Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Streszczenie

Sieci interakcji białko-białko (PPI) są dynamicznie przekształcane w chorobach, jednak większość podejść biologii systemowej koncentruje się na zmianach w obfitości białek, pomijając krytyczne dysfunkcje na poziomie interakcji. Przedstawiamy tutaj solidną, chemoproteomiczną metodę – dysfunkcyjną interaktom białko-białkowy (dfPPI) – która umożliwia wysokoprzepustowe, systematyczne, kontekstowe mapowanie dysfunkcji sieci PPI w komórkach i pierwotnej tkance ludzkiej. Metoda ta integruje sondy biologii chemicznej, które selektywnie rejestrują interaktomy oparte na epichaperomie, z bezoznakową chromatografią cieczową i spektrometrią mas tandemową (LC-MS/MS) oraz analizą obliczeniową opartą na sieci, aby odkryć przekształcenie sieci białkowych, które nie są widoczne wyłącznie z danych transkryptomicznych lub proteomicznych. Platforma dfPPI może być stosowana w różnych stanach choroby, gatunkach i tkankach, aby identyfikować możliwe do działania węzły dysfunkcji oraz umożliwiać wysokorozdzielcze, systemowe wglądy w postęp choroby. W tym protokole demonstrujemy krok po kroku procedury przygotowywania próbek, obróbki sondą chemiczną, wzbogacania powinowactwa, analizy LC-MS/MS bez oznakowania oraz bioinformatyczne przepływy pracy wykorzystywane do generowania i interpretacji zbiorów danych dfPPI. Niniejszy artykuł ma na celu promowanie powtarzalności i dostępności tego podejścia, wspierając jego przyjęcie przez szersze środowiska biologii systemowej i badań translacyjnych.

Wprowadzenie

Funkcja komórek, a co za tym idzie organizmów, zależy od precyzyjnej koordynacji sieci interakcji białko-białko (PPI) ^1,2. Te sieci odpowiadają za organizację i realizację niemal wszystkich procesów biologicznych. Chociaż sieci PPI są z natury dynamiczne i reagują na stres, w chorobach mogą ulegać nieprawidłowemu przeprogramowaniu, prowadząc do nieprawidłowych funkcji. Co ważne, ta zmiana nie musi wiązać się ze zmianami w ekspresji genów czy białek; wynika raczej ze zmienionych interakcji fizycznych między białkami, które normalnie są wyrażane^{jako 3,4,5}. Tradycyjne podejścia w biologii systemów, takie jak transkryptomika czy proteomika, nie są w stanie uchwycić tych kluczowych zmian na poziomie interakcji.

Technologie mapowania PPI znacznie się rozwinęły, dostarczając informacji o organizacji i regulacji sieci komórkowych 6,7,8,9,10,11. Powszechnie stosowane podejścia, takie jak oczyszczanie powinowactwa – spektrometria mas (AP-MS), sieciowanie (XL)-MS, znakowanie zbliżeniowe oraz kofrakcjonacja, oferują specyficzne zalety, takie jak wysoka specyficzność, rozdzielczość przestrzenna czy zdolność wykrywania kompleksów przejściowych 6,8,9,10,11 . Jednak metody te często wymagają białek przynętowych, manipulacji genetycznej lub złożonej bioinformatyki i mogą mieć trudności z uchwyceniem wielkoskalowego, chorobowo napędzanego przeprogramowania sieci białek w natywnych systemach biologicznych 6,7,8,9,10,11 . Większość z nich również nie jest skalowalna, co czyni je niepraktycznymi do analizy dużych kohort próbnych lub systematycznego mapowania zmian interaktomowych między warunkami, typami komórek lub punktami^czasowymi 6,7,8,9,10,11 (Tabela 1).

Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy dysfunkcyjną platformę Protein-Protein Interactome (dfPPI), metodę chemoproteomiczną, która bezpośrednio identyfikuje dysfunkcje sieci PPI odpowiedzialne za fenotypy chorobowe¹². Wykorzystuje kluczową wiedzę biologiczną: w stanach chorobowych podzbiór molekularnych chaperonów tworzy rusztowania nadmolekularne zwane epichaperomami 13,14,15. Struktury te nie działają w fałdowaniu białek, lecz pełnią funkcję rusztowania, które reorganizują łączność białek³. Co istotne, białka przechowywane w epichaperomach nie są losowe; Są to osoby aktywnie zaangażowane w utrzymanie fenotypu^chorobowego 16,17,18,19,20. Poprzez wychwytywanie tych białek związanych z epichaperomem oraz ich interaktorów, dfPPI identyfikuje dokładne zmiany sieciowe powodujące określone stany chorobowe. Przełączenie sieci sterowane przez epichaperom jest powszechne we wszystkich chorobach – głównie w kohortach z chorobą Alzheimera oraz ~70% w próbkach nowotworowych^16,20 – potwierdzające zastosowanie dfPPI w dużych, skoncentrowanych na chorobie badaniach.

Platforma dfPPI obejmuje cały proces od przygotowania próbki, przechwytywania powinowactwa epichaperomu oraz identyfikacji interaktomów przez MS, po analizy bioinformatyczne w dalszej fazie, takie jak wzbogacanie szlaków i modelowanie funkcjonalnych sieci białkowych (Rysunek 1). Metoda wykorzystuje specyficzne dla epichaperomu sondy chemiczne unieruchomione na macierzach powinowactwa (kulki PU lub inne sondy)13,16,17 do izolacji funkcjonalnego interaktomu z komórek lub tkanek. Te badania zostały już rygorystycznie zatwierdzone w wielu publikacjach pod kątem swoistości do epichaperomów oraz dopasowania do dfPPI 16,17,18,20,21,22^. Zdobyte kompleksy poddawane są MS, stosując zarówno procesy trawienia na kulce, jak i w żelu, a następnie LC-MS/MS BEZ ETYKIET. Uzyskane dane mogą być następnie analizowane za pomocą dedykowanego potoku bioinformatycznego, który definiuje dysfunkcje na poziomie interakcji i łączy je z procesami biologicznymi oraz fenotypami. Ponieważ epichaperomy konstruują kontekstowo-specyficzne interaktomy 17,18,20, dfPPI ujawnia, jak sieci białkowe są przekształcane w danej chorobie, typie komórki lub stadium, co czyni go potężnym narzędziem biologii systemowej do precyzyjnego fenotypowania.

Metoda ta jest wysoce skalowalna i została zastosowana na setkach próbek klinicznych i eksperymentalnych, w tym na tkankach ludzkich po śmierci oraz komórkach hodowlanych, w różnych chorobach, takich jak nowotwory i neurodegeneracja 16,17,18,19,20,22,23 . Poprzez ujawnienie zmian PPI definiujących stan patologiczny, dfPPI umożliwia zarówno mechanistyczne wglądy, jak i odkrycie praktycznych celów terapeutycznych 16,17,18,19,20,22,23.

W tym protokole szczegółowo opisujemy eksperymentalne komponenty platformy dfPPI, od wychwytywania powinowactwa interaktomów związanych z epichaperomem, przez przygotowanie próbki do LC-MS/MS, aż po identyfikację interaktomów za pomocą MS. Pipeline analizy obliczeniowej – czyli to, co robi się z listą białek zidentyfikowanych przez MS do definiowania różnicowych interakcji i konsekwencji funkcjonalnych – nie jest tu omówiony ze względu na ograniczenia miejsca. Jednak jest bezpłatnie dostępny i szeroko udokumentowany przez aplikację dfPPI Shiny w https://epichaperomics.mskcc.org (zaktualizowaną do https://dfppi.mskcc.org) oraz na stronie internetowej Chiosis Lab pod https://www.chiosislab.com/resources. Oprócz tych portali, pełny pipeline bioinformatyczny oraz towarzyszące mu recepty zostały uwzględnione w kilku publikacjach stosujących dfPPI do raka 16,17,19 oraz choroby Alzheimera ^18,20.

Protokół

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi komisji ds. etyki badań na ludziach oraz komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Sprzęt i odczynniki używane w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki do przechwytywania powinowactwa

1. Ekstrakcja białek z tkanek
   UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem próbek tkanki mózgowej po śmierci.
   1. Przygotuj bufor do ekstrakcji białek zawierający 20 mM Tris (pH 7,5), 20 mM KCl, 5 mM_MgCl2 oraz 0,01% NP-40 (natywny bufor lizyczny). Dodaj inhibitory proteazy i fosfatazy tuż przed użyciem. Trzymaj bufor na lodzie.
   2. Umieść zamrożoną tkankę (objętość docelowa około 50 mm³) do rurki homogenizującej mikro tkanki, która składa się ze specjalistycznej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL wyposażonej w tłuczek. Dodaj 500-700 μL natywnego buforu lizy, dostosowując objętość w zależności od zwartej tkanki i łatwości homogenizacji. Homogenizuj próbkę na lodzie, delikatnie poruszając tłukiem w górę i w dół oraz przy ściernych ściankach rurki homogenizatora, aż powstanie jednorodna zawiesina.
      UWAGA: Wszystkie etapy wykonuj na lodzie, aby utrzymać zespoły białkowe w ich natywnej konfiguracji i uniknąć degradacji białek.
   3. Inkubuj lizaty w temperaturze 4 °C przez 30 minut, umieszczając fiolkę na jednostce obrotowej. Delikatnie mieszaj próbki podczas inkubacji, stosując obrót.
   4. Wiruj próbki w 13 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki stołowej do usuwania zanieczyszczeń.
   5. Zbierz supernatanty i przelej je do przezroczystych rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL. Unikaj zakłócania pelletu podczas transferu.
   6. Określ całkowite stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu do testowania kwasu bicynchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Lizaty białkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Unikaj powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania. Należy odwołać się do wcześniejszej publikacji²⁴ , dotyczącej wpływu powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania oraz temperatury przechowywania na integralność zespołów białkowych.
2. Normalizacja próbek
   UWAGA: HSP90α i HSP90β są kluczowymi składnikami epichaperomu i bezpośrednimi partnerami wiązającymi sondę chemiczną używaną do wychwytywania interaktomów 13,21,23. Normalizacja próbek na podstawie HSP90α (lub HSP90β) zapewnia, że ilość epichaperomu docelowego do sondy jest dopasowana między próbkami, co jest niezbędne do dokładnego porównania przechwyconych interaktomów. Próbki można normalizować na podstawie poziomów HSP90 określonych metodą Western blot, ale mogą być również stosowane inne metody. Jeśli poziomy HSP90 są porównywalne we wszystkich próbkach, pomiń tę sekcję i przejdź do kroku 1.3. Użycie blottingu HSP90α/β jest tutaj wyłącznie do normalizacji wejściowej i nie należy go interpretować jako miara obfitości epichaperomu.
   1. Przygotuj 2× bufor próbek Laemmli, składający się z 4% siarczanu sodu dodecylowego (SDS), 20% gliceroli, 10% 2-merkaptoetanolu, 0,02% błękitu bromofenolowego oraz 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8.
      UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i lotny, powinien być stosowany w okapie spalanym.
   2. Połącz 5 μg całkowitego ekstraktu białka mózgowego (z etapu 1.1) w stosunku 1:1 (v/v) z buforem próbki Laemmli 2× w przezroczystej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   3. Podgrzej próbki w temperaturze 95 °C przez 3-5 minut w jednostce grzewczej, aby denaturować białka, a następnie załadować elektroforezą poliakrylamidową z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
   4. Załaduj próbki na prefabrykowane żele białkowe z zawartością tris-glicyny o stężeniu 8%. Alternatywnie użyj ręcznie odlewanych żeli.
   5. Załaduj 5 μL standardu białka wstępnie barwionego na każdy żel, na przykład do pierwszego dołku, aby określić masę cząsteczkową białka.
   6. Żele uruchamiaj w 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) z buforem na RT. Typowy czas pracy to 1,5-2 godziny przy napięciu 100 V.
   7. Przygotuj bufor transferowy zawierający 25 mM Tris, 192 mM glicyny i 20% metanolu.
      UWAGA: Metanol jest łatwopalny i należy go obchodzić zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa.
   8. Przenieś białka na błonę nitrocelulozową w buforze transferowym w temperaturze 4 °C przez 60 minut przy stałym napięciu (100 V).
   9. Przygotuj roztwór membranowy (1× TBS-0,1% Tween-20) oraz roztwór blokujący (5% mleka w 1× TBS-0,1% Tween-20). Protokół ten wykorzystuje suche mleko w proszku, beztłuszczowe, pochodzące z komercyjnego źródła.
   10. Umieść membranę w roztworze blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym poruszeniem na platformowym dźwigaczu. Użyj 10 ml roztworu blokującego na mini żel.
   11. Usuń roztwór blokujący i inkubuj membranę przeciwciałem anty-HSP90α (rozcieńczenie 1:6 000 w roztworze blokującym 10 mL) przez noc w temperaturze 4 °C na platformie dźwigaczej.
   12. Usuń roztwór przeciwciał i myj membranę trzy razy przez 5 minut każdy, używając 10 ml roztworu do płukania.
   13. Dodaj wtórne przeciwciało przeciwkrólikowe dla koz, sprzężone z HRP (rozcieńczenie 1:5 000 w 10 mL 1× TBS-0,1% Tween-20) i inkubuj przez 1 godzinę w RT na platformie bujanej.
   14. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj membranę cztery razy roztworem do płukania (ta sama objętość i czas pracy co powyżej).
   15. Wykrywanie specyficznego dla HSP90α sygnału chemiluminescencyjnego za pomocą zestawu do ulepszonej chemiluminescencji (ECL) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj systemu obrazowania chemiluminescencyjnego lub filmu autoradiograficznego.
   16. Ilościowo określ poziomy HSP90α w próbkach na podstawie intensywności sygnału i oblicz współczynnik normalizacji dla down-down.
       UWAGA: Natężenie sygnału HSP90 odzwierciedla ilość epichaperomu namierzanego przez sondę w każdej próbce. Porównując natężenie sygnału między próbkami i normalizując do testu referencyjnego na każdym żelu, można odpowiednio dostosować objętości wejściowe do przechwytywania interaktomów. Ilościowość można wykonać za pomocą oprogramowania densytometrycznego. Zawsze dołączaj aliquot próbki referencyjnej na każdym żelu, aby umożliwić normalizację między blotami.
3. Przygotowanie kulek PU
   UWAGA: Koraliki PU i koraliki kontrolne mogą być syntetyzowane wewnętrznie, jak wcześniej zgłoszono^21,25 lub na żądanie laboratorium Chiosis po podpisaniu umowy o transferze materiału (MTA). Powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C w izopropanole.
   1. Weź aliquot z kulek poliuretanowych (PU) lub kontrolnych bezpośrednio z materiału izopropanolowego. Dodaj około 30% nadwyżki, aby zrekompensować utratę kropelek podczas prania i obsługi.
   2. Usuń rozpuszczalnik magazynowy: pozwól osadzić się kulki, a następnie zasysaj izopropanol. Dodaj natywny bufor lizyczny (1 mL dla probówki 1,5 mL; 5 mL dla stożkowej 15 mL) i całkowicie zawiesij, delikatnie pipetując lub odwracając ją.
   3. Przemyj i wyrównuj trzy razy: dla każdego płukania, wir ponownie zawiesuje, wiruj (1,5 mL w probówce: 10 000 × g, 1 min; 15 mL stożkowa: 3 000 × g, 5 min), następnie aspiruj supernatant za pomocą linii próżniowej z końcówką pipety, uważając, by nie zakłócić granulki.
   4. Dodaj natywny bufor lizowy do pranych kulek w stosunku objętości 1:1 (koraliki:bufor), aby uzyskać jednolitą zawiesinę działającą kulek.
   5. Zachowaj 40 μL zawiesiny PU-kulek (lub kontrolnych kulek) (np. 1:1 kulki v/v:buffer) na próbkę do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL. Użyj końcówki pipety z odciętym końcem, aby ułatwić rozdawanie kulek.
      UWAGA: kulki PU są światłoczułe. Podczas składania używaj ciemnych lub folią owiniętych rurek 1,5 mL. Ze względu na hydrofobową powłokę powierzchniową z małomolekularnym spoiwem epichaperomu, kulki PU mają tendencję do zlepiania się i przylegania do powierzchni plastikowych. Pipetuj delikatnie i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierną zawies. Kluczowe jest podawanie równych ilości zawiesiny kulkowej do każdej próbki, aby uniknąć zmienności w wychwytywaniu białek, co może prowadzić do niespójnych lub niepowtarzalnych wyników.
   6. Przemyj kulki trzy razy natywnym buforem lizowym, dodając 1 ml buforu do każdej probówki, wirując, wirując w 10 000 × g przez 1 minutę i wyrzucając supernatant przez aspirację. Upewnij się, że kulki są całkowicie zawieszone między każdym myciem.
      UWAGA: Podczas aspiracji unikaj dotykania koralików. Delikatnie dociśnij końcówkę pipety do ściany rurki podczas usuwania płynu.
   7. Po końcowym myciu usuń większość płynu z rurek, uważając, aby nie ruszyć kulki.
      UWAGA: Umyte koraliki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Zazwyczaj koraliki są używane w ciągu 1-2 dni od przygotowania.
4. Interactome pull-down
   UWAGA: Pierwszym krokiem pull-down jest wstępny krok oczyszczania z użyciem kulek kontrolnych, które są sprzężone z obojętną małą cząsteczką, która nie wiąże epichaperomów¹⁶. Ten etap usuwa białka, agregaty oraz nierozpuszczalne zanieczyszczenia niespecyficznie oddziałujące z lizatu, poprawiając tym samym specyficzność następującego pull-upu kulki PU. Przedoczyszczanie zmniejsza wiązanie tła i zwiększa wykrywalność specyficznych białek związanych z epichaperomem.
   Interaktom odzyskany przez ten protokół jest analizowany przez MS, który jest bardzo wrażliwy na zanieczyszczenia eksperymentalne. Aby zapewnić dokładną identyfikację białek i zachować jakość danych, zawsze używaj świeżo przygotowanych i odczynników, minimalizuj narażenie na kurz i keratynę oraz zakładaj czyste, wolne od proszku rękawice podczas obsługi próbek, materiałów zużywalnych lub sprzętu. Do wszystkich etapów trawienia w zamian i żelu używaj szkła/materiałów eksploatacyjnych dedykowanych MS, a wszystkie przedmioty używane do Western blottingu trzymaj fizycznie oddzielnie. Jeśli używasz szkła ponownie, odczyszcz je poprzez kolejne płukanie 100% metanolem, wodą ultraczystą, kwasem octowym 80% i wodą ultraczystą, a następnie susz na powietrzu. Nie używaj detergentów; nawet śladowe pozostałości mogą zanieczyszczać kolumny LC i źródła jonów.
   1. Dodaj znormalizowane ekstrakty białkowe (zgodnie z krokiem 1.2, obliczonym na podstawie intensywności blotu HSP90) do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL zawierających 40 μL zawiesiny z kulek kontrolnych (czyli 20 μL kulek + 20 μL buforu), a końcową objętość dostosuj do 250 μL poprzez odpowiednią objętość natywnego buforu lizy.
      UWAGA: Aby określić specyficzne dla próbki objętości wejściowe, należy użyć wzoru A1 = (60 / C1) × X1, gdzie A1 to objętość znormalizowanego całkowitego białka do dodania (μL), C1 to zmierzone stężenie białka (μg/μL), a X1 to czynnik normalizacyjny wyprowadzony z HSP90 blotting (jak opisano w kroku 1.2). Objętość dodatkowego bufora do dodania oblicza się jako 250 μL minus A1. Jeśli normalizacja nie jest potrzebna, należy użyć 250 μg białka całkowitego w 250 μL.
   2. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez 30 minut, obracając się na rotatorze end-over end (10-15 rpm).
   3. Wiruj probówki w 10 000 × g przez 1 minutę w 4 °C, aby rozpylić kulki kontrolne wraz z agregowanym lub nierozpuszczalnym białkiem.
   4. Ostrożnie zbieraj supernatant z kulek kontrolnych za pomocą pipety o pojemności 1 mL i przelewaj go do probówek 1,5 mL zawierających 40 μL płynnej zawiesiny z kulek PU.
   5. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez 3 godziny, obracając się na rotatorze end-over end (10-15 rpm).
   6. Wiruj każdą probówkę w 10 000 × g przez 1 minutę, zasysaj supernatant i myj koraliki cztery razy 1 mL natywnego buforu lizy. Dla każdego płukania: wir, wirówka i zasysania, używając parametrów opisanych w kroku 1.3.
      UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przetwarzane do LC-MS/MS przy użyciu jednego z dwóch procesów pracy: (1) SDS-PAGE, a następnie trawienie w żelu, lub (2) trawienie przechwyconych białek na kulkach.
      W przypadku procesu trawienia w żelu, kontynuuj protokół zgodnie z napisanym tekstem. Do trawienia na koralikach należy przeprać koraliki jeszcze dwa razy zimnym PBS i natychmiast przejść do Sekcji 3. Nie zamrażaj koralików, jeśli trawisz się na koralikach; próbki muszą być przetworzone świeżo tego samego dnia. Mrożenie kompleksów białkowych związanych z kulkami może obniżyć wydajność trawienia poprzez sprzyjanie agregacji lub utratę rozpuszczalności białek, co prowadzi do mniejszej regeneracji peptydów i zwiększonej zmienności. Zgodnie z zaleceniami MS Core, próbki powinny być przetwarzane świeżo tego samego dnia, aby zapewnić spójne trawienie na kulkach.
5. Przygotowanie próbki do trawienia w żelu
   1. Do próbek kulek przygotowanych w kroku 1.4.6, które znajdują się w probkach mikrowirówek o pojemności 1,5 mL 2,5 mL buforu próbek próbek Laemmli, dodaj 25 μ×L buforu próbek.
      UWAGA: Próbki w tym momencie można przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 24 godziny. Zawsze ładuj całą objętość próbki do żelu SDS-PAGE do trawienia w żelu, aby zmaksymalizować pokrycie proteomu i zapewnić pełną reprezentację interaktomu. Częściowe ładowanie nie jest zalecane. Jeśli objętość próbki jest ograniczona, a częściowe obciążenie nieuniknione, pozostałe materiały powinny być przechowywane w aliquotach, aby zminimalizować cykle zamarzania i rozmrażania oraz zachować integralność interaktomową.
   2. Podgrzej każdą próbkę w 95 °C przez 3 minuty (z dodatkiem 2× buforu próbki Laemmliego, jak wyżej), aby zdenaturować kompleksy białkowe i wyludzić je z kulek przed załadowaniem na SDS-PAGE. SDS i środki redukujące w buforze rozbijają inhibitory protonowej i uwalniają białka z matrycy.
   3. Wiruj każdą probówkę w 10 000 × g przez 1 minutę w RT.
   4. Załaduj każdy supernatant na żele SDS-PAGE o prefabrykowanym gradientzie 4-20%.
   5. Żele uruchamiam w 1× TGS, buforując na RT i zatrzymaj bieg w połowie (~3,5-4 cm w żelu przy 100 V, zazwyczaj 30-60 minut pracy).
   6. Usuń żel z urządzenia elektroforezy i przystąpi do bejcowania kolorem Coomassie Brilliant Blue zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Żel zabarwiony, zanurzony w 5-7 mL ultraczystej wody w plastikowym pojemniku, może być transportowany do placówki MS w celu identyfikacji białka. Jeśli nie jest natychmiast przetworzony, przechowuj w 4 °C w ultraczystej wodzie przez maksymalnie 1-2 tygodnie. Zastosowano dwa alternatywne procesy proteomiczne w zależności od kluczowego obiektu, który wykonał pracę, oraz celów eksperymentalnych: Sekcja 2 opisuje trawienie w żelu, a następnie analizę niezależną od danych (DIA)-MS za pomocą spektrometru mas orbitrap quadrupole; Sekcja 3 opisuje protokół trawienia na kulce zoptymalizowany do spektrometrii mobilności jonów uwięzionych z równoległą fragmentacją akumulacyjną i szeregową (diaPASEF)²⁶. Kroki mogą być porównane, jeśli to stosowne.

2. Identyfikacja białek przez LC-MS/MS przy trawieniu białek w żelu

1. Redukcja i alkilacja białek cysteinylowanych w żelu
   1. Wyciąć zabarwiony obszar każdej ścieżki żelowej zabarwionej Coomassie i pokróć ją na około pięć równych plasterków żelu. Każdą kawałek odbarw przez trzykrotne inkubowanie w 500 μL metanolu 50% (v/v) przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, mieszając przy 700 obr./min na mikrorurowym shakerze z kontrolowaną temperaturą.
      UWAGA: Każdy plasterek żelu nie powinien mieć więcej niż ~1 cm × 0,5 cm × 1 cm, aby zapewnić efektywną dyfuzję odczynników w kolejnych etapach oraz efektywne trawienie trypsyny w żelu przez noc. Wyciąć region żelu odpowiadający silnie barwionym białkom – takim jak HSP90 i HSC70, które reprezentują bezpośrednie wiąźniki sondy chemicznej i rdzeniowych składników epichaperomu 15,16,23 – oddzielnie od reszty żelu. Ich wysoka obfitość mogłaby w przeciwnym razie zakłócać wykrywanie i ilościową ilościę interaktorów o niższej obfitości podczas analizy LC-MS/MS.
   2. Każdy plasterek żelu inkubuj w 500 μL 5 mM wodorowęglanu amonu (ABC) przygotowanego w 30% acetonitrylu (ACN) w temperaturze 37 °C, z potrząskiem przy 700 obr./min na mikrorurce z kontrolowaną temperaturą przez 15 minut, aby usunąć pozostałości plamca. Powtarzaj inkubację, aż plasterek żelu całkowicie się odbarwi.
      UWAGA: Każde pozostałe widoczne barwienie białkowe może zakłócać wiązanie peptydu z matrycą C18 podczas etapu oczyszczania peptydu, zmniejszając odbudowę i wrażliwość na SM w dalszej fazie.
   3. Usuń i wyrzuć roztwór ABC/ACN za pomocą pipety z cienkim końcówką, uważając, aby nie tracić kawałków żelu (czyli nie zasysać ich razem z cieczą). Następnie dodaj 500 μL 100% ACN do każdej probówki, zapewniając całkowite zanurzenie kawałków żelu. Inkubuj w RT na orbitalnym shakerze z prędkością 700 obr./min przez 10 minut, czyli aż kawałki żelowe staną się przezroczyste, skurczą się i przyjmą wygląd białego papieru.
      UWAGA: ACN jest łatwopalny i należy go obsługiwać w okapie parowym.
   4. Usuń i odrzuć ACN z każdej rurki za pomocą pipety z cienkim końcówką, uważając, by nie zasysać kawałków żelu. Krótko wiruj w 1000 × g przez 10 sekund, aby zebrać resztki cieczy, a następnie ostrożnie zasysaj pozostałe krople pipetą o cienkim końcówce. Otwarte probówki umieść w wirówce próżniowej na RT na 10-15 minut, czyli aż plasterki żelu wyschną i staną się sztywne.
      UWAGA: Nie przesuszaj. Regularnie sprawdzaj, aby uniknąć pęknięć lub nadmiernego kurczenia się żelowych kawałków. Po wyschnięciu przechowywać kawałki żelu w temperaturze 4 °C w szczelnej, niskowiążącej probówce lub mikrowirówce aż do strawienia; białka związane z żelem i oczyszczone są stabilne do kilku dni, gdy są utrzymywane w temperaturze 4 °C.
   5. Redukcja: Dodaj ~100 μL 10 mM Dithiothreitolu (DTT) (przygotowanego świeżo z wywaru 500 mM w 50 mM wodorowęglanu amonu) do każdej probówki, zapewniając pełne zanurzenie kawałków żelu. Inkubuj w temperaturze 56 °C przez 45 minut z mieszaniem przy 700 obr./min na mikrorurowym shakerze z kontrolą temperatury.
      UWAGA: DTT to drażniący środek na skórę i układ oddechowy. Trzymaj się pod kapturem chemicznym i zakładaj rękawiczki.
      UWAGA: Upewnij się, że probówki są szczelnie zamknięte podczas inkubacji, aby zapobiec parowaniu i utrzymać stężenie DTT.
   6. Alkilacja: Usuń roztwór DTT z każdej probówki za pomocą pipety z cienkim końcówką, uważając, aby nie ruszyć kawałków żelu. Natychmiast dodaj ~100 μL 55 mM jodoacetamidu (IAA) w 50 mM ABC, aby całkowicie pokryć plasterki żelu. Inkubuj w RT z mieszanką przy 700 obr./min przez 30 minut w ciemności.
      UWAGA: IAA jest toksyczne i wrażliwe na światło. Całą obsługę wykonuj w okapie oparowym, mając na sobie rękawiczki.
      UWAGA: Przed dodaniem IAA należy zapewnić całkowite usunięcie DTT, aby uniknąć zaciemnienia reakcji alkilacji. Owij rurki folią aluminiową lub używaj pojemników blokujących światło podczas inkubacji, aby zminimalizować degradację IAA.
   7. Wirówka w rurkach na chwilę z 1000 × g przez 5 sekund w RT, aby zebrać resztki płynu na dnie. Ostrożnie usuń supernatant za pomocą cienkiej końcówki pipety (np. końcówka P10), aby nie zakłócać kawałków żelu. Lekko przechyl tubkę i zasysaj od krawędzi, aby zminimalizować ryzyko zasysania fragmentów żelu.
   8. Równowaga: Pokryj żelowe kawałki 500 μL 50 mM ABC w 30% ACN. Inkubuj w RT przez 10 minut, mieszając z prędkością 700 obr./min na podgrzanym orbitalnym shakerze. Ten krok pomaga usunąć nadmiar odczynnika alkilacyjnego i wyrównuje żel przed odwodnieniem organizmu.
   9. Usuń roztwór: Krótko obróć w 1000 × g przez 5 sekund i odrzuć supernatant za pomocą pipety z cienkim końcówką, jak opisano powyżej.
   10. Ponownie odsusz: Powtórz kroki 2.1.3 i 2.1.4, aby ponownie odsuszyć kawałki żelu przy użyciu 100% ACN, a następnie przeprowadzić wirowanie próżniowe aż do wyschnięcia. Ten etap zapewnia optymalny odbudowę peptydów podczas trawienia enzymatycznego.
2. Proteoliza w żelu i oczyszczanie peptydów
   1. Strawić wysuszone próbki żelu, dodając trypsynę klasy MS w końcowym stężeniu 5 ng/μL w 50 mM ABC, aby w pełni nawilżyć kawałki żelu (zazwyczaj objętość 50-100 μL, czyli wystarczająco, by pokryć plasterki żelu). Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 mL, dbając o szczelne uszczelnienie rurek i zapobieganie parowaniu. Delikatnie mieszać, jeśli to możliwe (np. 300 obr./min na mikrorurowym shakerze z kontrolowaną temperaturą).
   2. Po nocnym trawieniu próbkę zakwaś, dodając 10% kwasu mrówkowego (FA) krople, aby uzyskać końcowe stężenie 1% (v/v) (np. dodaj 1 μL 10% FA do 100 μL trawienia). Delikatnie wymieszaj, a następnie sonifikuj rurki przez 10 minut w sonikatorze w kąpieli wodnej RT, aby poprawić ekstrację peptydów.
   3. Ostrożnie usuń supernatant zawierający peptydy za pomocą pipety o cienkim końcówce (np. końcówka wąskoprzewiercowego P10), uważając, aby nie zakłócić matrycy żelowej ani nie zasysać fragmentów żelu. Przełóż zebrany supernatant do niskowiązanej probówki 500 μL i umieść ją w lodzie.
   4. Do każdej probówki dodaj roztwór 5% FA/50% ACN (v/v) (zazwyczaj ~50-100 μL, czyli tyle, by całkowicie pokryć kawałki żelu), i delikatnie mieszaj w RT (np. na shakerze przy 70 obr./min przez 10-15 minut), aby wydobyć pozostałe peptydy. Ostrożnie zbieraj supernatant i łącz go z oryginalnym roztworem peptydowym od etapu 2.2.3.
   5. Skoncentruj połączony ekstrakt peptydowy za pomocą wirowania próżniowego na RT (np. 1 000 × g przez ~30 minut), aż pozostanie tylko mała kropla. Nie pozwól, by próbka całkowicie wyschła, ponieważ może to powodować utratę peptydów z powodu przylegania do ścianek rurki. Częściowo wysuszony ekstrakt użyj natychmiast do odsolonia lub przechowuj w temperaturze -20 °C w szczelnej, niskowiązanej tubce.
   6. Odsol peptydy za pomocą ręcznie pakowanych małych końcówek pipety z C18 (czyli StageTips) przygotowanych z dwoma ułożonymi na siebie dyskami ekstrakcyjnych C18 włożonymi do końcówki pipety 200 μL, jak opisano wcześniej²⁷, z następującymi modyfikacjami:
   7. Aktywuj dyski C18, dodając 40 μL metanolu. Wiruj końcówkę pipety zawierającą dyski (włożoną do pustej końcówki pipety 200 μL i umieszczoną w rurce 500 μL) za pomocą wirówki stołowej o pojemności 1 500 × g przez 3 minuty.
      UWAGA: Na wszystkich etapach nie pozwól, by dyski C18 wyschły. Suszenie zakłóca wiązanie i ewolencję peptydów. Zewnętrzna końcówka pipety 200 μL (tulej) trzymająca ręcznie pakowaną małą końcówkę pipety C18 może wymagać skrócenia przez cięcie ~ 1 cm od końca, aby upewnić się, że zespół z dwoma końcówkami w rurce prawidłowo pasuje do wirówki.
   8. Wyrównuj dyski, dodając 0,1% FA i wirując jak powyżej.
   9. Roztwór peptydowego, rekonstytuowany w 20 μL 0,1% FA, należy nałożyć bezpośrednio na górę ułożonych dysków.
   10. Wirować w 1500 × g przez 5 minut, aby ułatwić wiązanie peptydów z dyskami C18.
   11. Przemyj związane peptydy, przepuszczając 40 μL 0,1% FA przez kolumnę.
   12. Peptydy elute zawierające 40 μL 70% ACN zawierającego 0,1% FA. Przechowywać eluowane peptydy w niskowiążących rurkach w temperaturze -80 °C do analizy LC-MS/MS. Unikaj powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania.
3. Nano-LC sprzężony z analizą MS z użyciem DIA
   1. Skoncentruj odsolony eluat peptydów za pomocą wirowania próżniowego (np. 20-30 minut w RT, 1 000 × g), pozostawiając niewielką kroplę. Rekonstytucje peptydy w 10 μL 0,1% FA w wodzie klasy LC-MS, delikatnie pipetując w górę i w dół, krótko i krótko wirując. Krótko obróć w dół, aby zebrać płyn na dnie rurki, zanim zaczniesz kontynuować.
   2. Przeanalizuj 4 μL aliquotów z rekonstytuowanej próbki peptydu za pomocą nano-LC-MS/MS. Rozdziel peptydy na samodzielnie pakowanej kolumnie odwróconej fazy (75 μm ID × 2 cm, żywica C18, rozmiar cząstek 3 μm) utrzymywanej w temperaturze 50 °C. Przygotuj kolumnę za pomocą bomby^{ciśnieniowej 28} , pakując zawiesinę żywicy C18 (w metanolu, 1:3 v/v) w kapilarę stoionego krzemionki z zintegrowanym końcówką natryskową 10 μm (360 μm OD × 75 μm ID × końcówka 10 μm). Interfejs kolumny za pomocą jonizacji nanosprayowej z wysokorozdzielczym spektrometrem mas hybrydowym (typ quadrupol-Orbitrap) obsługującym workflow DIA.
      UWAGA: Zaleca się długość kolumny 20 cm, ponieważ zapewnia optymalne rozdzielenie mieszanin peptydowych powstałych z plasterków żelu SDS-PAGE.
   3. Utrzymuj kolumnę analityczną w temperaturze 50 °C, używając piekarnika kolumnowego lub bloku grzewczego, aby zapewnić spójne zatrzymywanie i separację peptydów. Zapewnij stabilną kontrolę temperatury przez cały okres pracy, ponieważ wahania mogą wpływać na powtarzalność.
   4. Peptydy eluty wykorzystują liniowy gradient 3-40% ACN w 0,1% FA przez 110 minut, z przepływem 250 nL/min. Ten gradient zapewnia skuteczne rozdzielenie peptydów przed wykryciem SM. Całkowity czas analizy, wliczając wyważenie kolumny, wynosi 120 min.
   5. Pobieranie danych w trybie DIA za pomocą wysokorozdzielczego MS, jak opisano wcześniej²⁹.
      1. Ustaw pełne skany MS1 do wykonania w trybie profilu z rozdzielczością 120 000 (m/z 200), w zakresie skanowania 300-1650 m/z. Po każdym skanowaniu MS1 należy wykonać fragmentację MS2 30 kolejnych okien prekursorowych (364-1370 Th) za pomocą schematu przesuwanego okna izolacyjnego.
      2. Przeprowadz fragmentację przy użyciu stopniowo znormalizowanych energii kolizji 25,5, 27,0 i 30,0. Domyślny maksymalny stan naładowania prekursora to 4. Ustaw stałą pierwszą masę w skanach MS/MS na 200 Da, a widma MS2 uzyskaj z rozdzielczością 30 000.
      3. Stosuj automatyczne ustawienie czasu wstrzyknięcia dla MS2 oraz maksymalny czas wstrzyknięcia 60 ms dla MS1. Dla skanów MS1 i MS2 ustaw cel jonowy (AGC) na 3e6.
4. Względna ilościowość interaktomów uchwyconych przez powinowactwa
   UWAGA: Aby ilościowo zidentyfikować białka zidentyfikowane w analizach DIA-MS interaktomów epichaperomu z powinowactwem, użyj platformy programowej wspierającej przepływy DIA i zapewniającej wiarygodne ilościowe określenia na podstawie intensywności peptydów lub liczby widmowych. Protokół ten wykorzystywał MaxQuant (np. wersja 2.5.1.0) oraz jego workflow MaxDIA^20,29 do identyfikacji peptydów/białek oraz ilościfikacji opartej na intensywności bez oznak. Wyszukiwania stosowały strategię odwróconej sekwencji wabików z 1% FDR przy poziomach PSM/peptydów i białek; Wpisy "Odwrotne" i "Potencjalne zanieczyszczenia" były filtrowane przed bioinformatyką. Nie stosowano żadnych kolców; Gotowość instrumentów została zweryfikowana przy użyciu 250 ng HeLa digest (oraz przerywanej mieszanki 6-białkowej o pojemności 10 fmol) spełniających wewnętrzne kryteria ID i stabilności RT.
   1. Analizuj surowe dane DIA-MS z jednolitymi parametrami we wszystkich próbkach. Zawiera do dwóch nieudanych rozszczepień i modyfikacji zestawu w następujący sposób: stała, karbamydometylacja cysteiny; zmienne, utlenianie metioniny oraz acetylacja białka N-terminus.
   2. Używaj biblioteki spektralnej predyktowanej in silico opartej na bazie danych białek ludzkich UniProt (np. ~20 000 wpisów), zapewniając uwzględnienie sekwencji wabików i zanieczyszczeń dla dokładnego oszacowania wskaźnika fałszywego wykrywania (FDR). Określ trawienie tryptyczne, chyba że użyto innego enzymu. Zweryfikowana biblioteka spektralna dla ludzi (oparta na wydaniu UniProt z 18.06.2020, 20 956 wpisów) jest dostępna w repozytorium Instytutu Biochemii Maxa Plancka,³⁰.
      UWAGA: Jako alternatywa dla tego przepływu pracy z przewidywanymi bibliotekami, krok 3.4 ilustruje przetwarzanie bezbiblioteczne, które pozwoliło na porównywalną identyfikację i ilościfikację na tych zbiorach danych.
   3. Ilościowo określ obfitość białek za pomocą wartości intensywności (nie ilościfikacji bez etykiet [LFQ]), ponieważ są one bardziej odpowiednie do analiz sieci PPI w dalszej fazie rozwoju. Upewnij się, że LFQ zostanie odznaczone, aby uniknąć artefaktów normalizacji, które mogą zniekształcać dane wzbogacania powinowactwa. Zamiast tego używaj surowych wartości intensywności pochodzących z dopasowań spektralnych peptydów, które odzwierciedlają siłę interakcji, a nie globalną ekspresję białek. Stosuj odpowiednie kryteria filtracji (np. minimum jeden unikalny peptyd na grupę białkową), aby poprawić wiarygodność identyfikacji i ilościowania białek. Eksportuj powstałą tabelę intensywności białek do kolejnych analiz statystycznych i sieciowych.
      UWAGA: W przeciwieństwie do standardowych procesów proteomicznych, gdzie wartości LFQ pomagają normalizować się dla obciążenia białkami przez całe lizaty, tutaj białka są wzbogacane poprzez wychwytywanie powinowactwa epichaperomów. Ten etap wzbogacania wprowadza wariancję biologiczną, którą normalizacja LFQ może zaciemniać. Dlatego preferowane są surowe wartości intensywności, ponieważ lepiej odzwierciedlają różnice między interakcjami białko-epichaperom w różnych warunkach i zachowują sygnał potrzebny do analizy na poziomie sieci (np. dfPPI). W wcześniejszych badaniach z wykorzystaniem wyszukiwań opartych na maskotkach^16,18, zamiast intensywności używano także wartości liczby widmowych MS/MS. W takich procesach przechwytywania powinowactwa liczby spektralne odzwierciedlają częstotliwość interakcji i są dobrze przystosowane do identyfikacji białek różnicowo oddziałujących między warunkami. W przeciwieństwie do wartości LFQ, liczenia MS/MS nie zakładają globalnej normalizacji w całym proteomie, zachowując biologicznie istotną zmienność od etapu wzbogacania epichaperomu.

3. Identyfikacja białek przez LC-MS/MS przy trawieniu białek na kulkach

1. Trawienie na kulkach
   UWAGA: Aby zapewnić optymalny odzysk białka i zminimalizować utratę próbki podczas trawienia białek na kulce do analizy SM, niezbędne jest stosowanie mikrowirówek o niskiej zawartości wiązania białek. Probówki te zostały zaprojektowane tak, aby zmniejszyć absorpcję białek do ścian rurek, co zwiększa wydobycie próbki. Wszystkie odczynniki używane w tej sekcji powinny być świeżo przygotowane przy użyciu wody i chemikaliów klasy LC-MS. Jeśli przesyłasz próbki do rdzenia proteomicznego, sprawdź lokalne zasady, ponieważ niektóre placówki mogą wymagać sterylizacji filtrów przed użyciem.
   1. Usuń wszelkie pozostałości PBS, które mogą pozostać w probówce z etapu 1.4.6. Ponownie zawiesij kulki w 80 μL 2 M mocznika, świeżo przygotowanej w 50 mM ABC, pH 8,5. Upewnij się, że całe mieszanie jest pipetowane lub krótko wirujące.
      UWAGA: Dostosuj objętość proporcjonalnie do ilości i rodzaju koralików. Protokół ten jest zoptymalizowany dla 40 μL zawiesiny z kulek PU.
   2. Dodaj DTT, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
      UWAGA: Przygotować świeży roztwór DTT 10 mM z 1 M roztworu zapasowego DTT w wodzie klasy LC-MS bezpośrednio przed użyciem, ponieważ DTT jest podatne na utlenianie w roztworze. Dodaj wymaganą objętość bezpośrednio do próbki i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.
   3. Zatkaj rurę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wstrząsając przy 1100 obr./min na podgrzewanym wstrząsaczu orbitalnym. Szczelnie zamykaj pokrywki, aby zminimalizować parowanie.
   4. Dodaj IAA, aby uzyskać końcowe stężenie 3,67 mM. Inkubuj w ciemności na RT przez 45 minut z drżeniami przy 1100 obr./min.
      UWAGA: Przed użyciem przygotuj świeży zapas IAA o objętości 10 mM w wodzie klasy LC-MS. Dodaj wymaganą objętość do próbki i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.
   5. Dodaj dodatkowe DTT do tłumienia niezareagowanych IAA, osiągając końcowe stężenie 3,67 mM. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie.
      UWAGA: Chłodzenie niezareagowanego IAA zapobiega nadmiernej alkilacji, co może osłabić aktywność proteazy i efektywność trawienia. Przygotuj świeże DTT i oblicz objętość na podstawie aktualnej objętości próbki, aby osiągnąć docelowe stężenie.
   6. Do próbki dodaj 750 ng 0,5 mg/mL proteazy Lys-C klasy MS. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, potrząsając przy 1 150 obr./min.
      UWAGA: Przygotuj Lys-C poprzez rozpuszczenie w wodzie klasy LC-MS. Przechowuj aliquoty enzymów w temperaturze -80 °C i unikaj wielokrotnych zamarzań i rozmrażania.
   7. Dodaj 750 ng 0,5 mg/ml świeżo przygotowanej trypsyny o jakości sekwencyjnej. Inkubuj przez noc w 37 °C z potrząsaniami przy 1150 obr./min. Inkubuj nie dłużej niż 16-18 godzin, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu i rozkładowi peptydów.
   8. Następnego dnia wiruj próbkę w 1 000-5 000 × g przez 1-5 minut w RT, a następnie przelej supernatant przez pipetowanie do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Usuń paciorki.
   9. Dostosuj pH trawienia poniżej 3, dodając po kroplach 50% kwasu trifluorooctowego (TFA). Sprawdź pH za pomocą pasków wskaźnikowych pH.
      UWAGA: Typowy zakres pH powinien wynosić ~2,5-3,0, a próbki powinny zostać zakwaszone przed odsolzeniem.
      UWAGA: TFA jest i lotna. Dodaj okap wypalniczy i noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE).
2. Odsolanie peptydów
   UWAGA: Do odsolania i oczyszczania peptydów używaj małych końcówek pipet z pakowaniem C18 (czyli StageTips)³¹. Przygotuj C18 StageTips, pakując trzy warstwy materiału C18 (np. dyski do ekstrakcji fazy stałej C18) w końcówkę pipety o pojemności 200 μL. Można również używać gotowych, komercyjnie dostępnych kolumn obrotowych C18. Stosuj się do protokołu producenta dotyczącego kondycjonowania, załadunku próbek i elucii peptydu. Wydajność (np. efektywność retencji, zdolność odzysku) może się różnić między urządzeniami domowymi a komercyjnymi. Małe końcówki pipet z C18 powinny być ściśle upakowane, aby uniknąć przepływu obejściowego.
   1. Kondycjonuj małoskalowe końcówki pipety wypełnione C18 kolejno: (1) 100 μL metanolem. Wiruj przy 400 × g i odrzucaj przepływ; (2) 100 μL 70% ACN/0,1% TFA. Wirować przy 400 × g i odrzucić przepływ; (3) 100 μL 0,1% TFA. Wiruj w wirówce przy 400 × g i wyrzuć przepływ. Powtórz ten krok dwa razy.
      UWAGA: Kondycjonowanie zapewnia pełne zwilżenie hydrofobowej żywicy C18. Dla gotowych, dostępnych komercyjnie kolumn spinowych C18 można również stosować kolektory próżniowe. Użytkownicy powinni zapoznać się z instrukcjami producenta, aby uzyskać szczegółowe zalecenia dotyczące obsługi.
   2. Załaduj zakwaszone trawienie peptydu na kondycjonowane małoskalowe końcówki pipety wypełnione C18, powoli pipetując próbkę bezpośrednio do końcówki. Wiruj w 300 × g , aby trawienie przeszło przez żywicę, a następnie wyrzuć przepływ. Jeśli objętość próbki przekroczy pojemność, ładuj w kilku nabojach.
      UWAGA: Pipetuj trawienie bezpośrednio na upakowanym łóżku żywicznym, unikając pęcherzyków powietrza. Jeśli używasz końcówek o niskim zatrzymywaniu, dotknij wewnętrznej ściany małych końcówek z C18, aby powoli i równomiernie uwalniać płyn.
   3. Pipeta włóż 100 μL 0,1% FA bezpośrednio do małej końcówki pipety upakowanej C18, zapewniając pełne nasycenie materiału C18. Wiruj w wirówce przy 400 × g i wyrzuć przepływ. Powtórz ten krok dwa razy, aby usunąć sole i substancje zakłócające.
      UWAGA: Upewnij się, że ciecz przepływa całkowicie przez materiał C18 przed każdym obrótem. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza, powoli rozprowadzając roztwór do płukania wzdłuż ścianki końcówki pipety.
   4. Uwolnij związane peptydy, pipetując 50 μL 70% ACN/0,1% FA do małej pipety wypełnionej C18. Wirówka 300 × g i zbiera eluat w czystej rurce mikrowirówki o niskim wiązaniu. Powtórz ten krok dwa razy, aby zapewnić pełną elucię.
      UWAGA: Do pełnego odzyskania eluata może być potrzeba kilku cykli wirowania. Jeśli pozostała ciecz uwięziona u podstawy końcówki, delikatnie stuknij w małą pipetę z C18 lub wykonaj krótkie dodatkowe obroty, aby zebrać pozostałą objętość. Połącz eluaty i sprawdź ostatni tom, zanim przejdziesz dalej.
   5. Zamrażaj i susz wylężone peptydy za pomocą koncentratora próżniowego aż wyschną. Upewnij się, że pokrywka jest luźno założona, aby umożliwić wentylację, ale unikaj chlapania.
   6. Rekonstytuuj wysuszone peptydy, dodając 12 μL 0,1% FA w wodzie klasy LC-MS bezpośrednio na dno rurki. Delikatnie przeplot i sonikuj rurki, aby peptydy całkowicie rozpuścić.
      UWAGA: Upewnij się, że cały pellet lub wyschnięta folia jest w pełni zrekonstituowana. Rozpuszczanie na bazie pipetek ryzykuje utratę peptydów z powodu przylegania do powierzchni końcówek.
   7. Sonikować zrekonstytuowane peptydy przez 5 minut w kąpielowym sonikatorze wypełnionym chłodną wodą, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie i zapobiec przegrzaniu.
   8. Wiruj peptydy w dawce 20 000 × g w 4 °C przez 10 minut. Przenieś supernatant peptydu do odpowiedniej fiolki z autopróbkowaniem, aby załadować ją do układu LC-MS. Używaj fiolek polipropylenowych o niskiej objętości, wysokiej jakości testowanych chromatografią gazową (GC) z wiązanymi pokrywkami przegrody silikonowo-politetrafluoretylenowej (PTFE), aby zminimalizować utratę próbek. Wyraźnie oznacz fiolki z identyfikatorem próbki i kolejnością wstrzyknięcia.
   9. Oszacuj stężenie peptydu za pomocą spektrofotometru na 280 nm. Należy zauważyć, że jest to przybliżone i może być zależało od zawartości pozostałości aromatycznych lub zanieczyszczeń. Alternatywnie, można użyć kolorymetrycznych testów peptydowych dla dokładniejszej ilości.
3. Parametry LC i MS
   UWAGA: Następujące parametry LC i MS są zoptymalizowane dla systemu nano-LC w połączeniu ze spektrometrem mas stosowanym w obecnym protokole. W przypadku innych systemów nano-LC i spektrometrów mas parametry powinny być odpowiednio dostosowane.
   1. Przygotowywać fazy mobilne co tydzień, aby zapewnić kompatybilność LC-MS i zminimalizować zanieczyszczenia: (1) Faza Mobilna A: Dodaj 1 mL FA klasy LC-MS do 1 L wody klasy LC-MS, oraz (2) Faza Mobilna B: Dodaj 1 mL FA klasy LC-MS do 1 L ACN klasy LC-MS.
      UWAGA: Używaj wyłącznie rozpuszczalników i kwasów klasy LC-MS. Przygotuj obie fazy w czystych szklanych butelkach i odgazuj, jeśli system LC tego wymaga. Niewykorzystane fazy wyrzucaj co tydzień, aby uniknąć wzrostu lub degradacji mikroorganizmów.
   2. Zamontować kolumnę kapilarną z fuzowanej krzemionki o długości 25 cm i średnicy wewnętrznej 75 μm, wypełnioną cząstkami C18 o odwróconej fazie 1,7 μm.
      UWAGA: Obchodz się z kolumnami ostrożnie, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza ani nie uszkodzić materiału opakowania. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi montażu i wyważania kolumny.
   3. Kondicjonuj kolumnę, stopniowo zwiększając przepływ z 50 nL/min do 300 nL/min przy użyciu 3% fazy mobilnej B.
      UWAGA: Ten etap zapewnia, że faza stacjonarna jest odpowiednio zwilżona i wyrównana przed wstrzyknięciem próbki. Monitoruj ciśnienie w kolumnie podczas zwiększania przepływu. Nagłe skoki ciśnienia mogą wskazywać na pęcherzyki powietrza lub zablokowanie kolumny. Równowaga może być uznana za zakończoną, gdy ciśnienie bazowe się ustabilizuje.
   4. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 50 °C, aby zapewnić optymalną wydajność chromatograficzną.
   5. Wstrzyknięcie 100 ng tryptycznego digestu z komórek HeLa jako standardu kontroli jakości (QC) w celu oceny wydajności systemu.
      UWAGA: Ta iniekcja QC służy jako punkt odniesienia do oceny spójności czasu retencji LC, czułości MS oraz pokrycia proteomu między różnymi seriami. Porównaj liczbę identyfikacji białek, powtarzalność czasu retencji oraz intensywność sygnału z referencyjnym zbiorem danych QC, aby potwierdzić gotowość systemu przed analizą próbek eksperymentalnych. Wykorzystaj komercyjne standardy digestu HeLa przygotowane w znanych stężeniach dla powtarzalności w różnych eksperymentach.
   6. Zastosuj elucię gradientową od 2% do 35% fazy mobilnej B przez 90 minut z przepływem 300 nL/min. Gradient 90-minutowy zapewnia rozdzielenie peptydów o wysokiej rozdzielczości odpowiednie dla złożonych proteomów. Podążając za gradientem, utrzymuj na 95% Fazy Mobilnej B przez 7 minut, aby opłukać kolumnę.
      UWAGA: Przed kolejnym wstrzyknięciem należy uwzględnić krok ponownego wyważenia (np. powrót do 2% B na 10-15 minut), aby zapewnić powtarzalność kolumny w różnych cyklach. Unikaj nagłych zmian gradientu, które mogą wpływać na stabilność czasu retencji i kształt szczytu.
   7. Przeprowadz analizę MS za pomocą spektrometru masowego wyposażonego w nanoprzepływowe źródło jonizacji elektrospray kompatybilne z nanoprzepływem (np. w stylu CaptiveSpray).
      UWAGA: Źródło jonów CaptiveSpray zapewnia stabilny elektrospray przy niskich szybkościach nanoprzepływu, zwiększając efektywność jonizacji i czułość. W laboratoriach używających alternatywnych spektrometrów mas dostosowuj odpowiednio parametry pozyskiwania i jonizacji. Przed analizą należy zapewnić odpowiednie strojenie i kalibrację, aby zachować dokładność i rozdzielczość. Prawidłowo ustaw emiter natryskowy i monitoruj stabilność natrysku podczas pracy, aby zapobiec zagadnianiu sygnału.
   8. Wykorzystaj niezależną od danych metodę diaPASEF³². Dla użytkowników nieznających diaPASEF, zapoznaj się z dokumentacją techniczną producenta lub najnowszymi protokołami opisującymi workflows spektrometrii uwięzionych jonów (TIMS)-DIA³³ , aby zoptymalizować pod kątem różnych typów próbek lub długości gradientów.
      UWAGA: diaPASEF łączy TIMS z DIA, aby zwiększyć szybkość sekwencjonowania i czułość poprzez wyrównanie jonów prekursorowych i fragmentowych w wymiarze mobilności³⁴. Upewnij się, że urządzenie TIMS jest prawidłowo skalibrowane i zsynchronizowane z kwadrupolem, aby uniknąć niewyrównania ruchomości jonów i okien masowych.
   9. Użyj następujących ustawień instrumentów: (1) Zakres masy: 100 do 1700 m/z; (2) Zakres mobilności jonowej: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Energia kolizji: 20-59 eV, podwyższona; (4) Czas podjazdu: 100 ms; (5) Czas akumulacji: 100 ms; (6) Zakres masy dla diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Szerokość okna masy: 26 Da z nakładem 1 Da; (8) Liczba kroków masy na cykl: 32; (9) Czas cyklu: ~1,8 s
      UWAGA: Te ustawienia są zoptymalizowane, aby zrównoważyć głębokość pokrycia i szybkość skanowania. Mogą być wymagane drobne korekty (np. szerokość okna lub liczba kroków) w zależności od złożoności próbki, długości gradientu oraz wydajności systemu LC-MS. Osiągnięcie identyfikacji ponad 7 500 białek do trawienia HeLa wskazuje na optymalne funkcjonowanie systemu. Liczba identyfikacji może się różnić w zależności od instrumentu i należy ją odpowiednio oceniać.
   10. Załaduj 300-400 ng próbki peptydu na jedno wstrzyknięcie, aby zapobiec przeciążeniu kolumny analitycznej. Przeciążenie może prowadzić do rozszerzenia szczytu, tłumienia jonów i zmniejszonej powtarzalności. Potwierdź stężenie peptydów przed wstrzyknięciem za pomocą spektrofotometru lub testu kolorymetrycznego peptydu, aby uniknąć zmienności między seriami.
   11. Wykonuj iniekcje puste między grupami próbek, aby uniknąć przeniesienia danych. Użyj 100% fazy mobilnej A (woda z 0,1% FA) jako pustego wkładu do wtrysku. To usuwa resztki peptydów z kolumny i zmniejsza zanieczyszczenia między cyklami. Monitoruj jony bazowe i tła, aby upewnić się, że czyszczenie jest odpowiednie.
4. Analiza danych DIA
   1. Użyj odpowiedniego oprogramowania wspierającego analizę danych z wykorzystaniem workflow directDIA³⁵ oraz bezbibliotecznego przetwarzania danych proteomicznych DIA. Przeprowadz identyfikację i ilościową identyfikację białek na podstawie bazy UniProt FASTA³⁶, ze standardowymi parametrami wyszukiwania i domyślnymi ustawieniami ilościfikacji.
      UWAGA: Wszystkie parametry, w tym specyficzność enzymów, ustawienia modyfikacji, progi FDR oraz wyniki po analizie, są szczegółowo opisane w Pliku Uzupełniającym 1. Alternatywne platformy analizy DIA, takie jak DIA-NN³⁷ , mogą być również stosowane, jeśli obsługują podobne procesy i wyniki.
   2. Uruchom bezbiblioteczne directDIA z q-wartościowymi granicami odpowiadającymi 1% FDR na poziomach prekursora, peptydu i grupy białkowej; Wyłącz identyfikacje wabików przed analizą dalszą.
      UWAGA: Nie dodano standardów iRT; wydajność została porównana za pomocą testów HeLa digest z wcześniej zdefiniowanymi kryteriami identyfikacji i stabilności czasu retencji.

Wyniki

Po pomyślnym uruchomieniu protokołu użytkownicy powinni uzyskać wysokiej jakości zbiory danych interakcji odpowiednie do dalszej analizy dfPPI. Identyfikacja białek przeprowadza się na podstawie danych DIA przy 1% FDR (PSM i poziomy białek), a ilościowa identyfikacja wykorzystuje surowe intensywności lub liczbę spektralnych MS/MS (nie LFQ). Oczekiwane sygnatury QC obejmują: ścisłe klasteryzowanie replikacji technicznych przez PCA, medianę CV prekursorów/białek około 10-12%, hierarchiczne klasteryzowanie oparte na pochodzeniu biologicznym, a nie na replikacji, oraz odporne wzbogacenie na poziomie szlaku na g:Profiler/Reactome.

Generowanie i walidacja aktywności sondy PU przed użyciem

Kulki PU przygotowuje się przez sprzężenie małocząsteczkowego analogu wiążącego epichaperom z agarozą aktywowaną przez NHS, jak opisano^{wcześniej 25}. Standardowe opakowanie żywicy o pojemności 25 mL daje ~25 mL kulek PU przechowywanych jako zawiesina 1:1 w izopropanole. Umieść w rurkach o niskim wiązaniu i przechowywać w temperaturze −20 °C, chronione przed światłem (np. owinąć folią aluminiową). W takich warunkach partia pozostaje stabilna przez ≥12 miesięcy. Przed użyciem usuń izopropanol i wyrównuj kulki w natywnym buforze wiążącym (krok 1.3). Każda partia kwalifikuje się do syntezy, a następnie okresowo za pomocą dwóch testów (Rysunek 2): (i) Dopasowane pull-downy o wykonaniu specyficzności biologicznej z lizatu o wysokiej zawartości epichaperomu (np. MDA-MB-468) i lizatu o niskiej zawartości epichaperomu (np. ASPC1) w identycznych warunkach (zawiesina kulek 40 μL z białkiem całkowitym 250 μg; 3 godziny przy 4 °C; natywne płukania), eluowanie/denaturacja oraz immunoblot dla HSP90, HSC70 i HOP. Akceptacja: silne wzbogacenie w próbie o wysokim poziomie epichaperomu z minimalnym sygnałem w próbce niskiej; współczynniki intensywności pasmowej porównywalne z partią referencyjną (±20-30%). (ii) Globalne profile ładunku przechwytywane równolegle z lizatu o wysokiej wartości epichaperomu z kulkami PU w porównaniu do dopasowanych obojętnych kulek kontrolnych, ładunek równych objętości eluatów na SDS-PAGE oraz barwnik Coomassie. Akceptacja: kulki z PU pokazują bogaty, wysokomolekularny ładunek z minimalnym tłem w pasie kontrolnym. Partia 25 mL obsługuje ~600 przechwytów przy 40 μL na próbkę; Często wycofuj, jeśli specyficzność lub profil ładunku nie jest akceptowany po ponownym myciu lub wyważeniu.

Reprezentatywne wyniki protokołów in-gel i on-bead

W pilotażowym porównaniu bezpośrednim na komórkach MDA-MB-468 o wysokim poziomie epichaperomu, procesy w żelu i na kulkach dały wysoce zgodne interaktomy: 4 616 z 6 333 białek (73%) było współdzielonych na poziomie grupy białkowej, z czego 1 275 (20%) wykryto wyłącznie przez in-gel, a 442 (7%) tylko przez on-bead. Zgodność na poziomie ścieżki była jeszcze wyższa: spośród 860 terminów Reactome 727 (85%) było wspólnych, z czego 81 (9%) unikalnych dla in-gelu, a 52 (6%) unikalnych dla on-beal. Mediana intensywności białek była ~3× wyższa dla in-gel niż on-beali, co jest zgodne z stężeniem elucji żelu, ale nie miało to istotnego wpływu na spójność szlaków.

Przykład na skalę kohortową i sygnatury QC

Na przykład przeanalizowaliśmy dwanaście próbek biologicznych (Rysunek 3). Cztery próbki zostały eluowane i przetworzone przez trawienie w żelu; osiem próbek przeszło oczyszczanie powinowactwa kompleksów epichaperomowych, a następnie trawienie na kulkach oraz nano-LC-MS/MS w duplikacie technicznym. Zaobserwowano oczekiwane sygnatury QC: ścisłe skupienie replikacji technicznych przez PCA, mediana CV prekursorów/białek na poziomie ~10-12%, hierarchiczne klasteryzowanie wynikające z pochodzenia biologicznego, a nie replikacji, oraz solidne wzbogacenie na poziomie szlaku na g:Profiler/Reactome. Wyniki te ilustrują powtarzalność w różnych komponentach przepływu pracy, szerokie wykrywanie białek zaangażowanych w epichaperom oraz jasną funkcjonalną interpretowalność różnicowych interaktorów na poziomie szlaku. Wzbogacenia szlaku uzyskane z obu procesów odpowiadały naszym opublikowanym wynikom dfPPI dla tej linii, potwierdzonym przez kilka biochemicznych i funkcjonalnych ortogonalnych^{testów 17}.

Jakość materiału wejściowego i trawienie

Reprezentatywny żel SDS-PAGE barwiony przez Coomassie jest przedstawiony dla czterech próbek przetworzonych przez trawienie w żelu (Rysunek 3A). Żel ilustruje powtarzalne wychwytywanie białek i spójny rozkład pasm na ścieżkach, potwierdzając pomyślne wzbogacenie kompleksów białkowych z rodzimych lizatów przed zastosowaniem spektrometrii masowej. Te zdenaturowane profile interaktomowe pokazują, że etap wychwytu powinowactwa daje wystarczające i spójne źródło białka do dalszej analizy MS.

Zdobyte interaktomy wykazują szerokie pokrycie białek w różnych masach cząsteczkowych, co odzwierciedla pomyślne wzbogacenie zespołów białek z rodzimych lizatów. Co istotne, to odzyskanie nie ogranicza się do obfitych białek, lecz obejmuje interaktory o niższej obfitości, zapewniając złożoność i głębię niezbędną do analizy na poziomie systemów.

Sterowanie i specyficzność na dużą skalę

W tym procesie pracy używamy kulek kontrolnych tylko do wstępnego oczyszczania (patrz kroki 1.3 i 1.4); Nie wykonujemy rutynowych "inertnych sond" porównawczych na każdej próbce biologicznej. Dla dużych kohort klinicznych przechwyty obojętne zużywają cenny materiał, ale wnoszą niewielką wartość interpretacyjną dla dfPPI, ponieważ statystyki dalsze działają na poziomie sieci/szlaku, a nie na poziomie pojedynczego białka. Losowe lub żywicowe zanieczyszczenia nie pojawiają się skoordynowane u członków tej samej ścieżki i dlatego nie przechodzą testów wzbogacania na poziomie szlaku ani filtrów spójności na poziomie kohort. W praktyce specyficzność zapewnia (i) wstępne oczyszczanie, (ii) ścisła powtarzalność replikacji (PCA/CV) oraz (iii) stabilność szlaku przez progi i ponowne próbowanie. Historycznie ocenialiśmy eksperymenty z blokiem z wychwytem obojętnym i konkurencyjnym (PU-H71) i stwierdziliśmy, że nie zmieniły one wyników szlaku dfPPI 16,17,21, podczas spożywania niezastąpionego materiału klinicznego; Dlatego rezerwujemy je wyłącznie do weryfikacji pilotażowej. Dla grup preferujących jawne kontrole na poziomie runów zauważamy, że obie opcje są kompatybilne z protokołem, ale nie są wymagane do analiz dfPPI na poziomie kohortowym.

Liczba replikacyjna

Wnioskowanie ścieżkowe w dfPPI jest oparte na zbiorach i nie wymaga stałej liczby replikacji. Dzięki solidnym akwizycjom pojedyncza próbka na każde schorzenie może prowadzić do wywołań szlaków eksploratorskich. Do analiz potwierdzających zalecamy ≥3 biologiczne replikacje na stan dla hodowanych komórek (z podwójnymi zastrzykami LC-MS/MS, gdy to możliwe) oraz odpowiednimi dla kohorty N dla tkanek ludzkich (zazwyczaj ≥5-10 na grupę dla odkrycia, większe przy warstwowaniu przez kowariaty). Oceniamy stabilność poprzez replikacyjne klasteryzowanie (PCA), medianę CV prekursora (cel ~10-15%) oraz bootstrap/resampling wyników wzbogacenia.

Techniczna powtarzalność między przebiegami

Techniczna powtarzalność oceniono za pomocą analizy głównych składników (PCA) (Rysunek 3B) danych o intensywności peptydów z próbek trawionych na koralikach (osiem mózgów myszy, przeprowadzonych w duplikacie). Replikacje skupiły się ściśle dla każdej próbki biologicznej, podczas gdy różne próbki rozdzielały się czysto wzdłuż pierwszych dwóch głównych składników. Pierwsze dwa główne składniki wyjaśniły odpowiednio 28,6% i 22,0% całkowitej wariancji oraz rozdzieliły próbki według różnic biologicznych, a nie szumu technicznego. Ta struktura odzwierciedla wysoką spójność analityczną i potwierdza, że metoda zachowuje różnice istotne biologicznie, co jest kluczowe dla umożliwienia dfPPI wykrywania specyficznych warunków przełączeń sieci.

Spójność detekcji w różnych próbkach

Rozkłady współczynnika zmienności (CV) dla intensywności jonów prekursorowych pokazują, że zdecydowana większość cech mieści się poniżej 20% CV, z wartościami medianami od 9,7% do 11,9% w zależności od warunków (rysunek 3C). Wyniki te potwierdzają spójne wykrywanie SM i odzyskiwanie peptydów w pojedynczych replikacjach.

Zakres dynamiczny i pokrycie proteomów

Hierarchiczne klasteryzowanie wartości liczebności białek przekształconych logologicznie (rysunek 3D) wykazało silne rozdzielenie próbek i zachowanie zmienności między próbkami, jednocześnie odzwierciedlając szeroki zakres dynamiczny uchwycony w testach MS. Intensywność białek obejmowała od interaktorów o niskiej ilości po wysoko wzbogacone grupy białkowe, co widać na podstawie gradientu niebieskiego do żółtego. Dane potwierdzają, że protokół umożliwia wykrywanie różnorodnych zespołów białek i interaktorów, rejestrując zarówno komponenty rdzeniowe, jak i peryferyjne.

Interpretacja funkcjonalna za pomocą dfPPI

Aby wspierać interpretację i powtarzalność, udostępniamy dwa uzupełniające się zasoby do analizy zbiorów danych dfPPI: (i) interaktywną aplikację webową Shiny (https://epichaperomics.mskcc.org/ zaktualizowaną do https://dfppi.mskcc.org) oraz (ii) otwarte, skryptowalne workflow i pliki sesji Cytoscape opublikowane wraz z wcześniejszymi badaniami dfPPI (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. Aplikacja pobiera surową intensywność lub tabele liczby spektralnych MS/MS, wykonuje kontrolę jakości (replikowanie klastrowania, sprawdzanie wartości brakujących), opcjonalne przetwarzanie szumów/wsad (regresja kowariancową), identyfikuje białka zaangażowane różnicowo oraz dostarcza odczyty szlaków/sieci za pomocą interaktywnych wykresów i raportów do pobrania – bez konieczności kodowania.

dfPPI traktuje zmierzone intensywności lub liczby widmowe jako wskaźniki "zaangażowania epichaperomu". Użytkownicy wybierają model różnicowej łączności (DC) obejmujący prosty dwustronny test t (domyślnie) po modele liniowe świadome kowariancje; krok DC można również pominąć. Po DC użytkownicy ustawiają progi zmiany fold i wartości p (domyślne odzwierciedlają wcześniejsze prace dfPPI; np. FC > 1.0, nominalne p ≤ 0.25), aby przekazać kandydatów do wzbogacenia. Dostępne są dwa silniki wzbogacające: GSEA oparte na rangach (na statystykach ze znakiem) oraz nadreprezentacja (hipergeometryczna) za pomocą g:Profiler z wielokrotną korektą testową. W kontekście skoncentrowanym na chaperonie pipeline oferuje również Interactome Enrichment Analysis (iEA), aby sprawdzić, czy bezpośrednie interaktory białek rusztowania chaperonów są nadreprezentowane wśród białek różnicowo zaangażowanych. Sieć analizuje węzły/krawędzie według rozmiaru efektu i/lub wsparcia statystycznego, co umożliwia wizualizację skoordynowanego przeprogramowania, a nie efektów pojedynczych białek. Dla użytkowników preferujących skryptowane przepływy pracy, kod R oraz pliki sesji Cytoscape używane do tworzenia map i wykresów sieci są publicznie dostępne (np. GitHub/Zenodo)38,39,40,41 wraz z powiązanymi publikacjami 17,18,19,20 i mogą być uruchamiane lokalnie lub dostosowane do nowych zbiorów danych.

Zaleca się permisywne odcięcie (zmiana fałdy > 1,0; nominalne p ≤ 0,25), aby zachować sygnały stanu oddziaływania wprowadzone przez wzbogacenie powinowactwa. Następnie przenosimy kontrolę statystyczną na poziom szlaku: białka kandydatów są testowane pod kątem wzbogacenia w wybranych ontologiach (np. GO, Reactome) za pomocą g:Profiler, a wartości p szlaku dostosowane wielokrotnie do testów określają istotność i ranking. Ten projekt odzwierciedla cel dfPPI – wykrywanie skoordynowanego przeprogramowania sieci, a nie ekspresji różnic pojedynczych białek – oraz unika normalizacji na poziomie całego proteomu, która mogłaby zaciemnić sygnały wzbogacania w zbiorach danych typu pull-down. Jak pokazano w wcześniejszych badaniach dfPPI^17,20, bardziej łagodne progi poziomu białek dają stabilne, odpowiednie dla choroby wywołania szlaków, podczas gdy inne modele (np. modele liniowe z empirycznym kurczeniem Bayesa) mogą być stosowane, gdy wariancja lub wsadowe kowariancje to wymagają, bez zmiany wnioskowania skoncentrowanego na rdzeniu szlaku.

Wychwytywanie powinowactwa nieuchronnie wzbogaca "lepkie" białka (np. keratyny, białka cytoszkieletowe, białka rybosomalne), a kulki PU mogą również przechwytywać ogólne interakcje chaperonów. W dfPPI nie wpływają one na biologię z kilku powodów. Po pierwsze, wstępne oczyszczanie i restrykcyjne mycia usuwają większość niespecyficznych spoiw. Po drugie, uniwersalne bindery, w tym wiele interaktorów chaperonów, wykazują zmiany foldu blisko 1,0 w zależności od warunków i/lub niespójne wykrywanie, przez co nie przechodzą ekranów FC/p-value. Po trzecie, wzbogacenie szlaku jest oparte na zbiorach i świadome tła: istotność oblicza się względem specyficznego dla eksperymentu wykrytego proteomu i wymaga współzmienności wielu członków tej samej ścieżki. Losowe lub wysokoobfitościowe zanieczyszczenia są rozproszone w wielu terminach i dlatego nie tworzą spójnych, znaczących dla FDR wzbogacenia. Żaden pojedynczy zanieczyszczenie białkiem ani inny czynnik nie jest w stanie "wywołać" sygnału szlakowego. Po czwarte, dfPPI interpretuje koherencję na poziomie sieci, a nie pojedyncze białka; wywołania szlaku muszą przetrwać wielokrotne testy korekty (np. wartości p-korygowane przez profiler), minimalne rozmiary zestawu genów oraz powtarzać spójność. Wraz z dopasowanymi preclearami z bezczynnymi kulkami i filtrowaniem wspólnych zanieczyszczeń, ta struktura sprawia, że dfPPI jest odporne na tło: nawet jeśli obecne są setki białek nieinformacyjnych, nie wpływają one na rankingi szlaków, ponieważ wzbogacenie zależy od liczby zgodnych białek w szlaku, a nie od całkowitej długości listy białek. Co więcej, każde dotychczasowe opublikowane badanie dfPPI potwierdziło przewidywania na poziomie szlaków i sieci poprzez szeroko zakrojoną walidację eksperymentalną (np. ukierunkowana biochemia, odczyty sygnalizacyjne, zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne)16,17,18,19,20, wykazując, że wyniki dfPPI to nie tylko szumowe listy białek, lecz powtarzalne mapy dysfunkcji sieci PPI istotnych dla choroby.

Aby ocenić funkcjonalny krajobraz uchwycony przez zbiór danych dfPPI z Rysunku 3D, przeprowadziliśmy analizę wzbogacenia za pomocą g:Profiler⁴² (Rysunek 3E). Wyniki pokazują solidne pokrycie adnotacjami we wszystkich głównych ontologiach funkcjonalnych, w tym w procesach biologicznych ontologii genów (GO-BP), funkcji molekularnej (GO-MF) oraz komponentach komórkowych (GO-CC), a także w wybranych zasobach szlakowych, takich jak Reactome, KEGG i WikiPathways. Ta reprezentatywna analiza ilustruje kluczową zaletę podejścia dfPPI: jego zdolność do ujawniania biologicznie istotnych powiązań ścieżek w różnych typach adnotacji, nawet z relatywnie małych prób. Szeroki zakres Reactome zaobserwowany tutaj prawdopodobnie odzwierciedla fakt, że dfPPI opiera się na zmianach na poziomie interakcji – przechwytywaniu zmian – przeprogramowaniu sieci białkowych, które bezpośrednio mapują się na procesy wieloskładnikowe i kaskady sygnalizacyjne, które są dobrze reprezentowane w strukturze Reactome. Ponieważ dfPPI wykorzystuje zmiany w łączności, a nie w ekspresji, jest szczególnie dobrze przystosowany do wykrywania przesunięcia funkcjonalnych na poziomie systemu, które mogą zostać przeoczone przez transkryptomikę lub proteomikę opartą wyłącznie na obfitości. To odkrycie jest zgodne z innymi badaniami, w których Reactome konsekwentnie dostarczał najbardziej spójne i istotne dla choroby wzbogacenia z zestawów białek pochodzących z dfPPI: 14,15,16,17,18,20,21.

Reaktom jest zorganizowany wokół procesów wielobiałkowych i kompleksów (kaskady transdukcji sygnału, moduły cyklu komórkowego, zespoły metaboliczne). Ponieważ dfPPI wzbogaca interakcje zaangażowane w epichaperom, czyli grupy białek, które są funkcjonalnie współrekrutowane do rusztowania chorobowego – jego wyjście naturalnie zawiera spójne moduły szlaków, a nie izolowane trafienia. To skoordynowane przechwytywanie daje szerokie, istotne pokrycie Reaktomem w powiązanych podszlakach i hierarchiach. Natomiast omiki skoncentrowane na obfitości (transkryptomika; globalna proteomika) zgłaszają zmiany ekspresji, a nie stany interakcji; AP-MS z pojedynczą przynętą lub oznakowanie bliskościowe zapewnia lokalnym osiedlom jedną przynętę inżynieryjną naraz; a łączenie krzyżowe/frakcjonowanie często zapewnia rzadką łączność. Żaden z nich sam w sobie rutynowo nie generuje zestawów na poziomie systemowym wyselekcjonowanym na poziomie kontekstu, które dfPPI zwraca z pojedynczego, endogennego wychwytu w komórkach lub tkankach. Efektem jest wzbogacenie szlaków, które jest zarówno szerokie (wiele gałęzi Reactome się świeci), jak i mechanistycznie spójne (białka przesuwają się razem, ponieważ ich interakcje – a nie tylko ich ilości – są przeprogramowane przez epichaperomy). Należy jednak zauważyć, że dfPPI jest komplementarne, a nie zamiennikiem: każda metoda interaktomiki ma swoje zalety i ograniczenia, a optymalny wybór (lub kombinacja) powinien być podyktowany pytaniem biologicznym, ograniczeniami próby i wymaganą rozdzielczością.

Razem te wyniki potwierdzają, że protokół daje powtarzalne, biologicznie informacyjne zbiory danych, które można wykorzystać do odkrywania różnicowych remodelacji interaktomów w różnych stanach chorobowych lub eksperymentalnych zaburzeń. Wyjście dfPPI jest dobrze przystosowane do integracji z ramami wzbogacania ścieżek i umożliwia mapowanie zdarzeń funkcjonalnych przewijania, których standardowe metody oparte na obfitości nie wykrywają.

Rysunek 1: Przegląd platformy dfPPI. (A) Platforma dfPPI (dysfunkcyjny interaktom białko-białko) umożliwia identyfikację specyficznych dla choroby dysfunkcji sieci PPI poprzez chemoproteomiczny przepływ pracy. Sekcja 1 obejmuje przygotowanie próbki i wychwytywanie interaktomów za pomocą sond chemicznych unieruchomionych na macierzach powinowactwa (np. kulki PU). Sekcje 2 i 3 opisują dwa kompatybilne procesy trawienia – na kulce lub w żelu – a następnie bezetykietowe LC-MS/MS do identyfikacji interaktomowej. Analizy obliczeniowe, w tym modelowanie statystyczne i wzbogacanie ścieżek, wykonywane są przy użyciu potoku bioinformatycznego dfPPI, który nie jest objęty tym protokołem, ale jest bezpłatnie dostępny w https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Zasada dfPPI. W kontekstach istotnych dla chorób endogenne epichaperomy tworzą rusztowania nadmolekularne, które reorganizują sieci PPI. Sondy chemiczne skierowane do epichaperomu (np. kulki PU lub odpowiedniki) przechwytują te rusztowania razem z ich powiązanymi interaktorami bezpośrednio z nienaruszonych komórek lub z rodzimych lizatów, co daje wieloprzynętowy pull-down w jednym eksperymencie. Dopasowane sterowanie (np. kontrola bezczynnym kulką i/lub konkurencja z wolną sondą) mogą być przetwarzane równolegle. Zdobyty materiał jest eluowany i trawiony na kulkach lub w żelu, analizowany przez LC-MS/MS, a białka są ilościowo określane (intensywność lub liczba widmów MS/MS). Powstały interaktom służy do obliczania różnicowych interaktorów między warunkami oraz do wzbogacania szlaków/sieci, ujawniając specyficzną dla kontekstu dysfunkcję PPI na poziomie systemowym. Workflow nie wymaga znakowania genetycznego ani nadmiernej ekspresji, jest kompatybilny zarówno z komórkami, jak i tkankami, a także można dostosować się do badań kohortowych. Natomiast tradycyjna metoda oczyszczania powinowactwa MS koncentruje się na jednej oznaczonej przynęcie na raz, generując lokalne sąsiedztwo na konstrukcję i zazwyczaj wymagając wielu konstrukcji/wybiegów do próbkowania sieci. Dla porównania, dfPPI wykorzystuje endogenne epichaperomy jako przynętę, wychwytując wiele dysfunkcyjnych inhibitorów pompy pompowej (PPI) jednocześnie z natywnego systemu, co przyspiesza odkrywanie specyficznych dla choroby przełączeń sieci i dostarcza odczyty na poziomie szlaku z pojedynczego przechwytu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Walidacja partii i wychwytywanie specyficzności w serii PU-kulki. (A) Specyficzność biologiczna i spójność między partiami. Komórki MDA-MB-468 (wysoki poziom epichaperomu) i ASPC1 (niski poziom epichaperomu) zostały zlizowane w natywnym buforze (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; inhibitory proteazy/fosfatazy). Przy każdym przechwytaniu inkubowano 40 μL zawiesiny PU-kulek z 250 μg całkowitego białka (1 μg/μL) przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją. Koraliki były myte w natywnym buforze; kompleksy były denaturowane/eluowane w ~100 μL buforu próbek SDS. 5-10 μL każdego eluata zostało wyrównane przez SDS-PAGE i immunoblotowane dla HSP90, HSC70 i HOP. Wprowadzone lizaty wejściowe są pokazane dla porównania. Dwie partie z koralikami PU (partia 1, świeża; Partia 2, starzana) dają silne wzbogacenie w MDA-MB-468 i minimalny sygnał w ASPC1, co wykazuje zachowaną specyficzność i spójność partii. (B) Globalny ładunek kontra kulki kontrolne. Lizaty MDA-MB-468 były przetwarzane jako w (A) z kulkami PU lub dopasowanymi kulkami kontrolnymi. ~20 μL każdego eluata było ładowane, rozdzielane przez SDS-PAGE i barwione Coomassie. Kulki PU odzyskują złożony, wysokomasowy ładunek charakterystyczny dla zespołów związanych z epichaperomem, podczas gdy kulki kontrolne wykazują minimalne tło. Wskazane są markery masy molekularnej (kDa). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki z wychwytywania powinowactwa dfPPI, identyfikacji interaktomów oraz analiz bioinformatycznych. (A) Białka SDS-PAGE barwione przez Coomassie wyemluowane z wychwytów powinowactwa PU-kulek interaktomów związanych z epichaperomem z czterech reprezentatywnych próbek ludzkiego mózgu (PT1-PT4). Zespoły białek związane z kulkami zostały denaturowane przez gotowanie w buforze próbki SDS, rozdzielane przez SDS-PAGE i barwione w celu oceny odzyskiwania interaktomów w różnych masach cząsteczkowych. Każda próbka była ładowana na osobny pas, z pustym pasem między próbkami, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe; słaby sygnał obserwowany okazjonalnie w tych pustych torach odzwierciedla niewielkie przelanie próbki podczas elektroforezy. Te żele są reprezentatywne dla próbek przesłanych do ośrodka MS, gdzie każdy tor został podzielony na pięć plasterków do trawienia w żelu i identyfikacji białek przez MS. (B) Analiza głównych składników (PCA) zidentyfikowanych intensywności białek z interaktomów epichaperomu trawionych na kulkach z ośmiu reprezentatywnych próbek mózgu myszy (przeprowadzonych w duplikacie) ujawnia ścisłe skupienie replikatów technicznych oraz wyraźne biologiczne rozdzielenie wzdłuż PC1 i PC2. Potwierdza to wysoką techniczną powtarzalność oraz wystarczającą wariancję biologiczną do solidnej analizy dfPPI. Struktura danych wykazuje, że różnice na poziomie interakcji, a nie artefakty techniczne, napędzają separację próbek, zapewniając solidne podstawy do dalszego modelowania interaktomowego różnicowego bez potrzeby sztucznej normalizacji. (C) Rozkłady współczynnika zmienności (CV) dla intensywności jonów prekursorowych w ośmiu grupach prób wykazują konsekwentnie niską wariancję, z medianą CV od 9,7% do 11,9% (wskazaną pionowymi liniami przerywanymi). Te niskie CV podkreślają powtarzalność i odporność pipeline'u wykrywania i ilościowania MS. Spójność ta wspiera wykorzystanie surowych wartości intensywności lub MS/MS jako wiarygodnych danych wejściowych do analizy dfPPI, gdzie zmienność siły interakcji – a nie globalna ekspresja białek – jest sygnałem biologicznym zainteresowania. (D) Hierarchiczna mapa ciepła klasteryzacji_{logologicznych} wartości intensywności 2-transformowanych przez wszystkie próbki (z pokazanymi duplikatami technicznymi). Próbki grupują się według pochodzenia biologicznego, a nie replikacji, co potwierdza solidne wychwytywanie interaktomów związanych z epichaperomem oraz zachowanie biologicznie istotnych wariancji. Szeroki zakres dynamiczny i spójna detekcja między białkami dodatkowo wspierają jakość zbiorów danych do analizy dfPPI. Pasek skali przedstawia logariatem wartości intensywności białek transformowanych₂, w zakresie od 2 (niebieski, niska obfitość) do 14 (żółty, wysoka obfitość). (E) Wykres Manhattan analizy wzbogacenia szlaków przeprowadzony na białkach różnicowo oddziałujących za pomocą dfPPI. Wzbogacenie przeprowadzono za pomocą g:Profiler, a istotne składniki są wykreślone przez −log₁₀(wartość p), kolorowane według źródła adnotacji: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways oraz Human Phenotype Ontology (HP). Ten wynik stanowi podstawową użyteczność dfPPI: odkrywanie biologicznie istotnych szlaków funkcjonalnych zaburzonych przez remodelowanie interaktomów sterowane epichaperomem. Szeroki zakres adnotacji podkreśla wgląd na poziomie systemowym, jaki można osiągnąć dzięki temu podejściu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Metoda	Co uchwyca	Główne zalety	Kluczowe ograniczenia	Typowe zastosowanie	Skalowalność (kohorty)
AP-MS (oczyszczanie powinowactwa – MS)	Bezpośrednie/niebezpośrednie interakcje pojedynczej przynęty	Wysoka swoistość; ilościowy; Dobre do złożonej kompozycji	Wymaga przynęty/tagu/przeciwciała; przynęta po jedno; może przegapić przejściowe/słabe	Zdefiniuj partnerów interesującego białka	Niskie do umiarkowane (potrzeba wielu przynęt)
Oznaczenie bliskości (np. warianty BioID/APEX)	Białka w okolicach przynęty na skalę nano-skalę w czasie	Uchwyca przejściowych/słabych sąsiadów; Prace w komórkach żywych	Inżynieria genetyczna; oznakowanie poza celem; Parametrów	Mapy lokalnych dzielnic; dynamika	Niski–umiarkowany (inżynieria na przynętę)
XL-MS (łączenie MS)	Przestrzenne bliskości/kontakty wewnątrz/między białkami	Ograniczenia konstrukcyjne; przechwytuje kontakty przejściowe	Analiza zespolona; szerokość dolnego proteomu; Specyficzne dla próbki	Topologia strukturalna/kontekstowa	Niskie (specjalistyczne)
Kofrakcjonacja/MS (CF-MS)	Współtworzenie zgromadzeń tubylczych	Bez tagowania; Zgromadzenia tubylcze	Pracochłonne; wnioskowanie zespolone; Ograniczona czułość	Globalny, złożony krajobraz	Umiarkowany
CETSA/TPP	Profile współstabilności/współagregacji	Bez wytwórni; Warunki rodzime	Pośredni dla PPI; Ograniczenia rozpuszczalności	Zaangażowanie w cel; Przesunięcia termiczne	Umiarkowany
dfPPI (epichaperomika)	Przewiążenie interakcji na poziomie sieci przechwytywane przez endogenne epichaperomy jako przynęty multipleksowe	Endogennego; Bez tagowania; jeden z nich przesłuchuje tysiące dysfunkcyjnych inhibitorów PPI; odczyty ścieżek/sieci; kompatybilny z tkankami; Przyjazny dla kohorty	Dotyczy tylko kontekstu chorób; specjalistyczne sondy (kulki PU, YK5-B); nie przeznaczone do ogólnego odkrywania złożonego	Interaktoma w kontekście choroby, priorytetyzacja szlaków, generowanie hipotez	Wysokie (setki próbek możliwych)

Tabela 1: Porównanie podejść do mapowania PPI i dfPPI. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Pełne ustawienia parametrów Spectronaut. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół umożliwia mapowanie dysfunkcyjnych inhibitorów protonowych środków protonowych w natywnych próbkach biologicznych za pomocą platformy dfPPI. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod wnioskujących o dysfunkcji wynikających ze zmian obfitości lub ekspresji, ta platforma rejestruje przekształcenie sieci na poziomie strukturalnym poprzez izolowanie specyficznych dla choroby interaktorów poprzez oczyszczanie powinowactwa sondami celującymi w epichaperom, a następnie ilościowe SM oparte na bezoznakowaniu. Chociaż obecne zastosowanie koncentruje się na tkance mózgu po śmierci, metoda ta jest szeroko stosowalna do innych typów próbek i modeli chorób, w tym hodowanych komórek i tkanek z modeli nowotworów, neurodegeneracji i zaburzeń odporności 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI opiera się na sondach, które kinetycznie wybierają epichaperomy i zatrzymują zespoły z ich powiązanymi interaktorami. PU-kulki (pochodzące z chemotypów wiążących epichaperom, takich jak PU-H71/PU-AD) angażują epichaperomy z jądrem HSP90 niekowalencyjne, ale z długim czasem pobytu, co jest cechą kinetycznej selektywności konformacji epichaperomu w porównaniu do konwencjonalnych kompleksów chaperonów²³. YK5-B to biotinylowana, kowalencyjna sonda skierowana na HSC70 w epichaperomach, umożliwiająca wychwytywanie wewnątrzkomórkowych przed lizą i zachowując endogenne inhibitory pompy proponacyjne¹⁷. Selektywność wynika z PTM związanych z chorobą, które remodelują konformacje HSP90/HSC70 oraz chemię kieszonkową i stabilizują zespoły epichaperomu 14,23,43,44^; te zmiany prowadzą do wiązania_{o wysokiej} afinitecie, wolnego wiązania K dla sond niekowalencjnych typu PU⁴⁵ (oraz umożliwiają wychwytywanie kowalencyjne z HSC70-skierowanym YK5-B), tym samym zachowując kompleksy epichaperomowe kinetycznie i izolując ich bezpośrednie i pośrednie interaktory dla LC-MS/MS. W praktyce kulki PU są optymalne do procesów lizatanowych/homogenicznych, podczas gdy YK5-B obsługuje przechwytywanie komórek żywych; oba zachowują kontekstowo zależne zespoły, które mogą być identyfikowane przez LC-MS/MS i wykorzystywane do dalszej analizy dfPPI.

Do dfPPI wymagana jest specjalistyczna wiedza chemiczna do syntezy sond chwytających. Jednak ten wymóg nie jest unikalny dla dfPPI: szeroko stosowane metody PPI (AP-MS, oznakowanie zbliżeniowe, XL-MS) również opierają się na specjalistycznych umiejętnościach, np. klonowanie/inżynieria tagowanych przynęt, generowanie stabilnych linii komórkowych, optymalizacja znakowania/sieci krzyżowych oraz złożone potoki bioinformatyczne. Dla kontrastu, dfPPI unika manipulacji genetycznej i nadmiernej ekspresji przynęty, działa bezpośrednio na komórkach lub tkankach rodzimych (w tym na rzadkich klinicznych próbkach biologicznych) oraz wykorzystuje standardowe procesy chwytania powinowactwa i LC-MS, które są już rutynowe w rdzeniach proteomicznych. Aby obniżyć bariery adopcyjne, zweryfikowane kulki PU i dopasowane koraliki kontrolne są dostępne za pośrednictwem MTA w laboratorium Chiosis, a kroki obsługi i kontroli jakości są w pełni określone w krokach 1.3 i 1.4. Na koniec, analizę wspiera internetowa aplikacja dfPPI, która implementuje wymagane statystyki oraz odczyty ścieżek/sieci, zmniejszając obciążenie bioinformatyczne (czyli dla użytkowników bez doświadczenia kodistycznego i z podstawowymi umiejętnościami bioinformatycznymi).

AP-MS, XL-MS, znakowanie zbliżeniowe, kofrakcjonacja oraz CETSA/TPP odpowiadają na różne pytania (bezpośrednie wiązaczy, bliskość przestrzenna, oznakowanie sąsiedztwa, współskładanie lub kostabilność termiczna). dfPPI jest metodą wybieraną, gdy celem jest mapowanie endogennego, kontekstowo zależnego przeprogramowania w chorobach – szczególnie w tkankach rodzimych lub dużych kohortach klinicznych, gdzie oznaczanie genetyczne nie jest możliwe, oraz gdy pożądane są odczyty na poziomie szlaku/sieci z pojedynczego przechwytu. dfPPI wykorzystuje epichaperomy jako przynęty multipleksowe do rejestrowania skoordynowanych zmian interakcji między wieloma białkami w jednym pull-down, umożliwiając skalowalną identyfikację LC-MS/MS oraz analizę skoncentrowaną na szlakach na podstawie materiału pierwotnego. W praktyce dfPPI może zasiewać walidację skoncentrowaną na przynęcie (np. AP-MS na konkretnych węzłach), podczas gdy tradycyjne metody mogą udoskonalać topologię (bezpośrednie kontakty, ograniczenia przestrzenne) dla kompleksów zaznaczonych przez dfPPI. Zobacz Tabelę 1 , aby porównać obok siebie.

Na skuteczność przepływu pracy wpływa kilka kluczowych kroków. Po pierwsze, wysokiej jakości ekstrakty białkowe są niezbędne. Wymaga to ostrożnego obchodzenia się z tkankami lub komórkami – najlepiej mrożonymi i przechowywanymi w temperaturze -80 °C – aby zminimalizować proteolizę i zachować naturalne kompleksy. Uwzględnienie zarówno inhibitorów proteazy, jak i fosfatazy jest niepodważalne: integralność epichaperomu, która pełni rolę funkcjonalnej "przynęty" w tym teście, zależy od specyficznych modyfikacji podstawowych składników po translacji, takich jak HSP90 ^23,43. Na przykład fosforylacja Ser226 i Ser255 jest niezbędna do stabilizacji konformacji epichaperomu i zachowania jego funkcji rusztowania.²³. Brak inhibitorów fosfatazy grozi upadkiem strukturalnym i utratą specyficzności biologicznej.

Kolejnym kluczowym czynnikiem jest jakość i obsługa macierzy powinowactwa kulek PU. Koraliki powinny być przechowywane w 100% izopropanolu w temperaturze -20 °C i używane w określonym przedziale aktywności, najlepiej w ciągu 1-2 lat. Aktywność powinna być weryfikowana przed krytycznymi eksperymentami, ponieważ starzejące się kulki mogą wykazywać zmniejszoną zdolność wiązania lub zwiększoną interakcję niespecyficzną. Czas inkubacji i dopływ białka muszą być również zoptymalizowane: nadinkubacja może podnieść tło, podczas gdy niewystarczający poziom dostarczania białek może obniżyć głębię detekcji. Zalecamy 3-godzinne inkubacje oraz pilotażowe wyciąganie w celu kalibracji odpowiedniego wejścia dla każdego typu próbki.

Z tym protokołem są kompatybilne dwie strategie trawienia: on-bead i in-gel. Oba procesy przynoszą powtarzalne rezultaty, ale każdy z nich ma swoje kompromisy. Trawienie w żelu może wprowadzać zanieczyszczenia, takie jak keratyna, i wymaga dodatkowych kroków obsługi. Trawienie na kulkach usprawnia przepływ pracy i jest zazwyczaj preferowane, gdy przepustowość próbki lub ilość wejścia jest ograniczająca. Jednak ilość proteazy musi być kalibrowana na podstawie całkowitego spożycia białka: chociaż metoda została zaprojektowana na 750 ng trypsyny, przy wysokim poziomie białka może wystąpić niepełne trawienie, co prowadzi do nieudanych rozszczepień i zmniejszonej regeneracji peptydów. Zaleca się ocenę wydajności trawienia i odpowiednie dostosowanie dopływu enzymów. Wszystkie etapy trawienia powinny być wykonywane w probówkach o niskim wiążeniu, używając świeżo przygotowanych, wolnych od zanieczyszczeń odczynników, aby zapewnić spójność i zminimalizować tło.

Obciążenie białkiem na jedno zastrzyknięcie LC-MS zależy od procesu wychwytu, wydajności peptydu oraz pojemności kolumny. Dla digestów na kulkach analizowanych na standardowych kolumnach nano-LC C18 (~50-75 μm ID, ~15-25 cm) zazwyczaj ładujemy 300-500 ng na jedno wstrzyknięcie; Nie zaobserwowaliśmy wzrostu wydajności powyżej ~400-500 ng, podczas gdy wyższe obciążenia sprzyjają tłumieniu jonów i szczytowemu rozszerzaniu. W przypadku procesów w żelu (np. pięć plasterków na tor) zazwyczaj wstrzykujemy ~25% odsolonego materiału na kawałek na replikację i zachowujemy ~50% jako zapas na ponowne wstrzykiwanie, jeśli zajdzie taka potrzeba. We wszystkich przypadkach należy zmierzyć stężenie peptydu przed wtryskiem, zweryfikować odpowiedź liniową za pomocą digestu QC i dostrojić obciążenie tak, aby kształt szczytu chromatograficznego i głębokość identyfikacji były zachowane bez przeciążenia.

Ilościfikacja bez etykiet za pomocą DIA jest szeroko stosowana w proteomice ze względu na swoją powtarzalność i głębokość⁴⁶. Jednak w kontekście eksperymentów z przechwytywaniem powinowactwa, takich jak ten, gdzie celem jest identyfikacja białek wchodzących w interakcje z rusztowaniami epichaperomowymi, a nie mierzenie globalnej obfitości białek – strategie normalizacji, takie jak MaxLFQ, nie są odpowiednie. Te podejścia zakładają jednolite wejście wejściowe i podobieństwo w całym proteomie, które są naruszane przez etap wzbogacania nieodłączny dla tego protokołu. Zamiast tego wartości intensywności lub liczby widmów MS/MS zapewniają wystarczającą i biologicznie istotną ilościowość do dalszej analizy funkcjonalnej. Te wskaźniki odzwierciedlają względną siłę lub częstotliwość interakcji białek z epichaperomami w różnych warunkach. Jak wykazały wcześniejsze badania 16,17,18,20, wartości te doskonale nadają się do analiz interaktomowych na poziomie systemowym, takich jak dfPPI, które identyfikują zmienione szlaki biologiczne bez polegania na normalizacji całej proteomu. Zachowując rzeczywistą zmienność biologiczną wprowadzoną przez chorobę lub leczenie, ilościowa ilościowa metoda oparta na intensywności lub MS/MS umożliwia dokładne i solidne mapowanie dysfunkcji sieci PPI.

Chociaż przechwytywanie powinowactwa zmniejsza przestrzeń wyszukiwania w porównaniu do całego lizatu, pull-downy dfPPI nadal zawierają setki do tysięcy białek obejmujących szeroki zakres dynamiczny, plus współwzbogacone tło. Dla porównań na skalę kohort, stochastyczny wybór prekursorów DDA prowadzi do brakujących wartości run-to-run oraz zmiennego próbkowania interaktorów o niskiej obfitości¹⁸. DIA systematycznie fragmentuje wszystkie jony w określonych oknach, zapewniając większą głębię, mniej brakujących wartości oraz wyższe właściwości powtarzalności run-to-run, które są kluczowe, gdy wnioskowanie w dalszej fazie jest na poziomie ścieżki/sieci, a nie pojedynczego białka. Dlatego standaryzujemy DIA dla dfPPI.

Jak w przypadku wszystkich metod wychwytywania powinowactwa, niespecyficzne wiązanie białek jest istotnym czynnikiem. Białka mogą być zatrzymywane ze względu na lepkość żywicy, dużą ilość lub agregację. Chociaż takie niespecyficzne interaktory mogą pojawić się w eluzji pull-down, ich obecność nie podważa dalszego celu analitycznego protokołu¹⁷. Workflow dfPPI nie jest zaprojektowany do definiowania interakcji binarnych, lecz do wydobywania wzorców przeprogramowania PPI na poziomie systemowym. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego są przeprowadzane na interaktorach różnicowych i wykorzystują statystyki sieciowe do ujawniania skoordynowanych zmian na poziomie szlaków. Jak wykazano w poprzednich badaniach¹⁷, takie podejście na poziomie systemowym minimalizuje wpływ izolowanych niespecyficznych białek i pozwala na wyciąganie solidnych wniosków biologicznych na podstawie danych na poziomie kohort.

W porównaniu z konwencjonalnymi podejściami do mapowania interaktomów – takimi jak współimmunoprecipitacja, znakowanie bliskości czy sieciowanie – platforma dfPPI oferuje wyraźną przewagę: rejestruje funkcjonalną remodelację interaktomów w warunkach związanych z chorobą, bez konieczności inżynierii przynęt czy nadmiernej ekspresji. Ponieważ metoda izoluje kompleksy białkowe utworzone wokół epichaperomów supramolekularnych, wykrywa powstające zespoły białkowe, które nie występują w zdrowych układach, co umożliwia odkrycie nowych czynników choroby. Podejście to jest skalowalne i adaptowalne w zależności od tkanek, gatunków i stanów chorobowych, a już dostarczyło unikalnych wglądów w przebudowywanie proteomów w nowotworach i neurodegeneracji. W związku z tym ta metoda stanowi potężne narzędzie do odkrywania sieci funkcjonalnych zakłóconych w chorobach ludzkich.

Poza przykładami tutaj, dfPPI jest dobrze przygotowane dla (i) dużych kohort klinicznych, aby stratyfikować pacjentów według dysfunkcji sieci oraz odkrywać farmakodynamiczne biomarkery raportujące zaangażowanie celów i korektę szlaków; (ii) podłużne próbkowanie (np. przed/po terapii, etap choroby) w celu śledzenia trajektorii przeprogramowania i przewidywania respondentów; (iii) integrację z fosfoproteomiką i innymi omikami świadomymi PTM w celu powiązania zmian stanu interakcji z sygnalizacją upstream; (iv) przestrzennie rozdzielone fragmenty z mikrorozciętych obszarów (interfejsy guz-normalne, podregiony mózgu) do mapowania lokalnej patobiologii sieci; (v) przesłony perturbacyjne (genetyczne lub złożone), gdzie odczyty dfPPI nominują węzły i mechanizmy działania, które można wykonywać; oraz (vi) modelowanie grafów/AI, które uczy się specyficznych dla choroby cech sieci z map dfPPI dla prognozowania i projektowania terapii. Metodologicznie miniaturyzacja, automatyzacja (np. formaty 96-dołkowe) oraz standaryzowana kontrola jakości umożliwią wysokoprzepustowe pipeline'y dla badań translacyjnych i badań klinicznych. Wreszcie, wyniki dfPPI mogą zasiewać ukierunkowane follow-upy – AP-MS, XL-MS lub oznakowanie bliskości – aby rozwiązać topologię priorytetowych modułów, podkreślając komplementarność metody w ramach narzędzi interaktomicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Toksyczne, łatwopalne
Acetonitryl (ACN) Optima	Fisher Scientific	A955-1	Klasa LC/MS (łatwopalna)
Ośrodek chromatografii aktywowanej Affi-Gel 10	Bio-Rad	1536099	Wykorzystywane do produkcji kulek PU i kontrolnych kulek (łatwopalne)
Wodorowęglan amonu (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Aurora Ultimate 25x75 C18 kolumna UHPLC	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Film autoradiograficzny	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternatywa wykrywania sygnału chemicznego po zachodnim blocie
Mikro homogenizator tkanek Biomasher	DWK Nauki o Życiu Kimble	7496250010	Wykorzystywane do homogenizacji zamrożonej tkanki mózgowej do ekstrakcji białka
Błękit bromofenolowy	Bioreagent Fishera	BP115-25
Wirówka do probówek 1,5 mL	Eppendorf	5424
Wirówka do probówek 1,5 mL	Eppendorf	5417R	Z regulacją temperatury
Wirówka do probówek 15-50 mL	Eppendorf	5810R	Stosowane do lamp stożkowych
System obrazowania ChemiDoc MP	Bio-Rad	17001402	Stosowane do densytometrii żelowej/blot
Piec kolumnowy	Sonation GmBH, Niemcy	ES071/ES072	Utrzymuje kolumnę nanoLC w temperaturze 50 i stopni; C oznacza stałą retencję
Stożkowe lampy (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Koraliki kontrolne	Laboratorium Chiosis	N/A	Taldone i in. (PMID:  21459002)
Bejca Coomassie G-250 (Bio-safe)	Bio-Rad	1610786
Ciemne rurki Eppendorfa (1,5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10197777001	Drażniące
Łatwy nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Łatwy nLC 1000	System LC używany z Q Exactive HF
Dyski ekstrakcji fazowej Empore	Kompania 3M	2215-C18 (Octadecyl)	Używany do przygotowania StageTips do odsolania peptydów; Aktywowany 100% metanolem
Zestaw do zwiększonej chemiluminescencji (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32209
Lampy Eppendorfa (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Kwas mrówkowy (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	Klasa LC/MS
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT Group-Tartu & Uuml; likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Wzbogacenie ścieżek
Glicerol	Bioreagent Fishera	BP229-1	Stopień biologii molekularnej
Glicyna	Bioreagent Fishera	BP381-5	Proszek krystaliczny
Przeciwciało przeciw myszom sprzężone z HRP (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	Wtórny przeciwciało H90-10
Przeciwciało przeciw kozikom sprzężone z HRP (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	Drugorzędny dla HSP90α oraz przeciwciała HOP
Przeciwciało przeciw szczurom sprzężone z HRP u kóz (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	Wtórny przeciwciało HSC70
Podgrzewana orbitalna wstrząsająca	Eppendorf	ThermoMixer C (2231001127)
Metoda trawienia białka HeLa standardowo-Pierce'a	Thermo Fisher Scientific	88329	Wykorzystywane do oceny jakości jakości LC-MS
Przeciwciało HOP (RRID: AB_10828378)	Sygnalizacja komórkowa	5670	Dla kontroli jakości kulek PU
Przeciwciało HSC70 (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Dla kontroli jakości kulek PU
Przeciwciało HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Dla kontroli jakości kulek PU
Przeciwciało alfa HSP90 (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Dla normalizacji zgodnie z Sekcją 1.2
Linia komórkowa ludzka: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Linia komórkowa kontrolna, epichaperom niski/chaperon wysoki
Linia komórkowa ludzka: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Linia komórkowa kontrolna, epichaperom wysoki/chaperon wysoki
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densytometria
Jodoacetamid (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Toksyczny
Mikrowirówki niskobiałkowe	Sarstedt	72.706.600
Proteaza Lys-C	Promega	VA1170	Klasa LC/MS
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	63068	Stopień biologii molekularnej
MaxQuant (v2.1.1.0)	Max-Planck-Instytut Biochemii	https://www.maxquant.org/	Workflow MaxDIA do identyfikacji peptydów/białek oraz ilościowej ilościowej opartej na intensywności bez oznak
Metanol	Fisher Chemical	A454-4	Klasy HPLC, łatwopalny, toksyczny
Tabletka koktajlowa z mini inhibitorem proteazy (kompletna)	Roche	4693124001
Mini elektroforetyczna komórka transferowa Trans Blot	Bio-Rad	1703930
Mini-żelowy zbiornik elektroforezy	Thermo Fisher Scientific	A25977	Stosowane do żeli prefabrykowanych Novex
Komórka Elektroforezy Pionowej Mini-PROTEAN Tetra	Bio-Rad	1658004	Stosowane do żeli białkowych Mini-PROTEAN Prefabrykowanych lub ręcznie odlewanych żeli
Mini-PROTEAN  TGX Prefabrykowane Żele Białkowe (4– 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Agilent	BioTek Synergy H1	Używany do szacowania stężenia peptydów przed iniekcją LC-MS
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	Zastosowanie w przepływie pracy diaPASEF
Źródło Nanospray Flex	Thermo Fisher Scientific	ES071	Dla nanospray ESI sprzężenia
Nowy obiektyw PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	Wypełnione zawiesiną C18 do długości 20 cm
Błona nitrocelulozowa	Cytiva Amersham	10600006
Mleko suche bez tłuszczu	Laboratorium naukowe	M0841
Prefabrykowane żele Novex 8% Tris-Glycine	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)	Gibco	10010023
Tabletka koktajlowa inhibitora fosfatazy PhosSTOP	Roche	4906837001
Zestaw do testowania białka BCA Pierce	Thermo Fisher Scientific	23225
Plastikowe pojemniki	Fisher Scientific	FB0875711A
Kołysak platformowy	Corning	6705
Chlorek potasu	Bioreagent Fishera	BP366-1	Białe Kryształy
Zasilacz uniwersalny PowerPac	Bio-Rad	1645070
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standard	Bio-Rad	1610375
Koraliki PU	Laboratorium Chiosis	N/A	Taldone i in. (PMID:  21459002)
Q Exactive HF Orbitrap spektrometr mas	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	Wykorzystywane w DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro; m	Dr. Maisch GmbH, Niemcy	R13.aq	Medium krzemionkowe do separacji peptydów; Zawiesina proszkowa/metanolu (1:3, v/v)
Jednostka obrotowa (rotator end-over-end)	Barnstead  Międzynarodowy	400110
Naboje Sep-Pak C18 (100 mg)	Waters Corporation	WAT023590
Siarczan dodecylosiarczan sodu (SDS)	Bioreagent Fishera	BP166-500	Stopień elektroforezy
Sonifikacji	Branson	2510
SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate czytnik	Urządzenia molekularne	Paradygmat SpectraMax
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	workflow directDIA
Koncentrator SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	Savant SPD111V
Podciśnienie ssące	Kardynał Zdrowia	CDL-65651-320
Spektrometr mas TimsTOF HT	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	Wykorzystywane do analizy diaPASEF
Kwas trójfluoroctowy (TFA) Optima	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	LC/MS klasy (, palne)
Tris	Bioreagent Fishera	BP152-5	Proszek krystaliczny; Stopień biologii molekularnej
Tris, pH 6,8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7,5 (1 M)	Bioreagent Fishera	BP1757-500	Stopień biologii molekularnej
Bufor soli fizjologicznej z buforem tris-buffer (20x TBS)	VWR, nauki przyrodnicze	97064-338
Tris-glycine-SDS (TGS 10x) z buforem żelowym	Bioreagent Fishera	BP13414	Elektroforezy
Trypsyna	Promega	V5111	Stopień sekwencjonowania
Trypsin Gold	Promega	V5280
Tween 20	Bioreagent Fishera	BP337-100
Mocznik	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Wir	Fisher Scientific	02-215-414
Woda	Fisher Scientific	W6-1	Stopień LC/MS