Artykuł metodologiczny

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne narządów poprzez symulację zmian hemodynamicznych w modelu przeszczepu wątroby szczura

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61779

⸱

6 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Intensive Care Unit, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of hepatobiliary surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Hospital of Medical School of Ningbo University, 3Department of transplantation, The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 4Digital Technology and Engineering college, Ningbo University of Finance & Economics

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis, jak zbudować zwierzęcy model fazy anhepatycznej (niedokrwienie wątroby) u szczurów, aby ułatwić podstawowe badania nad uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym po przeszczepie wątroby.

Streszczenie

Ortotopowy przeszczep wątroby (OLT) u szczurów to wypróbowany i sprawdzony model zwierzęcy używany do badań przedoperacyjnych, śródoperacyjnych i pooperacyjnych, w tym do uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) narządów pozawątrobowych. Model ten wymaga licznych eksperymentów i urządzeń. Czas trwania fazy bezwątrobowej jest ściśle związany z czasem do rozwoju IRI po przeszczepie. W tym eksperymencie wykorzystaliśmy zmiany hemodynamiczne do wywołania uszkodzenia narządów pozawątrobowych u szczurów i określiliśmy maksymalny czas tolerancji. Czas do najcięższego uszkodzenia narządu był różny dla różnych narządów. Metoda ta może być łatwo powtórzona i może być również wykorzystana do badania IRI narządów pozawątrobowych po przeszczepieniu wątroby.

Wprowadzenie

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) jest częstym powikłaniem po przeszczepie wątroby. IRI wątroby jest procesem patologicznym obejmującym uszkodzenie komórek za pośrednictwem niedokrwienia i nieprawidłowe pogorszenie reperfuzji wątroby. IRI wątroby i miejscową wrodzoną odpowiedź immunologiczną można podzielić na IRI gorące i zimne, w zależności od różnic w środowisku klinicznym1. Gorący IRI jest wywoływany przez uszkodzenie komórek macierzystych, zwykle w wyniku przeszczepu wątroby, wstrząsu i urazu2. Zimny IRI jest powikłaniem przeszczepu wątroby spowodowanym przez komórki śródbłonka i krążenie obwodowe3. Doniesienia kliniczne wykazały, że IRI wątroby jest związana z 10% wczesnych niewydolności narządów i może zwiększać częstość występowania ostrego i przewlekłego odrzucenia4,5. Ponadto, IRI wątroby może również wywoływać zespoły dysfunkcji wielonarządowej lub zespół ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, z wysoką śmiertelnością6. Pacjenci z zajęciem narządów pozawątrobowych zwykle pozostają dłużej w szpitalu, wydają więcej pieniędzy i mają gorsze rokowania7. Rozwój powikłań jest ściśle związany z długością fazy bezwątrobowej przeszczepu wątroby8.

Ortotopowy przeszczep wątroby (OLT) u szczurów został po raz pierwszy opisany przez amerykańskiego profesora Lee w 1973 roku. Eksperymentalna operacja symulowała etapy klinicznego przeszczepu wątroby oraz zespolenie naczyń krwionośnych i przewodu żółciowego wspólnego (CBD) przy użyciu metody szwów. Procedura jest trudna i czasochłonna, a wskaźnik sukcesu niski9. W 1979 roku Kamada i wsp. dokonali znaczącej poprawy OLT u szczurów, twórczo stosując "metodę dwóch mankietów" do zespolenia żyły wrotnej w celu kontrolowania fazy bezwątrobowej w ciągu 26 minut10. W tym samym roku Zimmermann zaproponował "metodę pojedynczego stentu żółciowego". Na podstawie pracy Lee Zimmermann użył rurki polietylenowej do bezpośredniego zespolenia CBD dawcy i biorcy, uprościł rekonstrukcję CBD i zachował funkcję zwieracza, a metoda ta stała się standardem w rekonstrukcji dróg żółciowych w modelach OLT11. W 1980 roku Miyata i wsp. zaproponowali "metodę trzech mankietów", w której żyła wrotna (PV), żyła nadwątrobowa (SVC) i żyła główna wewnątrzwątrobowa (IVC) były zespolene metodą mankietową. Istnieje jednak ryzyko zniekształcenia kaniuli w przypadku tej metody, co może prowadzić do niedrożności refluksu żyły głównej dolnej12. W 1983 r. zaproponowano "metodę dwóch mankietów" przy użyciu metody mankietowej do zespolenia PV i IVC, ale przyjmując metodę szwów dla SVC13. Metoda ta została przyjęta przez naukowców na całym świecie w celu ustalenia modeli OLT. Od tego czasu etapy zespolenia mankietu zostały ulepszone, aby skrócić fazę zniewatania i poprawić przeżywalność szczurów14. Podobnie, ulepszone metody są stosowane w praktyce klinicznej w celu skrócenia fazy anhepatycznej15. Jednak podstawowe badania nad IRI po przeszczepieniu wątroby wykazały, że wskaźnik przeżycia jest odwrotnie proporcjonalny do stopnia uszkodzenia narządów pozawątrobowych. Dlatego konieczne są dalsze badania, a także prosty i powtarzalny model zwierzęcy, który symuluje IRI po przeszczepie wątroby.

Opierając się na definicji fazy bezwątrobowej, przeprowadziliśmy symulację zmian hemodynamicznych w transplantacji wątroby, skutkujących IRI narządów pozawątrobowych u szczurów. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy opis, jak zbudować zwierzęcy model fazy anhepatycznej (niedokrwienie wątroby) u szczurów, aby ułatwić podstawowe badania nad IRI po przeszczepieniu wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja Etyki Zwierząt zatwierdziła eksperyment Uniwersytetu Medycznego Guangxi (No20190920). Wszystkie zwierzęta zostały dostarczone przez Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego Guangxi. Użyliśmy samców szczurów Sprague Dawley z filtrem SPF (200-250 g, 10-12 tygodni), trzymanych w temperaturze pokojowej 25 ± 2°C i wilgotności 50 ± 10%. Karmienie zostało przerwane na 24 godziny przed operacją; Nie zabrakło jednak wody.

UWAGA: Jeden operator może wykonywać wszystkie operacje bez podstawy mikrochirurgii lub mikroskopu operacyjnego.

1. Operacja

  1. Po zważeniu znieczulij szczury izofluranem (5%) za pomocą urządzenia do znieczulania zwierząt.
  2. Po 1-2 minutach delikatnie zaciśnij palce u nóg szczura pęsetą. Jeśli szczur nie reaguje po uszczypnięciu, wszedł w stan znieczulenia. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Używaj lamp grzewczych dla zwierząt, aby utrzymać temperaturę ciała szczurów na poziomie 37-38 °C.
  3. Po dezynfekcji jamy brzusznej (roztwór jodu powidonu) przymocuj szczura na stole do sekcji zwierząt. Wykonaj środkowe nacięcie 3 cm poniżej wyrostka mieczykowatego za pomocą kleszczy i nożyczek.
  4. Otwórz jamę brzuszną, odsłoń wątrobę za pomocą retraktora i zmobilizuj więzadło wątrobowo-żołądkowe. Użyj bawełnianych wacików, aby delikatnie odwrócić środkowy płat wątroby i obrócić go do góry, aby odsłonić wątrobę porta. Zidentyfikuj CBD, PV i HA.
  5. Wypchnij jelito cienkie w kierunku lewej dolnej jamy brzusznej za pomocą bawełnianych wacików, przykryj je mokrą gazą i przenieś żyłę główną wewnątrzwątrobową do prawej żyły nerkowej.
  6. Odizoluj żyłę wrotną, tętnicę wątrobową i żyłę główną dolną powyżej prawej żyły nerkowej za pomocą soczewki wewnątrzgałkowej i kleszczy oznaczonych jedwabną nicią 3-0, z których każdy ma węzeł poślizgowy.
  7. Rozetnij skórę lewej i prawej kończyny dolnej i odsłoń żyłę udową za pomocą kleszczy okulistycznych. Powoli wstrzyknąć heparynę drobnocząsteczkową 625 j.m./kg przez żyłę udową w celu heparynizacji całego organizmu.
  8. Podwiązać żyłę wrotną, tętnicę wątrobową i żyłę główną dolną powyżej prawej żyły nerkowej za pomocą szwów nr 3-0, trwających 45 minut (Ryc. 1). Wymień jelito cienkie w jamie brzusznej i przykryj je gazą. W tych okresach należy zmniejszyć znieczulenie wziewne.
  9. Po 45 minutach uwolnij żyłę wrotną, tętnicę wątrobową i żyłę główną dolną powyżej prawej żyły nerkowej.
  10. Zszyj mięsień i skórę, warstwa po warstwie, i zakończ znieczulenie wziewne. Zapewnić analgezję pooperacyjną za pomocą podskórnej morfiny w dawce 5 mg/kg co 4 godziny.
  11. Obserwuj szczura, aż się obudzi i karmić go w temperaturze 25 ± 2 °C i wilgotności 50 ± 10%. Niezbędne są lampy grzewcze dla zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tolerancja szczurów na niedokrwienie wątroby
W tym modelu zwierzęcym miejsca, w których naczynia krwionośne zostały podwiązane podczas operacji, przedstawiono na Rysunku 1. Szczury randomly podzielono na 5 grup: z niedokrwieniem trwającym 15 minut (grupa I15), 30 minut (grupa I30), 45 minut (grupa I45), 60 minut (grupa I60) oraz grupę pozorowaną (sham), po 10 szczurów w każdej grupie. Wskaźnik przeżywalności każdej grupy obserwowano 14 dni po operacji. Wszystkie szczur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

OLT u szczurów jest idealnym modelem do badania konserwacji narządów w transplantacji wątroby, IRI, odrzuceniu przeszczepu, tolerancji immunologicznej, patologii i farmakologii transplantacji, homotransplantacji i ksenotransplantacji. Obecnie jest szeroko stosowany w eksperymentalnych badaniach transplantacji wątroby.

Podczas badań pilotażowych najpierw podaliśmy pentobarbital sodu w znieczuleniu dootrzewnowym i stwierdziliśmy, że prowadzi to do wysokiej śmiertelności pooperacyjnej i krótkiej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy tego manuskryptu nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za przydatne sugestie udzielone przez dr Wen-tao Li i dr Ji-hua Wu z Drugiego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Guangxi. Autorzy pragną podziękować naszym kolegom z zespołu za przydatne uwagi i dyskusje. Autorzy pragną również podziękować anonimowym recenzentom i redaktorom JoVE za ich uwagi. Szczególne podziękowania należą się rodzicom dr Yuana za ich nieustanne wsparcie i zachętę. Prace były wspierane przez Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% roztwór paraformaldehyduShanghai Macklin Biochemical Co., LtdP804536
piec do suszenia powietrzemShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Aminotransferaza alaninowa (ALT) ZestawElabscience Biotechnology Co., LtdE-BC-K235-S
amoniakSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd10002118
amylazyElabscience Biotechnology Co., LtdE-BC-K005-M
bezwodny etanolSinopharm Chemical Reagents Co., Ltd100092183
Zwierzę Aparat anestezjologicznyShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
zestaw aminotransferazy asparaginianowej (AST)Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (gdy jest to konieczne)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
WirówkaBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
Zestaw kreatyninyRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
maszyna do odwadnianiaWęgry 3DHISTECH Co., LtdDonatello Series 2
Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
Wuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
roztwór barwnika hematoksyliny-eozynyWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
wysokowydajny wosk parafinowyShanghai huayong parafina wax co., LtdQ / YSQN40-91
Kwas solnySinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
kleszczyki do soczewek wewnątrzgałkowych (IOL)Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd—
mikro nożyczki (kiedy to konieczne)Szanghajska fabryka instrumentów chirurgicznychWA1010
uchwyty na igłyFabryka instrumentów chirurgicznych w SzanghajuJ32010
neutralna gumaShanghai Huashen Healing Equipment Co., Ltd.—
normalny mikroskop optycznyNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
Fabryka instrumentów chirurgicznych w SzanghajuProsteJ3CO30
Fabryka instrumentów chirurgicznych w SzanghajugięciaJD1060
Fabryka instrumentów chirurgicznych w SzanghajuJ1E0
krajalnica patologicznaShanghai Leica Instrument Co., LtdPipety RM2016
Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.
zwijaczyBeijing Jinuotai Technology Development Co., Ltd.Skaner JNT-KXQ
Węgry 3DHISTECH Co., LtdPannoramic 250
slajdWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
ksylenSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7
zestaw Automatyczny analizator biochemiczny Szkło nakrywkowe Maszyna do zatapiania Maszyna do zamrażania Kleszcze okulistyczne kleszcze okulistyczne Nożyczki do okulistycznego 7010101008

Bibliografia

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933(2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662(2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818(2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Symulacja zmian hemodynamicznychczas trwania fazy anhepatycznejuszkodzenie narz d w pozaw trobowychanaliza histopatologicznabiochemiczne markery surowiczeopracowanie modelu zwierz cegoczas tolerancji niedokrwieniaocena uszkodzenia narz d w

Powiązane artykuły