Name: Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj protokół fluorescencyjnego znakowania struktur serca u larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia szczegółową analizę morfologiczną naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują S.I. Bernstein (San Diego State University) za krytyczne przeczytanie oraz pomocne sugestie dotyczące przygotowania niniejszego manuskryptu. Praca ta była finansowana z grantów NIH przyznanych S.I. Bernstein (SDSU) oraz R. Bodmer (BIMR), a także z stypendiów postdoktorskich przyznanych przez Western States Affiliate of the American Heart Association dla G. Vogler oraz A. Cammarato.

Przed rozpoczęciem
<ol>
 <li>Przygotować następujące roztwory: 
 <ol class="lalpha">
 <li>bufor relaksujący (sztuczna hemolimfa Drosophila (ADH) (patrz: „Visualizing the beating heart in Drosophila”) zawierająca 10 mM EGTA) </li>
 <li>utrwalacz (4% formaldehyd w 1x PBS)</li>
 <li>PBSTx (PBS zawierający 0,1% Triton-X-100)</li>
 <li>odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwotne oraz specyficzne gatunkowo, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne w PBSTx</li>
 </ol></li>
 <li>Przeprowadzić sekcję Drosophila w celu odsłonięcia rurek serca (much dorosłych i/lub larw) zgodnie z:
 <ol class="lalpha">
 <li>protokołem preparatyki pół-zachowawczego serca Drosophila opisanym w "Visualizing the beating heart in Drosophila", lub </li>
 <li>Drosophila protokołem sekcji NMJ larw1 z następującymi modyfikacjami: podczas sekcji larw należy stosować natleniony ADH i lekko przesunąć tylną szpilkę z linii środkowej brzusznej. Larwy należy przeciąć wzdłuż linii środkowej brzusznej. Nie usuwać żadnych tkanek przed utrwaleniem.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
Barwienie fluorescencyjne
<ol>
 <li>Sprawdzić, czy wszystkie serca biją rytmicznie w natlenionym ADH. Szybko zastąpić ADH buforem relaksującym. Zbadać każdą rurkę serca, aby upewnić się, że skurcze zostały zahamowane.</li>
 <li>Utrwalić serca, zastępując bufor relaksujący utrwalaczem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy delikatnym wstrząsaniu. (W przypadku preparatów larwalnych wstrząsanie na żadnym etapie nie jest konieczne i może zostać uznane za szkodliwe dla integralności tkanki serca).</li>
 <li>Przemyć preparaty trzykrotnie po dziesięć minut PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
 <li>W przypadku osobników dorosłych ostrożnie przyciąć brzuszne krawędzie kutykuli odwłoka tak, aby pozostały obszar miał kształt bardziej eliptyczny niż zaokrąglony. Dodatkowo, jednym cięciem pomiędzy odwłokiem a klatką piersiową, ostrożnie i precyzyjnie oddzielić oba segmenty ciała, dbając o minimalne uszkodzenie przedniej części serca. W przypadku serc larwalnych ostrożnie usunąć ciało tłuszczowe za pomocą precyzyjnej pęsety. Usuwanie tłuszczu musi być wykonane z najwyższą ostrożnością, ponieważ serce larwalne jest szczególnie kruche i ma bardzo małe wsparcie ze strony innych mięśni lub tkanki łącznej. Nie usuwać odnóg tchawkowych, gdyż może to uszkodzić serce.</li>
 <li>Przenieść przyciętą grzbietową część kutykuli odwłoka, chwytając za krawędzie i unikając kontaktu z centralnie położoną rurką serca, do płytki 96-dołkowej, w której dołki zawierają 50-100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBSTx. Umieścić nie więcej niż 12 preparatów w jednym dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy ciągłym mieszaniu. Inkubację można również przeprowadzić przez noc w temperaturze 4° C.</li>
 <li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć serca trzykrotnie po dziesięć minut 100 μl PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
 <li>Po usunięciu ostatniego buforu płuczącego dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego w PBSTx, uzupełnionego o Alexa594-falloidynę (1:1000). Inkubować przez jedną godzinę przy ciągłym wstrząsaniu w temperaturze pokojowej. Próbki powinny pozostać przykryte, aby zapobiec blaknięciu fluoroforu.</li>
 <li>Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym przemyć serca trzykrotnie po dziesięć minut 100 μl PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu. Próbki należy trzymać pod przykryciem przez cały czas trwania etapów płukania.</li>
 <li>W celu usunięcia Triton-X-100 przepłukać serca ostatni raz w 100 μl PBS przez 10 minut. Preparaty można przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C przez kilka dni przed montowaniem.</li>
</ol>
Montaż serc dorosłych osobników
<ol>
 <li>Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm do przedmiotu szkiełka za pomocą 10 μl medium montażowego Vectashield. Szkiełka nakrywkowe powinny być oddalone od siebie o około 10-15 mm. Umieść małą, trzecią kroplę medium montażowego pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi.</li>
 <li>Nanieś 20 μl Vectashield na środek trzeciego szkiełka nakrywkowego. </li>
 <li>Ostrożnie wyjmij każde z serc z roztworu płuczącego PBS, chwytając za krawędzie kutykuli, a następnie delikatnie ułóż je stroną serca do dołu na kropli medium montażowego na trzecim szkiełku nakrywkowym. Na jednej kropli na szkiełku nakrywkowym należy umieścić nie więcej niż pięć serc. </li>
 <li>Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie serca są skierowane do dołu. </li>
 <li>Ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe z sercami i szybko połóż je na przedmiocie szkiełka z parą szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kropla z cewkami serca połączyła się z kroplą Vectashield znajdującą się pomiędzy parą szkiełek. Szkiełka nakrywkowe powinny utworzyć „mostek”. Serca zostaną zawieszone pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a przedmiotem szkiełka. </li>
 <li>Sprawdź pod mikroskopem, czy serca są teraz skierowane do góry. </li>
 <li>Zabezpiecz krawędzie szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci. </li>
 <li>Serca są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. </li>
</ol>
Montowanie serc larwalnych
<ol>
 <li>Nanieść kroplę (~20 μl) Vectashield na szkiełko mikroskopowe.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść do Vectashield maksymalnie dwa okazy larw i ułożyć je stroną grzbietową do dołu, posługując się igłami wolframowymi.</li>
 <li>Przesunąć poszczególne okazy w medium montażowym tak, aby znajdowały się równolegle względem siebie.</li>
 <li>Umieścić szkiełka nakrywkowe po przeciwnych stronach okazu. Za pomocą pęsety nałożyć trzecie szkiełko nakrywkowe na wierzch, kładąc najpierw jedną jego krawędź na tylnej nakrywce, a następnie opuszczając je w stronę przedniej nakrywki, tworząc w ten sposób mostek. Siły kapilarne spowodują przepływ Vectashield z tyłu do przodu, co ułatwi prawidłowe ustawienie serca larwy.</li>
 <li>Utrwalić wszystkie szkiełka nakrywkowe na krawędziach za pomocą lakieru do paznokci i ostrożnie wypełnić przestrzeń między nakrywkami 20-30 μl Vectashield.</li>
 <li>Uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze 4°C, lub w temperaturze -20°C w przypadku przechowywania długoterminowego.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy i powiązane tkanki naczynia grzbietowego powinny pozostać nienaruszone i być łatwo widoczne. Fluorescencja tła powinna być minimalna. U osobników dorosłych brzuszna warstwa mięśni podłużnych barwi się bardzo dobrze i generuje silny sygnał (Rysunek 1 i Rysunek 2). Leżące pod nią koliste kardiomiocyty mają jednak tendencję do generowania słabszego sygnału niż nadrzędna warstwa brzuszna. Miocyty przedniej „komory stożkowej” serca dorosłego osobnika zawierają znaczną ilość materiału kurczliwego, w związku z czym obszar ten wydaje się najbardziej wyraźny w porównaniu z pozostałą częścią rurki serca. Serce larwalne wykazuje spiralną strukturę miofibrylarną podobną do tej, którą mają kurczliwe kardiomiocyty osobników dorosłych (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Rysunek 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Rysunek 1b" /> Rysunek 1: Góra. Mikrografia fluorescencyjna przedstawiająca całą rurkę serca dorosłej Drosophila melanogaster wykazującej ekspresję miozyny-GFP. Obraz wykonano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Imager Z1 wyposażonego w moduł przesuwny Apotome. Miozyna-GFP jest widoczna w kolorze zielonym, aktyna została zabarwiona falloidyną AlexaFluor® 594 (kolor czerwony), a α-aktynina została oznakowana przeciwciałem anty-α-aktyninowym (kolor niebieski). Należy zauważyć, że procedura preparatywna pozwala na odzyskanie próbek serca o dobrze zachowanych strukturach. CC = komora stożkowa; AM = mięsień alarny; V = zastawka wewnętrzna; VLL = brzuszna podłużna warstwa mięśniowa. Dół. Odcinek rurki serca dorosłego osobnika od CC przez 3. segment brzuszny serca, tuż pod brzuszną warstwą podłużną, ukazujący spiralną strukturę miofibryli kurczliwych kardiomiocytów. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję Rysunku 1a, oraz <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1b
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Rysunek 2" /> Rysunek 2: Reprezentatywne serie obrazów konfokalnych przedniej części dorosłego serca barwionej faloidyną AlexaFluor® 594 (czerwony) oraz przeciwciałem anty-perikardyna (kolagen typu IV) (zielony). Perikardyna wiąże się z sercem wzdłuż powierzchni brzusznej, prawdopodobnie wywodząc się z podłużnie zorientowanych miofibryli brzusznej warstwy mięśniowej. Aby zobaczyć większą wersję rysunku 2, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">kliknij tutaj</a>.
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Rycina 3" /> Rycina 3: Mikrografia fluorescencyjna segmentu A7 właściwego serca larwy Drosophila w trzecim stadium. Obraz wykonano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Imager Z1 wyposażonego w moduł przesuwny Apotome. Aktyna została znakowana faloidyną AlexaFluor® 594 (kolor zielony), a α-aktynina została zabarwiona przeciwciałem anty-α-aktyniną (kolor czerwony). Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 3.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster%22">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster</a>. , Wiley. New York. (1950).</li>
<li>Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).</li>
<li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function%2C+myofibril+structure%2C+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li>
<li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li>
<li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przydatny do przygotowania i barwienia naczynia grzbietowego oraz tkanek towarzyszących u Drosophila melanogaster w celu obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Przedstawiamy zwięzły opis kroków dopracowanych i powszechnie stosowanych w naszym laboratorium w celu skutecznego barwienia, które umożliwia wysokorozdzielcze obrazowanie in situ rurek serca larwalnych i dorosłych osobników Drosophila. Inne metody o podobnym charakte...

<table><tbody><tr><td>Glikol etylenowy-bis (2-amino-etyloeter) -N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra-kwas octowy (EGTA)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, wolny od metanolu, Ultra Pure</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; falloidyna 594</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;#174; medium montażowe do fluorescencji z DAPI</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Odczynnik</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do igieł</td><td>Odczynnik</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne znakowanie struktur serca drosophila

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

TheDrosophila melanogasternaczynie grzbietowe, czyli serce, jest strukturą rurkowatą składającą się z pojedynczej warstwy kurczliwych kardiomiocytów, komórek osierdzia ułożonych wzdłuż każdej ze ścian serca, wspierających mięśni skrzydełek oraz, u osobników dorosłych, warstwy brzusznych komórek mięśni podłużnych. Włókna kurczliwe zawierają konserwowane składniki cytoarchitektury mięśniowej, w tym gęsto upakowane pęczki miofibryli oraz kompleksy białek cytoszkieletowych i podbłonowych, które oddziałują z homologicznymi komponentami macierzy zewnątrzkomórkowej. W niniejszym dokumencie opisujemy protokół fiksacji i znakowania fluorescencyjnego wybranych elementów mięśnia sercowego z serc wypreparowanych larw oraz częściowo nienaruszonych osobników dorosłychDrosophilaW szczególności demonstrujemy znakowanie sarkomerycznej F-aktyny oraz α-aktyniny w sercach larwalnych. Dodatkowo przeprowadzamy znakowanie F-aktyny i α-aktyniny u dorosłych much wykazujących ekspresję miozyny-GFP, a także znakowanie α-aktyniny i perikardyny, kolagenu macierzy pozakomórkowej typu IV, w sercach dorosłych osobników typu dzikiego. Szczególną uwagę poświęcono strategii montowania półzachowanych serc dorosłych, która minimalizuje manipulacje i optymalizuje szanse na zachowanie integralności rurek serca oraz powiązanych z nimi tkanek. Preparaty te nadają się do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Ogólnie rzecz biorąc, procedura ta pozwala na staranną i szczegółową analizę cech strukturalnych serca w potężnym, podatnym na modyfikacje genetyczne modelu systemowym.

W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Naczynie grzbietowe, czyli serce muchy *Drosophila melanogaster*, jest strukturą rurkowatą składającą się z pojedynczej warstwy kurczliwych kardiomiocytów, komórek osierdziowych...

Cześć, jestem Nikita Ari z laboratorium Ralph Boer w programie Rozwoju i Starzenia w Instytucie Badań Medycznych Burnham. Jestem Gil, również z tego laboratorium. Dzisiaj przedstawimy procedury fluorescencyjnego znakowania struktur serca płodowego i dorosłego szczura.Stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu przygotowania cewek serca do analizy morfologicznej i strukturalnej za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej, aby znakować fluorescencyjnie struktury serca u dorosłych osobników Drosophila. Najpierw należy wykonać pojedyncze cięcie między klatką piersiową a odwłokiem u częściowo nienaruszonej dorosłej muchy, aby oddzielić segmenty ciała. Następnie należy przyciąć wystające brzuszne krawędzie kutykuli osobnika dorosłego.Następnie przenieść i oznakować osobniki dorosłe lub wypreparowane larwy za pomocą przeciwciał pierwotnych i wtórnych. Po oznakowaniu zamocować wypłukane osobniki dorosłe, trzymając krawędzie kutykuli i kładąc je stroną serca do dołu na kropli Vector Shield na szkiełku nakrywką, a następnie odwrócić szkiełko nakrywkę na kroplę medium, flankowaną przez dwa szkiełka nakrywkowe na preparacie, aby utworzyć pomost. Serca pozostaną w ten sposób zawieszone pionowo. W celu montażu serc larwalnych.Przenieś okazy na szkiełko przedmiotowe stroną brzuszną do dołu i zamocuj dwa szkiełka nakrywki po obu stronach szkiełka. Na koniec utwórz mostek z trzecim szkiełkiem nakrywkowym, kładąc je najpierw na szkiełku nakrywce w pobliżu końców tylnych larw. Serca są teraz gotowe do obrazowania.Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować bufor relaksacyjny A DH zawierający A DH zgodnie z opisem w innym protokole wideo z tej serii, z fiksatywem EGTA 10 mM składającym się z 4% formaldehydu w 1X-P-B-S-P-B-S, TX, a także odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwotne i znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne. W PBS TX należy przeprowadzić sekcję dorosłych much oraz larw drosophila w celu odsłonięcia rurek sercowych, stosując metodę półintegralnej preparatyki serca drosophila przedstawioną w protokołach wideo „Visualizing the beating heart in drosophila” oraz „Drosophila larval NMJ dissection protocol”. Z modyfikacjami: podczas sekcji larw należy stosować natleniony A DH i nieco przesunąć tylne piny względem brzusznej linii środkowej larwy.Przetnij wzdłuż linii środkowej brzusznej. Nie usuwaj żadnej tkanki przed utrwaleniem w kolejnych krokach. Rozpocznij procedurę znakowania, sprawdzając pod mikroskopem, czy wszystkie serca rytmicznie się kurczą i rozkurczają w napowietrzonym A DH. Następnie szybko zastąp A DH buforem relaksującym i ponownie zbadaj każdą rurkę serca, aby upewnić się, że skurcze zostały zahamowane.Następnie należy utrwalić serca, zastępując bufor relaksacyjny utrwalaczem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy łagodnym wstrząsaniu. Należy pamiętać, że w przypadku preparatów z larw wstrząsanie nie jest konieczne na żadnym etapie i może nawet zaszkodzić integralności tkanki serca.Po 20 minutach usunąć utrwalacz i trzykrotnie przemyć okazy w P-B-S-T-X, płucząc je za każdym razem przez 10 minut. W temperaturze pokojowej, przy ciągłym wstrząsaniu w przypadku osobników dorosłych, wykonać jedno ostrożne i czyste cięcie między odwłokiem a klatką piersiową. Rozdzielić oba segmenty ciała, aby zapewnić minimalne uszkodzenie przedniej części serca.Należy uważać, aby nie przeciąć przedniego odcinka brzusznego, w którym znajduje się stożkowa komora serca. Obejrzyj preparat pod mikroskopem, aby upewnić się, że cięcie jest czyste. Następnie ostrożnie przytnij wystające brzuszne krawędzie kutikuli brzusznej tak, aby pozostały fragment miał kształt bardziej eliptyczny niż okrągły.W przypadku serc larwalnych, używając pęsety anatomicznej, ostrożnie usuń ciało tłuszczowe. Czynność tę należy wykonywać z najwyższą ostrożnością. Ponieważ serce larwy jest szczególnie delikatne i ma bardzo małe podparcie w postaci innych mięśni lub tkanki łącznej, nie usuwaj odgałęzień tchawkowych, gdyż może to uszkodzić serce.Następnie inkubuj z przeciwciałem pierwotnym, rozcieńczonym w PVS TX i naniesionym w ilości 50 µL na dołek płytki 96-dołkowej. W przypadku dorosłych much uchwyć przycięty kutikula grzbietową za krawędzie, nie dotykając znajdującej się w centrum rurki serca, i przenieś ją na płytkę. Umieść nie więcej niż 12 okazów w jednym dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny przy ciągłym mieszaniu.Chwyć osobniki larwalne za krawędź za pomocą pęsety i przenieś do dołka wypełnionego roztworem P-B-S-T-X. Ponownie przypominamy, aby nie wstrząsać osobnikami larwalnymi po zakończeniu inkubacji. Usuń roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.Serca należy przemyć trzykrotnie przez 10 minut każdorazowo, używając 100 µL P-B-S-T-X w temperaturze pokojowej; po ostatnim przemyciu należy dodać 100 µL przeciwciała wtórnego w PBS tx uzupełnionym o Alexa 594 Phin. Od tego momentu próbki należy trzymać przykryte, aby zapobiec blaknięciu fluoroforu, i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy usunąć roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć serca trzykrotnie przez 10 minut każdorazowo, używając 100 µL P-B-S-T-X w temperaturze pokojowej.Na koniec usuń TRITTON X 100, płucząc serca w 100 µL PBS przez 10 minut. Próbki można przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C przez kilka dni przed montowaniem. Najpierw przygotuj szkiełko do montowania.Nanieś trzy równomiernie rozmieszczone krople po 10 µL medium montażowego Vector Shield na szkiełko preparatu. Umieść dwa szkiełka nakrywki o wymiarach 18 by 18 mm na zewnętrznych kroplach, zachowując między nimi odstęp około 10 do 15 mm.Dodatkowo, nanieś 20 µL vector shield na środek trzeciego szkiełka nakrywki. Następnie chwyć wypreparowaną dorosłą muchę za krawędzie kutykuli. Aby ostrożnie wyjąć ją z roztworu piorącego PVS, delikatnie połóż ją stroną serca do dołu na kropli medium montażowego na trzecim szkiełku nakrywce, umieszczając nie więcej niż pięć serc na jedną kroplę na szkiełku.Po umieszczeniu serc w kropli znajdującej się na szkiełku nakrywkowym, sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie serca są skierowane w dół. Teraz ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe z sercami i szybko połóż je na szkiełku podstawowym, trzymając parę szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kropla z odwróconego szkiełka nakrywkowego zawierająca rurki sercowe połączyła się z kroplą tarczy wektorowej spoczywającą w przestrzeni między szkiełkami nakrywkowymi. Połączone w ten sposób trzy szkiełka nakrywkowe tworzą mostek.Serca zostaną zawieszone pomiędzy środkowym szkiełkiem podstawowym a mikroskopem. Wsunąć pod mostek i sprawdzić pod mikroskopem, czy serca dorosłych much są skierowane ku górze, używając do tego lakieru do paznokci. Przymocować szkiełka podstawowe na krawędziach.Serca są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Aby zamocować serca larwalne, nanieś za pomocą precyzyjnej pęsety kroplę około 20 µL medium BTA shield na szkiełko przedmiotowe. Chwyć larwę za brzegi kutykuli i ostrożnie przenieś ją do kropli.Uorientuj larwy grzbietową stroną do dołu, używając igieł wolframowych. Umieść do dwóch larw na jednym szkiełku. Następnie przesuń każdy okaz poza medium montażowe i ustaw larwy równolegle.Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywowe po każdej stronie wyrównanych serc. Umieść trzecie szkiełko nakrywowe na górze, kładąc najpierw jedną jego krawędź na przednim szkiełku, a następnie opuszczając je na tylne szkiełko. W ten sposób powstanie mostek.Siły kapilarne spowodują przepływ medium Vector Shield z tyłu do przodu, co ułatwi prawidłowe ustawienie serca larwalnego. Na koniec należy przymocować wszystkie szkiełka nakrywki na krawędziach za pomocą lakieru do paznokci, a następnie ostrożnie wypełnić przestrzeń między szkiełkami nakrywkami od 20 do 30 µL Vector Shield, uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkoterminowego przechowywania lub w temperaturze -20 °C w przypadku dłuższego okresu. Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy i powiązane tkanki naczynia grzbietowego powinny pozostać nienaruszone i być łatwo widoczne.Fluorescencja tła u osobników dorosłych powinna być minimalna. Brzuszna warstwa mięśni podłużnych barwi się bardzo dobrze i generuje wyraźny sygnał. Jednakże leżące pod nią okrężne kardiomiocyty mają tendencję do wytwarzania sygnału o mniejszej intensywności niż ten pochodzący z powyższej warstwy brzusznej.Miocyty przedniej komory stożkowatej dorosłego serca zawierają znaczną ilość materiału kurczliwego, w związku z czym obszar ten wydaje się najsilniej rozwinięty w porównaniu z pozostałą częścią rurki serca. Obraz serca larwalnego wykazuje spiralne ułożenie miofibryli. Podobnie jak w przypadku kurczliwych kardiomiocytów dorosłych, zaprezentowaliśmy właśnie protokół przygotowania i barwienia serc owalnych do mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ograniczyć wszelkie zbędne manipulacje. Zapewni to lepsze zachowanie nienaruszonej struktury serca. Niniejszy protokół stanowi jedynie punkt wyjścia.Podobnie jak w przypadku każdej innej immunohistochemii, różne przeciwciała wymagają różnych warunków i muszą zostać zoptymalizowane indywidualnie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w barwieniu.

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Protokół sekcji serca i obrazowania fluorescencyjnego Drosophila upraszcza badanie struktury i patologii serca. Podejście to obejmuje proste cięcie, barwienie i obrazowanie, z pominięciem wiedzy technicznej potrzebnej do tradycyjnej sekcji. Zwiększa to dostępność, dzięki czemu Drosophila jest modelem szerzej wykorzystywanym do badań związanych z sercem w szerszej społeczności naukowej.

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Poznaj protokół fluorescencyjnego znakowania struktur serca u larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia szczegółową analizę morfologiczną naczyń krwionośnych.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Przeglądaj więcej filmów