieścić je w bloku agarowym.
    9. Wyjmij blok z korka i przechowuj go w PBS.
      UWAGA: W przypadku podejścia pre-embedding, pro-ocieplenie ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Zdecydowanie zalecamy, aby probówki wirówkowe i końcówki do mikropipet, które będą używane na tym etapie, były całkowicie rozgrzane przed uruchomieniem.
  3. Zatapianie parafiny
    1. Zanurz wstępnie osadzony blok agaru w 35% etanolu, 50% etanolu, 75% etanolu i 85% etanolu na 15 minut każdy. Następnie zanurz 2 razy w 95% etanolu i 100% etanolu.
      UWAGI: W zależności od liczby zarodków w bloku konieczne jest około 5-10 razy większa objętość każdego bloku, a następnie stopniowany utrwalacz przez 15-30 minut.
    2. Zanurz blok zarodków w 100% roztworze etanolu i ksylenu (w stosunku 1:1) na 15 minut.
    3. Przenieś blok na ksylen na 1 minutę, aby tkanka zarodka była przezroczysta
      4. .
    4. Zanurz blok w ksylenie i parafinie (w stosunku 1:1) na 30 minut.
    5. Zanurz blok w parafinie I, parafinie II i parafinie III na 2 godziny za każdym razem.
    6. Wcześniej napełnij pudełko do zatapiania parafiną, a następnie delikatnie i poziomo przenieś blok na dno pudełka do zatapiania. Po naturalnym zestaleniu się parafiny, zestalony blok parafiny można przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGI: Wstępnie osadzoną próbkę można użyć w kriosekcji, wykonując następujące czynności. Po wstępnym zanurzeniu zarodków w agarozie, jak opisano powyżej, próbki są po prostu zatopione w związku OCT. Następnie kriosekcję można przeprowadzić zgodnie z rutynowym protokołem kriosekcji. Następnie na sekcjach można zastosować regularne metody barwienia.

4. Barwienie hematoksyliną-eozyną

  1. Przygotuj skrawki zarodków Drosophila. Przygotowane odcinki umieścić w piecu w temperaturze 60 °C na 15 minut, a następnie zanurzyć je 2 razy w ksylenie na 10 minut każdy. Zanurz sekcje raz w 100% etanolu i ksylenie (w stosunku 1:1) na 2 minuty.
  2. Uwodnić sekcje w 100% etanolu I, 100% etanolu II, 95% etanolu, 85% etanolu, 75% etanolu, 50% etanolu i w wodzie destylowanej przez 3 minuty.
  3. Wybarwić skrawki roztworem hematoksyliny przez 2 minuty. Zanurzyć szkiełka w 1% roztworze kwaśnego alkoholu (1 ml kwasu solnego, 100 ml 70% etanolu) i umyć szkiełka w wodzie destylowanej.
  4. Zanurz szkiełka kolejno w 50% etanolu, 75% etanolu, 85% etanolu i 95% etanolu.
  5. Zabarwić skrawki roztworem eozyny przez 1 min.
  6. Odwodnić szkiełka w 95% etanolu I, 95% etanolu II, 95% etanolu III, 100% etanolu I, 100% etanolu II i 100% etanolu III przez 1 minutę za każdym razem.
  7. Czyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III przez 5 minut za każdym razem.
  8. Zamontuj zjeżdżalnie z neutralnym balsamem zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Okresowe barwienie kwasem i srebrem metenaminą

  1. Odparafinować i uwodnić skrawki parafiny zarodka Drosophila do wody destylowanej.
  2. Utlenić skrawki w 1% kwasie okresowym przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej 3 razy po 1 minutę każde.
  4. Inkubować szkiełka w około 40 ml świeżo przefiltrowanego roztworu roboczego metenaminy srebra (3% metenaminy, 5% azotanu srebra, 5% roztworu boranu sodu) przez 1 godzinę i 20 minut w temperaturze 60 °C. Następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
  5. Tonuj szkiełka w 0,2% chlorku złota przez 2 minuty, a następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
  6. Umieść szkiełka w 3% tiosiarczanie sodu na 3 minuty, a następnie płucz je w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
  7. Przeciwbarwić szkiełka w hematoksylinie przez 30 s. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 3-5 minut.
  8. Odwodnić szkiełka w 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu I, 95% etanolu II, 95% etanolu III, 100% etanolu I i 100% etanolu II przez 5 minut każda.
  9. Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III na 5 minut każda.
  10. Zamontuj zjeżdżalnie w neutralnym balsamie zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Immunohistochemia

  1. Deparafinować i ponownie uwodnić skrawki parafiny zarodka Drosophila do PBS zgodnie ze standardowym protokołem19.
  2. Traktować szkiełka z 0,3% H2O2 w metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i unikać światła.
  3. Podgrzej wstępnie odpowiedni bufor do odzyskiwania antygenu do około 100 °C w pojemniku ze szkiełkami w naczyniu do gotowania na parze do warzyw. Pojemnik powinien mieć również pokrywkę. Umieść szkiełka w pojemniku. Zamknij pokrywę parowaru.
    1. Trzymaj pojemnik w parowarze przez 20 minut od tego momentu. Należy pamiętać, że pokrywka pojemnika na suwak nie powinna być całkowicie dokręcona, aby para wodna mogła dostać się podczas procesu gotowania na parze.
  4. Pozwól szkiełkom powrócić do temperatury pokojowej, a następnie delikatnie przepłucz je w PBS-T (PBS z Tween-20, pH 7,2) 3 razy przez 5 minut każde, a następnie przepłucz szkiełka w PBS 3 razy po 1 minutę każde.
  5. Zablokować szkiełka z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubować szkiełka z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-FKBP12 w stosunku 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
  7. Umyj szkiełka w PBS-T 4 razy po 5 minut każde.
  8. Nakładać szkiełka z polimerem znakowanym HRP sprzężonym z przeciwciałami drugorzędowymi (anty-Rabbit, 1:5 000) przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Rób to w ciemności, aby uniknąć wybielania zdjęć.
  9. Umyj szkiełka w PBS-T 3 razy po 5 minut każde.
  10. Inkubować szkiełka z 5% tetrachlorowodorkiem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) przez 2-10 minut, aż kolor produktów reakcji będzie odpowiedni pod mikroskopem.
  11. Przeciwbarwić szkiełka w hematoksylinie przez 30 s i myć szkiełka w wodzie destylowanej 2 razy przez 5 minut każde
    12. .
  12. Odwodnić szkiełka w 50% etanolu, 70% etanolu, 90% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu przez 1 minutę każda.
  13. Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III na 5 minut każda.
  14. Zamontuj zjeżdżalnie w neutralnym balsamie zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Hybrydyzacja in-situ

UWAGA: Sekcje zarodków Drosophila zostały przygotowane z 0,01% wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Wszystkie akcesoria używane do hybrydyzacji in situ z wyprzedzeniem stosują leczenie DEPC na noc.

  1. Przygotowanie rybosondy
    1. Linearyzuj matrycę DNA, przecinając w miejscu enzymu restrykcyjnego za sklonowaną wstawką za pomocą enzymu restrykcyjnego, który tworzy zwisy 5'. Po linearyzacji należy oczyścić matrycę DNA poprzez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie wytrącanie etanolu. Korzystaj ze standardowych protokołów.
    2. Dodać 1 μg oczyszczonego DNA matrycy do probówki wirówkowej bez RNaz. Umieść probówkę wirówkową na lodzie. Dodać wystarczającą ilość wody uzdatnionej DEPC do całkowitej objętości 13 μl.
      1. Następnie dodaj następujące odczynniki w kolejności: 2 μL 10x mieszaniny znakującej NTP, 2 μL 10x buforu transkrypcyjnego, 1 μL inhibitora RNazy ochronnej, 2 μL polimerazy RNA SP6 lub polimerazy RNA T7.
    3. Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Dłuższe inkubacje nie zwiększają wydajności znakowanego RNA. Krótkie wirowanie (~800 obr./min) zastosowane na rurce reakcyjnej jest niezbędne przed przejściem do następnego kroku. Ten wir pozwoli całej zawartości, która może powstać w wyniku inkubacji, dotrzeć na dno probówki.
    4. Dodać 2 μl DNazy I wolnej od RNaz w celu usunięcia matrycowego DNA i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 2 μl 200 mM EDTA (pH 8,0), aby zatrzymać reakcję.
      UWAGA: Sondy RNA znakowane DIG mogą być przechowywane w etanolu w temperaturze od -15 do -25 °C przez jeden rok.
  2. Prehybrydyzacja wycinka zarodka Drosophila
    1. Umieścić skrawki zarodka Drosophila w piecu o temperaturze 42 °C na 48 godzin.
    2. Odparafinować szkiełka w 100% ksylenie przez 10 minut dwukrotnie.
    3. Uwodnić szkiełka, zanurzając kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 90% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu na 5 minut.
    4. Inkubować szkiełka w PBS przez 5 minut 3 razy, aby usunąć roztwór utrwalający/roztwór Bouina z tkanki.
    5. Umyj szkiełka roztworem 100 mmol/l glicyny/PBS 2 razy po 5 minut.
    6. Umyj szkiełka PBS 2 razy po 5 minut każde.
    7. Inkubować szkiełka z 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut, aby przepuszczalność membran.
    8. Umyj szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.
    9. Inkubować szkiełka w 15 μg/ml proteinazy K wolnej od RNaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    10. Inkubuj szkiełka z 4% paraformaldehydem w PBS przez 3 minuty, aby zatrzymać trawienie.
    11. Umyj szkiełka PBS 2 razy po 5 minut każde.
    12. Inkubować szkiełka w 100 mM buforze trietanoloaminy (pH 8,0) z 0,25% (v/v) bezwodnikiem octowym 2 razy przez 5 minut każde.
    13. Dodaj wodę DEPC do komory wilgotnościowej szkiełka. Dodać 20 μl roztworu do wstępnej hybrydyzacji (zawierającego 100 μg/ml DNA plemników łososia) na szkiełka. Włóż szkiełka do komory wilgotnościowej szkiełka. Inkubować szkiełka w temperaturze 42 °C przez 4 godziny
      UWAGA: Konieczne jest zapewnienie szczelności pokrywy mokrego pudełka i to, aby mokre pudełko było zawsze trzymane w pozycji poziomej, aby zapobiec ulatnianiu się i odchyleniu od tkanki roztworu przed hybrydyzacją i następującego po nim roztworu hybrydyzacyjnego.
  3. Hybrydyzacja przekroju zarodka Drosophila
    1. Usunąć roztwór do hybrydyzacji i umyć szkiełka 0,2x SSC (150 mM chlorku sodu, 15 mM cytrynianu sodu, pH 7,0) 3 razy po 5 minut każde. Zetrzyj nadmiar 0,2x SSC wokół próbek tkanek.
    2. Nanieść 30 μl roztworu hybrydyzacyjnego sondy (zawierającego 2-6 ng sondy RNA znakowanej digoksyną przez rozcieńczenie w roztworze przed hybrydyzacją) za pomocą pipety. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej szkiełka w temperaturze 42 °C przez około 20 h.
      UWAGA: Upewnij się, że nakrętka jest szczelna, jak sugeruje ostatnia nuta. W przeciwnym razie wyschnięcie spowodowane wyciekiem przed hybrydyzacją lub przed hybrydyzacją spowoduje wygenerowanie brudnego tła, w tym pseudo-dodatniego na slajdach.
  4. krzyżowanie
    1. Usunąć roztwór hybrydyzacyjny i przemyć szkiełka 4 x roztworem SSC 4 razy przez 15 minut każde w temperaturze 37 °C.
    2. Umyć szkiełka w 2 x roztworze SSC z 20 μg/ml RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Myć szkiełka w 1x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Myć szkiełka w 0,5 x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Myć szkiełka w 0,1x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Umyj szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.
    7. Myć szkiełka w buforze myjącym (100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) przez 1 min.
    8. Inkubować szkiełka w 100 ml świeżo przygotowanego roztworu blokującego (2% surowicy owczej w buforze kwasu maleinowego bez Tween 20) przez 30 minut.
    9. Inkubować szkiełka w 20 ml roztworu przeciwciał przez 45 minut.
      1. Przed każdym użyciem odwirować przeciwciało przez 5 minut z prędkością 10 000 obr./min w oryginalnej fiolce i ostrożnie odpipetować niezbędną ilość z powierzchni. Rozcieńczyć anty-digoksygeninę-AP w stosunku 1:5000 (150 mU/ml) w roztworze blokującym.
    10. Przemyć szkiełka w 100 ml buforu płuczącego 2 razy po 15 minut w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu przeciwciał.
    11. Równowaga szkiełek w 20 ml buforu detekcyjnego (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) przez 2-5 minut.
    12. Inkubować szkiełka z 10 ml świeżo przygotowanego roztworu podłoża barwnego w komorze wilgotnościowej szkiełka. Reakcja rozpoczyna się w ciągu kilku minut i kończy się po 16 godzinach. Nie potrząsaj ani nie mieszaj, gdy kolor się rozwija.
    13. Płukać szkiełka 50 ml wody destylowanej przez 5 minut, aby zatrzymać reakcję.
    14. Wysuszyć próbkę przez noc w ciemności.
    15. Odwodnić szkiełka w 70% etanolu, 80% etanolu, 90% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu I i 100% etanolu II przez 3 minuty każda.
    16. Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III przez 20 minut każdy.
    17. Zamontuj zjeżdżalnie za pomocą neutralnego balsamu.
    18. Dokumentuj obrazy i analizuj je za pomocą mikroskopii odwróconej i oprogramowania producenta. Przeprowadzić analizę dystrybucji za pomocą ImageJ w zależności od gęstości sygnału dodatniego wzdłuż osi podłużnej lub w strefie różnicowej zarodków.
      UWAGA: Podczas inkubacji ze świeżo przygotowanym roztworem substratu barwnego w kroku 7.4.12 barwę reakcji można zobaczyć nawet gołym okiem. Ta obserwacja dotycząca tego, jak wywoływanie kolorów można sprawdzić pod stereoskopem. Gdy kolor reakcji jest rozsądny i można wykonać krok 7.4.13, aby zatrzymać reakcję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki opisują protokoły używane do pokonania wyzwania polegającego na dołączaniu wysokolipidowych i zawierających chitynę zarodków kosmówki Drosophila (Tabela 1) do szklanej powierzchni szkiełka w celu zbadania i eksperymentowania. Wykorzystując metodę powlekania szkiełka z żelatyny chromowo-ałunowej pokazaną na Rysunek 1, poprawiliśmy przyczepianie zarodków Drosophila do powierzchni szkiełek, podczas gdy metoda wstępnego osadzania zarodków pokazana w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja wapniowa za pośrednictwem RyRs i IP3R jest podstawowym szlakiem w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców 1,2,3,4. U ludzi mutacje punktowe, takie jak mutacja R4496C związana z CPVT, w genie RyR2 prowadzą do wycieku wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego kardiomiocytów, powodując dysfunkcję serca. Mutacje te objawiają się jako arytmia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (#31771377/ 31571273/31371256), Program dla Wybitnych Zagranicznych Naukowców z Narodowego Departamentu Edukacji (#MS2014SXSF038), Narodowy Departament Edukacji Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), a XZ jest wspierany przez Fundusz Wybitnych Prac Doktorskich (#2019TS082 /2019TS079), Kluczowy Program Departamentu Edukacji Prowincji Shaanxi (#20JS138), Projekt Młodzieżowy Programu Badań Podstawowych Nauk Przyrodniczych Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Shaanxi (#2020JQ-885).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-20&stopni; C LodówkaMeiling Biologia & MedycznyDW-YL270Używany do przechowywania regentów-80
° C Lodówka niskotemperaturowaSeria ThermoForma 90Służy do przechowywania regentów
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPrzygotowanie talerzy agarowych z sokiem winogronowym
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty FabRoche11093274910Do wykrywania związku znakowanego digoksygeniną
Inkubator biochemicznyShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybrydyzacja
Roztwór BouinaOdczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie69945460Wirówka do osadzania zarodków Drosophila
Eppendorf540BH07808In-situ
Probówka wirówkowaDenvilleC-2170Kolekcja zarodków Drosophila Odczynnik
Chrome AlumSinopharm w Beijing10001018Coating
Slides Kąpiel wodna o stałej temperaturzeJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCBarwienie hematoksyliną-eozyną, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i okresowe barwienie kwasem i srebrem Metenamina
Dako REAL System wykrywania EnVisionDakoK5007W reakcji immunohistochemicznej lub reakcji hybrydyzacji in situ wiąże się z pierwotnym przeciwciałem antygenowym, a cel jest znakowany przez barwienie.
DEPCSigma-AldrichD5758Zestaw do znakowania RNA in-situ Zestaw
do znakowania RNA11093274910 RocheZnakowanieRNA za pomocą diagooksygeniny-UTP metodą transkrypcji in vitro polimerazą RNA SP6 i T7
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Stada Drosophila melanogaster mutant
Elektryczny piec do suszenia strumieniowegoTianjin Taiste Instruments101-0ABDo powlekania szkiełek i zatapiania parafiny
EozynaSigma-Aldrich230251Barwienie hematoksyliną-eozyną
EtanolSinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie100092680Osadzanie parafiny, barwienie hematoksyliną-eozyną, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i barwienie kwasem okresowym i srebrem Metenamina
Żelatynowyodczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie10010328Szkiełka powlekające
Chlorek złotaSigma-Aldrich379948Kwas okresowy-Srebro Barwienie Metenaminą
HematoksylinaSigma-AldrichH3136Barwienie Hematoksyliną-Eozyną
Zestaw do oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystościRoche11732668001Do oczyszczania produktów
PCRInteligentna skrzynka na stałą temperaturę i wilgotnośćNingbo Jiangnan InstrumentsHWSDo konserwacji muchy
LE AgarozaHyAgaroza14190108029Wstępne zatapianie
metanoluSinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie10014108Mikroskop do pobierania zarodków Drosophila
ZEISSObserver.A1Barwienie hematoksyliny-eozyny, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i okresowe barwienie kwasowo-srebrne
preparaty mikroskopoweMetenaminy Produkcja sprzętu laboratoryjnego MeVidP105-2001Szkiełka powlekające Neutralny
odczynnik chemiczny Guma Sinopharm w Pekinie10004160Barwienie hematoksyliny-eozyny
N-heptanSinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie40026768zarodek Drosophila Kolekcja
Krajalnica do parafinyPrzyrząd naukowy HuahaiHH-2508IIIIn-situ Hybrydyzacja
parafinyOdczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie69019461Parafina do zatapiania
pH / mVSartoriusPB-10Do określania wartości pH roztworu
Odczynnik chemiczny Sinopharm zazotanu srebra10018461Okresowe barwienie kwasem i srebrem Metenaminą
Ultraczysty wodomierzThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybrydyzacja
Odczynnik chemiczny Xylen-Sinopharmw Pekinie10023418Osadzanie parafiny
do hybrydyzacji chemiczny miernika w Pekinie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hybrydyzacja in situhistochemiapowlekanie szkie ekzatapianie zarodk wdystrybucja bia ekekspresja RNAlokalizacja FKBP12sygnalizacja wapniowa

Powiązane artykuły