Wielolaboratoryjny model udaru zakrzepowo z trombolizą Stroke Preclinical Assessment Network Stroke: TE-MCAo

Podsumowanie

Aby zasymulować udar zakrzepowo-zatorowy, do tętnicy środkowej mózgowej wstrzykiwano zatory przygotowane z heterologicznego krwi szczura, a następnie podano trombolizę ogólnoustrojową w celu reanalizacji. Ta wersja modelu jest zoptymalizowana do pracy w sieci wielolaboratoryjnej i wspiera testowanie wielu kandydatów na terapię.

Streszczenie

Obecne translacyjne modele udaru gryzoni indukują okluzję środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) za pomocą włókien nylonowych, wstrzykiwanych zatorek, zakrzepicy śródświatłowej lub śródkrwio-naczyniowego endotelu-1 do symulacji udaru ludzkiego. Spośród tych metod zastrzyk z zakrzepów i zatorów, a następnie tromboliza, najlepiej naśladuje zdarzenia neurozapalne obserwowane u pacjentów i może być preferowany od najczęściej stosowanej metody z obojętnym nylonem. Standardowe modele zakrzepowe zatorowe, stosowane w wiodących pojedynczych laboratoriach, mogą jednak być czasochłonne, dawać różne wyniki i wymagać znacznych umiejętności, by je opanować. Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy model zakrzepowo-zatorowy MCAo, który celuje w okluzję naczyń i wykorzystuje dożylną trombolizę do osiągnięcia reanalizacji, równolegle do ogólnoustrojowej trombolizy podawanej w scenariuszach klinicznych. Aby zmniejszyć liczbę zwierząt, opracowaliśmy metodę przechowywania krwi od dawców na późniejsze przygotowanie do zbolów dla wielu osób. Nasze wykorzystanie prefabrykowanych mikrocewników Doccol upraszcza przygotowanie i wstrzyknięcie zakrzepów poprzez wstępne obciążenie zakrzepów do mikrocewników, które następnie są wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej. Aby osiągnąć reanalizację, podaliśmy dożylną tenekteplazę w dawce 1,5 mg/kg. Aby promować powtarzalność, przygotowaliśmy i przetestowaliśmy standardowe procedury operacyjne, filmy szkoleniowe oraz praktyczne warsztaty chirurgiczne. Model wykorzystuje standardowe podejście chirurgiczne, które powinno być dobrze znane wszystkim badaczom stosującym powszechnie akceptowany model nylonowego włókna. Przejście mikrocewnika do dalszej tętnicy wewnętrznej szyjnej, omijając tętnicę skrzydłowopodniebową, odbywa się w sposób podobny do wszczepienia włókna nylonowego. Oceny pooperacyjne i po udarze mogą być przeprowadzane według typowych protokołów behawioralnych, radiograficznych i histologicznych. Model ten oferuje praktyczne, powtarzalne i dostępne podejście dla badaczy poszukujących zakrzepo-zatorowego modelu MCAo z kontrolowaną reanalizacją.

Wprowadzenie

Udar jest jedną z głównych przyczyn zgonów i niepełnosprawności na całym świecie¹. Wielu pacjentów korzysta z trombolizy dożylnej, a wybrani pacjenci korzystają z trombotyki mechanicznej. Ponieważ nie wszyscy pacjenci docierają do szpitala na czas na trombolizę lub trombektomię, a nie wszyscy pacjenci odnoszą korzyści z pełnego powrotu do zdrowia, nadal istnieje znaczna potrzeba dalszego rozwoju dodatkowych lub uzupełniających terapii cerebroprotekcyjnych. Najczęściej stosowanym modelem udaru niedokrwiennego gryzoni jest monofilamentowa okluzja środkowej tętnicy mózgowej (MCA), po której następuje całkowita reperfuzja. Model ten symuluje okluzję dużych naczyń (LVO), modelując pacjentów z dużymi udarami, którzy poddawali się pomyślnie całkowitej mechanicznej trombektomii. Jednak ten model obejmuje niewielki procent udarów klinicznych. Dla porównania, więcej pacjentów doświadcza udarów zakrzepowo-zatorowych wtórnych do miażdżycy (pęknięcie blaszki miażdżycyjnej in situ lub miegłowe zatorki spowodowane chorobą układową) i leczone są wyłącznie trombolizą układową, której model nylonowy nie potrafi odwzorować ^2,3. Ponadto model MCAo z włóknem nylonowym nie posiada kaskady zapalnej związanej z zakrzepową okluzją ^4,5. Modele zwierzęce z wykorzystującymi zakrzepki i podanie trombolitów ogólnoustrojowych odzwierciedlałyby patofizjologię i podstawową biologię występującą u wielu pacjentów po udarze ^4,6. Jak dotąd jednak modele udaru zakrzepowo-zatorowego u gryzoni są znane jako złożone i trudne do odtworzenia. W izolowanych laboratoriach z dedykowanymi ekspertami można uzyskać model zakrzepowo-zatorowy z rozsądną powtarzalnością. Taki model nie nadaje się łatwo do szerokiego zastosowania, gdy jest to konieczne w projektach wielolaboratoryjnych.

Przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące zaktualizowanego i standaryzowanego zakrzepania śródmózgowej arterii środkowej (TE-MCAo), a następnie modelu trombolizy układowej. Konkretnie uprościliśmy przygotowanie zakrzepu, ustandaryzowaliśmy obciążenie zakrzepów do cewników oraz zweryfikowaliśmy skalowalność tego modelu dla badań wielolaboratoryjnych. Opracowaliśmy ten model do wykorzystania w Stroke Preclinical Assessment Network (SPAN). Zamierzaliśmy jednak, aby model był użyteczny dla każdej sieci, która dąży do realizacji wieloskalowych przedklinicznych badań sieciowych nowych, kandydatów na leczenie. Korzystając z naszego standaryzowanego modelu, udało nam się indukować TE-MCAo u 6 szczurów dziennie na każde miejsce badania w trakcie okresu badania.

SPAN i podobne sieci rozwinęły się w odpowiedzi na powtarzające się i trwające niepowodzenia w przenoszeniu obiecujących cerebroprotectantów z warunków przedklinicznych na sukces w praktyce klinicznej⁷. W 2019 roku Narodowe Instytuty Zaburzeń Neurologicznych i Udaru (NINDS) zainicjowały SPAN⁸. SPAN dąży do skuteczniejszego selekcjonowania potencjalnych terapii poprzez minimalizację uprzedzeń poprzez scentralizowane maskowanie, losowość oraz automatyczną, scentralizowaną analizę wyników. SPAN 1 stosował model nylonowego filamentu w swoich pierwszych dwóch wersjach, ponieważ wszystkie uczestniczące laboratoria już go używały, a wdrożenie⁹ było łatwe. Aby wierniej modelować wiele aspektów zakrzepowo-zatorowej i trombolizy, SPAN dążył do stworzenia opisanego tutaj modelu TE-MCAo. Model ten byłby pomocny dla chirurgów przedklinicznych, którzy przechodzą z modelu nylonowego filamentu na model TE-MCAo. Zalecamy, aby laboratoria przedkliniczne potwierdziły obecność udaru 24/48 godzin po MCAo (lub TE-MCAo) za pomocą techniki obrazowania, np. rezonansu magnetycznego (MRI).

Sieć SPAN została w pełni opisana w poprzednich badaniach⁹, a wszystkie Standardowe Procedury Operacyjne (SOP) SPAN są dostępne na stronie internetowej SPAN. Krótko mówiąc, sieć jest zarządzana przez centrum koordynujące (CC), które zajmuje się dystrybucją leków, kontrolą jakości danych, weryfikacją zgodności protokołów oraz komunikacją sieciową. Wszystkie SOP są opracowywane przez CC i zatwierdzane przez Komitet Sterujący po przeglądzie. W SPAN wszystkie gryzonie mają po przybyciu do laboratoriów badawczych zamontowany identyfikator z kodem kreskowym kompatybilny z MRI, a wszyscy uczestnicy są rejestrowani w bazie danych SPAN Research Electronic Data Capture (REDCap). Zwierzęta są losowo przydzielane przez CC przy użyciu tabel losowych powielonych według miejsca i płci. W SPAN 1 i SPAN 2 badano skuteczność potencjalnych terapii w sześciu uczestniczących laboratoriach badawczych. Wszystkie leki testowe były pakowane w identycznie wyglądające fiolki, oznaczane w centrum koordynującym i wysyłane do laboratoriów badawczych na początku projektu.

Protokół

Wszystkie uczestniczące laboratoria SPAN, w tym centrum koordynujące na USC, stosowały się do wytycznych NIH i AAALAC dotyczących humanitarnego i etycznego traktowania zwierząt. Uzyskano zgodę lokalnego IACUC we wszystkich lokalizacjach.

1. Przygotowanie zakrzepu

UWAGA: Wszelka krew i zakrzep powinny być traktowane zgodnie ze wszystkimi lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi zagrożeń biologicznych. Wszystkie materiały mające kontakt z krwią powinny być albo usuwane jako odpady biologicznie niebezpieczne, lub, w przypadku narzędzi chirurgicznych, dokładnie czyszczone i dezynfekowane autoklawem. Aby ograniczyć użycie zwierząt dawców krwi w tym badaniu, opracowaliśmy metodę przechowywania krwi dawcy, a następnie wykorzystywania krwi do produkcji zakrzepów w razie potrzeby.

1. Pobieraj świeżą krew dawcy z tętnicy do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL lub do mikrorurek z etylendyaminy tetraoctowej (EDTA), napełniając tylko do poziomu 500 μL.
   UWAGA: Preferujemy kaniulację tętnicy udowej przy pobieraniu krwi, ponieważ tętnica udowa ma dużą średnicę świetlną umożliwiającą cewnikowanie, jest obustronna, co pozwala na dwa oddzielne pobrania krwi, i jest operacją możliwą do przeżycia dla gryzoni. Krew może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 4 tygodnie, z naszego doświadczenia.
2. Dodaj 1 ml roztworu CaCl₂ (5 mg/mL) do 500 μL zgromadzonej, antykoagulowanej krwi.
3. Bezpośrednio po odwróceniu przeciwzakrzepnięcia CaCl₂ należy zasysać krew z rurki mikrowirówki do rurki PE-50 o średnicy 100 cm za pomocą delikatnego ssania.
   UWAGA: Opóźnienie spowoduje zakrzepnięcie krwi zanim zostanie ona zasysana do rurki PE-50.
4. Inkubuj zwiniętą rurkę w podgrzanej soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w piecu stołowym.
   UWAGA: Umieszczenie szalki Petriego na otwartej płycie grzewczej skutkuje niespójnym wynikiem z powodu nierównomiernego rozkładu ciepła.
5. Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji natychmiast przenieś napełnioną krwią rurkę PE-50 do 4 °C w celu przechowywania. Będzie nadal użyteczny na kolejne etapy między 20 a 72 godzinami.

2. Ładowanie cewnika

1. Podłącz skręconą rurkę PE-50 (średnica wewnętrzna: 0,58 mm) do strzykawki 3 lub 5 cc wypełnionej solą fizjologiczną i delikatnie wydłużaj zakrzep do szalki Petriego zawierającej PBS.
   UWAGA: Może to wymagać znacznej siły. Utrzymuj nacisk na miejsce połączenia, aby cewnik i strzykawka nie odłączyły się podczas wyciskania. Cewnik PE-50 można przeciąć na mniejsze segmenty (10-50 cm), jeśli jest to konieczne, aby ułatwić ekstruzję.
2. Cięcie krzepki o długości około 6 cm żyłką.
3. Każdy segment zakrzepu delikatnie wciągnij do cewnika PE-50 i całkowicie wypróżnij 5 razy.
4. Następnie płucz zakrzep, delikatnie wprowadzając go do cewnika PE-10 (średnica wewnętrzna: 0,279 mm) i całkowicie wypróżniając go 15 razy.
   UWAGA: Jeśli podczas tego etapu występują częste pękania, rozważ użycie powiększenia mikroskopem operacyjnym lub chirurgiczną lupą, aby upewnić się, że zakrzep jest zasysany w linii z otworem cewnika.
5. OPCJONALNIE: Używanie niebieskiego Evan's do wizualizacji trombi
   1. Przygotuj 4% Evan's Blue w 1x roztworze PBS.
   2. Dodaj 200 μl 4% niebieskiego Evan's do szalki Petriego wypełnionej 10 mL 1x PBS. Będzie to bardziej skoncentrowany roztwór = Niebieskie rozcieńczenie Evana # 1.
   3. Weź 400 μL Evan's Blue Dilution # 1 i wymieszaj w osobnej szalce Petriego wypełnionej 20 mL 1x PBS. Jest to rozcieńczony roztwór Evan's Blue = Evan's Blue Runution # 2.
   4. Umieść skrzep w bardziej skoncentrowanym roztworze szalki Petriego Blue Evana (rozcieńczenie #1) na 1 sekundę, a następnie przenieś go do rozcieńczonej szalki Petriego Blue Evana (rozcieńczenie #2).
6. Załaduj jeden umyty trombus do prefabrykowanych mikrocewników (średnica wewnętrzna: 0,2 mm, średnica zewnętrzna: 0,360 mm, długość: 300 mm, połączona z zamkiem Luer ze strony samicy) bez embolów powietrznych, stosując metodę mokro-mokra.
   UWAGA: Zalecamy użycie powiększenia (np. 2,5x lup) w tym kroku.
7. Gdy krzep jest w pełni załadowany, wyciągnij tyle krzepów, aby dokładnie 5,0 cm pozostało w mikrocewniku. Przytnij nadmiar żyletką.
   UWAGA: Długość załadowanego krzepu może być dostosowana do różnych zastosowań w zależności od rozmiaru pożądanego skoku.
8. Zaznacz mikrocewnik na odległość 16 mm od końca, aby określić zakres cewnika, który powinien być przesunięty wewnątrzświatłowo poza rozgałęzienie tętnicy szyjnej wspólnej.

3. Chirurgia zwierząt i znieczulenie

1. Indukować znieczulenie 4% izofluranem w mieszance tlenu i podtlenku azotu 30:70 oraz utrzymywać znieczulenie z 1-2% izofluranem w tej samej mieszance gazów.
2. Podawaj leki przeciwbólowe karprofen 5 mg/kg podskórnie oraz atropinę 0,05 mg/kg dootrzewkowo, aby zapewnić komfort zwierzęcia podczas operacji.
   UWAGA: Wielu chirurgów infuzuje miejsce nacięcia 1,0 mL bupiwakainy (2,5 mg/mL).
3. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C przez cały zabieg, używając termoforu kontrolowanego sondą do odbytu.
4. Podawaj karprofen 5 mg/kg lub meloksykam 1 mg/kg podskórnie raz lub dwa razy dziennie przez co najmniej 3 dni jako pooperacyjne środki przeciwbólowe.

4. Pobieranie krwi dawcy

1. Pobieranie krwi od dawcy przez cewnikowanie tętnicze udowe. Dopasuj płeć biologiczną dawcy i biorców.
2. Jeśli krew ma być użyta tego samego dnia:
   1. Przygotuj trzy rurki wirówek po 1,5 mL. Każdą probówkę oznacz na poziomie 500 μL niezatartym długopisem laboratoryjnym.
   2. Przygotuj trzy zestawy rurek PE-50, każda o długości 100 cm, podłączonych do strzykawki o pojemności 1,0 mL za pomocą tępej igły o grubości 23.
3. Jeśli krew ma być przechowywana do późniejszego użytku, przygotuj sześć pediatrycznych mikrorurek EDTA. Poluzuj nasadki, żeby później było łatwiej ich używać.
4. Przygotuj 10,0 cm rurki PE-50, zaciskaną na jednym końcu zaciskiem gumowym i tępym fazowaniem na drugim końcu.
   1. Aby wykonać zacisk z gumowymi butami, włóż jeden zębek standardowego zacisku hemostatycznego do rurki PE-100 i przytnij go do dopasowania. Powtarzam po drugiej stronie.
   2. Aby uzyskać tępy fazowany PE-50, najpierw wyciąć koniec pod kątem fazowanym. Następnie odetnij sam czubek fazowego punktu mikronożyczkami.
      UWAGA: Ważne jest, aby usunąć punkt, aby uniknąć przebicia tylnej ściany tętnicy po włożeniu, ale jeśli usunięto zbyt dużą część czubka, utrata efektu fazowania bardzo utrudnia wprowadzenie cewnika wewnątrzświetlnie.
5. Wykonaj standardowe cięcie tętnicy udowej.
6. Przygotuj zwierzaka (ogol wewnętrzną część uda), ułóż go w pozycji leżącej grzbietowej na stole operacyjnym. Sterylizuj skórę 3 myciami z 70% etanolu, a następnie 1 myj betadyną lub innym środkiem antyseptykiem. Dezynfekuj skórę trzema naprzemiennymi dawkami betadyny lub innego środka antyseptycznego oraz 70% etanolu.
7. Zabezpiecz tylne łapy w sposób rozłożony, używając miękkich kajdanów.
8. Wykonaj pionowe nacięcie na wewnętrznej stronie uda o długości około 1,5-2 cm wzdłuż naturalnego fałdu pachwinowego przecięcia z nogą. To nacięcie będzie prostolegle do oczekiwanego przebiegu anatomicznego tętnicy udowej.
9. Stosując tępy rozwarstwienie, ostrożnie rozcień aż do naczyń udowych. Ostrożnie oddziel tętnicę udową od żyły i nerwu biegnącego w tym samym pęczku.
10. Dystalnie zatkać tętnicę udową jedwabną ligaturą 5-0 i użyć końców szwów, aby zapewnić lekkie napięcie dystalnie z hemostatami.
11. Szkieletyzuj tętnicę udową tak blisko, jak to możliwe, śledząc jej pochodzenie z zaotrzewną. Luźno załóż pętlę z jedwabiu 5-0 wokół tętnicy udowej i ponownie użyj ogonów, aby delikatnie naprężyć bliższy koniec tętnicy. Nie zaciskaj teraz węzła jedwabnego. To napięcie powoduje hemostazę po wykonaniu arteriotomii.
    UWAGA: Pętlę można przesunąć dalej proksimalnie za pomocą zacisku na tętniaka.
12. Około 2/3 odległości od pętli szwów bliższych umieść kawałek jedwabnego szwu pod tętnicą i wykonaj małą arteriotomię dystalnie od luźnego szwu za pomocą mikronożyczek. Luźny szew zostanie przywiązany, aby zabezpieczyć cewnik śródświatłowy po kanilowaniu.
13. Używając ostrych szczypiec, podnieś górne otwarcie tętnicy i wprowadź tępy cewnik fazowany do otworu. Przesuń cewnik jak najbliżej.
    UWAGA: Może występować tarcie między cewnikem a wewnętrzną ścianą naczynia. Dwie rzeczy mogą w tym pomóc: 1) pokrycie zewnętrznej strony końca cewnika surowiczą płynem z wnętrza nogi tuż przed wprowadzeniem go do naczynia oraz 2) użycie tępych, rowkowanych kleszczy, trzymanie zewnętrznej części naczynia przy jednoczesnym przesuwaniu cewnika. Zapobiega to przesuwaniu się naczynia wraz z cewnikiem.
14. Gdy końcówka cewnika zostanie przesunięta niemal do punktu pętli bliższej, uwolnić napięcie z ogonów tego szwu. Krwawienie powinno być zapobiegane przez ciasne dopasowanie cewnika wewnątrz naczynia.
15. Przesuń cewnik na tyle, aby luźna pętla, po dokręceniu, objęła cewnik. Delikatnie dokręć szew, upewniając się, że nie jest on tak mocno zaciśnięty przez cewnik. Upewnij się również, że szew nie znajduje się na fazie cewnika, biorąc pod uwagę jego zwężający się charakter.
16. Zwolnij zacisk z gumowymi butami. Cewnik powinien natychmiast wypełnić się krwią.
17. Napełnij otwarte probówki wirówkowe lub mikrorurki EDTA dla dzieci, umieszczając nie więcej niż 500 μL w każdym pojemniku zbiorczym.
18. Po wypełnieniu mikrorurek usuń cewnik PE-50 z tętnicy udowej, podwiązuj bliższy koniec i zamknij nacięcie przerwanym szwem prolenowym 5-0.
19. Jeśli krew ma być użyta później, umieść kapsle na napełnionych pediatrycznych sondach EDTA i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
20. Jeśli krzep ma być przygotowany do użycia tego samego dnia, przejdź do kroku 1.2 powyżej.
21. Natychmiast powtórz z pozostałymi rurkami wirówek.
22. Dawcy krwi tętniczej mogą być ponownie dołączani do wiwarium po wyzdrowieniu z znieczulenia, jeśli przeprowadzono jednostronne cewnikowanie. Przeciwległa tętnica udowa może zostać później zakateryzowana, ale po obustronnej cewnikowaniu tętnicy udowej dawcy powinni być uśpiewani zgodnie z przepisami IACUC.

5. TE-MCAo

UWAGA: Podejście TE-MCAo wykorzystuje standardowe cięcie tętnicy szyjnej wspólnej. Wybór znieczulenia i metody ograniczania zależy od użytkownika. Protokół zaczyna się w momencie, gdy chirurg już izolował tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) oraz tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA).

1. Odsłonij CCA i wycofaj za pomocą jedwabnej ligatury 3-0. Zrób to samo z ECA i ICA.
2. Za pomocą więzy lub kauteru odsłonić i zatkać tętnicę potyliczną.
3. Odsłonić i cofnąć lub zatkać tętnicę skrzydłowopodniebną (PPA).
   UWAGA: Po odpowiednim doświadczeniu ten krok można pominąć. Zalecamy zawsze wykonywanie tego kroku podczas nauki procedury.
4. Stosując delikatne wyciąganie, przesuń ECA i ICA w konfigurację "T".
5. Ligaturę CCA zawiązuj dopiero po zakończeniu wszystkich powyższych kroków.
6. Wykonaj arteriotomię w ECA (Zea Longa CCA otwarta metodologia¹⁰) za pomocą mikronożyczek.
7. Stosując metodę tępego fazowania opisaną w kroku 4.4.2, przygotuj końcówkę jednego z już załadowanych mikrocewników (średnica wewnętrzna: 0,2 mm, średnica zewnętrzna: 0,360 mm, długość: 300 mm, połączona z żeńskim zamkiem Luera).
8. Ostrożnie włóż mikrocewnik z wcześniej załadowanym zakrzepem do ECA. Poluzuj pętlę ograniczającą ICA i przesuń mikrocewnik wewnątrzczaszkowo do 16 mm w miejscu rozgałęzienia szyi pod bezpośrednią wizualizacją, aby uniknąć niezamierzonego wykanulowania pozaczaszkowego PPA.
   UWAGA: Jeśli cewnik woli wejść do CCA, delikatne ucisnięcie z kociastą bawełnianą końcówką może pomóc ukierunkować przesuwający się cewnik do ICA.
9. Przymocuj mikrocewnik śródświatłowy do ICA i CCA za pomocą jedwabiu 3-0, uważając, by nie przekręcić za bardzo.
10. Wstrzyknij 20 μL do strzykawki o pojemności 1 mL za pomocą zmotoryzowanej pompki strzykawkowej z częstotliwością 10 μL/min przez czas trwania 2 minut.
    UWAGA: Zazwyczaj pompa strzykawkowa nie przesuwa się na początku, dopóki nie pojawi się odpowiednie ciśnienie.
11. Wstrzyknij dodatkowe 20 μL bezpłodnej soli fizjologicznej przy tych samych ustawieniach pompy.
    UWAGA: Podczas badań przepływu krwi za pomocą obrazowania laserowego splamionego uzyskaliśmy 100% sukcesu przy płukaniu 20 μL.
12. Usuń mikrocewnik i trwale podwiązuj ECA szwem bliższym od miejsca arteriotomii. Usuń wszystkie pętle ograniczające. Dokładnie obserwuj ewentualne wycieki krwi i zabezpiecz dodatkowymi więzami, jeśli to konieczne.
13. Tymczasowo zamknij nacięcie skórne zszywkami lub przebiegającym szwem prolene 5-0.
14. Wyjmij zwierzę z narkozy i umieść je w ciepłej klatce do regeneracji.
15. Opcjonalnie: Laboratoria mogą stosować laserową przepływometrię Dopplera do potwierdzenia skutecznego zatkania MCA. Alternatywnie można wykonać obrazowanie rezonansem magnetycznym po 24 lub 48 godzinach, aby potwierdzić i ilościowo określić zawał mózgu.
    UWAGA: Wielu użytkowników woli podawać 1,5 ml soli fizjologicznej lub laktowanego roztworu Ringera podskórnie po zakończeniu operacji.

6. Tromboliza ogólnoustrojowa

UWAGA: Tenekteplaza (TNK, 1,5 mg/mL) może być zakupiona do stosowania jako tromboliza układowa. Użytkownicy mogą preferować inne środki lityczne. Pojedyncze fiolki po 50 mg są rekonstytuowane z 50 mL wody destylowanej, a następnie 2,5 mL jest precyzyjnie alicytowane do fiolek po 3,0 mL. Aliquoty można zamrażać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Stabilność rekonstytuowanego rekombinowanego aktywatora plazminogenu tkankowego przechowywanego w temperaturze -20 °C wynosi 60 dni¹¹.

1. Rozmroz jedną zamrożoną alikwotę TNK dla każdego podmiotu. Rozmrażaj w temperaturze pokojowej przez około 15 minut.
2. Używając strzykawki 1 cc, pobierz dokładnie 1,5 mg/kg. Na przykład szczur ważący 300 g będzie potrzebował 0,45 mg.
3. Ponownie znieczulić zwierzę i usunąć tymczasowe zamknięcie skóry.
4. Odsłonić dowolną gałąź żyły szyjnej zewnętrznej.
   UWAGA: Żyła ogonowa może być użyta, jeśli laboratorium czuje się bardziej komfortowo z tą drogą. Preferowaliśmy stosowanie żyły szyjnej, ponieważ chirurdzy SPAN lepiej radzą sobie z mobilizacją żyły szyjnej zewnętrznej, a w naszym modelu filamentu robi się to rutynowo.
5. Używając igły 30 lub 32 G, podaj TNK przez bezpośrednie nakłucie do żyły.
   UWAGA: Na początku użytkownicy mogą chcieć izolować żyłę pomiędzy 3-0 pętlami jedwabnymi. Z praktyką nie będzie to konieczne.
6. Zamknij nacięcie przerwanym prolenem 5-0 lub innym szwem niewchłanialnym.
7. Zwróć zwierzęta do klatki odzyskującej zgodnie z krokiem 5.14.

7. Metody statystyczne

1. Do tworzenia statystyk opisowych używaj średniej i odchylenia standardowego dla danych liczbowych o rozkładzie normalnym, a dla danych o rozkładzie nienormalnym mediany i interkwartylu. Przedstawiamy dane kategoryczne jako rozkłady częstotliwości. Do testowania hipotez stosuje się test t lub ANOVA w zależności od tego, co jest odpowiednie dla normalnie rozkładanych danych parametrycznych; W przeciwnym razie nie przeprowadzaj testowania hipotez.

Wyniki

Rysunek 1: Pobieranie krwi od zwierząt dawców i przygotowanie zakrzepu. Krew pobrano od dawcy przez cewnikowanie tętnicy udowej i przeniesiono do mikrowirówki z (może być przechowywana do 4 tygodni) lub bez EDTA (użycie tego samego dnia). Aby przygotować zakrzep, do przechowywanych rurek krwi dodano roztwór chlorku wapnia i natychmiast zasysał do cewnika PE-50. Zwinięta rurka PE-50 była inkubowana w podgrzanej soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 37°C przez 2 godziny w piecu stołowym. Po 2 godzinach rurka PE-50 wypełniona krwią została natychmiast przeniesiona do temperatury 4°C w celu przechowywania. Zobacz sekcję 1 protokołu, aby uzyskać więcej informacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Załadowanie zakrzepu do cewnika do wstrzyknięcia. (A) W dniu operacji MCAo zakrzep został wytłoczony z rurki PE-50 do szalki Petriego zawierającej PBS. (B) Na szalce Petriego krzep był przycięty do około 6 cm za pomocą żyletki. (C) Trombus był myty PBS przez wciągnięcie go do rury PE-50 i wypychanie 5 razy, a następnie 15 razy do rury PE-10. (D) Trombus został przeniesiony do szalki Petriego zawierającej skoncentrowany roztwór Evan's Blue. (E) Trombus został przeniesiony do szalki Petriego zawierającej rozcieńczony roztwór Evan's Blue i załadowany do prefabrykowanego mikrocewnika. (F) Mikrocewnik przesuwano przez wewnętrzną tętnicę szyjną szczura, aż 16 mm od czubka cewnika przeszło przez rozgałęzienie tętnicy szyjnej wspólnej i zostało wstrzyknięte za pomocą zmotoryzowanej pompy strzykawkowej. Zobacz sekcję 2 protokołu, aby uzyskać więcej informacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

W pilotażowym studium wykonalności zapisało się 135 uczestników w 6 laboratoriach badawczych. Chociaż uczestnicy zostali losowo przydzieleni do jednego z 8 terapii, przedstawiamy tutaj dane zbiorcze, aby zilustrować wykonalność modelu. Spośród 135 przyjętych osób, TNK podano w odpowiedniej dawce i czasie u 132 (98%). MRI wykonano 3 dni po TE-MCAo u 102 (75%) z powodu śmierci zwierząt przed badaniem u 33 (24%). Utrata zwierząt przed 3. dniem była spójna we wszystkich 6 laboratoriach (Tabela 1), co wskazuje, że model może być wdrożony w wielu lokalizacjach. Średnia wielkość zmian ± SD wynosiła 13 ± 16% (powierzchnia zmian obejmuje niedokrwienie i obrzęk jako procent półkuli ipsilateralnej), z pewną zmiennością w różnych laboratoriach (Tabela 2). Reprezentatywne obrazy MR oraz zatory pośmiertne można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym 1.

	Laboratorium
Zmienna	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Wielkość próby (N)	23	30	11	28	24	19
MRI wykonane	19	24	9	23	14	13

Tabela 1: Wykonalność według laboratorium. Laboratoria badawcze to Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) oraz Yale University (YL). Pokazano liczbę zarejestrowanych zwierząt (N) oraz liczbę tych, które przeżyły do badania MRI wykonane 3 dnia po udarze. Te dane wspierają wykonalność modelu.

Miejsce	Wielkość próby (N)	Średnia ilość zmian (%) ± SD	Indeks przesunięcia linii środkowej (%) Mean ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabela 2: Objętość zmian widocznych na rezonanse magnetycznym 3. dnia, według miejsc. Aby ustalić powtarzalność modelu w sześciu miejscach badań, porównano objętość zmian (niedokrwienie plus obrzęk) oraz przesunięcie linii środkowej. Objętość zmian wyraża się jako procent powierzchni półkuli ipsilateralnej. Przesunięcie linii środkowej wyraża się jako liniowy procent maksymalnej szerokości przestrzeni wewnątrzczaszkowej. Dane potwierdzają heterogeniczność w różnych laboratoriach.

Ilustracja uzupełniająca 1: Obrazy reprezentatywne. (A-E) Różne obrazy wieloecho i wieloskanowe (MEMS) mózgów szczurów wykonane 48 godzin po TE-MCAo. Przekroje mają około 1 mm przed bregmą. (F-J) Kilka przykładów zatoków zostało umieszczonych u źródła MCA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Dyskusja

Udoskonaliliśmy model udaru niedokrwiennego u zakrzepowo zakrzesowego do wykorzystania w wielolaboratoryjnej sieci badań przedklinicznych, SPAN. Znacznie zmniejszyliśmy liczbę zwierząt, opracowując metodę przechowywania krwi dawcy na później. Uprościliśmy również przygotowanie zakrzepów i chirurgii, aby ułatwić wykonanie kilku zabiegów MCAo w ciągu jednego dnia. Naszym celem jest, aby TE-MCAo osiągnął taki sam poziom komfortu użytkownika i objętości chirurgicznej, jak to możliwe w szeroko stosowanej nylonowej wersji MCAo. Aby osiągnąć ten wynik, zorganizowaliśmy dwa warsztaty szkoleniowe dla chirurgów stacjonarnych, a wszyscy chirurdzy zaangażowani w to badanie mieli już kilkamiesięczne, jeśli nie lata, doświadczenia z bardziej standardowym modelem filamentu. Wykazaliśmy wykonalność w sześciu różnych laboratoriach badawczych i wykazaliśmy doskonałe przestrzeganie protokołów.

Decydując się na wdrożenie tego protokołu, badacz powinien wziąć pod uwagę następujące czynniki decydujące o jego sukcesie. Po pierwsze, skrupulatna ostrożność przy pobieraniu krwi wpłynie na skuteczne powstawanie zakrzepa. Należy pobrać krew tętniczą, a nie żylną, aby zapobiec przedwczesnemu krzepnięciu. Po drugie, ważne jest, aby pobrać więcej krwi, niż wydaje się być potrzebne. Czasami jeden okaz nie udaje się w nocy krzepkować, podczas gdy pozostałe tak. Po trzecie, zdecydowanie zalecamy załadowanie cewnika za pomocą optycznego powiększenia, albo chirurgicznych lup z reflektorem, albo soczewki powiększającej z oświetleniem. Po czwarte, ostrożna i staranna sekcja CCA, ICA i ECA jest niezbędna, aby uniknąć pęknięć i zakrzepicy wewnątrznaczyniowej. Ponadto niezbędne jest zobrazowanie PPA, aby upewnić się, że cewnik prawidłowo wchodzi do ICA. Po piąte, rzadko obserwuje się jakiekolwiek negatywne skutki u gryzoni po wstrzyknięciu trombolitów. W naszych badaniach nie zaobserwowaliśmy żadnych działań niepożądanych, takich jak obrzęk naczynionaczyniowy czy krwawienia obwodowe, po wstrzyknięciu TNK. To nie znaczy, że to niemożliwe, ale nie jesteśmy świadomi żadnych doniesień o ogólnoustrojowych skutkach ubocznych trombolitów u gryzoni. Badacz decydujący się na wdrożenie tego protokołu po raz pierwszy może być zasugerowany konsultację z jednym z badaczy wymienionych tutaj jako współautor, ponieważ uznali my spersonalizowane instrukcje za bardzo pomocne.

Wybierając model choroby zwierzęcej do testowania terapii kandydatów, ważne jest, aby dokładnie przedstawić populację pacjentów, do której lek ma być przeznaczony. Modele ogniskowego udaru niedokrwiennego obejmują modele fotozakrzepotyczne Rose Bengal, zgryzanie tętnicy szykowej korowej oraz stereotaktyczne zastrzyki endotelliny-1 13,14,15. Modele te mają tę zaletę, że tworzą wysoce powtarzalne zmiany w przewidywalnych obszarach kory. Ta przewaga sprawia, że są one preferowane w badaniach mechanizmów komórkowych lub korelacji lokalizacji zmian z wynikami behawioralnymi. Dodatkowy koszt, złożoność i brak komponentu reperfuzyjnego sprawiają, że są one mniej przydatne do badań przesiewowych na narkotyki.

MCAo z monofilamentem śródświatłowym lub krzepozatowiem są uznanymi modelami wyboru dla okluzji dużych naczyń (LVO)10,16,17. Model monofilamentowy pokryty krzemem jest prosty w wykonaniu i szeroko stosowany. Chociaż lokalizacja i rozmiar zmiany są mniej przewidywalne, w testach na dużą skalę ta heterogeniczność jest postrzegana jako zaleta, ponieważ udary u ludzi są również dość zróżnicowane^18,19. Wadą metody monofilamentowej jest to, że okluzja jest biologicznie bezwładna. U pacjentów zakrzep i tromboliza wywołują kaskadę zapalną związaną z uwalnianiem trombiny, plazminogenu i innych elementów zakrzepowych 20,21,22. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wielu zaproponowało modele zakrzepowo-zatorowe w badaniach królików, świń, psów i naczelnych nieludzkich 23,24,25,26,27. Te badania są złożone i wymagają specjalistycznej wiedzy ogólnie. Niemniej jednak staraliśmy się dostosować model zakrzepowo-zatorowy do zastosowań w naszej wielolaboratoryjnej, przedklinicznej sieci testów. Wymagało to uproszczenia przygotowania zakrzepów, usprawnienia podejścia chirurgicznego oraz znacznego zmniejszenia liczby potrzebnych zwierząt. Opracowaliśmy model zakrzepowo-zatorowy, TE-MCAo, który można było z powodzeniem wdrożyć w sześciu różnych laboratoriach przy doskonałej zgodności protokołu (Tabela 1) i stosunkowo spójnym rozmiarze zmian (Tabela 2). Przepustowość była wystarczająca, średnio 6 osób tygodniowo.

Istnieje kilka kroków rozwiązywania problemów, które mogą okazać się przydatne. Niewydolność krwi do zakrzeplicy jest najczęstszym źródłem niezgodności protokołu i najczęściej wynika z zanieczyszczenia cewnika przygotowawczego EDTA lub heparyną, jeśli jest umieszczony na stole chirurgicznym. Zalecamy skrupulatną metodę zbierania danych. Zalecamy również przygotowywanie roztworu chlorku wapnia używanego do inaktywacji EDTA co tydzień lub co dwa tygodnie. Po elucii zakrzepa z cewnika przygotowawczego może być trudne pocięcie krzepka na wymagane fragmenty o średnicy 5 cm. Niektóre krzeple są delikatne i łatwo się łamią. Zalecamy przygotowanie zakrzepów z powiększeniem optycznym, a w skrajnych przypadkach przejście do innego zakrzepa dawcy. Aspiracja i elumacja zakrzepów wymaga umiarkowanego poziomu umiejętności; Dlatego zalecamy dość długi okres szkolenia. Upewnij się, że końcówka cewnika aspiracyjnego jest wolna od zaczepów, korzystając z optycznego powiększenia. Zakrzeple można wcisnąć w cewniku implantacyjnym – zalecamy delikatną naprzemienność "tam i z powrotem" między aspiracją a elucią. Dla chirurgów doświadczonych w typowym modelu filamentu MCAo, identyfikacja PPA może być kolejnym krokiem. Zdecydowanie zalecamy oznaczenie krzepów niebieskim cewnikiem, aby można było go śledzić i śledzić podczas wspinania się przez ICA. Bifurkację ICA/PPA można łatwo zlokalizować poprzez ostrożną, głęboką dysparację po ICA i jest niezawodnie lokalizowana głęboko w cienkiej gałęzi nerwu szyjnego wewnętrznego.

Ten protokół ma pewne ograniczenia. Do wykonania kaniulacji tętnic szyjnych u gryzoni potrzebny jest element umiejętności chirurgicznych. Jednak podobnie jest to z modelem filamentu. Obsługa zakrzepów krwi wymaga również umiejętności chirurgicznych. Jak we wszystkich modelach zakrzepowo-zatorowych, wskaźnik zawału jest niższy niż w modelu filamentowym. Jeśli celem badania są częstsze incydenty zawału, preferowany byłby model filamentu. Z drugiej strony, jeśli celem jest replikacja zakrzepu i trombolizy, to taki model jest pożądany.

Model ten przeznaczony jest do testowania kandydatów na środki ochrony mózgu z wykorzystaniem modelu wiernie wykorzystującego zakrzep i trombolizę. Przyszłe kierunki mogą obejmować także badania terapii adiuwantowej ukierunkowanej na zjawisko braku reflow. Wielu zaproponowało antykoagulanty i leki przeciwpłytkowe w tym celu.

Podsumowując, protokół TE-MCAo przedstawiony tutaj został dostosowany do możliwości wdrożenia w wielu laboratoriach. Uprościliśmy przygotowanie zakrzepów i usprawniliśmy podejście chirurgiczne. Opracowaliśmy metodę przechowywania krwi dawcy, co znacząco zmniejszyło liczbę potrzebnych zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml strzykawki	BD	309628
10x lupy
1cc strzykawka	Terumo	SS-01T
23g tępej igły	Grainger	5FVK7
3,0 cc strzykawka	BD	309656
Jedwabna ligatura 3-0
Igła 30g	BD	305128
Szew prolenowy 5-0	Ethicon	8698	Zamknąć ranę skórną
Jedwabna ligatura 5-0	Ethicon	A182
Zacisk na tętniaka
Siarczan atropiny	Vet One	NDC86136-006-10	Ogranicz wydzielanie oskrzeli
Szczypce z tępymi rowkami
Bupivacaine	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Znieczulenie miejscowe
Chlorek wapnia	Sigma	C7902
Karprofen	Zoetis Inc	NADA #141-199	Środek analgetyczny
Rurki wirówkowe	Eppendorf	22364111	Do pobierania krwi
Etanol	Koptec	UN1170
Evan' s Blue	Sigma	E2129
Poduszka grzewcza	Aparat Harvarda	K021-435
Zacisk hemostatyczny
Izofluran	Vet One	NDC13985-528-60
Made By Me Ultimate Weaving pętle	Grupy Horyzontów	Nie dotyczy	Miękkie kajdanki
Mikronożyczki	F.S.T.	15000-00
Mikrocewniki	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Prefabrykowane cewniki do zastrzyków
Cewnik PE-10	BD	427401
Rurka PE-100	Intramedyk	7426
Rurka PE-50	BD	427410
Pediatryczne rurki EDTA	BD Microtainer	K2E-363706	Przechowuj krew dawcy
Szalka Petriego	Eppendorf	30702115
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Fisher	B2438
Prevantics	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Środek odkażający
Patyczek higieniczny	VWR	89031-288
Żyletka	AccuTec Pro	71960
Sól fizjologiczna	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Nożyczki	F.S.T.	14958-11
Ostre kleszcze
Pompa strzykawkowa	New Era Pumps Inc.	BS-300
Piekarnik stołowy	Boekel	132000
Tenecteplaza (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	Tromboliza
Znacznik na uchu	RapID Lab, San Francisco, CA	Tagi RapID