Praktyczne podejście do genetycznego indukowanego mapowania losu: wizualny przewodnik po oznaczaniu i śledzeniu komórek in vivo

Mapy losów są generowane poprzez oznaczanie i śledzenie komórek in vivo w celu określenia, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do określonych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się i dorosłych. Postępem w tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losu lub GIFM łączące ekspresję genów, siarczany i zachowania komórek in vivo w celu stworzenia map losu opartych na linii genetycznej. Cześć, nazywam się Deborah Ellisor i pracuję na Wydziale Biologii Molekularnej, Biologii Komórki i Biochemii na Uniwersytecie Browna.

Dzisiaj moi koledzy Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown i ja zademonstrujemy procedurę mapowania genetycznie indukowanego losu. Używamy tej procedury w laboratorium do badania wczesnego rozwoju mózgu. Możemy również zastosować tę technikę do badań nad inaktywacją genów i zwierzęcych modeli chorób u ludzi.

Zacznijmy więc od zarodków E-R-M-G-F-P. MGFP LAE jest allelem reporterowym obecnym we wszystkich komórkach reprezentowanych przez szare owale X cre, er, gdzie X reprezentuje elementy regulatorowe genów. Kontrolowanie ekspresji C ER jest przestrzennie ograniczone do domeny ekspresji genu X pokazanej na niebiesko, a białko CRE ER jest sekwestrowane w cytoplazmie przez HSP 90.

W przypadku braku tamoksyfenu, reporter będzie wyłączony. Podanie tamoksyfenu powoduje zmapowanie losu komórek w domenie X, ponieważ CER jest uwalniany z HSP 90, przemieszcza się do jądra i usuwa kasetę stop z allelu reporterowego. Trwała i dziedziczna rekombinacja zapewnia, że komórki konstytutywnie wyrażają MG FP LA Z. Połączenie allelu reporterowego CER i tamoksyfenu powoduje znakowanie, gdy populacja komórek jest początkowo oznaczana w pierwotnym regionie mózgu zarodka na podstawie ekspresji genów, te zmapowane w losie komórki są śledzone nawet po wygaśnięciu początkowej ekspresji genu używanego do napędzania CER.

W ten sposób. Ostateczna dystrybucja i końcowy los genetycznie zdefiniowanej linii komórkowej można zidentyfikować u osoby dorosłej. Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania roztworu tamoksyfenu o stężeniu 20 miligramów na mililitr łodygi, rozpuszczenia 200 miligramów tamoksyfenu w 10 mililitrach przedwojennego oleju kukurydzianego w szklanej fiolce do inhalacji.

Następnie inkubuj roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny na wirze Tatora. Przygotowany roztwór podstawowy tamoksyfenu należy okresowo chronić przed światłem, owijając fiolkę folią i przechowując ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zapas może być używany przez okres do jednego miesiąca.

Do eksperymentów mapowania losu należy ustalić parę hodowlaną składającą się z dzikiej szwajcarskiej samicy Webster i samca typu dzikiego, będących nosicielami zarówno allelu CreER specyficznego dla genu, jak i allelu reporterowego. Na potrzeby tej demonstracji użyjemy wygranej do jednego samca CreER MG FP. Każdego ranka sprawdzaj szwajcarską samicę Webster, czy nie ma czopa dopochwowego.

Oznaczyć poranek w dniu czopa dopochwowego jako 0,5 dnia po cotus i obliczyć datę podania tamoksyfenu. Opierając się na tym punkcie wyjścia w tym eksperymencie, tamoksyfen zostanie podany w 8,5 dniu embrionalnym. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki z igłą do karmienia zwierząt pobrać 200 mikrolitrów roztworu łodygi tamoksyfenu.

Mocno utrzymaj ciężarną szwajcarską samicę Webster, chwytając za włos szyi i pleców, aby unieruchomić głowę i obrócić mysz tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry. Trzymaj ogon między wolnymi palcami, aby utrzymać ciało w linii prostej. Następnie umieść igłę do karmienia w kąciku ust i delikatnie prowadź igłę równolegle do podniebienia, aż końcówka igły do karmienia znajdzie się mniej więcej w pozycji oka.

Delikatnie odchyl głowę do tyłu, aby uzyskać dostęp do przełyku. Prowadź igłę obok nagłośni i w dół przełyku w kierunku żołądka. Uważaj, aby nie dostać się do tchawicy.

Gdy igła do karmienia znajdzie się w żołądku, należy podać tamoksyfen i usunąć igłę. Następnie zwróć samicę do jej domowej klatki do dnia sekcji. W dniu sekcji zarodki E 12,5 pochodzące od ciężarnej samicy w czasie są poddawane sekcji, a następnie oceniane pod kątem oznakowania GFP.

W zarodku z dodatnim GFP obserwujemy, że neurony pochodzące z wiatru pierwszego przyczyniają się do budowy śródmózgowia, rozpieszczania tylnej części mózgu i rdzenia kręgowego. Reporter MG FP oznacza projekcje aksonalne, które można również zobaczyć przenosząc zarodki, które są dodatnie dla GFP, montując w domu na szalkę Petriego zawierającą PPS i fotografując je za pomocą ramki na zdjęcia Po sfotografowaniu zarodków użyj kleszczy, aby uszczypnąć mały kawałek ogona z każdego zarodka i umieść każdy kawałek w probówce do PCR. Tkanki zostaną zgenotypowane za pomocą PCR dla obu alleli w celu potwierdzenia wyników uzyskanych za pomocą analizy całego wierzchowca.

Poniższe procedury pozwalają nam przeanalizować, w jaki sposób oznaczone komórki pochodzące z regionów embrionalnych zasiedlają mózg dorosłego człowieka przed rozpoczęciem kraniotomii. Potwierdzone przez uszczypnięcie palca u nogi, że mysz jest w pełni innu. U osób z nembutalem wykonuje się nacięcia, aby uzyskać dostęp do serca przez klatkę piersiową.

Następnie umieść igłę motylkową w wierzchołku lub lewej komorze serca i zabezpiecz zaciskiem C. Za pomocą nożyczek stwórz miejsce wydostania się płynu w prawym przedsionku, a następnie przelej 10 do 15 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej, aż płyn będzie czysty. Następnie od 20 do 25 mililitrów 4% aldehydu paraformowego.

Po zakończeniu obfitości wewnątrzsercowej usuń głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż nad ramionami. Przesuń skalpel wzdłuż grzbietowej linii środkowej głowy, rostral de cottle, aby przeciąć skórę głowy i odsłonić czaszkę S. Za pomocą skalpela zeskrob nadmiar tkanki lub mięśni z boku i z tyłu czaszki.

Za pomocą kleszczy nakłuj czaszkę w linii środkowej, po prostu przyłóż rostral do opuszki węchowej i utwórz mały otwór, w którym pomieszczą się końcówki cienkich nożyczek. Włóż cienkie nożyczki do tego otworu i wykonaj dwa obustronne nacięcia od linii środkowej wzdłuż długości opuszki węchowej. To cięcie złamie czaszkę na przecięciu kości nosowej i kości czołowej i zapewni dobry dostęp nożyczkom.

Przetnij wzdłuż szwów strzałkowych w czaszce, upewniając się, że końcówki nożyczek są ustawione pod kątem od mózgu, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki. Następnie delikatnie chwyć czaszkę kleszczami i oderwij kość wzdłuż przyśrodkowego nacięcia, aby odsłonić mózg. Czaszka może odłupywać się na małe kawałki lub odłamywać się w większych częściach.

Kontynuuj używanie kleszczy, aby usunąć wszystkie czołowe kości ciemieniowe, międzyciemieniowe i potyliczne. Uwolnij para oculi znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku, delikatnie ściskając kuliste kości z każdej strony. Użyj nożyczek, aby ostrożnie przeciąć grzbietową część kości otaczającej pień mózgu.

Włóż jedną stronę nożyczek tuż pod grzbietową krawędzią kości, zaczynając od miejsca, w którym przecięto rdzeń kręgowy i przecinając w kierunku móżdżku. Aby uwolnić pień mózgu i móżdżek. Usuń pozostałą kość z okolic pnia mózgu za pomocą kleszczy.

Delikatnie odciągnij kości, odwróć głowę grzbietową stroną do dołu i użyj kleszczy, aby przeciąć nerwy czaszkowe i uwolnić mózg z czaszki. Umieść mózg na szalce Petriego z lodem. Zimny PPS Oceń mózg dorosłego człowieka pod kątem oznaczania GFP, używając fluorescencyjnej lunety preparacyjnej i sfotografuj za pomocą ramki na zdjęcie.

W tym przykładzie śródmózgowie jest oznaczone GFP oprócz jego wykorzystania do analizy linii podczas embriogenezy, a w dorosłym GIFM może być łączone z innymi zastosowaniami powszechnie stosowanymi w biologii rozwojowej, takimi jak mikropreparacja i eksperymenty z eksplantatem tkanek. Na przykład brzuszne śródmózgowie jest strefą progenitorową dla rozwoju neuronów dopaminowych, które wyrażają gen wiatru. W ten sposób wyizolowanie brzusznego śródmózgowia za pomocą mikropreparacji pozwala na ustalenie warunków in vitro w celu dalszego zbadania jego rozwoju.

Jest to tylko jeden z przykładów wykorzystania GIFM do wyizolowania strefy zainteresowania przodków zdefiniowanej na podstawie historii genetycznej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przenieść wcześniej zidentyfikowane zarodki z dodatnim wynikiem GFP do lodowatego sterylnego PBS w naczyniu do hodowli komórkowych za pomocą cienkich nożyczek. Usuń część głowy zarodka, przecinając poprzecznie rozpieszczony do rommy.

Następnie usuń rostralną część głowy za pomocą koronalnego przecięcia przez głow. Spowoduje to odsłonięcie struktury przypominającej rurkę, w której czwarta komora przez pęcherzyk mezocefaliczny tworzy kanał między tkankami grzbietowymi i brzusznymi. Ostrożnie włóż końcówki nożyczek do czwartej komory i przetnij wzdłuż grzbietowej linii środkowej rozpieszczonej do rostralu, całkowicie otwierając rurkę, tworząc otwartą książkę do przygotowania.

Brzuszne śródmózgowie będzie teraz odsłonięte przyśrodkowo. Podczas gdy dwie połówki grzbietowe śródmózgowia będą znajdować się po bokach, może być konieczne usunięcie pozostałej tkanki nienerwowej pod brzusznym śródmózgowiem. Aby plan leżał płasko, powinien teraz przypominać motyla, u którego śródmózgowie grzbietowe reprezentuje skrzydła, a skrzeplina tylko jeden ogon.

Aby dodatkowo wyizolować brzuszne śródmózgowie do analizy faksowej lub eksperymentów z hodowlą komórkową, usuń boczne aspekty tkanki. Teraz pokażemy kilka reprezentatywnych wyników GIFM. W tym eksperymencie komórki wyrażające ekspresję WINT one oznaczone jako E 8,5 są wizualizowane w celu określenia, w jaki sposób komórki bezpośrednie wint one przyczyniają się do struktur nerwowych w całym rozwoju.

Na przykład jeden zarodek C EER MG FP w E 12,5 wykazuje fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części mózgu i rdzeniu kręgowym w dużym powiększeniu, widoczne są unerwione drobne projekcje neuronalne. Komórki oznaczone w śródmózgowiu, ścianie ciała, kończynach i twarzach czaszki można również wizualizować i analizować na poziomie komórkowym za pomocą immunohistochemii. Jak pokazano na tym przekroju optycznym o grubości jednego mikrometra zarodka E 12,5 oznaczonego przez podanie tamoksyfenu w E 8,5, znakowanie przeciwciał jądrowych beta galakto na czerwono i znakowanie przeciwciał GFP na zielono wskazuje na zmapowane komórki losu pokazane w brzusznej części śródmózgowia.

Tutaj połączyliśmy komórki, które są podwójnie dodatnie ze względu na naturę warunkowego reportera MGFP w dorosłym mózgu. Gęstość dojrzałej tkanki może przesłaniać fluorescencję GFP emanującą z wewnętrznych struktur mózgu. W związku z tym mikroskopia fluorescencyjna całego wierzchowca ujawnia tylko słabą fluorescencję GFP w górnej izolacji pod izolacją osoby dorosłej oceniającej wygraną.

Jedna linia oznaczona jako E 8.5 na dorosłych odcinkach z mikroskopią w małym powiększeniu ujawnia, że pierwsza linia WIN daje początek strukturom śródmózgowia, w tym górnemu i dolnemu cui. Na tym obrazie w większym powiększeniu, wykonanym z brzusznego śródmózgowia w pobliżu neuronów dopaminergicznych, jądrowe komórki beta cal-dodatnie i bogaty splot aksonalny GFP dodatni można zobaczyć w kontraście znakowanie na E 9,5, co skutkuje znacznym znakowaniem GFP, które można łatwo zaobserwować w dolnej części śródmózgowia przez fluorescencję całej góry. Jedna linia WINT oznaczona jako E 9.5 na odcinkach dorosłych jest skoncentrowana w dolnym kaulu, co widać pod mikroskopem w małym powiększeniu.

Na tym obrazie w większym powiększeniu, wykonanym z brzusznego śródmózgowia w neuronach dopaminergicznych, można zobaczyć komórki dodatnie jądrowego żelu beta i bogaty splot aksonalny GFP dodatni. Tak więc, podczas gdy pierwsze neurony pochodne oznaczone jako E 8,5 w porównaniu z E 9,5 są stopniowo ograniczane w przyczynianiu się do grzbietowego śródmózgowia. Jedna linia WIN nadal przyczynia się do rozwoju brzusznej części śródmózgowia.

Właśnie pokazaliśmy Ci procedurę mapowania genetycznego indukowanego losu w celu oznaczania i śledzenia linii komórkowych in vivo. Dzięki temu możemy oznaczać komórki na podstawie ich linii genetycznej i śledzić je w czasie, nawet po wygaszeniu ekspresji genów. Wykazaliśmy, że tamoksyfen podawany w dawce ośmiu i pół roku przyczynia się do rozwoju śródmózgowia oprócz całego śródmózgowia u osoby dorosłej.

W przeciwieństwie do tego, podawanie tamoksyfenu w dawce dziewięciu i pół dawki, gdy jedna domena zostaje ograniczona, powoduje bardziej ograniczony wkład w rozwijającą się śródmózgowienie podczas embriogenezy, która utrzymuje się do osoby dorosłej. Wykonując tę procedurę, należy wziąć pod uwagę, że system oznacza komórki mozaikowo, a zatem nie każda komórka w określonej strukturze może być oznaczona. Jest to prawdopodobnie spowodowane używaną linią CRE er lub warunkowym allelem reporterowym.

Co ważne, chociaż znakowanie komórek jest mozaikowe, wzór i rozmieszczenie komórek mara jest wysoce powtarzalne. Stwierdziliśmy, że podawanie tamoksyfenu przez zgłębnik doustny jest korzystne w porównaniu z podawaniem przez wstrzyknięcie międzyotrzewnowe, ponieważ minimalizuje stan zapalny w przestrzeni międzyotrzewnowej, a także mechaniczne uszkodzenie zarodków. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.