Artykuł metodologiczny

Implantacja kaniuli wewnątrzczaszkowej do seryjnych infuzji limfocytów T lokoregionalnego receptora chimerycznego antygenu (CAR) u myszy

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64886

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Center for Data Driven Discovery in Biomedicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Division of Neurosurgery, Children’s Hospital of Philadelphia, 4Ben Towne Center for Childhood Cancer Research, Seattle Children’s Research Institute, 5Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u dzieci, a lokoregionalne terapie immunologiczne są coraz częściej testowane dla pacjentów w badaniach klinicznych. Protokół ten opisuje metody lokoregionalnej implantacji kaniuli u myszy w celu przedklinicznej oceny infuzji immunoterapeutycznych ukierunkowanych na guzy OUN.

Streszczenie

Guzy OUN u dzieci są odpowiedzialne za większość zgonów związanych z rakiem u dzieci i mają złe rokowania, pomimo postępów w chemioterapii i radioterapii. Ponieważ wiele nowotworów nie ma skutecznych metod leczenia, istnieje pilna potrzeba opracowania bardziej obiecujących opcji terapeutycznych, takich jak immunoterapie; szczególnie interesujące jest zastosowanie terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) skierowanej przeciwko nowotworom OUN. Cele powierzchniowe komórek, takie jak B7-H3, IL13RA2 i disialogangliozyd GD2, ulegają silnej ekspresji na powierzchni kilku guzów OUN u dzieci i dorosłych, co stwarza możliwość zastosowania terapii komórkami CAR T przeciwko tym i innym celom powierzchniowym. Aby ocenić powtarzające się lokoregionalne dostarczanie limfocytów CAR T w przedklinicznych modelach mysich, stworzono system cewników na stałe, który podsumowuje cewniki stosowane obecnie w badaniach klinicznych na ludziach. W przeciwieństwie do podawania stereotaktycznego, system cewnika na stałe pozwala na wielokrotne dawkowanie bez konieczności przeprowadzania wielu operacji. Protokół ten opisuje umieszczenie wewnątrz guza stałej kaniuli prowadzącej, która została wykorzystana do skutecznego testowania seryjnych wlewów komórek CAR T w ortotopowych mysich modelach guzów mózgu u dzieci. Po ortotopowym wstrzyknięciu i wszczepieniu komórek nowotworowych u myszy, doguzowe umieszczenie stałej kaniuli prowadzącej jest zakończone na aparacie stereotaktycznym i zabezpieczone i żywicą akrylową. Kaniule zabiegowe są następnie wprowadzane przez stałą kaniulę prowadzącą w celu wielokrotnego dostarczania limfocytów CAR T. Stereotaktyczne umieszczenie kaniuli prowadzącej można dostosować tak, aby dostarczało limfocyty CAR T bezpośrednio do komory bocznej lub innych miejsc w mózgu. Platforma ta oferuje niezawodny mechanizm badań przedklinicznych powtarzających się infuzji wewnątrzczaszkowych limfocytów CAR T i innych nowatorskich metod leczenia tych wyniszczających nowotworów dziecięcych.

Wprowadzenie

Pomimo postępów w chemioterapii, radioterapii i chirurgii, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są najbardziej śmiertelnym nowotworem złośliwym w pediatrii1, podkreślając ważną potrzebę nowych metod z bardziej pomyślnymi wynikami. Dzięki znaczącym postępom w dziedzinie immunoterapii, podejścia adoptywnej terapii komórkowej (ACT) wykazały obiecujące wyniki w różnych nowotworach, zwłaszcza w nowotworach hematologicznych2. Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), specyficzny rodzaj ACT, wykorzystuje naturalną zdolność układu odpornościowego do rozpoznawania i zabijania szkodliwych komórek poprzez przekierowanie specyficzności limfocytów T w celu wytworzenia limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór3. Terapia komórkami CAR T wykazała znaczny sukces w leczeniu białaczek i chłoniaków4, co czyni ją obiecującym podejściem immunoterapeutycznym i zachęca do badań nad guzami litymi. Jednak do tej pory terapia komórkami CAR T w guzach litych osiągnęła niewielki sukces kliniczny i stoi przed wieloma wyzwaniami, takimi jak nieefektywna penetracja guza, ograniczona liczba docelowych antygenów i supresyjne mikrośrodowisko guza5.

Ostatnie badania kliniczne rozpoczęły ocenę terapii komórkami CAR T w przypadku guzów OUN u dzieci, dostarczając dowodów na słuszność koncepcji i wczesne dowody aktywności limfocytów T we wstępnych raportach6,7,8. Podczas gdy większość początkowych danych przedklinicznych koncentrowała się na dożylnym podawaniu limfocytów CAR T, ostatnie dowody przedkliniczne sugerują wyższość dostarczania lokoregionalnego w klasie CNS9,10, która została również z powodzeniem wykorzystana w kilku badaniach klinicznych6,7,8,11. Dotychczasowe badania przedkliniczne, w których uwzględniono lokoregionalne dostarczanie limfocytów CAR T do OUN, opierały się na pojedynczej wewnątrzczaszkowej dawce komórek CAR T dostarczanej stereotaktycznie9,10. Jednak badania kliniczne na ludziach wymagały wielokrotnych infuzji limfocytów CAR T w klasie CNS6,7,8,11, podkreślając potrzebę oceny wielu powtarzających się infuzji w badaniach przedklinicznych. Celem tej procedury jest skuteczne przetestowanie seryjnych wlewów limfocytów CAR T za pomocą cewnika w ortotopowych mysich modelach guzów mózgu u dzieci. Zaletą tej techniki jest uniknięcie wielu zabiegów chirurgicznych w celu zapewnienia powtarzających się zabiegów wewnątrzośrodkowych układu nerwowego. Kaniule były głównie używane do mikrodializy, pobierania próbek neuroprzekaźników i dostarczania substancji neuroaktywnych w neurobiologii i badaniach behawioralnych u gryzoni12, z ograniczonymi doniesieniami o ich zastosowaniu do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Opierając się na wcześniejszych doniesieniach, protokół ten wykorzystuje stereotaktycznie umieszczony system kaniuli na stałe do dostarczania komórek CAR T w mysich modelach ksenoprzeszczepów guzów OUN. Protokół może być wykorzystany do testowania dodatkowych terapii w mysich modelach zaburzeń neurologicznych lub neuroonkologicznych i może być pomocny w testowaniu nowych terapii, w których ominięcie bariery krew-mózg ma kluczowe znaczenie dla skuteczności.

Protokół

Wszystkie procedury protokołu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Filadelfii (IAC 19-000907), który jest akredytowany przez AAALAC. W badaniu tym wykorzystano 6-12-tygodniowe myszy NOD scid gamma (NSG) z ortotopowymi guzami ksenoprzeszczepu; Jednak protokół może być stosowany na każdym szczepie myszy. Myszy NSG trzymano w sterylnych warunkach barierowych, a operację przeprowadzono w sterylnych komorach bezpieczeństwa biologicznego. Gdy używany jest materiał ludzki, taki jak komórki nowotworowe lub limfocyty T, procedury i postępowanie z nimi muszą zostać zakończone w komorach bezpieczeństwa biologicznego ABSL-2.

1. Przygotowanie myszy do operacji

  1. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej izofluranem (2-4%) przy natężeniu przepływu tlenu 1 l/min, aż do osiągnięcia odpowiedniej płaszczyzny znieczulenia (około 5 min).
  2. Zważyć mysz za pomocą wagi z dokładnością do 0,1 g i podać podskórnie buprenorfinę o spowolnionym uwalnianiu (SR) (1 mg/kg) lub inny środek przeciwbólowy.
    UWAGA: Buprenorfina SR zapewnia działanie przeciwbólowe przez 72 godziny.
  3. Ogol sierść na czubku głowy myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia lub środków do depilacji.
  4. Za pomocą szpatułki delikatnie otwórz spód ramienia stereotaktycznego i włóż kaniulę prowadzącą za pomocą kleszczy. Dokręć na ramieniu, aby zabezpieczyć kaniulę tak, aby około 1/2 do 2/3 białej plastikowej części kaniuli wystawało z dna otworu, wraz z całą metalową długością kaniuli o długości 5 mm.
  5. Włóż i zabezpiecz górne zęby myszy w belce zgryzowej aparatu stereotaktycznego. Pociągnij stożek nosowy do przodu i dokręć go, upewniając się, że mysz wdycha izofluran.
  6. Zamontuj mysz na rozgrzanym aparacie stereotaktycznym za pomocą nauszników lub listew nausznych, unikając nadmiernego nacisku.
    UWAGA: Podgrzana taca powinna mieć włożony termometr doodbytniczy, a taca grzewcza powinna dostosować się tak, aby utrzymać normalną temperaturę ciała myszy podczas zabiegu.
  7. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oba oczy za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
  8. Przetrzyj pole operacyjne powidonem jodu na waciku lub aplikatorze, a następnie nasącz je alkoholem. Wykonaj ten krok w sumie trzy razy.
  9. Przed rozpoczęciem zabiegu należy uszczypnąć palec u nogi kleszczami, aby ocenić, czy sedacja jest odpowiednia.

2. Zabieg chirurgiczny

UWAGA: Wszystkie aspekty procedury chirurgicznej wykorzystują wysterylizowane narzędzia i techniki aseptyczne. Myszy kontynuują znieczulenie izofluranem (2-4%) przez cały czas trwania zabiegu, około 10-20 min.

  1. Delikatnie podnieś skórę głowy między uszami za pomocą kleszczy. Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij uniesioną skórę głowy równolegle do czaszki i usuń owalny płat skóry (0,75-1 cm długości), aby odsłonić czaszkę.
    UWAGA: Nożyczki są preferowane zamiast skalpela, aby zapewnić czysty, owalny otwór i zapobiec niepotrzebnym uszkodzeniom otaczającej skóry i tkanek.
  2. Odepchnij powięź za pomocą skalpela lub wacików z bawełnianą końcówką i hemostatycznego bawełnianego granulatu, aby w razie potrzeby spowolnić nadmierne krwawienie.
    UWAGA: Używanie drewnianej strony sterylnej bawełnianej końcówki może również odepchnąć powięź i uniknąć nadmiernego krwawienia.
  3. Zidentyfikuj punkty orientacyjne bregma i lambda, odpowiednie przednie i tylne znaki na czaszce, gdzie spotykają się płytki czaszkowe13.
    UWAGA: Identyfikację można ułatwić, przecierając górną część odsłoniętej czaszki wodą utlenioną.
  4. Delikatnie naciąć czaszkę za pomocą skalpela, aby stworzyć powierzchnię, na której można przymocować akryl. Nacinanie powinno obejmować wiele linii liniowych o długości około 0,5-1 cm pod kątem 90° względem siebie.
  5. Za pomocą ramienia stereotaktycznego zlokalizuj kaniulę w interesującym Cię punkcie orientacyjnym (bregma lub lambda). Po zlokalizowaniu podnieś końcówkę kaniuli 1-2 mm nad powierzchnię czaszki i przejdź do żądanych współrzędnych. W przypadku wstrzyknięć donowotworowych wykorzystuje się te same współrzędne A/P i M/L, co w przypadku umieszczenia guza.
  6. Na odsłoniętej czaszce, z dala od miejsca, w którym wejdzie kaniula, wykonaj dwa otwory na za pomocą igły 18 G lub wiertła chirurgicznego. Upewnij się, że otwory są rozmieszczone tak, aby było wystarczająco dużo miejsca na kaniulę. Za pomocą wiertła przekręć otwory na, aż zaczepią się o czaszkę. Włóż i dokręć dwie w otworach za pomocą śrubokręta z płaską końcówką. Następnie delikatnie pociągnij do góry, aby upewnić się, że są dokręcone.
    UWAGA: Nie wkładaj, dopóki nie zrównają się z czaszką, ponieważ mogą uszkodzić mózg myszy pod spodem. Pozostaw co najmniej 1-2 mm odstęp między śrubą a czaszką.
  7. Za pomocą igły 18 G lub wiertła chirurgicznego przewierć czaszkę w określonych współrzędnych, aby utworzyć otwór do wprowadzenia kaniuli.
  8. Za pomocą ramienia stereotaktycznego opuść kaniulę do żądanej współrzędnej D/V.
    UWAGA: Współrzędna D/V implantacji kaniuli musi uwzględniać długość projekcji manekina i kaniul zabiegowych i może być bardziej powierzchowna niż ortotopowe wstrzyknięcie komórek nowotworowych (Rysunek 1).
  9. W porcelanowej 12-dołkowej płytce napełnij jedną studzienkę proszkiem żywicy akrylowej (około 0,3 g) i 10-15 kroplami (około 0,5-0,75 ml) płynu z żywicy akrylowej. W ten sposób powstaje lepki materiał o białym kolorze. Pobrać mieszaninę do strzykawki o pojemności 1 ml i użyć jej do pokrycia i pokrycia czaszki, wypełniając przestrzenie wokół kaniuli i.
    UWAGA: Lepki materiał z czasem twardnieje w cement, dlatego ten krok należy wykonać natychmiast po wymieszaniu.
  10. Podczas gdy cement jest nadal giętki, poluzuj na ramieniu stereotaktycznym i użyj szpatułki w otworze na dole, aby delikatnie zwolnić kaniulę z uchwytu i powoli cofnij ramię stereotaktyczne w górę od myszy.
  11. Gdy cement całkowicie wyschnie, włóż atrapę kaniuli do kaniuli prowadzącej i mocno ją zabezpiecz, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
  12. Po zakończeniu procedury umieść mysz z powrotem w jej ogrzewanej klatce domowej, aby uważnie monitorować, zapewniając odpowiednią regenerację i rejestrując wszelkie obserwacje pozabiegowe, w tym to, że mysz w pełni odzyskała przytomność, przed powrotem do kolonii.
    UWAGA: Generalnie zaleca się umieszczenie tylko połowy klatki na poduszce grzewczej, aby zwierzę mogło przesunąć się na chłodniejszą stronę, aby uniknąć przegrzania.
  13. W razie potrzeby należy podać dodatkowe leki przeciwbólowe, jeśli myszy wykazują zachowania wskazujące na ból po operacji, takie jak meloksykam w dawce 5 mg/kg podawany podskórnie raz dziennie przez okres do 3 dni.

3. Przygotowanie komórek CAR T

  1. Zmierz stężenie wstępnie transfekowanych limfocytów CAR T za pomocą licznika komórek.
  2. Odwirować wstępnie transfekowane limfocyty T przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Odessać supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura w systemie aspiracji próżniowej i ponownie zawiesić osad w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) do pożądanego stężenia. Typowe objętości dostarczania to 2-5 μL. Typowe dawki komórek to 0,5-5 x 106 komórek.

4. Wlewy z limfocytów CAR T

  1. Przygotuj kaniulę zabiegową, przepuszczając górną część przez mały kawałek rurki PKG.
  2. Napełnij strzykawkę z zawiesiną komórek CAR T i włóż ją przez drugi koniec rurki PKG na tyle, aby pokryć górną część kaniuli terapeutycznej.
  3. Znieczulić mysz izofluranem (2-4%) przy natężeniu przepływu tlenu 1 l/min.
  4. Ustabilizuj kaniulę prowadzącą za pomocą kleszczy u podstawy, a następnie ostrożnie odkręć i wyjmij atrapę kaniuli, umożliwiając dostęp do kaniuli prowadzącej.
    UWAGA: Konfiguracja stereotaktyczna nie jest konieczna, ale może być użyta do ustabilizowania głowy do zabiegu.
  5. Podawać limfocyty CAR T przez 1 minutę i przytrzymać kaniulę leczniczą na miejscu przez dodatkową 1 minutę po zaprzestaniu infuzji.
  6. Wyjmij kaniulę zabiegową i mocno przykręć atrapę kaniuli z powrotem na miejsce.
  7. Podawać podskórnie meloksykam (5 mg/kg) w celu opcjonalnego zwalczania bólu.

Wyniki

Pomyślna implantacja kaniuli do OUN myszy
Myszy z prawidłowo wykonaną kaniulacją mają stabilnie osadzoną kaniulę prowadzącą, która nie utrudnia codziennej aktywności (Rycina 2A) oraz pozwala na łatwe wprowadzenie kaniuli terapeutycznej i podawanie cieczy bez oporu (Rycina 2B). Według naszych doświadczeń większość kaniul pozostaje na miejscu przez ponad 4 tygodnie, choć w 0-25% przypadków mogą one z czasem zostać przesunięte. Weryfikację prawidłowego umiejscowienia można potwierdzić, wstrzykując do kaniuli barwnik błękit Evansa. Na przykład kaniula wprowadzona do komory bocznej wykazuje obecność błękitu Evansa w całym układzie komorowym w miarę przemieszczania się barwnika w płynie mózgowo-rdzeniowym, co potwierdza prawidłowe umiejscowienie (Rycina 2C). W przypadku kaniul wprowadzonych do guza błękit Evansa jest widoczny w miejscu implantacji guza.

Skuteczne dostarczanie komórek CAR-T do OUN w celu leczenia guzów ksenoprzeszczepowych.
Skuteczność systemu kaniuli wewnątrzczaszkowej oraz efekt terapeutyczny komórek CAR-T w modelach mysich można mierzyć za pomocą różnych mechanizmów, w tym obrazowania bioluminescencyjnego oraz całkowitego przeżycia. Komórki CAR-T skierowane przeciwko GPC2 przetestowano w modelach mysiego medulloblastoma oraz rozlanego glejaka linii środkowej, odpowiednio 7316-4509 i 7316-3058, stosując wielokrotne dawkowanie komórek CAR-T poprzez opisany system kaniuli wewnątrzczaszkowej14. Ortotopowe umiejscowienie i przyjęcie się guza potwierdzono obrazowaniem bioluminescencyjnym, a kaniule wprowadzono do łoża guza, korzystając z tych samych współrzędnych, co przy ortotopowym umiejscowieniu guza. Leczenie polegało na infuzjach komórek GPC2 CAR-T raz lub dwa razy w tygodniu przez 2-4 tygodnie, co łącznie stanowiło od czterech do sześciu dawek. Po zastosowaniu terapii, leczenie komórkami CAR-T skierowanymi przeciwko GPC2 wywołało znaczną regresję guza w modelu medulloblastoma 7316-4509 (p < 0,01) (Rycina 3A) oraz znacząco przedłużyło przeżycie w przypadku rozlanego glejaka linii środkowej w obrębie wzgórza 7316-3058 (p < 0,05) (Rycina 3B)14.

System implantów śrubowych, prowadnica z końcówkami 0,5 mm i 2 mm, przedstawiona na schemacie porównawczym do pomiaru.
Rycina 1: Kanula prowadząca z atrakiem projekcyjnym i kanulami terapeutycznymi. (A) Kanula prowadząca z zamontowanymi atrakaami projekcyjnymi o wysunięciu 0,5 mm i 2 mm. (B) Kanula prowadząca z zamontowanymi kanulami terapeutycznymi o wysunięciu 0,5 mm i 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura chirurgiczna u myszy w celu przygotowania okna czaszkowego; układ eksperymentalny dla badań neuroobrazowania.
Rycina 2: System podawania przez kaniulę terapeutyczną dla wielokrotnych dawek komórek CAR T. (A) Kaniula wszczepiona w czaszkę myszy z założoną zatyczką, gdy nie jest używana. (B) Infuzja komórek CAR T do guza mostu via kaniuli terapeutycznej podczas znieczulenia myszy. (C) Weryfikacja umiejscowienia kaniuli w komorze bocznej z użyciem barwnika błękitu Evansa. Barwnik wprowadzono przez kaniulę, po czym przeprowadzono eutanazję i wycięcie mózgu, wykazując obecność barwnika w całym układzie komorowym. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres promieniowania w funkcji dni oraz wykres prawdopodobieństwa przeżycia wykazujący skuteczność leczenia w badaniu eksperymentalnym.
Rycina 3: Komórki CAR T skierowane przeciwko GPC2 pośredniczą w odpowiedziach przeciwnowotworowych i przedłużają przeżycie w dziecięcych guzach mózgu in vivo. (A) Ilościowe oznaczenie bioluminescencji ortotopowego ksenoprzeszczepu medulloblastoma grupy 4 7316-4509 leczonego komórkami mRNA CAR T skierowanymi przeciwko GPC2 lub CD19. Dawki są zaznaczone strzałkami na wykresie. Dane przedstawiono jako średnia z SD, n = 9-11 myszy w grupie. (B) Przeżycie całkowite myszy z implantowanym ksenoprzeszczepem DMG wzgórza 7316-3058 leczonych sześcioma powtórzonymi dawkami 2 x 106 komórek CAR T. Dawki są zaznaczone strzałkami na wykresie. n = 7 myszy w grupie. **p < 0.01; *p < 0.05; ns = brak istotności statystycznej. Rycina została powielona za zgodą Foster i wsp.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Terapia komórkami CAR T zrewolucjonizowała leczenie nowotworów hematologicznych i wykazuje obiecującą wartość w leczeniu litych guzów mózgu 6,7,8. Protokół ten został opracowany, aby umożliwić przedkliniczną ocenę lokoregionalnego dostarczania komórek CAR T w leczeniu nowotworów OUN u dzieci. System kaniuli replikuje zbiornik Ommaya lub Rickhama, system cewnika dokomorowego stosowany obecnie w trwających badaniach klinicznych terapii komórkami CAR T w guzach OUNu dzieci 6,7,8, podkreślając znaczenie i potencjał translacyjny tych metod. System ten pozwala na wielokrotne dostarczanie limfocytów CAR T, które omijają barierę krew-mózg, podobnie jak metody stosowane w trwających badaniach klinicznych. Dostarczanie lokoregionalne może zapewnić maksymalną skuteczność w OUN9, a także może zmniejszyć ryzyko toksyczności ogólnoustrojowej związanej z transportem z krążenia15. Podczas gdy dostarczanie stereotaktyczne może zapewnić pojedynczą dawkę do OUN, zaletą tego systemu jest możliwość podania wielu powtarzanych dawek w określone miejsce w OUN bez konieczności przeprowadzania wielu operacji. Ograniczenia tej procedury obejmują stałe miejsce porodu bez możliwości zmiany lokalizacji lub dokonania regulacji po założeniu kaniuli oraz możliwość przemieszczenia kaniuli.

Krytycznym krokiem w tym protokole jest implantacja stałej kaniuli prowadzącej we współrzędnej D/V, która uwzględnia projekcję kaniul zabiegowych. Kaniula zabiegowa będzie wystawać poza końcówkę kaniuli prowadzącej, dlatego należy zadbać o to, aby umieszczenie spowodowało dostarczenie limfocytów CAR T do obszaru zainteresowania. Długości projekcji kaniuli zabiegowej można dostosować, a z doświadczenia autora wynika, że 0,5 mm to przydatna długość projekcji. Taka długość zapewnia, że terapeutyk nie pozostaje w kaniuli prowadzącej po dozowaniu, ale także nie wymaga znacznego dostosowania współrzędnych D/V kaniuli prowadzącej do obszaru zainteresowania. Dodatkowym ważnym krokiem w tym protokole jest czas, w którym kaniula lecznicza pozostaje na miejscu po infuzji komórek CAR T. Kaniulę leczniczą należy trzymać na miejscu przez co najmniej 1 minutę po zakończeniu infuzji, aby zapobiec przeciekom i utracie lokoregionalnego dostarczania terapii komórkami CAR T.

Rozwiązywanie problemów z tą metodą jest proste, a większość powikłań polega na trudnościach z wyjęciem atrapy kaniuli lub włożeniem kaniuli zabiegowej do stałej kaniuli prowadzącej, prawdopodobnie z powodu zaschniętej krwi po wewnętrznej stronie kaniuli prowadzącej. Można to łatwo rozwiązać, delikatnie przepuszczając atrapę kaniuli przez kaniulę prowadzącą, aż opór będzie mniejszy, a zanieczyszczenia zostaną usunięte. Żywica akrylowa może czasami odsuwać się od czaszki, powodując utratę systemu kaniuli. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to na ogół ograniczone przez nacięcie czaszki skalpelem i umieszczenie dwóch. Ponadto z klatki usuwane są wszelkie przedmioty, które mogą przypadkowo przyłożyć siłę do kaniuli, gdy mysz się porusza, takie jak niektóre chatki do wzbogacania myszy z małymi otworami.

Podsumowując, opisano tutaj protokół wprowadzania systemu kaniuli w mysich modelach guzów OUN w celu wielokrotnego dostarczania komórek CAR T. Umieszczenie kaniuli można dostosować do wielu lokalizacji porodu w lokalizacjach lokalnych, testując skuteczność różnych miejsc porodu. Ponadto system ten może być stosowany w dodatkowych terapiach poza limfocytami CAR T do oceny skuteczności przy omijaniu bariery krew-mózg, a także może być przydatny do oceny terapii w mysich modelach zaburzeń nieonkologicznych.

Oświadczenia

JBF posiada patent związany z immunoterapiami ukierunkowanymi na glipikan 2 (GPC2). Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Fundusze na tę pracę zostały zapewnione przez Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 i 1K08CA263179-01, oraz Departament Obrony W81XWH-21-1-0221.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 18 GBD 5110971 1/2 cala metalowa piasta
Płyn z żywicy akrylowejLang Dental B1323 
Żywica akrylowa w proszkuLang Dental B1323 
Chusteczki nasączone alkoholemWirówka do326895
5240Eppendorf5420000040Wirówka 
Waciki z końcówką bawełnianąPuritan826-WCSzerokość rękojeści = 2.11 mm (0.083), Szerokość główki = 1.27 mm (0.050), Długość rączki = 147.62 mm (5.812), Długość całkowita = 152.4 mm (6), Długość głowicy = 12.7 mm (0.500)
Uchwyt wiertła Technologie P1 DH-1 Uchwyt do wierteł do D56-D70 
Wiertło Technologie P1 D58 1,07 mm 
Atrapa kaniuli Technologie P1 C315DCS-5/SPC Konfiguracja: Mała czapka;   Długość: Wytnij 5,00 mm poniżej cokołu; Projekcja: 0,50 mm 
Śrubokręt z płaską końcówką Technologie P1 SD-80 Śrubokręt 
Kleszcze GraefeFine Science Tools11051-10Kleszcze
Prowadnica kaniuli Technologie P1 C315GS-5/SPC Konfiguracja: wysokość cokołu 5,00 mm; Długość: Cięcie 5,00 mm poniżej postumentu 
Hemostatyczne granulki bawełniane z racemiczną epinefryną Pascal 1151602 
MOXI Z Mini automatyczny licznik komórek Zestaw MoxiMXZ001Licznik ogniw
NOD  scid  myszy gamma (NSG)Jackson Laboratory5557do 12-tygodniowych samców i samic
Pipet PasteuraVWR14673-043
Rurki PKG Technologie P1 C313CT Średnica: 0,58 mm x 1,27 mm 
Płytka porcelanowa 12-dołkowaFlinn ScientificAP6064 
Powidon jodMedlineMDS093943
SkalpelWorld Precision Instrument50-822-457Jednorazowy skalpel, nr 10, sterylny, 10/pudełko, plastikowy uchwyt ze linijki 6"
 Technologie P1 0-80 X 3/32 2,4 mm   
Ramka stereotaktyczna David Kopf Instrumenty 940 Model 940 Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczem Konsola 
Cienkie nożyczki studenckieFine Science Tools91460-12Nożyczki
Kaniula zabiegowa Technologie P1 C315IS-5/SPC 33GA;   Konfiguracja: Standardowa wewnętrzna; Długość: Wytnij 5,00 mm poniżej cokołu; Projekcja: 0,50 mm   
Strzykawki zabiegowe Hamilton879085 & mikro; L, Strzykawka specjalna (SN) z igłą cementowaną model 75, 75SN/22/0.5"/PT3 
Vactrap XL System próżniowy Foxx Life Sciences305-4401-FLS
BD 6

Bibliografia

  1. Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014. NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).
  2. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: the current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  3. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality. Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).
  6. Vitanza, N. A., et al. Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis. Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).
  7. Majzner, R. G., et al. GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas. Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).
  8. Vitanza, N. A., et al. Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety. Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).
  9. Theruvath, J., et al. Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors. Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).
  10. Donovan, L. K., et al. Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma. Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).
  11. Brown, C. E., et al. Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  12. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  13. Zhou, P., et al. Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images. PLoS One. 15 (12), 0244378(2020).
  14. Foster, J. B., et al. Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450(2022).
  15. Akhavan, D., et al. T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead. Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

komórki CAR-Tchirurgia stereotaktycznaguzy OUNinfuzja lokalnoregionalnaumieszczanie kaniuli prowadzącejdziecięce guzy mózguortotopowy model mysicewnik komorowyregresja guza
Implantacja kaniuli wewnątrzczaszkowej do seryjnych infuzji limfocytów T lokoregionalnego receptora chimerycznego antygenu (CAR) u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.