Artykuł metodologiczny

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63612

⸱

2 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Office of New Animal Drug Evaluation, Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration, 5Division of Applied Regulatory Science, Office of Clinical Pharmacology, Office of Translational Sciences, Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący hodowlę organoidów jelitowych psów w dwukomorowym, przepuszczalnym systemie wsparcia. Opisano wysiewanie organoidów w przepuszczalnych podporach, utrzymanie monowarstwy i późniejsze eksperymenty z przepuszczalnością leków.

Streszczenie

System przepuszczalnego wsparcia jest zazwyczaj używany w połączeniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi (2D) liniami komórkowymi jako narzędzie in vitro do oceny przepuszczalności doustnej nowych kandydatów na leki terapeutyczne. Jednak zastosowanie tych konwencjonalnych linii komórkowych ma ograniczenia, takie jak zmieniona ekspresja ścisłych połączeń, częściowe różnicowanie komórek i brak kluczowych receptorów jądrowych. Pomimo tych niedociągnięć, modele Caco-2 i MDCK są powszechnie akceptowane i walidowane do przewidywania przepuszczalności jamy ustnej u ludzi in vivo.

Psy są istotnym modelem translacyjnym dla badań biomedycznych ze względu na ich podobieństwa w anatomii przewodu pokarmowego i mikroflorze jelitowej do ludzi. W związku z tym, a także w celu wsparcia równoległego opracowywania leków, wysoce pożądane jest opracowanie skutecznego i dokładnego narzędzia in vitro do przewidywania charakterystyki przepuszczalności leków in vivo zarówno u psów, jak i u ludzi. Takim narzędziem może być układ organoidów jelitowych psów, charakteryzujący się trójwymiarowymi (3D), samoorganizującymi się strukturami nabłonkowymi pochodzącymi z dorosłych komórek macierzystych.

Protokół (1) Siewu Przepuszczalnego Wsparcia opisuje eksperymentalne metody dysocjacji i rozsiewania psich organoidów we wstawkach. Izolacja, hodowla i odławianie organoidów psów zostały wcześniej opisane w osobnym zestawie protokołów w tym wydaniu specjalnym. Metody ogólnego utrzymania monowarstwy organoidów jelitowych psów są dokładnie omówione w (2) Protokole konserwacji jednowarstwowej. Ponadto w protokole tym opisano metody oceny integralności strukturalnej monowarstwy za pomocą pomiarów transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i mikroskopii świetlnej. Wreszcie, (3) Eksperymentalny Protokół Przepuszczalności opisuje zadania bezpośrednio poprzedzające eksperyment, w tym walidację wyników eksperymentalnych in vitro.

Ogólnie rzecz biorąc, model organoidu psów, w połączeniu z technologią dwukomorowej hodowli komórek, pokonuje ograniczenia związane z eksperymentalnymi modelami 2D, poprawiając tym samym wiarygodność przewidywań pozornej przepuszczalności doustnej kandydatów na leki terapeutyczne zarówno u psa, jak i u człowieka.

Wprowadzenie

Systemy przepuszczalnych podpór są zazwyczaj stosowane do wyznaczania pozornej przepuszczalności kandydatów na leki terapeutyczne przez barierę nabłonkową jelit1,2. Mogą być one również wykorzystywane do oceny sekrecji komórkowej3, migracji komórek4 oraz toksyczności leków5. Analizy przepuszczalności leków podawanych doustnie in vitro są kluczowym etapem procesu odkrywania i opracowywania leków2, przy czym poszczególni kandydaci na leki są testowani na wczesnym etapie cyklu życia badań i rozwoju (R&D) leku6. System przepuszczalnej podpory to dwukomorowy aparat do hodowli komórkowej, składający się z insertu z błoną półprzepuszczalną umieszczonego w płytce wielodołkowej. System ten umożliwia bezpośredni dostęp do strony apikalnej i basolateralnej monowarstwy komórek hodowanej w insercie7. Monowarstwa stosowana w tych systemach pochodzi zazwyczaj z komórek nabłonkowych przewodu pokarmowego (np. ludzka linia komórkowa raka gruczołowego jelita grubego Caco-2)8. Hodowle komórkowe rosną w stanie spolaryzowanym, naśladując naturalną mikroarchitekturę komórek nabłonkowych jelit, co umożliwia dalszą różnicację komórkową oraz uzyskanie podobnej mikroanatomii i funkcji7. Szczegóły dotyczące insertu przepuszczalnej podpory znajdują się na Rysunku 1. Zasiewanie insertów 2D hodowlami komórkowymi, tradycyjnie stosowanymi do oceny przepuszczalności leków w jelitach, jest stosunkowo niedrogie i łatwe do prowadzenia9. Systemy te wykazują jednak kilka istotnych ograniczeń, w tym ograniczoną zdolność do przewidywania metabolizmu jelitowego kandydatów na leki terapeutyczne10,11. Dotyczy to wszystkich mechanizmów wchłaniania leków, niezależnie od tego, czy jest to wchłanianie pasywne przez połączenia ścisłe między komórkami nabłonkowymi, aktywny transport transepitelialny poprzez mechanizmy efleksu lub transportery pobierające (np. P-glikoproteina, transporter monokarboksylanowy 1), a także leków metabolizowanych przez enterocyty.

Psy dzielą z ludźmi wspólne środowisko i dietę12. Anatomia jelit oraz skład mikrobiomu psów ściśle przypominają te u ludzi13, co przypisuje się udomowieniu i wspólnemu żywieniu na przestrzeni ostatnich 36 000 lat14. Niestety, podobieństwa te mogą być również wspólnymi przyczynami lub wyzwalaczami rozwoju chorób. U psów rozwijają się chroniczne schorzenia podobne do tych u ludzi, takie jak otyłość15, nieswoiste zapalenia jelit16, gruczolakowaty rak jelita grubego17, guzy stromalne przewodu pokarmowego (GIST)18 oraz różne inne patologie związane z ich względną długowiecznością19. W związku z tym organoidy psie mogą być z powodzeniem wykorzystywane w badaniach translacyjnych w kierunku odwrotnym (reverse translational research) nad tymi przewlekłymi chorobami wieloczynnikowymi, zgodnie z ideą inicjatywy One Health20.

Komórki Caco-2 są najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi w badaniach absorpcji doustnej leków21. Komórki te są obecnie uważane za model „złotego standardu” w badaniach przepuszczalności jelitowej in vitro2,22,23. Linia komórkowa Caco-2 wykazuje ekspresję transporterów wysyłających i pobierających występujących w ludzkim przewodzie pokarmowym, choć na różnych poziomach ekspresji24,25,26. Komórki Caco-2 są również szeroko stosowane jako modele do określania, czy dany lek jest substratem lub inhibitorem jelitowych transporterów wysyłających22,27. Mimo że komórki Caco-2 mają pochodzenie okrężnicze, naśladują one enterocyt. Niestety, komórki Caco-2 reprezentują tylko jeden typ komórek warstwy nabłonkowej jelita cienkiego9, co sprawia, że nie odzwierciedlają one dokładnie złożonego składu typów komórek nabłonka jelitowego. Na przykład w hodowlach Caco-2 brakuje komórek kubkowych odpowiedzialnych za produkcję śluzu, przez co interakcje między śluzem a lekiem nie mogą być oceniane bez kokultury z innymi liniami komórkowymi28. Ponadto hodowle Caco-2 nie wykazują ekspresji kilku ważnych receptorów jądrowych typowo obecnych w jelitach, takich jak receptor pregnanowy X (PXR), receptor steroidowy X (SXR) oraz konstytutywny receptor androgenowy (CAR)29. W konsekwencji hodowle Caco-2 nie pozwalają na modelowanie indukcji transporterów leków i enzymów przez niektóre leki, które są induktorami tych receptorów (np. ryfampicyna)30.

Technologia trójwymiarowych (3D) organoidów jelitowych pozwala na rozwiązanie niektórych z tych ograniczeń19. Organoidy są samoorganizującymi się konstrukcjami pochodzącymi z dorosłych komórek macierzystych, które mogą być hodowane z próbek tkanek pobranych za pomocą technik mikroinwazyjnych20. W modelach przepuszczalności jelitowej wykorzystuje się ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste31,32. Organoidy psie stanowią odpowiednią alternatywę dla organoidów ludzkich, ponieważ badania nad ludzkimi komórkami macierzystymi są ograniczone kwestiami etycznymi33. Co więcej, organoidy psie zapewniają system in vitro do badania przepuszczalności leków, metabolizmu, transportu aktywnego oraz interakcji lek-lek u psów. Aby wypełnić tę lukę technologiczną, opisano metodę spójnego i niezawodnego wzrostu psich organoidów jelitowych w systemie z przepuszczalnym podłożem34. Test przepuszczalności z wykorzystaniem psich organoidów jelitowych może potencjalnie lepiej przewidywać przepuszczalność jelitową i metabolizm małych cząsteczek leków u psów w porównaniu do obecnie stosowanych testów (Caco-2). Potwierdzenie tych kluczowych cech sprawia, że ten nowy system in vitro może zostać wykorzystany w przyszłych badaniach nad potencjalnym wpływem induktorów na metabolizm wewnątrzkomórkowy i transport aktywny.

Organoidy psie składają się ze wszystkich typów komórek zazwyczaj obecnych w warstwie nabłonkowej jelita. Z punktu widzenia funkcjonalnego i mikroanatomicznego wiarygodnie odwzorowują one środowisko warstwy nabłonkowej jelit psów19,35. Ponadto obecność śluzu, specyficznych dla psów transporterów leków i enzymów oraz ogólne różnicowanie komórkowe w jelitowych organoidach psich jest porównywalne z tym, co obserwuje się in vivo u psów34. Zatem organoidy mogą być izolowane od chorych pacjentów weterynaryjnych i wykorzystywane do modelowania wpływu różnych procesów chorobowych (np. przewlekłego zapalenia jelit) na doustną przepuszczalność leków u psów19,36. System jelitowych organoidów psich może być stosowany również w innych zastosowaniach niż eksperymenty dotyczące przepuszczalności leków. Te struktury 3D mogą być również izolowane od chorych pacjentów, jak opisano wcześniej przez zespół Chandry i współpracowników w przypadku nieswoistych zapalń jelit, gruczolakoraka jelita grubego oraz guzów podśluzówkowych przewodu pokarmowego19.

Protokół wysiewania na podłoże przepuszczalne opisuje metody tworzenia hodowli organoidów jelitowych psa w insertach. Ten pierwszy protokół przedstawia metody dysocjacji ugruntowanych hodowli organoidów psich wysiewanych w macierzy zewnątrzkomórkowej błony śluzowej. Ponadto w protokole omówiono wstępne pokrywanie insertów kolagenem I oraz macierzą zewnątrzkomórkową błony śluzowej. Szczegółowo opisano również osadzanie organoidów psich w przepuszczalnych insertach.

Drugim protokołem jest Protokół Utrzymania Monowarstwy, który obejmuje ogólną pielęgnację psich organoidów 3D wysianych w insercie. W tym drugim protokole przedstawiono częstotliwość i objętości pożywek dla organoidów używanych do odświeżania hodowli oraz sposoby zapobiegania uszkodzeniom hodowli komórkowej, wraz z metodami eksperymentalnymi służącymi do oceny konfluencji monowarstwy nabłonkowej.

Wreszcie, Protokół Badawczy Przepuszczalności skupia się na sposobach określenia, czy psie trójwymiarowe organoidy jelitowe w teście przepuszczalności są gotowe do zastosowania eksperymentalnego, oraz na krokach weryfikacyjnych niezbędnych przed przeprowadzeniem każdego doświadczenia. W tej sekcji opisano również konfigurację i pomyślne przeprowadzenie eksperymentu przepuszczalności, wraz z inkubacją i pobieraniem próbek kandydatów na leki terapeutyczne w komorach hodowli単warstwowej. Omówiono także zastosowanie niskoprzepuszczalnej fluoresceiny izotiocyjanianowej (FITC-dekstranu) w celu monitorowania integralności warstwy jednokomórkowej. Na koniec opisano metodę oceny in vitro służącą do walidacji wyników po zakończeniu eksperymentu. Eksperymenty dotyczące przepuszczalności stanowią niezwykle obszerny temat, który został bardzo dobrze podsumowany przez Hubatscha i wsp.37. Schemat blokowy protokołów przedstawiono na Rysunku 2.

Psie organoidy jelitowe na podłożu przepuszczalnym, schemat procesów transportu w płytce 24-dołkowej.
Rycina 1: Psie organoidy jelitowe w systemie z podłożem przepuszczalnym. Wkład z podłożem przepuszczalnym jest umieszczony w dołku płytki 24-dołkowej. Membrana mikroporowata umożliwia wysiew rozproszonych psich organoidów jelitowych, a komórki te ostatecznie tworzą dwuwymiarową monowarstwę organoidową. Technologia ta zapewnia dostęp do strony AP oraz BL monowarstwy. Pożywka dla organoidów jest wprowadzana do obu komór podłoża przepuszczalnego: AP i BL. Przedstawiono absorpcję (AP→BL) i sekrecję (BL→AP) kandydata na lek, a także dwa możliwe mechanizmy transportu leku. Skróty: AP = apikalna; BL = bazolateralna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat protokołu organoidów psich; wysiewanie, utrzymywanie, eksperyment, pomiar TEER, różnicowanie.
Rycina 2: Schemat blokowy protokołów z wykorzystaniem wstawek przepuszczalnych dla organoidów psich. Wstawka przepuszczalna jest wstępnie powlekana mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej i kolagenu I, a następnie inkubowana przez 1 h. W czasie inkubacji hodowla organoidów jest dysocjowana. Pojedyncze komórki organoidów są wysiewane do wstawki; po wysiewaniu niezwłocznie dodaje się pożywkę do komory basolateralnej, natomiast pożywkę do komory apikalnej dodaje się 24 h po zakończeniu procesu wysiewania. Utrzymywanie i monitorowanie organoidów obejmuje regularne zmiany pożywki, pomiary wartości TEER oraz badanie w mikroskopii świetlnej w celu oceny integralności monowarstwy. Przed eksperymentem organoidy muszą zostać zróżnicowane poprzez usunięcie z pożywek inhibitora ROCK i GSKiβ. Wartości TEER są mierzone w dniu eksperymentu, a monowarstwa organoidów jest sprawdzana pod mikroskopem świetlnym pod kątem uszkodzeń komórek. Następnie pożywkę wymienia się na odpowiedni bufor i inkubuje przed rozpoczęciem eksperymentu. Test z FITC-dekstranem jest stosowany podczas eksperymentów nad przepuszczalnością jelitową39 jako marker integralności monowarstwy. Pomiary TEER są wykonywane po eksperymencie, a wyniki są weryfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej po 24 h. Skróty: TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelialna oporność elektryczna); ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogen synthase kinase beta; F = fluorescencja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Badania zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego w Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). Następna sekcja (kroki 1.1-1.3) opisuje protokół wysiewu na przepuszczalne podłoże, a procedury zostały podsumowane na Rysunku 3.

Schemat procesu protokołu wysiewania na podłoże przepuszczalne; hodowla organoidów i dysocjacja organoidów psich.
Rysunek 3: Schemat procesu protokołu wysiewania na podłoże przepuszczalne. Wkładki z podłoża przepuszczalnego są wstępnie pokrywane kombinacją CMGF+ R/G, kolagenu I oraz macierzy błony zewnątrzkomórkowej, a następnie inkubowane. Pożywka z hodowli organoidów psich jest odsysana i zastępowana roztworem Cell Recovery Solution, po czym następuje 30 min inkubacji w 4 °C. Następnie hodowlę przenosi się do probówki i przeprowadza dysocjację organoidów przy użyciu proteazy podobnej do trypsyny. Niedysocjowane organoidy są usuwane poprzez przeciskanie przez sito w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a stężenie komórek jest określane za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Komórki są wysiewane na wkładkę z podłoża przepuszczalnego, a do komory bazolateralnej dodaje się CMGF+ R/G. Hodowlę inkubuje się następnie przez 24 h, po czym pozostałą ciecz z komory apikalnej usuwa się i zastępuje CMGF+ R/G. Skróty: ROCK = kinaza związana z rho; GSKiβ = kinaza syntazy glikogenu beta; CMGF + R/G = pełna pożywka z czynnikami wzrostu wzbogacona o inhibitor ROCK i GSKiβ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Protokół wysiewania na podłoże przepuszczalne

  1. Wstępne powlekanie przepuszczalnych wkładów wspierających
    1. Przygotować pełną pożywkę z czynnikami wzrostu wzbogaconą inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) oraz inhibitorem kinazy syntazy glikogenu beta (GSKiβ) (CMGF + R/G) zgodnie z informacjami w Tabeli 1.
    2. Przygotować pojemnik z lodem i rozpocząć rozmrażanie macierzy zewnątrzkomórkowej błony na lodzie. Umieścić płytkę 24-dołkową zawierającą wymaganą liczbę wkładów w inkubatorze w celu wstępnego ogrzania. Pobrać kolagen I z ogona szczura (3 mg/mL) i umieścić na lodzie, chroniąc przed światłem. Pobrać CMGF + R/G i umieścić na lodzie.
    3. Obliczyć całkowitą liczbę wkładów i próbek kontrolnych (blanków) wymaganych do eksperymentu, odliczając 100 µL roztworu do powlekania na każdy wkład.
      UWAGA: Przygotować więcej roztworu do powlekania niż jest to wymagane; zaleca się przygotowanie co najmniej 15% nadmiaru.
    4. W probówce 15 mL wymieszać CMGF+ R/G z macierzą zewnątrzkomórkową błony (1%) oraz kolagenem I (1%) i delikatnie wymieszać za pomocą pipety.
    5. Powlec każdy poliestrowy wkład 100 µL roztworu do powlekania i umieścić wkłady w inkubatorze (37 °C; atmosfera 5% CO2 ) na 1 h.
    6. Po inkubacji ostrożnie odessać roztwór do powlekania z każdego wkładu za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety P1000, uważając, aby nie uszkodzić filtra wkładu. Umieścić wstępnie powleczoną płytkę w inkubatorze, aby utrzymać ciepłotę.
  2. Dysocjacja organoidów psich
    UWAGA: Należy używać organoidów psich hodowanych przez co najmniej cztery dni. Przed rozpoczęciem dysocjacji należy zapoznać się z publikacją Gabriel et al.38, aby określić, kiedy próbka jest zdrowa, gęsta i wystarczająca do przeprowadzenia eksperymentu. Zaleca się dysocjację jednego dodatkowego dołka organoidów na każdą procedurę wysiewania. Ponadto zaleca się zwiększenie pożądanej liczby wkładów o ok. 20%, aby uwzględnić nierównomierny wzrost organoidów lub uszkodzenia spowodowane niewłaściwą manipulacją. W przypadku planowanego użycia FITC-dekstranu należy przygotować dodatkowe dołki.
    1. Przygotować pojemnik z lodem oraz fiolkę z zimnym roztworem Advanced DMEM/F12 1x w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Umieścić macierz zewnątrzkomórkową błony na lodzie, aby rozpocząć rozmrażanie, zanurzając ją w lodzie w celu ochrony przed zbyt szybkim rozmrożeniem i uniknięcia krzepnięcia. Umieścić pudełko z końcówkami do pipet (P200) w zamrażarce na potrzeby wysiewania macierzy zewnątrzkomórkowej błony.
    3. Wstępnie schłodzić wirówkę chłodzącą do 4 °C.
    4. Przenieść CMGF+ R/G z zamrażarki/lodówki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jeśli to możliwe, unikać bezpośredniej ekspozycji na światło.
    5. Usunąć całą pożywkę z płytki 24-dołkowej z hodowlą organoidów dla odpowiedniej liczby dołków (1 dołek płytki 24-dołkowej na 2-4 wkłady), uważając, aby nie naruszyć macierzy zewnątrzkomórkowej błony.
      UWAGA: Objętość może się różnić w zależności od stosowanego systemu liczenia komórek.
    6. Dodać 0,5 mL wstępnie schłodzonego roztworu Cell Recovery Solution na dołek, aby rozpuścić kopułki macierzy zewnątrzkomórkowej błony.
    7. Inkubować płytkę w lodówce (4 °C) przez 30 min.
    8. Pipetować zawiesinę, zebrać wszystkie organoidy i rozpuszczoną macierz zewnątrzkomórkową błony, a następnie przenieść je do probówki 15 mL.
    9. Wirować (700 × g przez 5 min w 4 °C) i usuwać nadsącz, aż poziom osiągnie markę 0,5 mL, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    10. Dodać 1 mL proteazy podobnej do trypsyny i inkubować w łaźni wodnej 37 °C przez 8 min. Kilkukrotnie potrząsnąć probówką podczas inkubacji, aby wymieszać komórki.
    11. Przenieść probówkę z próbką z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i powoli dodać 7 mL wstępnie schłodzonego Advanced DMEM/F12, aby inaktywować proteazę podobną do trypsyny i zatrzymać dysocjację komórek.
    12. Wstępnie zwilżyć sitko komórkowe 40 µm 1 mL Advanced DMEM/F12. Delikatnie pipetować mieszaninę i przefiltrować zawiesinę; dopipetować dodatkowy Advanced DMEM/F12, aby wypłukać sitko.
    13. Wirować probówkę (700 × g przez 5 min w 4 °C) i usunąć nadsącz. Nie naruszać osadu.
    14. Resuspendować osad komórkowy w ok. 50-100 µL pożywki hodowlanej (CMGF+ R/G) na każdy dołek zdysocjowanych organoidów.
    15. Policzyć podpróbkę zawiesiny (ok. 10 µL) przy użyciu hemocytometru lub odpowiedniego urządzenia i określić całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
  3. Wysiew organoidów psich
    1. Rozcieńczyć lub zagęścić zawiesinę komórkową, aby uzyskać stężenie ok. 75 000 komórek na mL.
    2. Wysiać 100 µL zawiesiny do każdego wkładu, używając końcówek wstępnie powleczonych BSA (1%), aby uniknąć adhezji komórek podczas przenoszenia. Dodać jeden powleczony wkład jako kontrolę bezkomórkową (blank) bez hodowanych organoidów, przy jednoczesnym zachowaniu regularnych wymian pożywki.
    3. Delikatnie poruszać płytką okrężnym ruchem przez ok. 30 s, aby rozproszyć wysiane komórki na wkładzie. Potwierdzić równomierny rozkład komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.
    4. Dodać 700 µL CMGF + R/G do komory basolateralnej i umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C; atmosfera 5% CO2 ) na 24 h.
    5. Po 24 h delikatnie usunąć zawiesinę komórkową z komory apikalnej i zastąpić ją 200 µL CMGF + R/G. Zwrócić płytkę do inkubatora.

2. Protokół utrzymania monowarstwy komórek organoidowych

UWAGA: Poniższa sekcja (kroki 2.1-2.2) opisuje protokół utrzymania monowarstwy komórek organoidów. Przebieg procedur przedstawionych w niniejszym protokole został podsumowany na Rycynie 4. Tabela do sporządzania notatek, która może pomóc w standaryzacji pomiarów wartości TEER, została przedstawiona w Tabeli uzupełniającej 1.

Schemat utrzymywania hodowli na wsporniku przepuszczalnym; sterylizacja, pomiar TEER, mikroskopia.
Rycina 4: Schemat utrzymywania hodowli na wsporniku przepuszczalnym. Wartości TEER są mierzone przy użyciu elektrod (sond) oraz woltomierza/omierza. Sonden należy poddać sterylizacji chemicznej 70% alkoholem przed wprowadzeniem ich do dołków. Wykonuje się pomiary dla wkładki kontrolnej (blank) oraz wkładki z organoidami, a następnie oblicza wartości TEER. Następnie odświeża się pożywkę w komorach apikalnej i bazolateralnej, a hodowlę organoidów psich na wkładce wizualizuje się za pomocą mikroskopii świetlnej. Ewentualne przerwania w kulturze organoidów lub w membranie mikroporowatej są odnotowywane i obsługiwane zgodnie z protokołem. Skrót: TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelialna oporność elektryczna). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pomiar wartości TEER
    UWAGA: Pomiary wartości TEER wykonuje się przy użyciu woltomierza/omomierza nabłonkowego z przystawką w formie pałeczek. Należy zapoznać się z instrukcją obsługi producenta. Wartości TEER dostarczają informacji o integralności monowarstwy organoidów psich.
    1. Dokonywać pomiarów wartości TEER co drugi dzień podczas wzrostu hodowli komórkowej.
    2. Przenieść woltomierz/omomierz nabłonkowy wraz z elektrodami do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przed użyciem wysterylizować elektrody chemicznie w 70% alkoholu. Ustawić funkcję na omy. Odczekać co najmniej jedną minutę do wyschnięcia elektrod.
    3. Przed wykonaniem pierwszego pomiaru włożyć elektrodę drucianą do portu i włączyć zasilanie. Upewnić się, że miernik wyświetla 1,000 Ω przy włożonej elektrodzie drucianej zamiast elektrod w formie pałeczek. Jeśli tak nie jest, należy skalibrować urządzenie.
    4. Włożyć elektrody do komory apikalnej i basolateralnej wkładki pozbawionej komórek (blank), tak aby w komorze apikalnej znajdowała się krótsza elektroda, a w komorze basolateralnej dłuższa elektroda (jak pokazano na Rysunku 4). Nie dotykać membrany, dbając jednocześnie o to, aby elektrody były zanurzone w medium.
    5. Odczekać kilka sekund do ustabilizowania się wartości i zanotować ją w dzienniku laboratoryjnym. Zmierzyć pozostałe monowarstwy organoidów psich, pamiętając o sterylizacji elektrod 70% alkoholem przy pomiarze różnych próbek. Należy uważać, aby nie dotknąć monowarstwy organoidów elektrodą.
    6. Po zakończeniu pomiarów wysterylizować elektrody 70% alkoholem po raz ostatni. Należy chronić je przed uszkodzeniami wynikającymi z niewłaściwej manipulacji i przechowywać zgodnie z instrukcją producenta.
    7. Obliczyć wartości TEER dla każdej studzienki, korzystając z równania (1), gdzie Rsample i Rblank to wartości w omach (Ω) odpowiednio dla studzienek z monowarstwą i studzienek kontrolnych (blank), a pole powierzchni (cm²) to powierzchnia wkładki.
      Równanie TEER do obliczania rezystancji, formuła z członami rezystancji i powierzchni. (1)
  2. Utrzymanie monowarstwy
    UWAGA: Zapoznać się z zalecanym planem wymiany medium w Tabeli 2.
    1. Za pomocą sterylnych jednorazowych pipet Pasteura 9" i aspiratora próżniowego delikatnie odessać medium z komory apikalnej, a następnie basolateralnej. Przechylić płytkę, aby wyraźnie widzieć powierzchnię medium. Unikać odsysania zbyt blisko membrany mikroporowatej w komorze apikalnej, aby zapobiec uszkodzeniu monowarstwy komórkowej.
      UWAGA: Używać nowej pipety Pasteura przy przechodzeniu między próbkami. W tej procedurze można zastosować również pipety automatyczne.
    2. Powoli dodać CMGF+ R/G za pomocą pipet P1000, kierując strumień w stronę ścianki komory apikalnej lub basolateralnej. Wymianę medium w komorze apikalnej przeprowadzać bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić monowarstwy.
    3. Sprawdzać studzienki co drugi dzień pod mikroskopem świetlnym, oceniając kondycję hodowli i monitorując pod kątem rozdarć w monowarstwie organoidów lub membranie mikroporowatej. Użyć mikroskopii fazowo-kontrastowej, aby uwydatnić szczegóły hodowli.
      UWAGA: W przypadku rozdarć monowarstwy organoidów psich, pozostawia się czas na regenerację i odrost monowarstwy. W przypadku rozdarć membrany mikroporowatej, studzienkę należy wykluczyć z eksperymentu.

Tabela 2: Zalecenia dotyczące wymiany pożywki dla kultur organoidów. Pożywka CMGF+ R/G jest wymieniana w komorze apikalnej i bazolateralnej studzienek co drugi dzień. Dłuższy okres hodowli podczas weekendu wymaga zwiększenia objętości pożywki w obu komorach, bazolateralnej i apikalnej, co jest realizowane w piątkowe popołudnie, a wymiana następuje w poniedziałek. Skróty: ROCK = kinaza związana z rho; GSKiβ = kinaza syntazy glikogenu beta; CMGF + R/G = pożywka kompletna z czynnikami wzrostu wzbogacona o inhibitor ROCK i GSKiβ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Protokół eksperymentalny badania przepuszczalności

UWAGA: Następująca sekcja (kroki 3.1-3.5) opisuje Protokół Badawczy Przepuszczalności. Schemat protokołu badawczego służącego do pomiaru przepuszczalności leku in vitro przedstawiono w Rysunku 5.

Schemat procesu pomiaru TEER; proces obejmuje tworzenie monowarstwy, wymianę buforu oraz test z FITC-dekstraną.
Rycina 5: Schemat protokołu eksperymentalnego. Poziom pożywki dla organoidów musi zostać zmieniony z CMGF+ R/G na CMGF+ od ośmiu do dwunastu dni po wysianiu wkładów, aby umożliwić różnicowanie komórkowe. Po zmianie pożywki (zarówno w części apikalnej, jak i basolateralnej) na CMGF+, wartości TEER powinny nadal rosnąć, a monowarstwa organoidów psich powinna niemal osiągnąć pełną konfluencję. Gotowość monowarstw ocenia się co najmniej cztery dni po zmianie pożywki na CMGF+. Gdy monowarstwa jest całkowicie uformowana, a wartości TEER osiągną fazę plateau (zazwyczaj między 1 500 a 2 500 Ω.cm2), pożywka zostaje wymieniona na bufor transportowy na 30 min, aby umożliwić monowarstwie przystosowanie się do nowego środowiska. W czasie 0 min eksperymentu wykonuje się test z FITC-dekstraną i pobiera próbkę basolateralną po 20 min. Wyniki są następnie analizowane za pomocą czytnika płytek. Po zakończeniu eksperymentu zawartość komór apikalnej i basolateralnej zostaje ponownie zmieniona na CMGF+, a następnie dokonuje się odczytów wartości TEER. Monowarstwy inkubuje się przez 24 h, a integralność monowarstwy ocenia się poprzez powtórne pomiary TEER. Skróty: TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelny opór elektryczny); ROCK = rho-associated kinase (kinaza związana z białkiem rho); GSKiβ = glycogen synthase kinase beta (kinaza syntazy glikogenu beta); CMGF + R/G = kompletna pożywka z czynnikami wzrostu wzbogacona o inhibitor ROCK i GSKiβ; CMGF+ = kompletna pożywka z czynnikami wzrostu, ale bez inhibitora ROCK lub GSKiβ; FITC = fluoresceinian izotiocyjanianowy; F = fluorescencja. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Ocena gotowości monowarstwy organoidowej
    UWAGA: Ten etap następuje od 8 do 14 dni po wysianiu.
    1. Kontroluj monowarstwę co najmniej co drugi dzień pod mikroskopem świetlnym (użyj kontrastu fazowego, aby zwizualizować integralność monowarstwy). Przejdź do następnego kroku, gdy monowarstwa komórkowa będzie w pełni uformowana, bez przerw i wyraźnych oznak pęknięć.
    2. Zmień pożywkę organoidową z CMGF+ R/G na CMGF+ (usuwając z składu pożywki inhibitor ROCK oraz GSKiβ). Zaleca się zmianę pożywki co najmniej cztery dni przed eksperymentem.
      UWAGA: Ten krok umożliwi prawidłowe różnicowanie monowarstwy organoidowej.
    3. Kontynuuj pomiary wartości TEER mniej więcej co drugi dzień. Gdy wartości TEER zaczną osiągać plateau na poziomie około 1,500 do 2,000 Ω × cm² (Rysunek 6), mierz wartości TEER codziennie.
      UWAGA: Stan stacjonarny ten może być utrzymany przez około 2-3 dni, co stanowi optymalne okno czasowe do przeprowadzenia testów przepuszczalności (zazwyczaj w dniach od 11 do 13). Wartości plateau TEER mogą nieznacznie oscylować w zależności od lokalizacji jelitowej organoidów, temperatury pomiaru, rasy, wieku i stanu chorobowego psa.
    4. Zaplanuj analizę przepuszczalności leku niezwłocznie, aby uniknąć gwałtownego spadku wartości TEER lub przerostu monowarstwy organoidowej do wielu warstw komórkowych.
  2. Przygotowanie do eksperymentu
    UWAGA: Podczas eksperymentu można stosować inkubatory z wytrząsarką, aby uniknąć efektów nieruchomej warstwy wodnej. Mierz wartości TEER w stałych temperaturach.
    1. W dniu eksperymentu zmierz wartości TEER i potwierdź, że osiągnęły one stan stacjonarny i nie spadają gwałtownie.
    2. Z nadmiaru 20% insertów wybierz najlepsze monowarstwy (na podstawie mikroskopii świetlnej i wartości TEER), aby przeprowadzić eksperyment.
    3. Obejrzyj monowarstwy pod mikroskopem świetlnym i odrzuć monowarstwy organoidowe niekompletne, przerwane lub przerośnięte.
    4. Przygotuj bufor transportowy i dostosuj jego pH do pożądanych wartości.
      UWAGA: Skład buforu eksperymentalnego różni się w zależności od układu doświadczalnego. Często stosowany bufor składa się z zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), glukozy (12.5 mM) oraz kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, 25 mM). Skład ten zapewnia żywotność kultury organoidów podczas eksperymentu.
    5. Ostrożnie odessij pożywkę z komór apikalnych i bazolateralnych wybranych dołków.
    6. Dodaj 200 µL buforu transportowego do komory apikalnej i 800 µL do komory bazolateralnej.
      UWAGA: Bufor transportowy należy najpierw dodać do komory apikalnej, a następnie do komory bazolateralnej, aby uniknąć odklejenia monowarstwy od membrany mikroporowatej.
    7. Umieść płytkę w inkubatorze (37 °C; atmosfera 5% CO2 ) na 30 min w celu ekwilibracji.
      UWAGA: Monowarstwy organoidów psich są teraz gotowe do eksperymentu przepuszczalności leków.
  3. Typowy układ eksperymentalny – roztwór stężenia IgY
    UWAGA: Projekt i układ eksperymentu mogą ulec zmianie w zależności od pytania badawczego. W protokole jako przykład wykorzystano przepuszczalność immunoglobulin Y (IgY) przez monowarstwę organoidową, którą można zmodyfikować. Termin „komora donora” odnosi się do komory, w której lek jest początkowo aplikowany, natomiast „komora odbiorcza” odnosi się do komory przyjmującej lek z komory donora. W typowym eksperymencie próbki z komór odbiorczych pobiera się przez 2 h (np. 15, 30, 60, 90, 120 min).
    1. Przygotuj roztwór IgY (wybrany lek lub substancję rozpuszczalną), rozpuszczając go w buforze transportowym do pożądanego stężenia końcowego. Przygotuj więcej roztworu leku niż jest wymagane.
      UWAGA: Leki o niskiej rozpuszczalności w wodzie można najpierw rozpuścić w rozpuszczalniku organicznym (np. etanolu, DMSO) przed dodaniem do buforu. Końcowe stężenie rozpuszczalnika powinno być mniejsze niż 1%, aby nie uszkodzić monowarstwy komórkowej.
    2. Usuń bufor z komory donora (komory apikalnej lub bazolateralnej) każdego dołka.
    3. Dodaj roztwór IgY (roztwór leku) do wszystkich komór donora. Pozostały roztwór wykorzystaj jako roztwór donora w czasie 0 do pomiaru początkowego stężenia leku.
    4. W wymaganych punktach czasowych pobierz 50 µL z komory odbiorczej i umieść w oznakowanej probówce. W ostatnim punkcie czasowym pobierz próbkę z komory donora. Po zakończeniu eksperymentu przenieś alikwoty z komory donora i odbiorczej do zamrażarki -20 °C.
      UWAGA: Jeśli wymagane jest wiele punktów czasowych, można wymienić bufor w komorze odbiorczej, ale musi to zostać uwzględnione w obliczeniach pozornej przepuszczalności. Aby zachować warunki sink, stężenie w komorze odbiorczej nie powinno przekroczyć 10% stężenia w komorze donora na koniec eksperymentu44.
  4. Kontrola jakości monowarstwy komórkowej organoidów
    UWAGA: Roztwór FITC-dekstranu może być użyty do potwierdzenia integralności monowarstwy podczas eksperymentu. FITC-dekstran służy jako przykład analizy integralności monowarstwy. Inne metody obejmują użycie Lucifer yellow, PEG-4000, znakowanego izotopowo mannitolu oraz inuliny44.
    1. W czasie 0 min odessij zawartość komory apikalnej i zastąp ją 250 µL roztworu FITC-dekstranu (5 mg/mL, 4 kDa) w trzech powtórzeniach dla każdej grupy eksperymentalnej.
      UWAGA: Nie wystawiaj FITC-dekstranu na działanie światła.
    2. Po 20 min usuń bufor z komory bazolateralnej.
    3. Zmierz intensywność fluorescencji próbki bazolateralnej za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (użyj krzywej kalibracyjnej; wzbudzenie ustawione na 485 nm i emisja na 528 nm).
      UWAGA: Papp FITC można również obliczyć metodą opisaną w dyskusji.
    4. Po zakończeniu eksperymentu ostrożnie odessij nadmiar buforu z komór apikalnych i bazolateralnych.
    5. Dodaj 200 µL CMGF+ do komory apikalnej i 700 µL do komory bazolateralnej.
    6. Zmierz wartości TEER w poszczególnych dołkach.
    7. Umieść płytkę w inkubatorze (37 °C; atmosfera 5% CO2 ) na 24 h.
    8. Jeśli jest to dot. po 24 h zmierz wartości TEER, aby ocenić możliwe uszkodzenia monowarstwy podczas etapu kontroli jakości eksperymentu. Użyj mikroskopii świetlnej, aby zwizualizować integralność monowarstwy organoidów psich.
  5. Fiksacja monowarstw komórkowych do dalszych analiz
    1. Przygotuj roztwór formaliny, kwasu octowego i alkoholu (FAA, skład w Tabeli 1).
    2. Usuń bufor transportowy lub CMGF+ z komór apikalnych i bazolateralnych za pomocą pipety P1000 lub sterylnych jednorazowych pipet Pasteura 9" i aspiratora próżniowego.
    3. Wypełnij komory apikalne i bazalne roztworem FAA.
    4. Po 24 h odessij FAA i zastąp go 70% etanolem.
    5. Owiń płytkę elastyczną folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu, i przystąp do przygotowania bloków.

Wykres wartości TEER; grupy jelita cienkiego (jejunu) vs jelita grubego w dniach po wysiewaniu; porównanie oporności elektrycznej.
Rysunek 6: Wartości TEER w grupach eksperymentalnych. Wartości TEER mierzono w pięciu grupach monowarstw organoidów jelitowych psa. Trzy grupy składały się z enteroidów z jejunum psa, a dwie grupy składały się z kolonoidów. Każda grupa obejmowała od 12 do 22 powtórzeń. Wartości TEER dla kultur enteroidów z jejunum przedstawiono od 4. do 14. dnia, a dla kultur kolonoidów od 4. do 12. dnia (pomiary zakończono, gdy monowarstwa organoidów osiągnęła wartości stanu stacjonarnego, co wskazywało na gotowość monowarstwy do użycia w eksperymentach). Słupki błędów reprezentują SEM pomiarów. Skrót: TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelna oporność elektryczna). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Standardowe procedury operacyjne dotyczące hodowli organoidów psich zostały opisane wcześniej33, a protokół hodowli organoidów psich został również szczegółowo omówiony w tym wydaniu specjalnym38. Jelitowe organoidy psie hodowane na podporach przepuszczalnych zostały utrwalone i zatopione w parafinie w celu zbadania mikroanatomii monowarstwy oraz populacji komórek. Proces zatapiania w parafinie został wcześniej omówiony przez Gabriela i współpracowników38. Wykonano rutynowe barwienie (hematoksyliną i eozyną), a technika barwienia błękitem Alciana została zastosowana do wykrycia komórek kubkowych w monowarstwie organoidów psich (patrz Rycina 7).

Barwienie organoidów jelita psa, H&E i AB, obrazy mikroskopowe, analiza histologiczna, 40x, 60x.
Rysunek 7: Barwienie monowarstwy organoidów jelita psa. Organoidy jelita psa pochodzenia okrężniczego na podłożu przepuszczalnym zostały zatopione w parafinie i zabarwione H&E oraz AB. Reprezentatywne obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 40x (A) i 60x (B). Barwienie H&E ujawnia kolumnowy nabłonek jednowarstwowy, a mikrokosmki w części apikalnej komórek są widoczne przy powiększeniu 60x. Barwienie AB dodatkowo wykazuje obecność komórek kubkowych (ciemnoniebieskie) w monowarstwie organoidów jelita psa. Paski skali = 20 µm (A), 50 µm (B). Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; AB = błękit alkianowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kulturę organoidów na przepuszczalnym podłożu należy hodować od 10 do 14 dni, aby była gotowa do eksperymentu z przepuszczalnością. Mikroskopia świetlna jest stosowana wraz z pomiarami wartości TEER w celu potwierdzenia gotowości kultury organoidów do badania przepuszczalności potencjalnych leków. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe warstw jednowarstwowych organoidów jelita psiego od zwierząt zdrowych i chorych przedstawiono na Rysunku 8.

Schemat mikroskopowy monowarstw organoidów jelitowych psów i linii komórkowych 2D przy różnych powiększeniach.
Rysunek 8: Mikroskopia monowarstw organoidów jelitowych psów. Zdjęcia rosnących monowarstw wykonane za pomocą mikroskopii świetlnej. Monowarstwy organoidów pochodzące od zdrowych dawców są reprezentowane przez hodowle enteroidów jelita cienkiego (10x; 40x) oraz kolonoidów (20x; 40x). Monowarstwy organoidów od dawców chorych są reprezentowane przez enteroidy dwunastnicze (5x; 10x) i jelita krętego (5x; 10x) pochodzące od psa zdiagnozowanego z PLE. Obie hodowle organoidów PLE są przykładami nieprawidłowej izolacji komórek podczas wysiewania organoidów; hodowle te nie mogły zostać użyte do testów przepuszczalności leków ze względu na obecność organoidów 3D. Przykłady odchyleń od prawidłowego tworzenia monowarstwy, takie jak przerwania monowarstwy (5x), są spowodowane nieostrożną manipulacją próbkami biologicznymi. Przedłużona hodowla organoidów (10x; 20x) wynika z długiego utrzymywania organoidów na wkładce, kiedy organoidy zaczynają przypominać swoją pierwotną strukturę 3D. Dla porównania przedstawiono zdjęcia tradycyjnych linii komórkowych 2D na wspornikach przepuszczalnych, powszechnie stosowanych w badaniach przepuszczalności leków (MDCK-10x; 40x oraz Caco-2-10x; 20x). Skróty: PLE = enteropatia z utratą białka; MDCK = Madin-Darby canine kidney. Paski skali = 500 µm (5x), 200 µm (10x), 100 µm (20x), 50 µm (40x). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Monowarstwy organoidów utrwalono również w 3% Paraformaldehydzie i 3% Glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Do charakteryzacji ultrastruktury hodowli organoidów na podporach przepuszczalnych wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Mikroanatomiczne struktury mikrokosmków i połączeń ścisłych widoczne są na Rysunku 9.

TEM organoidów jelitowych psa; monowarstwy jelita czczego, kątnicy i okrężnicy; mikrokosmki, połączenia, membrana.
Rysunek 9: Obrazy TEM zdrowych monowarstw organoidów jelitowych psa. TEM wykorzystano do ukazania mikroarchitektury komórkowej monowarstw organoidów jelita czczego (A), kątnicy (B) oraz okrężnicy (C). Mikroporowata membrana wkładki z przepuszczalnym wsparciem zaznaczona jest żółtą strzałką. Na obrazach zaznaczono obecność mikrokosmków (niebieska strzałka) i połączeń ścisłych (czerwona strzałka). Skrót: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Paski skali = 5 µm (A), 2 µm (B, C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Zarówno pomiary TEER, jak i mikroskopia świetlna powinny zostać przeprowadzone, aby upewnić się, że system jest gotowy do testów przepuszczalności. Analiza jest gotowa do użycia, gdy TEER osiągnie stan stacjonarny, natomiast mikroskopia świetlna pomoże wykluczyć uszkodzenia lub nadmierny rozrost organoidów. Podsumowanie typowych pomiarów TEER dla pięciu grup składających się z enteroidów jelita czczego i kolonoidów psów przedstawiono na Rysunku 6.

Tabela 1: Skład mediów do organoidów i FAA. Pełny skład CMGF+, CMGF+ R/G oraz FAA został podsumowany w tej tabeli. Skróty: ROCK = kinaza związana z rho; GSKiβ = inhibitor kinazy syntazy glikogenu beta; CMGF + R/G = podłoże kompletne z czynnikami wzrostu, wzbogacone o inhibitor ROCK i GSKiβ; CMGF+ = podłoże kompletne z czynnikami wzrostu, ale bez inhibitora ROCK lub GSKiβ; FAA = formalina-kwas octowy-alkohol; EGF = epidermalny czynnik wzrostu. Tabela została opracowana na podstawie 38. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela do sporządzania notatek dotyczących systemu podpory przepuszczalnej dla organoidów psich. Skróty: TEER = transepithelial electrical resistance; ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogen synthase kinase beta; CMGF + R/G = pożywka kompletna z czynnikami wzrostu wzbogacona o inhibitor ROCK i GSKiβ; CMGF+ = pożywka kompletna z czynnikami wzrostu, ale bez inhibitora ROCK lub GSKiβ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Kultury organoidów jelitowych psów w aparaturze z przepuszczalnym podłożem stanowią unikalną koncepcję łączącą tradycyjne testy przepuszczalności leków40 z nowatorskim modelem psim in vitro41. W zależności od celu eksperymentu można stosować i oceniać różne typy organoidów jelitowych psów, wprowadzając minimalne korekty. Zaleca się testowanie wielu stężeń badanego leku w 3-4 dołkach na grupę. Stężenia mogą być oparte na przewidywanym stężeniu leku w jelitach. Ponadto wykorzystanie wcześniejszych badań może pomóc w ustaleniu odpowiednich punktów czasowych dla projektu badania. Należy sporządzić właściwą dokumentację projektu badania, aby zwiększyć powtarzalność i ułatwić rozwiązywanie problemów.

Ta technologia posiada kilka ograniczeń wynikających z nowości metody42, głównie ze względu na brak standaryzacji w projekcie eksperymentalnym i wykonaniu protokołu w różnych laboratoriach. Brak standaryzacji został odnotowany przez inne grupy43, a Protokoły Monowarstw 3D Organoidów Psa pozwolą na uzyskanie odtwarzalności międzylaboratoryjnej i wprowadzą standaryzację do tego systemu. Ustandaryzowane podejścia do analizy danych poprawiają powtarzalność i mogą wzmocnić wyniki wstępnych testów leków z użyciem organoidów psich w systemie podpór przepuszczalnych w różnych laboratoriach. W psim modelu 3D organoidów brakuje również zestawów danych porównujących wartości in vitro Papp leków modelowych z ich znanym ludzkim lub psim wchłanianiem jelitowym in vivo, podobnie jak w przypadku komórek Caco-244,45,46. Po wygenerowaniu takich danych ten psi model organoidowy może zostać wykorzystany do oceny przepuszczalności jelitowej podczas opracowywania leków.

Kluczowe jest zachowanie ostrożności podczas wysiewania organoidów na przepuszczalny system podparcia, aby zapewnić wystarczająco wysoką gęstość odpowiednio dysocjowanych komórek. Wartości TEER systemu są bardziej wiarygodne i powtarzalne, gdy hodowla odbywa się w ścisłych monowarstwach. Przedłużona hodowla monowarstw może prowadzić do wykładniczego wzrostu wartości TEER, które oddalają się od fizjologicznych wartości jelita. Przekroje H&E takich struktur 3D wykazują wówczas obecność kilku warstw komórek ułożonych jedna nad drugą, z przekształconą strukturą enterocytów w pobliżu błony.

Po pomyślnej ekspansji monowarstwy organoidów jelitowych psa, wyniki można analizować w ten sam sposób, co w tradycyjnych testach komórkowych 2D, obliczając współczynnik pozornej przepuszczalności leku (Papp) według wzoru44. Wartość Papp (patrz. równanie (2)) opisuje szybkość transportu przez monowarstwę komórkową47.

Równanie Pappa dla przepuszczalności, przedstawiające tempo zmian i stężenie na symbolu matematycznym. (2)

Wzór Pochodna ładunku względem czasu, formuła: dQ/dt, koncepcja: analiza prądu elektrycznego. przedstawia początkowe nachylenie krzywej zależności stężenia od czasu (np. nmol/s). A to powierzchnia wkładki (cm2), a C0 to stężenie początkowe leku lub związku w komorze dawcy37. Wiarygodne rozpoznanie integralności monowarstwy jest kluczowym elementem testu przepuszczalności, który wymaga standaryzacji. Aby ocenić organoidy psie w systemie wsparcia przepuszczalnego i pomóc w ustaleniu właściwego czasu przeprowadzenia eksperymentu, zaleca się zastosowanie mikroskopii świetlnej oraz pomiarów TEER. Dodatkowo, do funkcjonalnej oceny integralności monowarstwy organoidów można wykorzystać markery o zerowej przepuszczalności molekularnej (np. FITC-dextran, Lucifer yellow, PEG-400). Należy zachować ostrożność, jeśli testowany związek jest substratem dla transportera. Jako powszechny przykład pompy efluksowej wykorzystuje się glikoproteinę P (P-gp). Należy wyznaczyć współczynnik efluksu (Papp,BL-AP/Papp,AP-BL) i porównać go z dobrze znanym substratem sondy P-gp.

Mikroskopia świetlna (zwykła lub wzmocniona kontrastem fazowym) jest nieocenioną metodą sprawdzania integralności monowarstwy 2D lub 3D oraz wkładki filtra, przy jednoczesnej ocenie ewentualnego nadmiernego rozrostu komórek. Rysunek 7 może służyć jako pomoc w rozpoznawaniu zdrowych kultur komórek organoidów jelitowych psa. Wartości TEER stanowią istotny miernik tworzenia się połączeń międzykomórkowych oraz różnicowania kultur organoidów w nienaruszone nabłonki jelitowe. Psie organoidy jelitowe różnicują się w enterocyty i komórki kubkowe (Rysunek 6). Te komórki produkujące śluz umożliwiają badanie interakcji leków ze śluzem, co było trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych kultur komórkowych 2D48. Obecność komórek enteroendokrynnych w psich organoidach jelitowych została wcześniej potwierdzona przez zespół Chandry i wsp.33.

Przedstawiono dalszą charakterystykę monowarstw organoidów psich pochodzących z organoidów jelita czczego, krętego i grubego z wykorzystaniem TEM. Obrazy TEM ukazują mikroarchitekturę komórkową, w tym tworzenie się połączeń ścisłych i mikrokosmków, co dodatkowo ilustruje złożoność i użyteczność tych modeli organoidowych w medycynie translacyjnej. Na podstawie wyników eksperymentalnych kultury organoidów na wsporniku przepuszczalnym były gotowe do eksperymentów między 11. a 13. dniem po wysiewaniu (Rysunek 9). Wartości TEER w tym punkcie czasowym mieściły się w zakresie od 1 500 do 2 500 Ω.cm2. Faza plateau wartości TEER trwa w bardzo ograniczonym oknie czasowym, w którym eksperyment musi zostać rozpoczęty przed powolnym spadkiem wartości TEER. Wartości TEER mogą być również kluczowym elementem prezentacji istotnych wyników eksperymentalnych, ponieważ niektóre leki lub substancje pomocnicze produktów leczniczych mogą oddziaływać na monowarstwę (np. na połączenia ścisłe), co może znacząco wpłynąć na odczyty wartości TEER. Sam ten parametr może służyć jako dane eksperymentalne.

Psie organoidy jelitowe w dwukomorowym aparacie do hodowli komórkowej mogą być stosowane w dziedzinach innych niż badanie przenikalności leków drogą doustną, dzięki unikalnej architekturze powstałej monowarstwy komórek. Mogą one być wykorzystywane na przykład w badaniach mikrobiologicznych (np. wpływ modyfikacji flory mikrobiologicznej przewodu pokarmowego), badaniach nad pobieraniem wirusów, interakcjach lek-lek oraz mechanizmami transportu leków49. Komorę dawczą wypełnia się zazwyczaj badanym lekiem lub wybranym związkiem, a z komory odbiorczej pobiera się aliquoty w różnych punktach czasowych. Alikwoty te można analizować za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas, testu ELISA lub innych technik, aby określić ilość i szybkość przenikania substancji rozpuszczonej przez monowarstwę.

Badania te wymagają nienaruszonej warstwy jednowarstwowej w celu dokładnej oceny przepuszczalności leku. Zazwyczaj wiąże się to z hodowlą większej liczby warstw jednowarstwowych niż jest to konieczne, aby uwzględnić studzienki nieprzydatne do analizy. Jednowarstwy komórek organoidowych mogą być również wykorzystywane do pomiaru poboru wirusów z powierzchni apikalnej lub bazalnej, a odczyty obejmują testy immunofluorescencyjne z wykorzystaniem przeciwciał do wykrywania wewnątrzkomórkowego poboru wirusa. Wreszcie, do komory donora można wprowadzić wiele leków (np. substrat i inhibitor), aby zidentyfikować interakcje lek-lek oparte na transporterach.

Na podstawie aktualnych obserwacji metody te będą możliwe do zastosowania nie tylko w przypadku psich organoidów w insertach hodowlanych, ale będą również odpowiednie dla innych gatunków zwierząt weterynaryjnych i układów narządowych, przy niewielkich modyfikacjach niezbędnych do optymalnego dopasowania do wybranego gatunku lub modelu narządu. Protokoły wzrostu psich organoidów jelitowych musiały zostać dostosowane do unikalnych właściwości hodowli. W związku z tym protokół można dostosować do innego gatunku, co jednak będzie wymagało subtelnych zmian w procedurze. Modyfikacje mogą rozpocząć się od zmian gęstości wysiewu komórek i obejmować zmiany w składzie pożywki w celu prawidłowego zróżnicowania interesujących nas organoidów.

Standaryzacja, szczegółowa dokumentacja procedur eksperymentalnych oraz konsekwentne monitorowanie monowarstw komórkowych są kluczowymi praktykami niezbędnymi we wszystkich testach na podporach przepuszczalnych i nie ograniczają się jedynie do układu psiego. Dokumentowanie i raportowanie tych potencjalnych modyfikacji gatunkowych lub organowych jest krytyczne dla dalszego postępu w tej dziedzinie. Model ten posiada kilka ograniczeń, na przykład wymagania kosztowe, zmienność międzylaboratoryjną oraz ograniczone dane dotyczące zdolności do przewidywania wchłaniania jelitowego in vivo. Psy w niektórych przypadkach posiadają inne transportery leków i enzymy metabolizujące niż ludzie50.

Ponadto system organoidów psich musi zostać przetestowany na różnych innych aparatach dwukomorowych od innych producentów, aby określić przydatność takiego modelu (np. należy określić przydatność różnych składów membran filtracyjnych). Kolejną wadą jest to, że część rękopisu dotycząca eksperymentu nad przepuszczalnością leków jest mniej opisowa niż poprzednie części. Jest to spowodowane nadmiarem informacji w tej dziedzinie. Celem tej części rękopisu było opisanie tych metod w sposób modyfikowalny, bez pomijania kluczowych elementów tych eksperymentów. Bardziej szczegółowe informacje na temat eksperymentów nad przepuszczalnością zostały zebrane przez Hubatsch i wsp.37. Dodatkowo wkładki przepuszczalne mogą być stosowane w eksperymentach z kokulturą, migracją komórek oraz testach inwazji4.

Podsumowując, psie organoidy jelitowe w dwukomorowych układach hodowlanych mają potencjał do zastosowania w szerokim zakresie obszarów, w tym m.in. w biomedycynie i medycynie translacyjnej. Przedstawione protokoły oferują kilka strategii planowania eksperymentów oraz sprzyjają powtarzalności danych między laboratoriami w przypadku modeli organoidowych w całej dziedzinie biologii.

Oświadczenia

K. Allenspach jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics i Mars. J.P. Mochel jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions oraz pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health i Ethos Animal Health. Ten artykuł odzwierciedla poglądy autorów i nie powinien być interpretowany jako reprezentujący poparcie, pogląd lub politykę Agencji ds. Żywności i Leków. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Pragniemy wyrazić wdzięczność pracownikom Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego Uniwersytetu Stanowego Iowa, a mianowicie Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victorii Green i Jennifer Groeltz-Thrush, za terminowe przetwarzanie próbek. Chcielibyśmy również podziękować Jodi Smith i Bethann Valentine za dostarczenie materiału do eksperymentów z przepuszczalnością. Chcemy również podziękować Davidowi Diazowi-Reganonowi za jego pomoc przy rysunku 9. Z wyjątkiem rysunku 6, wszystkie figury zostały stworzone w BioRender.com. Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award oraz podnagrody NSF SBIR dla ISU # 1912948.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Organoid media
  Inhibitor ROCK (Y-27632)EMD Millipore Corp.SCM 075
[Leu15]-Gastrin I człowiekSigmaG9145-.5MG
A-83-01PeproTech9094360
Zaawansowany DMEM/F12Gibco12634-010
B27 suplementGibco17504-044
FBSCorning35-010-CV
GlutamaxGibco35050-061substytut glutaminy
HEPES VWRLife ScienceJ848-500ML
Ludzka R-Spondyna-1PeproTech120-38-500UG
Mysz EGFPeproTech315-09-1MG
Mysz NogginPeproTech250-38-250UG
Mysz Wnt-3aPeproTech315-20-10UG
N2 suplementGibco17502-048
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165-25G
NikotynamidSigmaN0636-100G
PrimocinInvivoGenant-pm-1
SB202190 (inhibitor P38)SigmaS7067-25MG
Stemolekula CHIR99021 (GSK3β)Reprocell04-0004-base
TMS (siarczan trimetoprimu)SigmaT7883-5G
Odczynniki
kwas octowy, lodowatyFisher ChemicalA38-500
alfa-D(+)-glukoza, 99+%, bezwodnyAcros Organics170080010
roztwór do odzyskiwania komórekCorning
Kolagen I, Ogon Szczura 3 mg / mlGibcoA10483-01
FITC-CM-DekstranMillipore Sigma68059-1G
Formaldehyd (37%)Fisher ChemicalF79P-4
Roztwór aldehydu glutarowegoSigmaG5882
HBSS (1x)Gibco14025-076
Matrigel Matrix Do Kultura organoidówCorning356255Matryca błony zewnątrzkomórkowej
Paraformaldehyd, 97%Alfa AesarA11313
PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning21-040-CM
TrypLE ExpressGibco12604-021Proteaza trypsyna podobna
Materiały i sprzęt
Probówka wirówkowa 15 mlCorning430766
9-calowe pipety PasteuraFisherbrand13-678-6B
Corning Transwell 6,5 mm Wkładki z membraną poliestrową wstępnie załadowane na 24-dołkowe płytki hodowlane, wielkość porów: 0,4 i mikro; m, SterylneCorning3470Przepuszczalne wsparcie
Millicell ERS (sondy)Millipore SigmaMERSSTX01
Millicell ERS-2 Woltoomomierz MilliporeSigmaMERS00002
Inkubator PanasonicPanasonic MCO-170ML-PA
Parafilm M Folia do pakowaniaBemis Company IncPM996/EMDElastyczna folia laboratoryjna
Płytka do hodowli tkankowych 24 dołkiFisherbrandFB012929
354253

Bibliografia

  1. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638(2013).
  2. Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
  3. Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204(2019).
  4. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046(2014).
  5. Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  6. Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411(2019).
  7. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  8. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  9. Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
  10. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  11. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  12. Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
  13. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72(2018).
  14. Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
  15. Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
  16. Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
  17. Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330(2018).
  18. Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
  19. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33(2019).
  20. Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
  21. Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
  22. Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
  23. Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  24. Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
  25. Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333(2007).
  26. Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
  27. Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
  28. Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824(2021).
  29. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  30. Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
  31. Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
  32. Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
  33. Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  34. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423(2020).
  35. Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625(2021).
  36. Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
  37. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  38. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515(2022).
  39. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).
  40. van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
  41. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  42. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  43. Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
  44. Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
  45. Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
  46. Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
  47. Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
  48. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761(2013).
  49. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  50. Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System dwukomorowymonowarstwa organoidowaprzepuszczalność drogą przydrukowątransepitelna oporność elektrycznamechanizmy transportu lekówprotokół wysiewania organoidówutrzymanie monowarstwywalidacja in vitro
Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.