Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Podsumowanie

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Streszczenie

Wirusy i bakterie mogą powodować różnego rodzaju defekty powierzchni oka i zwyrodnienia, takie jak rany i wrzody poprzez infekcję rogówki. Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1), którego częstość występowania waha się od 60 do 90% na całym świecie, często powoduje zmiany śluzówkowo-skórne w okolicy ustno-twarzowej, które objawiają się również zmianami chorobowymi i ślepotą związaną z infekcją. Podczas gdy obecne leki przeciwwirusowe są skuteczne, pojawienie się oporności i utrzymywanie się toksycznych skutków ubocznych wymaga opracowania nowych leków przeciwwirusowych przeciwko temu wszechobecnemu patogenowi. Chociaż ocena in vitro dostarcza pewnych danych funkcjonalnych dotyczących pojawiającego się leku przeciwwirusowego, nie pokazuje złożoności tkanki oka in vivo. Jednak badania in vivo są drogie i wymagają przeszkolonego personelu, zwłaszcza w przypadku pracy z czynnikami wirusowymi. W związku z tym modele ex vivo są skutecznymi, ale niedrogimi krokami do testowania przeciwwirusowego. W tym miejscu omawiamy protokół badania zakażenia HSV-1 za pomocą rogówek świń ex vivo oraz metodę leczenia ich miejscowo przy użyciu istniejących i nowych leków przeciwwirusowych. Demonstrujemy również metodę wykonywania testu płytki nazębnej przy użyciu HSV-1. Opisane metody mogą być wykorzystane do przeprowadzenia podobnych eksperymentów w celu zbadania zakażeń przypominających patogen HSV-1.

Wprowadzenie

Osoby cierpiące na infekcje oczu często doświadczają utraty wzroku¹. Ze względu na wysoką seroprewalencję na całym świecie, osoby zakażone HSV cierpią na nawracające infekcje oczu, które prowadzą do bliznowacenia rogówki, zapalenia rogówki podścieliska i neowaskularyzacji^2,3,4,5. Wykazano również, że zakażenia HSV rzadziej powodują szereg poważnych schorzeń wśród nieleczonych pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak zapalenie mózgu i zachorowalność ogólnoustrojowa^6,7,8. Leki takie jak acyklowir (ACV) i jego analogi nukleozydowe wykazały stały sukces w ograniczaniu zakażenia HSV-1, a nawet kontrolowaniu reaktywacji, jednak długotrwałe stosowanie tych leków wiąże się z niewydolnością nerek, nieprawidłowościami płodu i brakiem ograniczenia pojawiania się oporności na ewoluujące szczepy wirusa^{9,10,11,12,13}. Złożoność związana z infekcjami oka HSV-1 była wcześniej badana in vitro przy użyciu monowarstw i hodowli 3D ludzkich komórek rogówki oraz in vivo przy użyciu zakażeń oka myszy lub królika. Chociaż te modele in vitro dostarczają istotnych danych na temat komórkowych składników biologicznych zakażeń HSV-1, nie naśladują one skomplikowanej złożoności tkanki rogówki i niewiele robią, aby rzucić światło na dendrytyczne rozprzestrzenianie się wirusa¹⁴. W przeciwieństwie do tego, chociaż systemy in vivo są bardziej wnikliwe w pokazywaniu rozprzestrzeniania się infekcji w rogówce i odpowiedzi aktywacji immunologicznej podczas infekcji HSV-1, wiążą się z zastrzeżeniem, że wymagają wyszkolonych badaczy i dużych obiektów opieki nad zwierzętami, aby przeoczyć eksperymenty.

Tutaj używamy rogówek świń jako modelu ex vivo do zbadania systemu ran wywołanych infekcją HSV-1. Zarówno potencjalna farmakologia niektórych leków, jak i biologia komórkowa i molekularna systemu ran spowodowanych zakażeniem mogą być badane za pomocą kultur eksplantatów tkankowych. Model ten może być również zmieniony do stosowania w przypadku innych infekcji wirusowych i bakteryjnych. W tym badaniu rogówki świń wykorzystano do przetestowania skuteczności przeciwwirusowej przedklinicznej małej cząsteczki BX795. Preferowano stosowanie rogówek wieprzowych ze względu na łatwość dostępu i opłacalność. Dodatkowo, modele rogówki świń są dobrymi modelami ludzkich oczu, przy czym rogówki są łatwe do wyizolowania, odpowiednio zwymiarowane do infekcji i wizualizacji oraz wytrzymałe w obsłudze¹⁵. Rogówki świń są również porównywalne ze złożonością ludzkich modeli rogówki zarówno pod względem przepuszczalności transrogówki, jak i wchłaniania ogólnoustrojowego¹⁵. Wykorzystując ten model do badania, byliśmy w stanie wyjaśnić, w jaki sposób BX795 jest wart dalszych badań jako kompetentny inhibitor infekcji wirusem HSV-1 i dodaje do literatury klasyfikowanie go jako potencjalnego małocząsteczkowego związku przeciwwirusowego¹⁶.

Protokół

Wszystkie tkanki świńskie użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez prywatną organizację zewnętrzną, a żadna z czynności związanych ze zwierzętami nie została wykonana przez personel Uniwersytetu Illinois w Chicago.

1. Materiały

1. Odczynniki
   1. Do testu płytki nazębnej należy użyć następujących odczynników: metyloceluloza w proszku, zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS), penicylina i streptomycyna (P / S) do testu płytki nazębnej.
   2. Użyj tabletek z fioletem krystalicznym i etanolu (klasa biologii molekularnej) do przygotowania roztworu fioletu krystalicznego do testu płytki nazębnej.
2. Pożywki do wzrostu komórek Vero - całe pożywki DMEM
   1. Otwórz butelkę z pożywką DMEM wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych. Usunąć 55 ml pożywki z butelki za pomocą pipety serologicznej i wyrzucić. Dodaj 50 ml FBS P/S do DMEM. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
3. Pożywki do oznaczania płytek nazębnych - Zapas 5% pożywek metylocelulozowych
   1. Odmierz 2,5 g proszku metylocelulozy za pomocą magnesu mieszającego w szklanej butelce o pojemności 500 ml i przeprowadź w autoklawie. Po ostygnięciu butelki do temperatury pokojowej należy pobrać 500 ml całej pożywki DMEM zawierającej 50 ml FBS i 5 ml roztworu P/S i dodać ją do szklanej butelki zawierającej metylocelulozę.
   2. Mieszać w temperaturze 4 °C przez 2 dni za pomocą mieszadła magnetycznego. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
4. Przygotowanie podłoża dla wyciętej rogówki świńskiej
   1. Otwórz butelkę z minimalną ilością niezbędnych pożywek (MEM) wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych. Wylać 10 ml MEM z butelki za pomocą pipety serologicznej.
   2. Dodać 5 ml insuliny-transferyny-selenu (ITS) i 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (AA) do pożywki i przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C.
5. Główny i roboczy zapas fioletu krystalicznego:
   1. Aby przygotować roztwór podstawowy fioletu krystalicznego, dodaj 1 g proszku fioletu krystalicznego do 100 ml 20% etanolu w wodzie. Ten bulion (1% w/v fioletu krystalicznego) może być przechowywany i używany przez okres do roku, jeśli jest przechowywany w ciemnym miejscu.
   2. Aby zrobić z tego zapas roboczy, dodaj 50 ml oryginalnego roztworu podstawowego do 350 ml wody. Dodaj 100 ml etanolu do tego roztworu, aby uzyskać 500 ml roboczego roztworu fioletu krystalicznego (0,1% w/v fioletu krystalicznego).
      UWAGA: Oba te roztwory należy przechowywać w ciemności.

2. Procedura

1. Izolacja rogówek świń od całych oczu¹⁷
   1. Po otrzymaniu świńskich oczu od odpowiedniego sprzedawcy, przechowuj je na lodzie, jeśli wystąpi opóźnienie w przetwarzaniu tkanek, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
   2. Upewnij się, że podczas tej procedury używane i noszone są środki ochrony osobistej, aby uniknąć zanieczyszczenia, a także wypadków spowodowanych rozlaniem ciała szklistego.
   3. Spryskaj obszar roboczy 70% etanolem w celu oczyszczenia i dezynfekcji. Aby upewnić się, że przestrzeń robocza jest stabilna, rozłóż pokrowiec na ławkę i bezpiecznie przyklej boki, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
   4. Umieść oczy świni na gazie (Rysunek 3). Używając gazy 50 mm, przytrzymaj jedną ręką tylną część (Rysunek 4A) oczu świni, jak pokazano na Rysunek 4B.
   5. Za pomocą igły o wadze 30 G delikatnie wykonaj pojedyncze ukłucie w przybliżeniu na środku powierzchni nabłonka oka i upewnij się, że nie ma uszkodzenia zrębu (Ryc. 5). Szturchanie powinno być ograniczone do nabłonka (~100-200 μm), aby uniknąć zajęcia zrębu.
   6. Za pomocą ostrego, wysterylizowanego ostrza wykonaj małe nacięcie na twardówce w odległości 1 mm od rogówki. Przeciąć krawędź rogówki, upewniając się, że ciało szkliste nie przecieka, wykonując szybkie i płynne obracanie ręki (Rysunek 6A). Przytrzymując rogówkę na krawędzi rogówki-twardówki płaską pęsetą, odetnij pozostałe błony spętujące oko za pomocą ostrza (Rysunek 6B).
   7. Weź rogówkę i umieść ją na 12-dołkowej płytce pokrytej 2 ml pożywki rogówkowej. Rogówka powinna być skierowana do góry, co pokazano w serii kroków na rysunkach 7A-D, Rysunek 8).
   8. Dodać 5 μl roztworu wirusa zawierającego 5 x 10⁵ jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) 17 GFP do oczyszczonego miejsca na powierzchni rogówki. Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą zakażone rogówki świń w inkubatorze z 5% stężeniem CO_{2 przez} 72 godziny.
   9. Spryskaj wszelkie dodatkowe oczy, które nie były używane w eksperymencie, 10% wybielaczem i bezpiecznie wyrzuć je do worków na zagrożenia biologiczne.
2. Wizualizacja
   UWAGA: Wirus powinien być wizualizowany codziennie przed dodaniem leków.
   1. Włącz mikroskop stereoskopowy i źródło światła LED i poczekaj, aż lampa urządzenia rozgrzeje się przed obrazowaniem rogówki. Ostrożnie przenieś płytkę rogówki do instrumentu, nie naruszając roztworu. Zmień filtr tak, aby GFP (380-460 nm) był używany do oglądania próbek. Ustaw czas naświetlania na 500 ms, aby robić zdjęcia.
   2. Najpierw umieść płytkę rogówki pod stereoskopem i uchwyć obrazy w najmniejszym powiększeniu 7,5x. Następnie wykonaj serię obrazów w rosnącym powiększeniu (np. 15x, 25x, 35x), tak aby całe rozprzestrzenianie się wirusa i tworzenie dendrytów było wyraźnie widoczne
   3. Upewnij się, że zainfekowane rogówki wróciły z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i zapisz wszystkie wykonane obrazy.
3. Kwantyfikacja infekcji wirusem
   UWAGA: Miana wirusa z rogówki świń powinny być oceniane codziennie w celu analizy wpływu leczenia farmakologicznego.
   1. Aby określić ilościowo wirusa, wysiewaj komórki Vero o gęstości 5 x 10⁵ komórek na studzienkę, jeśli używasz płytki 6-dołkowej, jak to miało miejsce w tym eksperymencie. Zrób to dzień przed infekcją. Inkubuj posiałe komórki przez noc, aby upewnić się, że zlewają się w celu ilościowego określenia wirusa.
   2. Porcję 500 μl pożywki wolnej od surowicy do wielu probówek do mikrowirówek. Włóż sterylny wacik z bawełnianą końcówką zanurzony w probówkach wypełnionych pożywką bez surowicy. Waciki bawełniane należy zanurzyć i zwilżyć przez co najmniej 5 minut przed użyciem.
   3. Nie naruszając podłoża, należy przetransportować zakażoną płytkę rogówki świni do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mokrych wacików bawełnianych wykonaj 3 obroty zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 3 obroty przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o średnicy 5 mm od środka zainfekowanej rogówki świni bez wywierania nadmiernego nacisku.
   4. Włóż bawełniany wacik z powrotem do probówki mikrowirówkowej wypełnionej pożywką bez surowicy i obróć ją 5 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Metalową końcówkę bawełnianego wacika należy przyciąć na krótko, aby całkowicie zmieściła się w probówce do mikrowirówki, a pokrywkę można było zamknąć.
   5. Umieść probówkę mikrowirówki zawierającą wacikową końcówkę na maszynie do wirowania i wiruj z dużą prędkością przez 1 minutę.
   6. Przeprowadzić kwantyfikację wirusa za pomocą testu płytkiowego na tych próbkach.
      UWAGA: Ten etap oznaczania ilościowego należy przeprowadzić w 2., 4. i opcjonalnie 6 dni po zakażeniu.
4. Kwantyfikacja wirusa za pomocą testu płytki nazębnej
   UWAGA: Aby wykonać test płytki nazębnej, wyhoduj i płytkuj komórki Vero na 6-dołkowej płytce i upewnij się, że 90% zbiegu komórek przed rozpoczęciem testu. Użyj zlewającej się kolby o długości 75^cm2 tych komórek. Wszystkie poniższe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   1. Przepłukać zlewającą się monowarstwę komórek Vero w kolbie 10 ml świeżego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) po zaaspirowaniu pożywki hodowlanej. Powtórz etap płukania jeszcze raz z PBS po zassaniu pierwszego zestawu roztworu myjącego.
   2. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny do monowarstwy komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Gołym okiem upewnić się, że komórki są odłączone od wewnętrznej powierzchni kolby. Jeśli nie, odczekać kolejne 5 minut przed ponownym zbadaniem kolby. Gdy wydaje się, że komórki są odłączone, dodać 9 ml całej pożywki do monowarstwy, aby upewnić się, że komórki całkowicie odsuną się od powierzchni kolby.
   3. Zebrać wszystkie komórki z kolby wraz z całą pożywką i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   4. Na każdą studzienkę z 6 dołków, które są używane do oznaczania płytki nazębnej, użyj 300 μl z probówki wirówkowej. Uzupełnić każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 2 ml całego podłoża. Pozostaw płytki w inkubatorze na noc, aby mogły rosnąć i utworzyć zlewającą się monowarstwę w każdym dołku.
   5. Aby przeprowadzić test płytki nazębnej, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie próbek przed określeniem ilościowym wirusa.
   6. Wykonać log₁₀1-krotne rozcieńczenie wirusa w probówkach do mikrowirówek, używając pożywki wolnej od surowicy, aż do osiągnięcia rozcieńczenia ^10-8. W rozcieńczeniu ^10-3 przenieś 1 ml rozcieńczenia do monowarstwy posianych komórek po zaessaniu pożywki wzrostowej na komórkach z płytki 6-dołkowej, będzie to etap infekcji. Inkubować zakażoną płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
   7. Odessać istniejącą pożywkę infekcyjną, dwukrotnie delikatnie przemyć PBS, aby pokryć komórki i dodać 2 ml pożywki z metylocelulozą na studzienkę do wszystkich 6 studzienek. Inkubować przez 72 godziny lub do momentu, gdy będzie można zobaczyć tworzenie się blaszek. Blaszki miażdżycowe można zidentyfikować po tworzeniu się małych przerw między komórkami w monowarstwie komórki.
   8. Powoli dodawaj 1 ml metanolu do rogu każdej studzienki, używając ścianki jako końcówki prowadzącej. Inkubować 6-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powoli odsysać zawartość każdej studzienki z płytki, nie naruszając ani nie mieszając monowarstwy komórek.
   9. Dodaj 1 ml roztworu roboczego fioletu krystalicznego do każdej studzienki z 6-dołkową płytką, upewniając się, że wszystkie komórki są pokryte. Inkubować 6-dołkową płytkę w ciemności przez 30 minut. Wyrzuć roztwór fioletu krystalicznego przez zasysanie go i wysusz studzienki na arkuszu chłonnego papieru.
   10. Policz liczbę blaszek w basenie o najwyższym rozcieńczeniu, aby określić ilościowo całkowitą zawartość wirusa w roztworze wyjściowym. Powtórz proces dwukrotnie, aby potwierdzić miano wirusa.

Wyniki

Aby zrozumieć skuteczność eksperymentalnych leków przeciwwirusowych, muszą one zostać poddane szerokim testom przed przekazaniem do badań klinicznych in vivo u ludzi. W związku z tym należy wyznaczyć grupy kontrolne dodatnie, ujemne oraz grupy badawcze. Trifluorotymidyna (TFT) od dawna jest stosowana jako preferowana metoda miejscowego leczenia zapalenia rogówki wywołanego przez wirusy opryszczki¹⁶. W roli kontroli dodatniej grupy rogówek traktowane TFT wykazują mniejszy rozprzestrzenianie się inf...

Dyskusja

Wcześniejsze badania wykazały, że BX795 ma obiecującą rolę jako środek przeciwwirusowy przeciwko zakażeniu HSV-1; poprzez hamowanie kinazy wiążącej TANK 1 (TBK1)¹⁶. Zarówno TBK1, jak i autofagia odegrały rolę w hamowaniu infekcji HSV-1, jak wykazano na ludzkich komórkach nabłonka rogówki. Wykazano, że BX795 jest maksymalnie skuteczny w działaniu przeciwwirusowym w stężeniu 10 μM, a przy użyciu zarówno analizy western blot, jak i analizy płytki wirusowej kluczowych białek wirusowych, wykazano, że B...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły podskórne 30 G.	BD	305128
szklana butelka o pojemności 500 ml.	Thomas Scientific	844027
Antybiotyk i Antybiotyk (AA)	GIBCO	15240096	Podwielokrotność do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
wirownika laboratoryjnego.	Szafa	BioDot BDVM-3200
z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego Level-2 (BSL-2).	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterylne standardowe waciki z alginianu wapnia.	Puritan	22029501
Skrobak do komórek - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Przechowuj proszek w ciemnym miejscu
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Przechowywać w 4 & st.; C do czasu użycia
Etanol	Sigma Aldrich	E7023
Płodowa surowica bydlęca -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Podwielokrotność do probówek 50 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
Pęseta o płaskich krawędziach – 2.	Harward Instruments	72-8595
Zamrażarki --80 °C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Świeże pudełko ostrzy.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Folder Johnson		108 cali kwadratowych 12-warstwowy
HSV-1 17GFP	uprawiany w domowym		oryginalnym szczepie od dr Patricii Spears, Northwestern University. GFP eksprymujący HSV-1 szczep 17
Insulina, transferyna, selen - ITS	GIBCO	41400045	Aliquot do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
Mieszadło magnetyczne.	Thomas Scientific	H3710-HS
.	Harward Instruments	72-8400
Mikropipety o pojemności od 1 do 1000 i mikrolitrów.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium - MEM	GIBCO	11095080	Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C do czasu użycia
OptiMEM	GIBCO	31985047	Sklep pod adresem 4 ° C do czasu użycia
Penicylina/streptomycyna.	GIBCO	15140148	Porcję rozlać do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna -PBS	GIBCO	10010072	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Specjalne zamówienie na życzenie
Pokrowce na ławki zabiegowe - w razie potrzeby.	Thermofisher	Scientific S42400
	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Sprzęt do pipetowania serologicznego.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Magnes mieszający.	Thomas Scientific	F37120
Kolby do hodowli tkankowych, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Inkubatory do hodowli tkankowych, które mogą utrzymać 5% CO2 i 37 & Temperatura C.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Płytki poddane działaniu kultur tkankowych (6-dołkowe).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	GIBCO	25-300-062	Podwielokrotność do probówek o pojemności 10 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
Komórki Vero Kolekcja	kultur typu amerykańskiego	ATCC CRL-1586

bezpieczeństwa biologicznego Nożyczki metalowe Pipety serologiczne