Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62130

⸱

7 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leicester Cancer Research Center, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Streszczenie

Zrozumienie oporności na leki i opracowanie nowych strategii uwrażliwiania na wysoce oporne nowotwory zależy od dostępności odpowiednich modeli przedklinicznych, które mogą dokładnie przewidzieć reakcje pacjentów. Jedną z wad istniejących modeli przedklinicznych jest brak możliwości kontekstowego zachowania mikrośrodowiska ludzkiego guza (TME) i dokładnego odwzorowania heterogeniczności wewnątrznowotworowej, co ogranicza kliniczne tłumaczenie danych. W przeciwieństwie do tego, reprezentując kulturę żywych fragmentów ludzkich nowotworów, platforma eksplantatu pochodzącego od pacjenta (PDE) umożliwia badanie reakcji na leki w trójwymiarowym (3D) kontekście, który jak najdokładniej odzwierciedla patologiczne i architektoniczne cechy pierwotnych guzów. Poprzednie doniesienia z PDE udokumentowały zdolność platformy do odróżniania nowotworów chemowrażliwych od chemoopornych i wykazano, że ta segregacja jest predyktorem reakcji pacjentów na tę samą chemioterapię. Jednocześnie PDE dają możliwość zbadania molekularnych, genetycznych i histologicznych cech nowotworów, które przewidują reakcje na leki, identyfikując w ten sposób biomarkery stratyfikacji pacjentów, a także nowatorskie podejścia interwencyjne do uwrażliwiania opornych nowotworów. W tym artykule szczegółowo opisano metodologię PDE, od pobrania próbek od pacjentów po analizę punktów końcowych. Zawiera szczegółowy opis metod pozyskiwania eksplantacji i hodowli, podkreślając warunki dostosowane do potrzeb poszczególnych nowotworów, w stosownych przypadkach. W przypadku analizy punktów końcowych nacisk kładziony jest na multipleksowaną immunofluorescencję i obrazowanie wielospektralne w celu profilowania przestrzennego kluczowych biomarkerów zarówno w obszarach guza, jak i zrębu. Łącząc te metody, możliwe jest wygenerowanie ilościowych i jakościowych danych dotyczących odpowiedzi na leki, które można powiązać z różnymi parametrami kliniczno-patologicznymi, a tym samym potencjalnie wykorzystać do identyfikacji biomarkerów.

Wprowadzenie

Opracowanie skutecznych i bezpiecznych środków przeciwnowotworowych wymaga odpowiednich modeli przedklinicznych, które mogą również dostarczyć wglądu w mechanizmy działania, co może ułatwić identyfikację biomarkerów predykcyjnych i farmakodynamicznych. Niejednorodność między- i wewnątrznowotworowa1,2,3,4,5 i TME6,7,8,9,10,11,12 są znane z tego, że wpływają na reakcje leków przeciwnowotworowych, a wiele istniejących przedklinicznych modeli raka, takich jak linie komórkowe, organoidy i modele mysie, nie jest w stanie w pełni uwzględnić tych kluczowych cech. "Idealny" model to taki, który może podsumować złożone interakcje przestrzenne komórek złośliwych i niezłośliwych w obrębie guzów, a także odzwierciedlić regionalne różnice w obrębie guzów. Ten artykuł skupia się na PDE jako nowej platformie, która może spełnić wiele z tych wymagań13.

Pierwszy przykład użycia ludzkich PDE, znanych również jako histokultury, pochodzi z późnych lat 80., kiedy Hoffman et al. wygenerowali wycinki świeżo wyciętych ludzkich guzów i wyhodowali je w matrycy kolagenowej14,15. Wiązało się to z opracowaniem systemu hodowli 3D, który zachowywał architekturę tkanek, zapewniając utrzymanie komponentów zrębu i interakcji komórkowych w TME. Nie dekonstruując oryginalnego guza, Hoffman i wsp.16 ogłosili nowe podejście do badań translacyjnych i od tego czasu wiele grup zoptymalizowało różne metody eksplantacji w celu zachowania integralności tkanki i generowania dokładnych danych dotyczących odpowiedzi na leki17,18,19,20,21,22,23,24, chociaż pewne różnice między protokołami są oczywiste. Butler i wsp. hodowali eksplantaty w gąbkach żelatynowych, aby pomóc w dyfuzji składników odżywczych i leków przez próbkę20,21,25, podczas gdy Majumder i in. stworzyli ekosystem nowotworowy, hodując eksplantaty na matrycy złożonej z białek guza i zrębu w obecności autologicznej surowicy pochodzącej od tego samego pacjenta22, 23.

Niedawno, nasza grupa stworzyła protokół, w którym eksplantaty są generowane przez fragmentację guzów na kawałkio rozmiarach 3 - 2 - 3 mm, które są następnie umieszczane bez dodatkowych składników na przepuszczalnych membranach na granicy powietrze-ciecz systemu hodowli24. Podsumowując, te liczne badania wykazały, że PDE pozwalają na hodowlę nienaruszonych, żywych fragmentów ludzkich guzów, które zachowują architekturę przestrzenną i regionalną heterogeniczność pierwotnych guzów. W oryginalnych eksperymentach eksplantaty lub hodowle histologiczne były zwykle poddawane homogenizacji po leczeniu farmakologicznym, po czym do homogenizowanych próbek stosowano różne testy żywotności, takie jak test odpowiedzi na lek w kulturze histogenicznej20,21, test MTT (bromek 3-(6)-2,5-difenylotetrazoliowy), test dehydrogenazy mleczanowej lub test oparty na resazurynie26,27,28. Niedawny postęp w technikach analizy punktów końcowych, szczególnie w patologii cyfrowej, rozszerzył repertuar testów końcowych i testów, które można wykonać na eksplantatorach29,30. Aby zastosować te nowe technologie, zamiast homogenizacji, eksplantaty są utrwalane w formalinie, zatopiane w parafinie (FFPE), a następnie analizowane przy użyciu technik barwienia immunologicznego, co umożliwia profilowanie przestrzenne. Przykłady tego podejścia zostały udokumentowane dla niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), raka piersi, raka jelita grubego i eksplantatów międzybłoniaka, przy czym barwienie immunohistochemiczne markera proliferacji, Ki67, i markera apoptotycznego, rozszczepionej polimerazy rybozy poli-ADP (cPARP), zastosowano do monitorowania zmian w proliferacji komórek i śmierci komórki24,31,32,33,34.

Multipleksowana immunofluorescencja jest szczególnie podatna na profilowanie przestrzenne reakcji leków w eksplantatach w punkcie końcowym35. Na przykład, możliwe jest zmierzenie relokalizacji i rozkładu przestrzennego określonych klas komórek odpornościowych, takich jak makrofagi lub limfocyty T, w TME po leczeniu farmakologicznym13,36,37,38, i zbadać, czy środek terapeutyczny może sprzyjać przejściu z "zimnego guza" do "gorącego guza"39. W ostatnich latach grupa ta skupiła się na wyprowadzaniu PDE z różnych typów nowotworów (NSCLC, rak nerki, rak piersi, rak jelita grubego, czerniak) oraz testowaniu szeregu środków przeciwnowotworowych, w tym chemioterapii, inhibitorów małocząsteczkowych i inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych (ICI). Metody analizy punktów końcowych zostały zoptymalizowane tak, aby obejmowały immunofluorescencję multipleksową, aby umożliwić przestrzenne profilowanie biomarkerów żywotności, a także biomarkerów dla różnych składników TME.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie tkanek

  1. Po zabiegu chirurgicznym przenieś świeżo wycięte próbki ludzkiego guza do probówki zawierającej 25 ml świeżej pożywki hodowlanej (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco uzupełniona 4,5 g / l glukozy i L-glutaminy + 1% (v/v) surowicy cielęcej płodu + 1% penicyliny-streptomycyny) i przechowywana na lodzie. Eksplant należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od zabiegu w sterylnym kapturze klasy II.

2. Przygotowanie roślin

  1. Wyczyść cały sprzęt chirurgiczny (ostrza do przeszczepów/powierzchnię wosku dentystycznego/pęsetę) 70% przemysłowym roztworem spirytusu metylowego (IMS).
  2. Napełnij 10 cm naczynie hodowlane (patrz Tabela materiałów) ~25 ml świeżej pożywki i umieść ją na wierzchu warstwy lodu.
  3. Za pomocą pęsety przenieś próbkę na powierzchnię wosku dentystycznego (patrz tabela materiałów) i pokrój tkankę na fragmenty o wielkości około 2–3 mm3 za pomocą dwóch ostrzy do przeszczepu skóry.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepszą wydajność, zacznij kroić tkankę, aby uzyskać pojedynczy pasek o grubości 2–3 mm, a następnie przetnij pasek wzdłuż długości, aby uzyskać końcowe eksplantaty. Powtarzaj proces, aż cała próbka zostanie posiekana.
  4. Niezwłocznie przenieś eksplantaty do lodowatego podłoża hodowlanego w naczyniu o średnicy 10 cm. Weź część eksplantatów (6-9 sztuk), umieść je w probówce o pojemności 1 ml zawierającej 10% niebuforowanego roztworu formaliny i pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 24 godziny
    UWAGA: Fragmenty te będą reprezentować eksplantaty kontrolne dla stanu "niehodowlanego".
  5. Napełnij żądaną liczbę dołków 6-dołkowych płytkami 1,5 ml świeżej pożywki na studzienkę i umieść krążek z wkładką do hodowli organotypowej (patrz Tabela materiałów) w każdym dołku tak, aby unosił się na wierzchu pożywki, ostrożnie unikając pęcherzyków powietrza na granicy faz pożywki.
  6. Wybierz eksplantaty losowo i umieść je pojedynczo na włożonym dysku. Aby zachować spójność z warunkami "niehodowlanymi", użyj 6-9 eksplantatów na studzienkę. Umieścić płytkę wielodołkową w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozostawić eksplantaty do odzyskania przez 16 h.
    UWAGA: Aby uniknąć zmiażdżenia tkanki, zdecydowanie zaleca się delikatne obchodzenie się z pęsetą.

3. Leczenie odwykowe

  1. Po 16 godzinach należy wziąć nowe płytki 6-dołkowe, dodać 1,5 ml świeżej pożywki do każdej studzienki, dodać odpowiednie leki w pożądanych stężeniach i dołączyć studzienkę do kontroli pojazdu. Za pomocą pęsety przenieś każdą wkładkę zawierającą eksplantaty na nowo przygotowane 6-dołkowe płytki zawierające leki. Umieścić płytki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24–48 godzin.
  2. Przenieść niehodowane eksplantaty uprzednio utrwalone w formalinie do kasety histologicznej (patrz sekcja 4 poniżej) i przechowywać w 70% IMS do końca eksperymentu.

4. Przetwarzanie histologiczne

  1. Utrwalanie tkanek
    1. Po leczeniu farmakologicznym przenieś krążki zawierające eksplantaty do nowych 6-dołkowych płytek zawierających 10% formaliny i dodaj kilka kropli 10% formaliny na wierzch eksplantatów, aby zapewnić całkowite pokrycie utrwalaczem.
      UWAGA: Formalina jest niebezpieczna. Unikaj kontaktu ze skórą i obchodź się z nim w oparach, aby zapobiec wdychaniu.
    2. Pozostaw eksplantaty na noc (20–24 godziny) w 10% formalinie.
    3. Następnego dnia namocz odpowiednią liczbę małych gąbek histologicznych w 70% IMS i umieść je w kasetach histologicznych. Delikatnie przenieś wszystkie eksplantaty z danego stanu leczenia farmakologicznego na jedną gąbkę (utrzymuj orientację eksplantatów tak, aby boki eksplantatów stykające się z krążkami wkładki, a tym samym obszary leczone lekiem, stykały się z gąbką). Umieść kolejną wstępnie namoczoną gąbkę na wierzchu eksplantatów i zabezpiecz w kasecie histologicznej (jedna kaseta na studzienkę/zabieg).
    4. Zanurz kasety w 70% IMS i pozostaw na RT na 24 godziny.
  2. Osadzanie parafiny i cięcie tkanek
    1. Następnego dnia przenieść kasety histologiczne zawierające eksplantaty do koszyka na próbki w procesorze tkanek (patrz Tabela Materiałów) i zabezpieczyć pokrywę. Umieść kosz w retorcie i delikatnie zamknij. Wybierz żądany program i uruchom procesor. Opróżnij retortę, otwórz ją, aby wyjąć kosz i przenieś kosz do kąpieli woskowej w centrum zatapiania.
    2. Po zatopieniu przenieś metalowe pokrywki kasety do kosza i wróć do retorty procesora tkanek w celu przeprowadzenia programu czyszczenia. Wytrzyj czujnik suchą chusteczką, usuń nadmiar wosku z pokrywy retorty i kontynuuj program czyszczenia.
    3. Umieścić blok parafiny w mikrotomie obrotowym, przeciąć kilka odcinków pod kątem 4 μm i umieścić blok z powrotem w lodzie. Zmień położenie bloku i wytnij więcej odcinków 4 μm. Przenieś sekcje małym pędzlem i kleszczami na łaźnię wodną, aby usunąć zagniecenia i bąbelki.
    4. Ułożyć skrawki centralnie na szkiełkach mikroskopowych, osuszyć szkiełka na kilka minut i umieścić je w stojaku na szkiełka do wyschnięcia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Gdy sekcje wyschną, przechowuj je w RT w folderze lub pudełku na slajdy, aby chronić je przed kurzem.

5. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Napełnij barwiarkę (patrz Tabela Materiałów) odczynnikami i ustaw wymagany program do barwienia H&E: czas inkubacji hematoksyliny: 5 min; czas inkubacji eozyny: 3 min.
  2. Przymocuj stojak na prowadnice do nośnika, umieść go w pierwszym pojemniku z ksylenem i uruchom program. Wyjmij wspornik prowadnicy ze stojaka i przenieś pojemnik z prowadnicą do obszaru montażowego.
  3. Zamontuj szkiełka z ftalanem dibutylu ksylenem (DPX) pod okapem odciągowym. Umieść DPX na każdym szkiełku nakrywkowym i opuść szkiełko na szkiełko nakrywkowe sekcją skierowaną w dół, umożliwiając rozłożenie się DPX.
    UWAGA: DPX jest niebezpieczny. Unikać kontaktu ze skórą i stosować w przeznaczonym do tego dygestorium.

6. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonane w RT, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Deparafinowanie i ponowne nawodnienie
    1. Umieścić szkiełka w stojaku na szkiełka i podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie odparafinować sekcje w ksylenie przez 3 minuty (2x). Zminimalizuj ilość przenoszonego roztworu.
      UWAGA: Ksylen jest łatwopalny, niebezpieczny i drażniący. Uchwyt wewnątrz dygestorium podczas używania dwuwarstwowych rękawic. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Odpady należy utylizować w szczelnie zamkniętym pojemniku.
    2. Ponownie nawodnić szkiełka w gradiencie alkoholu w następujący sposób: 99% IMS przez 1 minutę (2x) i 95% IMS przez 1 min. Zminimalizuj ilość przeniesionego roztworu.
      UWAGA: IMS jest wysoce łatwopalny, lotny i drażniący. Przechowywać wewnątrz dygestorium i unikać kontaktu ze skórą i oczami.
    3. Całkowicie zanurz ruszt do szkiełków w ultraczystej (UP) wodzie na 5 minut.
  2. Pobieranie antygenu
    1. Przygotować bufor do pobierania antygenu zgodnie z wytycznymi producenta dla danego zastosowanego przeciwciała.
      UWAGA: Bufor cytrynianowy 0,2 M, pH 6 lub kwas tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris)-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 0,1 M, pH 9 są powszechnymi stosowanymi odpowiednio w warunkach kwaśnych lub zasadowych. Kwas cytrynowy jednowodny i Tris są środkami drażniącymi. Przygotować wszystkie roztwory podstawowe w dygestorium. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.
    2. Zanurz stojak zawierający szkiełka w buforze do pobierania antygenu i mikrofalówce (patrz tabela materiałów) z pełną mocą (800 W) na 20 minut
      UWAGA: Przez cały czas trwania procesu slajdy powinny być całkowicie zanurzone w buforze. Aby uniknąć nadmiernego zmniejszenia objętości bufora, należy nałożyć pokrywkę na używany pojemnik.
  3. Immunofluorescencja multipleksowa (mIF)
    UWAGA: Ten proces trwa 1–2 dni.
    1. Napełnij czysty pojemnik 250 ml wody UP i całkowicie zanurz stojak na szkiełka na 2 minuty (2x). Kontynuuj montaż każdego suwaka w pokrywie prowadnicy (patrz tabela materiałów).
      1. Aby zamontować szkiełko na pokrywie, przygotuj szklane koryto z wodą. Zanurz zarówno pokrywę, jak i wsuń w wodzie, umieszczając część tkanki stroną skierowaną w stronę pokrywy.
      2. Umieść dolną krawędź szkiełka na górze wypukłości w dolnej części pokrywy, a na koniec wyrównaj prowadnicę z pokrywą, pozwalając wodzie wypełnić szczelinę pomiędzy nimi bez uwięzienia powietrza. Przytrzymaj pokrywę i zsuń ją razem, a następnie umieść je w stojaku na pokrywę.
    2. Napełnij pokrywę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i poczekaj, aż bufor zmyje szkiełka, wypływając grawitacyjnie (2x). Odpipetować 110 μl buforu blokującego (patrz tabela materiałów) na każdą płytkę przykrywającą i inkubować przez 10 minut.
    3. Przygotować pożądane rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego w PBS lub buforze blokującym zgodnie z zaleceniami producenta. Inkubować szkiełka z przeciwciałem pierwszorzędowym (110 μl każda szkiełka) przez 30 minut. Umyć szkiełka 5 ml PBS (2x), jak opisano w ppkt 6.3.2.
    4. Inkubować szkiełka z 110 μl polimeru peroksydazy chrzanowej przez 30 minut. Przemyć szkiełka 5 ml PBS (2x), jak opisano w ppkt 6.3.2.
    5. Przygotować rozcieńczenie fluoroforu w rozcieńczalniku do amplifikacji w stosunku 1:100 (v/v) i inkubować szkiełka z fluoroforem (110 μl każde szkiełko) przez 10 minut. Przemyć szkiełka 5 ml PBS (2x), jak opisano w 6.3.2.
      UWAGA: W przypadku stosowania fluoroforu 780 należy postępować zgodnie z wytycznymi producenta. W tym miejscu eksperyment można przerwać, jeżeli szkiełka są inkubowane w końcowym płukaniu PBS i przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Odpiąć szkiełka od pokryw i wrócić do etapu pobierania antygenu, aby rozpocząć barwienie innym przeciwciałem. Powtórz barwienie dla żądanej liczby przeciwciał, które mają być przetestowane.
    7. Postępując zgodnie z krokiem 6.3.5 dla ostatniego używanego fluoroforu, należy przytrzymać szkiełka podstawowe na płytkach przykrywających, przygotować 6 μM roztwór dylatanu 4'-6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) z wodą UP i przeciwbarwić szkiełka przez 5 minut (110 μl każde szkiełko). Umyj szkiełka wodą UP (2x) i usuń nadmiar wody, susząc krawędzie szkiełek. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego i przechowuj w RT w ciemności.

7. Skanowanie

UWAGA: Skanowanie preparatów zostało przeprowadzone przy użyciu wielospektralnego automatycznego systemu obrazowania (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Zamontuj szkiełka w nośniku i załaduj je do skanera w żądanej kolejności.
    UWAGA: Zaleca się dołączenie szkiełka kontrolnego, w którym podczas barwienia immunohistochemicznego nie stosuje się fluoroforu ani DAPI. Szkiełko to będzie używane jako kontrola wewnętrznego kwitnienia (autofluorescencji (AF)) tkanki.
  2. Po uruchomieniu oprogramowania skanera slajdów wybierz opcję Edytuj protokół ze strony głównej. Utwórz nowy protokół odnoszący się do nazwy, trybu obrazowania, typu skanowania wielospektralnego, które ma zostać wykonane (4–7 kanałów) i badania (katalog).
    UWAGA: Aby zmodyfikować domyślne ustawienia analizowanych pasm, należy zaznaczyć/odznaczyć żądane filtry za pomocą funkcji Wybierz pasma skanowania
  3. Kontynuuj pracę z Ekspozycją skanowania i nośnikiem ładunku, a na koniec wybierz nośnika do konfiguracji protokołu. Wybierz opcję Take Overview (Przegląd pobierania), aby wykryć tkankę na szkiełku. Wybierz slajd wyświetlany na nośniku i wybierz określony obszar tkanki za pomocą czerwonego kursora, aby przenieść go do podglądu na żywo w lewym oknie ekranu.
  4. Wybierz filtr DAPI i kliknij Autofokus lub ręcznie dostosuj suwak Wysokość sceny, aby ustawić ostrość pola zainteresowania. Kliknij opcję Automatyczna ekspozycja, aby umożliwić systemowi znalezienie najlepszej ekspozycji dla tego filtra/pasma.
    UWAGA: Czas naświetlania dla każdego filtra jest ustawiony na 12 ms. Po automatycznym naświetleniu systemu doprecyzuj czas ekspozycji, aby uzyskać lepsze oszacowanie. Możliwe jest również zastąpienie wartości automatycznej ekspozycji poprzez ręczne wpisanie wartości w podświetlonej komórce.
  5. Powtórz powyższe kroki dla wszystkich filtrów w protokole. W razie potrzeby zmień lokalizacje i/lub slajdy, aby znaleźć najlepsze sygnały do ustawiania ekspozycji.
    UWAGA: Jeśli tkanka jest podświetlona na czerwono w trybie podglądu na żywo, sygnał fluorescencyjny analizowanego filtra jest nasycony i należy powtórzyć automatyczną ekspozycję.
  6. Po ustaleniu ustawień ekspozycji kliknij przycisk Wstecz i zapisz protokół. Na stronie głównej oprogramowania (patrz Spis materiałów) wybierz opcję Scan Slides (Skanuj slajdy).
  7. Ułóż wszystkie nośniki do zeskanowania w hotelu Slide Carrier i zanotuj kolejność slajdów, aby przypisać ich identyfikator do systemu.
    UWAGA: Na ekranie oprogramowania każdy nośnik będzie powiązany z gniazdem zawierającym 4 slajdy.
  8. Aby skonfigurować wiele slajdów o tych samych parametrach, kliknij Konfiguruj zadania i wybierz jeden lub więcej slotów z opcją Using te same zasady dla tych samych slajdów. Po otwarciu Edytuj slajdy skonfiguruj: Zadania, Badanie i Protokół, a następnie kliknij OK.
  9. Oznacz każdy slajd, klikając ikonę Miejsce i wpisz nazwę w komórce Identyfikator slajdu. Kliknij Skanuj, aby rozpocząć skanowanie.
    UWAGA: Gdy ikona miejsca zmieni kolor na niebieski, a slajdy zostaną oznaczone niebieską strzałką, nośnik ma wszystkie zasady i jest gotowy do zeskanowania. Możliwe jest zapisanie identyfikatorów slajdów, badań, protokołów i zadań, klikając przycisk Zapisz ustawienia.

8. Analiza

UWAGA: Poniższy protokół ilustruje metodę analizy fenotypu.

  1. Przygotowanie obrazu
    1. Aby przygotować obrazy do analizy, otwórz oprogramowanie przeglądarki (patrz Spis materiałów) i wybierz opcję Załaduj slajdy. Wybierz żądane skany dla projektu szkoleniowego po prawej stronie ekranu.
    2. Dla każdego skanu kliknij Stempel i wybierz Projekt w polu Wybierz dla: Zdefiniuj stempel o rozmiarze 1 x 1 w polu obrazu, który ma być później wykorzystany jako szablon do analizy treningowej. Zauważ, że ten stempel będzie oznaczony jako czerwony kwadrat.
      UWAGA: Liczba adnotacji stempla dla Projektu jest dowolna. Zaleca się wygenerowanie jednego do wewnętrznego skanu fluorescencyjnego i kilku innych, które są ogólnie reprezentatywne dla dystrybucji sygnału w tkance.
    3. Na koniec otwórz wszystkie skany eksperymentu. Dla każdego z nich kliknij Pieczęć i tym razem wybierz opcję Partia w polu Wybierz dla: Umieść stempel opisujący każdy eksplant.
      UWAGA: Tym razem stemple zostaną oznaczone jako zielone kwadraty i będą wymagane po uruchomieniu analizy wsadowej. Wybierz odpowiedni rozmiar stempli (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) i unikaj nakładania się stempli, które spowodowałoby wygenerowanie zduplikowanych danych w eksportowanym pliku.
  2. Analiza szkoleń
  3. Uruchom oprogramowanie do analizy (patrz tabela materiałów) i utwórz nowy projekt: Wybierz punkt menu Plik | Nowość | Projekt.
  4. Wpisz nazwę w polu Nazwa projektu i skonfiguruj typ project.
    UWAGA: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu następujących specyfikacji: możliwa do trenowania segmentacja tkanek; adaptacyjna segmentacja komórek; fenotypowanie.
  5. Załaduj skany zawierające stemple do treningu: Plik | Otwórz | Obraz. W widoku w trybie pojedynczym poruszaj się po obrazach i wybierz skany z wewnętrzną fluorescencją.
  6. Kliknij przycisk Autofluorescencja (AF) i za pomocą selektora Autofluorescencja narysuj niezabarwioną część tkanki. Kliknij Przygotuj obrazy, aby umożliwić oprogramowaniu odjęcie intensywności wewnętrznej fluorescencji od wszystkich obrazów przesłanych do treningu.
  7. Kliknij przycisk Edytuj markery i kolory, a następnie wprowadź nazwy znaczników w polu powiązanym z ich fluoroforem. Kliknij krok Segmentuj tkankę u góry ekranu, aby otworzyć okno Trening segmentacji tkanek.
  8. W oknie Kategorie tkanek wpisz nazwę kategorii tkanek, na które chcesz podzielić obrazy (np. Guza, Zrąb, Tło, Martwica).
  9. W oknie Trening segmentacji tkanek kliknij przycisk Rysuj i narysuj regiony wokół grup komórek, aby zdefiniować interesującą Cię kategorię tkanki. Na przykład, aby zdefiniować obszar guza, narysuj obszar wokół grupy komórek nowotworowych. Przejdź do następnej kategorii i powtórz proces rysowania.
    UWAGA: Zaleca się rysowanie regionów na większości obrazów przesyłanych do treningu. Możliwe jest również doprecyzowanie szkolenia poprzez edycję Skali Wzorca i Rozdzielczości Segmentacji, których szczegóły są lepiej opisane w instrukcji obsługi.
  10. Po zdefiniowaniu regionów treningowych przejdź do Train the Tissue Segmenter.
    UWAGA: Podczas procesu trenowania oprogramowanie wyświetla procentową dokładność segmentacji tkanek. Aby uzyskać optymalne wyniki, zaleca się, aby segmentacja tkanek była dokładna w co najmniej 90%. Gdy Segmenter się ustabilizuje, kliknij przycisk Gotowe.
  11. Aby zobaczyć maskę kategorii tkanek na wszystkich obrazach, kliknij przycisk Podziel wszystko na segmenty.
  12. Po zweryfikowaniu jakości segmentacji tkanek ponownie narysuj regiony treningowe wokół obszarów, które zostały nieprawidłowo sklasyfikowane, i ponownie trenuj Segmenter Tkanek, aż proces zakończy się sukcesem.
  13. Kliknij krok Segmentacja komórek na pasku kroków w górnej części okna, aby kontynuować analizę.
  14. Wybierz przedziały komórkowe do segmentacji: jądra, cytoplazma i/lub błona.
    UWAGA: Ponieważ adaptacyjna segmentacja komórek może wykrywać tylko komórki z sygnałem jądrowym, nie należy usuwać zaznaczenia jąder. Chociaż możliwa jest również segmentacja cytoplazmy i/lub błony, zaleca się, aby najpierw wybrać najsilniejszy, najobficiej występujący składnik jądrowy (np. DAPI).
  15. Skonfiguruj komponent jądrowy za pomocą suwaka Typowa intensywność, aby dostosować próg używany do wykrywania pikseli jądrowych. Zwróć uwagę na okno podglądu, które otwiera się i wyświetla informacje zwrotne na żywo po dostosowaniu progu.
    UWAGA: Ten próg jest adaptacyjny i jest mierzony względem otaczającego tła. Zwiększ tę wartość, jeśli zbyt duże tło zostanie wykryte jako jądrowe. Zmniejsz tę wartość, jeśli słabe jądra są pomijane. Użyj przycisku Pokaż/Ukryj regiony, aby włączać i wyłączać maski segmentacji oraz sprawdzać, czy właściwe piksele są wykrywane jako jądrowe.
  16. Aby podzielić klastry pikseli jądrowych, należy użyć panelu Podział komponentu jądrowego. Wybierz przycisk, który najlepiej opisuje jakość barwienia jąder. Następnie użyj suwaka, aby dostosować czułość podziału, pamiętając, że niższe wartości spowodują więcej podziałów.
  17. Kliknij przycisk Segmentuj wszystko, aby podzielić wszystkie obrazy na segmenty. Jeśli wynik nie jest dokładny, zmodyfikuj ustawienia i ponownie przetrenuj oprogramowanie, aż do uzyskania satysfakcjonującej segmentacji.
  18. Przejdź do ostatniego kroku analizy: fenotypowania. W panelu Fenotypy dodaj listę fenotypów do wykrycia i wpisz nazwę w odpowiednim polu tekstowym. Kliknij przycisk Edytuj fenotypy, wybierz konkretną komórkę, aby wyświetlić menu rozwijane, a następnie wybierz odpowiedni fenotyp.
    UWAGA: Do wytrenowania klasyfikatora potrzeba co najmniej pięciu komórek dla każdego fenotypu. Wyłączenie wizualizacji jąder pozwala na lepszą wizualizację fenotypu komórki, który należy przypisać.
  19. Po zakończeniu wyboru do trenowania kliknij przycisk Train Classifier (Klasyfikator pociągów).
    UWAGA: Oprogramowanie sklasyfikuje każdą pojedynczą komórkę na obrazie, a za każdym razem, gdy wystąpią błędy w klasyfikacji, możliwa jest edycja fenotypu komórek i powtórzenie treningu klasyfikatora. Zapisz projekt przed przystąpieniem do analizy wsadowej i kliknij przycisk Eksportuj na pasku narzędzi u góry ekranu.
  20. Wybierz kartę Analiza kąpieli w menu po lewej stronie i załaduj projekt w polu Algorytm wsadowy lub Projekt.
  21. Kliknij Opcje eksportu, aby utworzyć osobne katalogi dla każdego obrazu, a następnie za pomocą przycisku Przeglądaj przejdź do lokalizacji, w której chcesz wyeksportować dane. Kliknij wszystkie opcje obrazów i tabel do wyeksportowania.
  22. Po prawej stronie ekranu kliknij Dodaj slajdy i załaduj wszystkie obrazy zawierające stemple dla wcześniej przygotowanych partii (krok 7.3). Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć analizę wsadową i przetwarzać jeden stempel na raz, eksportując odpowiednie dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie wielospektralne histologicznych skrawków barwionych metodą mIF umożliwia identyfikację i fenotypowanie poszczególnych populacji komórkowych oraz rozpoznanie komponentów nowotworowych i zrębowych w mikrośrodowisku guza (TME) eksplantu (Rysunek 2). Obrazowanie wielospektralne jest szczególnie przydatne w analizie tkanek o wysokiej wewnętrznej autofluorescencji, takich jak tkanki o wysokiej zawartości kolagenu, ponieważ pozwala na dekonwolucję sygnału autofluorescencji od innych syg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano metody wytwarzania, leczenia i analizy PDE oraz podkreślono zalety platformy jako systemu modelu przedklinicznego. Posiew ex vivo świeżo wyciętego guza, który nie wiąże się z jego dekonstrukcją, pozwala na zachowanie architektury guza13,24, a tym samym oddziaływań przestrzennych składników komórkowych w TME, a także niejednorodności wewnątrznowotworowej. Metoda ta pokazuje, w jaki sposób, przy użyciu markera specyficznego dla nowotworu, można z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nic do ujawnienia

Podziękowania

Dziękujemy chirurgom i patologom z University Hospitals of Leicester NHS Trust za dostarczenie chirurgicznej wyciętej tkanki nowotworowej. Dziękujemy również ośrodkowi Histologii w ramach Core Biotechnology Services za pomoc w przetwarzaniu tkanek i cięciu bloków tkankowych FFPE oraz firmie Kees Straatman za wsparcie w stosowaniu Vectra Polaris. Badania te były wspierane i finansowane przez Explant Consortium składające się z czterech partnerów: Uniwersytetu w Leicester, Jednostki Toksykologicznej MRC, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories oraz LifeArc. Dodatkowego wsparcia udzieliło CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Finansowanie GMO, CD i NA zostało zapewnione przez program Breast Cancer Now's Catalyst Programme (2017NOVPCC1066), który jest wspierany przez fundusze firmy Pfizer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma320099Odczynnik barwiący
Rozcieńczalnik przeciwciał / Blok, 1xPerkin ElmerARD1001EARozcieńczalnik/bufor blokujący przeciwciało
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Monohydrat kwasu cytrynowegoSigma-AldrichC7129Odczynnik do buforu cytrynianowego
Costar Płytki do hodowli wielodołkowych komórek Corning Incorporated35166 płytek wielodołkowych
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350Naczynie o średnicy 100 mm do hodowli tkankowych
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/ml Pirogronian soduGibco (Life Technologies)10569-010Pożywka do hodowli tkankowych (500 mL)
mocująca DPXVWR360294HPodłoże montażowe
Mocowanie DPXMerck6522Podłoże montażowe
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich3609Odczynnik do buforu TE
EosinCellPathRBC-0100-00AOdczynnik barwiący
Płodowa surowica bydlęcaGibco10500-064Do stosowania w hodowlach tkankowych medium
37% FormaldehydFisher (Acros)11969001010% Formalina
iGenix, kuchenka mikrofalowa IG2095iGenixIG2095Kuchenka mikrofalowa używana do odzyskiwania antygenu
Przemysłowy spirytus metylowy (IMS)Genta Medical19905099% Przemysłowy alkohol denaturowany (IDA)
InForm Zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazuAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomatyczny próżniowy procesor tkankowy
Leica Arcadia H i CLeica BiosystemsKąpiel woskowa do wbudowywania
Leica RM2125RTLeica BiosystemsMikrotom obrotowy
Marker liniowy Leica ST4040Leica BiosystemsH& E stainer
Mayer's HaematoxylinSigmaGHS132-1LOdczynnik do barwienia
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 &mikro; mMerck MiliporePICMORG50Organotypowy dysk do hodowli
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining:
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorofor z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO
)OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorofor z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO)
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorofor z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO
)OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorophore z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO)
OPAL 650 Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorofor z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO)
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorofor z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO
)OPAL 780 / OPAL TSA-DIG OdczynnikAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore z rozcieńczalnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO) i odczynnikiem TSA-DIG
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP
polimerpenicylina/streptomycyna roztwór roztworuFisher Scientific11548876Do stosowania w hodowlach tkankowych medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerOprogramowanie Akoya BiosciencesPhenoChartViewer do skanowanych obrazów
Fosforanowe tabletki soli fizjologicznejThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
strong>1x Plus Amplification DilurentPerkin ElmerFP1498Rozcieńczalnik fluoroforowy
Prolong Diamond AntibladeInvitrogenP36961Nośnik montażowy średni
przesuwnyPerkin ElmerAby załadować szkiełka do hotelu Slide Carrier w celu skanowania za pomocą Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formalina
Sodium Wodoroxide granulkiFisher ScientificS/4920/53Odczynnik do buforu cytrynianowego
Tenatex Hardenened Wax - Różowy (500 g)KEMDENT1-601Wosk powierzchniowy do zębów
Thermo Scientific  Shandon Sequenza Slide Rack do Centrum Barwienia ImmunologicznegoFisher Scientific10098889Uchwyt do szkiełek i klipsów do prowadnic
Thermo Scientific Plastikowe osłony ShandonFisher Scientific11927774Klipsy do slajdów
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Sigma-Aldrich252859Odczynnik do buforu TE
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Medium
montażoweVectra Skaner do slajdów PolarisPerkin ElmerVectra Skaner PolarisSlide
XyleneGenta MedicalXYL050Środek do usuwania wosku
zwierząt kit<

Bibliografia

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366(2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71(2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106(2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840(2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169(2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139(2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58(2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224(2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967(2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002(2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631(2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815(2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Eksplantaty pochodz ce od pacjentamikro rodowisko guzaprzewidywanie oporno ci na lekihodowla tr jwymiarowamultipleksowa immunofluorescencjaobrazowanie wielospektralnesegmentacja kom rekidentyfikacja biomarker wheterogenno guzainhibitory punkt w kontrolnych odpowiedzi immunologicznej
Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.