Name: Praktyczne podejście do genetycznego indukowanego mapowania losu: wizualny przewodnik po oznaczaniu i śledzeniu komórek in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj technikę GIFM do oznaczania i śledzenia komórek in vivo w zarodkach myszy E12.5. Metoda ta umożliwia badanie pochodzenia genetycznego komórek w rozwoju mózgu i modelowaniu chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni S. Arber za myszy mGFP oraz członkom laboratorium Zervas za krytyczne przeczytanie artykułu i pomoc techniczną. A. Brown otrzymał wsparcie w ramach Brain Science Kaplan Summer Graduate Research Award. E. Normand otrzymała wsparcie w ramach Brain Science Program Graduate Research Award. Badania te były finansowane również z funduszy na rozpoczęcie działalności badawczej (MZ).

Przygotowanie tamoksyfenu i procedura gavage'u doustnego (E8.5)
<ul>
 <li>Przygotuj roztwór zapasowy tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając tamoksyfen w uprzednio ogrzanym oleju kukurydzianym.</li>
 <li>Inkubuj roztwór w temperaturze 37° C przez 2 godziny na nutatorze, okresowo mieszając w wortexie.</li>
 <li>Chroń roztwór zapasowy tamoksyfenu przed światłem, przechowuj w temperaturze 4°C i zużyj w ciągu maksymalnie jednego miesiąca.</li>
 <li>W eksperymentach mapowania losów komórek (fate mapping) utwórz parę hodowlaną składającą się z samicy Swiss Webster (typ dziki; zakupionej w Taconic) oraz samca niosącego zarówno allel CreERT specyficzny dla genu, jak i allel reporterowy. W celach demonstracyjnych używamy samców Wnt1-CreERT;mGFP (Ellisor 2009).</li>
 <li>Każdego ranka sprawdzaj u samic Swiss Webster obecność czopa pochwowego. Poranek (godz. 09:00) dnia zauważenia czopa pochwowego wyznacz jako 0,5 dnia po kopulacji i na podstawie tego punktu wyjściowego oblicz datę podania tamoksyfenu. (W tym eksperymencie zastosowano dzień embrionalny 8,5).</li>
 <li>Użyj strzykawki 1 ml z igłą do karmienia zwierząt (20G x 1-1/2), aby pobrać 200 μl roztworu zapasowego tamoksyfenu (4 mg tamoksyfenu).</li>
 <li>Mocno unieruchom ciążną samicę Swiss Webster, chwytając ją za kark i plecy, aby ustabilizować głowę, a następnie odwróć ją brzuchiem do góry.</li>
 <li>Przytrzymaj ogon wolnymi palcami, aby utrzymać ciało w linii prostej.</li>
 <li>Wprowadź igłę do karmienia w kącik ust i delikatnie prowadź ją wzdłuż podniebienia.</li>
 <li>Obróć igłę tak, aby była równoległa do ciała, jednocześnie odchylając głowę do tyłu, aby szyja pozostała wyprostowana.</li>
 <li>Wprowadź igłę w dół przełyku, w stronę żołądka. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły do tchawicy. Jeśli poczujesz opór, zwierzę wykaże odruch wymiotny lub zacznie się szamotać, natychmiast wyjmij igłę i spróbuj ponownie przeprowadzić zgłębnikowanie.</li>
 <li>Po wprowadzeniu igły do żołądka podaj tamoksyfen dożylnie do żołądka i przenieś samicę z powrotem do klatki aż do dnia sekcji.</li>
</ul>
Kraniektomia:
<ul>
 <li> Przeprowadzić perfuzję wewnątrzsercową dorosłej myszy z mapowaniem losów komórek przy użyciu 4% PFA, a następnie odciąć głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż nad barkami.</li>
 <li> Przesunąć skalpelem wzdłuż linii środkowej grzbietowej głowy (od strony rostralnej do kaudalnej), aby przeciąć skórę głowy i odsłonić czaszkę.</li>
 <li> Za pomocą skalpela usunąć nadmiar tkanki lub mięśni z bocznych i tylnych części czaszki.</li>
 <li> Pincetą przebić czaszkę w linii środkowej, tuż przed opuszka węchowe, tworząc mały otwór, w który można wprowadzić końcówki cienkich nożyczek.</li>
 <li> Wprowadzić cienkie nożyczki w ten otwór i wykonać nacięcie od strony przyśrodkowej do bocznej na długość odpowiadającą mniej więcej długości opuszek węchowych. Cięcie to spowoduje złamanie czaszki na styku kości nosowej i kości czołowej, zapewniając dobry dostęp dla nożyczek.</li>
 <li> Przeciąć wzdłuż szwów strzałkowych w czaszce (linia środkowa grzbietowa), upewniając się, że końcówki nożyczek są skierowane w stronę przeciwną do mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki podległej.</li>
 <li> Ostrożnie chwycić czaszkę pincetą i oddzielić kość wzdłuż nacięcia przyśrodkowego, aby odsłonić mózg. Czaszka może odpryskiwać w małych kawałkach lub łamać się w większych sekcjach. Kontynuować usuwanie wszystkich kości czołowych, ciemieniowych, międzyciemieniowych i potylicznych za pomocą pincety.</li>
 <li> Rozłamać kości otaczające paraflocculi (znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku), ściskając kuliste kości po każdej stronie. Ostrożnie usunąć kości.</li>
 <li> Odwrócić głowę do góry dnem (stroną grzbietową w dół) i za pomocą pincety przeciąć nerwy czaszkowe, aby uwolnić mózg z czaszki.</li>
</ul>
Mikroskopia całego preparatu: mózg dorosłego osobnika
<ul>
 <li>Oceń mózg dorosłego osobnika pod kątem oznakowania GFP za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu.</li>
 <li>Przenieś mózg do szalki Petriego zawierającej PBS i wykonaj zdjęcie przy użyciu oprogramowania PictureFrame lub innego odpowiedniego programu.</li>
</ul>
Mikroskopia całego preparatu: zarodki w stadium E12.5
<ul>
 <li>Oceń zarodki w całości pod kątem oznakowania GFP, używając fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego.</li>
 <li>Przenieś osobniki wykazujące pozytywny sygnał GFP w całej objętości do szalki Petriego zawierającej PBS i wykonaj dokumentację fotograficzną przy użyciu oprogramowania PictureFrame lub innego odpowiedniego programu.</li>
 <li>Za pomocą pęsety odetnij mały fragment ogona z każdego zarodka, umieść każdy fragment w probówce PCR i przeprowadź genotypowanie tkanki metodą PCR (Ellisor 2009) dla obu alleli, aby potwierdzić wyniki uzyskane w analizie całego zarodka.</li>
</ul>
Mikrodysekcja i przygotowanie eksplantatów brzusznej części śródmózgowia z embrionów w stadium E12.5
<ul>
 <li>Po wyjęciu z łańcucha macicznego i zidentyfikowaniu embrionów z mapowaniem losu komórek za pomocą fluorescencji całego preparatu, przenieś embriony do sterylnego, lodowatego PBS w naczyniu do hodowli komórkowej.</li>
 <li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuń część głowy embrionu, wykonując cięcie poprzeczne w kierunku ogonowym względem rombomeru 1.</li>
 <li>Następnie usuń przednią część głowy, wykonując cięcie wieńcowe przez częścią przedmózgowia. Odsłoni to strukturę rurkowatą, w której czwarta komora oraz pęcherzyk śródmózgowia tworzą kanał między tkankami grzbietowymi a brzusznymi.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadź końce nożyczek do czwartej komory i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietowej, od strony ogonowej do przedniej, całkowicie otwierając rurkę i tworząc preparat typu „otwartej książki”. Brzuszna część śródmózgowia będzie teraz odsłonięta przyśrodkowo, natomiast dwie grzbietowe połowy śródmózgowia znajdą się bocznie.</li>
 <li>Usuń wszelkie pozostałe tkanki nie-neuronalne znajdujące się pod brzuszną częścią śródmózgowia, aby tkanka mogła leżeć bardziej płasko. W razie potrzeby wykonaj nacięcia w częściach przedniej i ogonowej, tak aby grzbietowe „skrzydła” eksplantu również leżały płasko. Eksplant powinien teraz przypominać „motyla”, w którym grzbietowa część śródmózgowia reprezentuje skrzydła, a rombomer 1 ogon.</li>
 <li>Aby dodatkowo wyizolować brzuszną część śródmózgowia do analizy FACS lub eksperymentów z hodowlą komórkową, usuń boczne (grzbietowe) części tkanki.</li>
</ul>
Reprezentatywne wyniki:
W tym eksperymencie GIFM komórki wykazujące ekspresję Wnt1 są trwale i dziedzicznie znakowane podczas embriogenezy poprzez podanie tamoksyfenu w dniu E8.5 zarodkom Wnt1-CreERT;mGFP. Następnie znakowane komórki są wizualizowane za pomocą fluorescencji całych preparatów oraz immunohistochemii na skrawkach, aby określić, w jaki sposób komórki pochodzące z Wnt1 przyczyniają się do tworzenia struktur neuronalnych w trakcie rozwoju. Fluorescencja całych preparatów opiera się na związanej z błoną komponent GFP reportera mGFP, a zatem dostarcza informacji komórkowych, jak i ogólnego obrazu projekcji neuronalnych pochodzących z Wnt1. Na przykład przy podaniu tamoksyfenu w dniu E8.5, zarodki Wnt1-CreERTmGFP w dniu E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części rąbca i rdzeniu kręgowym (Rysunek 1A). Przy dużym powiększeniu widoczne są cienkie projekcje neuronalne unerwiające śródmózgowie, ścianę ciała, kończynę i region kraniofacjalny. Na tym etapie rozwoju zarodek jest przeźroczysty, a wewnętrzne znakowanie GFP jest łatwo dostrzegalne. Jednak w miarę rozwoju mózgu gęstość dojrzałej tkanki przesłania fluorescencję GFP emitowaną przez wewnętrzne struktury mózgu. W związku z tym, przy podaniu tamoksyfenu w dniu E8.5, w badaniu fluorescencyjnym całych preparatów u osobników dorosłych obserwuje się jedynie niewielkie znakowanie GFP w wzgórzkach górnych (Rysunek 1C, wstawka). Dodatkowo widoczne są niektóre projekcje aksonalne przebiegające wzdłuż brzusznej powierzchni rąbca (nie pokazano). W przeciwieństwie do tego, gdy tamoksyfen jest podawany w dniu E9.5, występuje znaczne znakowanie GFP w całym obszarze wzgórzków dolnych (Rysunek 1B, wstawka). Ten wzrost fluorescencji w całych preparatach może wskazywać, że komórki wykazujące ekspresję Wnt1 w dniu E9.5 w większym stopniu przyczyniają się do tworzenia powierzchownych regionów grzbietowego śródmózgowia lub emitują więcej wypustek w tym regionie niż komórki wykazujące ekspresję Wnt1 z dnia E8.5. Niezależnie od tego, różnica w fluorescencji całych preparatów odzwierciedla dynamiczny charakter ekspresji Wnt1 podczas rozwoju i demonstruje, jak GIFM może być wykorzystane do śledzenia odrębnych populacji komórek od stadium embrionalnego aż do dojrzałego osobnika.
Za pomocą immunohistochemii wykonano analizę przekrojów tkanek z mapowaniem losów komórek z Wnt1-CreERT;mGFP Zwierzęta analizuje się na poziomie komórkowym. Przeciwciała przeciwko GFP i β-galaktozydazie (β-gal) stosuje się wraz z różnymi swoistymi dla tkanek biomarkerami, aby określić szczegółowy wkład komórkowy Wnt1 linia komórkowa prowadząca do struktur i typów komórek neuronalnych. Przy podaniu tamoksyfenu w E8.5 i analizie tkanek w E12.5, komórki podwójnie dodatnie (GFP+ i β-gal+) obserwuje się w całym śródmózgowiu i rąbmózgowiu, z projekcjami przebiegającymi przez brzuszną część śródmózgowia (Rycina 1B). W mózgu dorosłym, Wnt1linia komórkowa znakowana w dniu E8.5 daje początek wielu strukturom śródmózgowia, w tym wzgórzkom górnym i dolnym, a także obszarom w pobliżu populacji komórek dopaminergicznych pola brzusznego nakrywki oraz istoty czarnej (Rycina 1D) (patrz również Zervas 2004). W przeciwieństwie do tego, Wnt1linia komórkowa znakowana w dniu E9.5 daje początek wzgórkom dolnym, a także neuronom w sąsiedztwie populacji komórek dopaminergicznych (Rysunek 1F).
<img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Ekspresja genów w embrionie myszy z barwieniem EGFP i nß-gal; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Reprezentatywne wyniki mapowania losów Wnt1-:
Przykłady wyników barwienia całego preparatu oraz immunocytochemii w embrionach Wnt1-CreERT;mGFP i dorosłych mózgach z mapowaniem losów (oznaczeniem) w E8.5 (A-D) i E9.5 (E-F). A. Embriony Wnt1-CreER;mGFP w E12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu (Mb), tylnej części rąbca (Hb) i rdzeniu kręgowym (Sp). B. Oznaczone komórki zwizualizowane i przeanalizowane na poziomie komórkowym za pomocą immunohistochemii, co pokazano na tym przekroju optycznym o grubości 1-μm (obiektyw 40x, akwizycja serii z). Przeciwciała przeciwko nuklearnej β-galaktوزydazie (nβ-gal) (czerwone) i przeciwciała przeciwko GFP (zielone) wskazują na komórki z mapowaniem losów widoczne w brzusznej części śródmózgowia. Tutaj komórki rekombinowane są podwójnie dodatnie (nβ-gal+/GFP+) ze względu na naturę warunkowego reportera mGFP. C. Mikroskopia fluorescencyjna całego preparatu ujawnia słabą fluorescencję GFP w wzgórzkach górnych (SC) osobnika dorosłego (wstawka). Ocena linii Wnt1 oznaczonej w E8.5 na przekrojach dorosłych przy użyciu mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) wykazuje, że linia Wnt1 daje początek strukturom śródmózgowia, w tym wzgórkom górnym (SC) i dolnym (IC) (C). D. Przekrój optyczny 40x, 1 mm pobrany z brzusznej części śródmózgowia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. E. Oznaczenie w E9.5 skutkuje znacznym znakowaniem GFP, które jest łatwo widoczne we wzgórku dolnym śródmózgowia podczas fluorescencji całego preparatu (wstawka). Linia Wnt1 oznaczona w E9.5 na przekrojach dorosłych (β-gal+, czerwone) jest skoncentrowana we wzgórku dolnym (grzbietowo-tylna część śródmózgowia), co widać w mikroskopii o niskim powiększeniu (5X) (E). F. Przekrój optyczny 40x, 1 mm pobrany z brzusznej części śródmózgowia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych z komórkami nβ-gal+ i bogatym splotem aksonalnym GFP+. Wnt1-pochodne neurony oznaczone w E8.5 w porównaniu do E9.5 wykazują progresywne ograniczenie wkładu w grzbietową część śródmózgowia, podczas gdy linia Wnt1 nadal przyczynia się do budowy brzusznej części śródmózgowia.

<ol><li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li>
<li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy wnieśli równy wkład w tę pracę i są wymienieni w porządku alfabetycznym. Wkład każdej osoby jest widoczny poprzez jej udział w artykule wideo.

Zaprezentowany przez nas system GIFM może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących różnorodnych procesów komórkowych. Na przykład myszy zmodyfikowane za pomocą różnych driverów Cre mogą służyć do celowania w dowolny typ komórek, tkankę lub interesującą linię genetyczną. Ponadto, ponieważ tamoksyfen może być podawany w dowolnym punkcie czasowym w okresie embrionalnym lub postnatalnym, rekombinację można skierować na dowolny istotny etap rozwoju. Przestrzenna i czasowa kontrola tego sys...

praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Mapy losów komórek są tworzone poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo w celu określenia, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do powstania konkretnych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się i dorosłych. Rozwinięciem tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losów komórek (Genetic Inducible Fate Mapping, GIFM), które łączy ekspresję genów, los komórki i zachowania komórkowe in vivo, aby tworzyć mapy losów w oparciu o linię genetyczną.
wykorzystuje GIFM X-CreER linie, w których X jest genem lub zestawem elementów regulacyjnych genu, które zapewniają przestrzenną ekspresję zmodyfikowanego białka bakteriofagowego, rekombinazy Cre (CreERT). CreERT zawiera zmodyfikowany eestrogen rdomena wiążąca ligand receptora, co sprawia, że CreERT zatrzymane w cytoplazmie w przypadku braku leku tamoksyfen. Wiązanie tamoksyfenu powoduje uwolnienie CreERT, który przemieszcza się do jądra komórkowego i pośredniczy w rekombinacji między sekwencjami DNA flankowanymi przez miejsca loxP. W GIFM rekombinacja zazwyczaj zachodzi między flankowaną przez loxP kasetą Stop poprzedzającą gen reporterowy, taki jak GFP.
Myszy są hodowane tak, aby posiadały albo specyficzny dla regionu, albo specyficzny dla typu komórek CreER oraz warunkowy allel reporterowy. Myszy niepoddane działaniu leku nie będą posiadały markerów, ponieważ kaseta Stop w reporterze zapobiega dalszej transkrypcji genu reporterowego. Podajemy tamoksyfen drogą zgłębnika do samic w określonym czasie ciąży, co zapewnia kontrolę czasową uwalniania CreERT i jego późniejszą translokację do jądra komórkowego, co usuwa kasetę Stop z reportera. Po rekombinacji allel reporterowy jest wyrażany konstytutywnie i dziedzicznie. Ten ciąg zdarzeń znakuje komórki w taki sposób, że ich historia genetyczna zostaje trwale zapisana. Zrekombinowany reporter służy zatem jako wysokiej wierności genetyczny śledzik linii komórkowych, który po aktywacji staje się niezależny od ekspresji genu pierwotnie wykorzystywanego do napędzania CreERT.
Stosujemy GIFM u myszy, aby badać prawidłowy rozwój oraz określić wkład linii genetycznych w typy komórek i tkanki dorosłych osobników. Wykorzystujemy również GIFM do śledzenia komórek w mutantach genetycznych, aby lepiej zrozumieć złożone fenotypy naśladujące istotne cechy ludzkich zaburzeń genetycznych.
Niniejszy artykuł wideo przeprowadza badaczy przez metody doświadczalne pozwalające na skuteczne zastosowanie GIFM. Prezentujemy tę metodę na dobrze scharakteryzowanych myszach Wnt1-CreERT;mGFP, podając tamoksyfen w 8,5 dniu embrionalnym (E8.5) drogą zgłębnika do żołądka, po czym w dniu E12.5 przeprowadzono sekcję i analizę za pomocą stereomikroskopii epifluorescencyjnej. Demonstrujemy również, jak przeprowadzić mikrosekcję domen z mapowaniem linii komórkowych w celu przygotowania eksplantów lub analizy FACS, a także jak sekcjonować mózgi dorosłych osobników z mapowaniem linii komórkowych do fluorescencyjnego obrazowania całych preparatów. Wspólnie procedury te pozwalają badaczom na rozstrzyganie kluczowych pytań w biologii rozwoju oraz w modelach chorób.

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Mapy losów komórek są generowane poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo w celu ustalenia, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do tworzenia konkretnych struktur i typów komórek w rozwijającym się...

Mapy losów komórek są tworzone poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo, aby określić, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do powstania konkretnych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się oraz u dorosłych osobników. Rozwinięciem tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losów komórek (GIFM), które łączy profil ekspresji genów z zachowaniami komórek in vivo w celu stworzenia map losów opartych na linii genetycznej. Cześć, nazywam się Deborah Ellisor z laboratorium Mark Services oraz z wydziału biologii molekularnej, biologii komórki i biochemii na Uniwersytecie Brown.Dzisiaj wraz z moimi współpracownikami — Ashley Brown, Liz Norman, Neen Hagen oraz Steve'em Brownem — zaprezentujemy procedurę indukowalnego genetycznego mapowania losów komórek. Wykorzystujemy tę procedurę w laboratorium do badania wczesnego rozwoju mózgu. Możemy również zastosować tę technikę w badaniach nad inaktywacją genów oraz w modelach zwierzęcych chorób ludzkich.Zacznijmy zatem. W embrionach X cre, E-R-M-G-F-P, MGFP LAE jest allelem reporterowym obecnym we wszystkich komórkach reprezentowanych przez szare owale X cre, er, gdzie X reprezentuje elementy regulacyjne genu. Kontrola ekspresji C ER jest ograniczona przestrzennie do domeny ekspresji genu X pokazanej na niebiesko, a białko CRE ER jest sekwestrowane w cytoplazmie przez HSP 90.W przypadku braku tamoksyfenu reporter będzie wyłączony. Podanie tamoksyfenu prowadzi do mapowania losów komórek w domenie X, ponieważ CER zostaje uwolniony z HSP 90, przemieszcza się do jądra komórkowego i usuwa kasetę stop z allelu reportera. Trwała i dziedziczna rekombinacja zapewnia konstytutywną ekspresję MG FP LA Z przez komórki. Kombinacja allelu reportera CER i tamoksyfenu umożliwia znakowanie; gdy populacja komórek zostanie początkowo oznakowana w pierwotnym regionie mózgu zarodka na podstawie ekspresji genu, komórki te zmapowane pod kątem losu są śledzone nawet po wygaśnięciu początkowej ekspresji genu sterującego CER.W ten sposób można zidentyfikować ostateczną dystrybucję i końcowy los genetycznie zdefiniowanej linii komórkowej w organizmie dorosłym. Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania roztworu tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/mL poprzez rozpuszczenie 200 mg tamoksyfenu w 10 mL podgrzanego oleju kukurydzianego w szklanej fiolce inhalacyjnej.Następnie inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez dwie godziny na mieszalniku wirówkowym Tator. Przygotowany roztwór zapasowy Tamoksifenu należy chronić przed światłem, owijając fiolkę folią, i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zapasowy można wykorzystać w ciągu miesiąca.W celu przeprowadzenia eksperymentów z mapowaniem losów komórek, należy utworzyć parę hodowlaną składającą się z samicy Swiss Webster typu dzikiego oraz samca niosącego zarówno allel CreER specyficzny dla genu, jak i allel reporterowy. Na potrzeby niniejszej demonstracji użyjemy samca win to one CreER MG FP. Każdego ranka należy sprawdzać samicę Swiss Webster pod kątem obecności czopu pochwowego.Przyjmij poranek dnia zaobserwowania czopa pochwowego jako 0,5 dnia po kopulacji i oblicz datę podania tamoksyfenu. W tym eksperymencie, przyjmując ten punkt startowy, tamoksyfen zostanie podany w 8,5 dniu embrionalnym. Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą do karmienia zwierząt, pobierz 200 µL roztworu stokowego tamoksyfenu.Mocno unieruchom ciążą samicę myszy Swiss Webster, chwytając ją za kark i plecy, aby ustabilizować głowę, a następnie odwróć mysz grzbietem do dołu, tak aby strona brzuszna była skierowana do góry. Trzymaj ogon pomiędzy wolnymi palcami, aby ciało zwierzęcia pozostawało w linii prostej. Następnie wprowadź igłę do karmienia w kącik pyszczka i delikatnie prowadź ją równolegle do podniebienia, aż końcówka igły znajdzie się mniej więcej na wysokości oka.Delikatnie odchyl głowę do tyłu, aby uzyskać dostęp do przełyku. Poprowadź igłę poza krtanią i w dół przełyku w kierunku żołądka. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły do tchawicy.Gdy igła do karmienia znajdzie się w żołądku, podaj tamoksyfen i wyjmij igłę. Następnie przenieś samicę z powrotem do klatki domowej aż do dnia sekcji. W dniu sekcji zarodki E 12.5 od samicy w określonym czasie ciąży zostają wypreparowane, a następnie ocenione pod kątem znakowania GFP.W embrionie dodatnim pod kątem GFP obserwujemy, że neurony pochodzące z linii wind one przyczyniają się do budowy śródmózgowia, końcowego mózgu i rdzenia kręgowego. Reporter MG FP znakuje projekcje aksonalne, które można również zaobserwować, przenosząc embriony dodatnie pod kątem GFP metodą whole mount na szalkę Petriego zawierającą PPS i fotografując je za pomocą ramki do zdjęć. Po sfotografowaniu embrionów należy za pomocą pęsety odciąć mały fragment ogona każdego embrionu i umieścić każdy fragment w probówce PCR. Tkanki zostaną poddane genotypowaniu metodą PCR w celu wykrycia obu alleli, aby potwierdzić wyniki uzyskane w analizie whole mount.Poniższe procedury umożliwiają analizę sposobu, w jaki komórki znakowane, pochodzące z regionów embrionalnych, zasiedlają dorosły mózg przed rozpoczęciem kraniotomii. Potwierdzono za pomocą ucisku palca u nogi, że mysz jest w pełni znieczulona. Po znieczuleniu nembutalem wykonuje się nacięcia, aby uzyskać dostęp do serca poprzez klatkę piersiową.Następnie wprowadź igłę motylkową do wierzchołka lub lewej komory serca i zabezpiecz ją zaciskiem C. Za pomocą nożyczek utwórz miejsce odpływu płynu w prawym przedsionku, a następnie przeprowadź perfuzję 10 do 15 mililitrów lodowatego roztworu soli fizjologicznej, aż wypływający płyn będzie przejrzysty. Następnie podaj 20 do 25 mililitrów 4%paraform aldehyde.Po zakończeniu perfuzji wewnątrzsercowej odciąć głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż powyżej barków. Prowadzić skalpel wzdłuż linii środkowej grzbietu głowy, w kierunku rostralnym, aby rozciąć skórę i odsłonić czaszkę. Za pomocą skalpela zeskrobać wszelkie nadmiarowe tkanki lub mięśnie z boków i tylnej części czaszki.Za pomocą pęsety przebij czaszkę w linii środkowej, tuż rostralnie względem opuszek węchowych i wykonaj mały otwór, aby pomieścić końce drobnych nożyczek. Wprowadź drobne nożyczki do tego otworu i wykonaj dwa bilateralne nacięcia od linii środkowej wzdłuż opuszek węchowych. Cięcie to spowoduje przełamanie czaszki na styku kości nosowej i kości czołowej, zapewniając swobodny dostęp dla nożyczek.Przetnij czaszkę wzdłuż szwów strzałkowych, dbając o to, aby końcówki nożyczek były skierowane w stronę przeciwną do mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem. Następnie delikatnie chwyć czaszkę pęsetą i odwarstw kość wzdłuż cięcia przyśrodkowego, aby odsłonić mózg. Czaszka może odpryskiwać w małych fragmentach lub pękać w większych sekcjach.Nadal używając pęsety, należy usunąć wszystkie kości czołowo-ciemieniowe, międzyciemieniowe i potyliczne. Uwolnić para oculi znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku, delikatnie ściskając kości sferyczne po każdej stronie. Za pomocą nożyczek ostrożnie odciąć grzbietową część kości otaczającą pień mózgu.Wsuń jedno ostrze nożyczek tuż pod grzbietową krawędź kości, zaczynając od miejsca przecięcia rdzenia kręgowego i tnąc w kierunku móżdżku, aby uwolnić pień mózgu i móżdżek. Usunąć pozostałą część kości z okolic pnia mózgu za pomocą pęsety.Ostrożnie odsunąć kości, odwrócić głowę grzbietem do dołu i za pomocą pęsety przeciąć nerwy czaszkowe, uwalniając mózg z czaszki. Umieścić mózg w szalce Petriego z lodem. Schłodzony PPS Oceń mózg dorosłego osobnika pod kątem oznakowania GFP, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, i wykonaj fotografię za pomocą ramki do zdjęć.W tym przykładzie śródmózowie zostało oznakowane białkiem GFP; poza zastosowaniem w analizie linii komórkowych podczas embriogenezy, w dorosłym organizmie GIFM można łączyć z innymi metodami powszechnie stosowanymi w biologii rozwoju, takimi jak mikrodysekcja i eksperymenty na eksplantach tkankowych. Przykładowo, brzuszna część śródmózowia jest strefą progenitorową dla rozwijających się neuronów dopaminergicznych, które wykazują ekspresję genu wind one. Zatem wyizolowanie brzusznej części śródmózowia za pomocą mikrodysekcji pozwala na stworzenie układu in vitro w celu dalszego badania jego rozwoju.To jest tylko jeden z przykładów wykorzystania metody GIFM do wyizolowania interesującej strefy progenitorowej, zdefiniowanej na podstawie historii genetycznej. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś wcześniej zidentyfikowane embriony GFP-dodatnie do sterylnego, lodowatego PBS w naczyniu do hodowli komórkowej, używając precyzyjnych nożyczek. Usuń część głowy embrionu, wykonując cięcie poprzeczne.W następnym kroku należy usunąć rostralną część głowy, wykonując cięcie wieńcowe przez cefalon. Ukaże to strukturę rurkową, w której czwarty komor poprzez pęcherzyk śródmózgowia tworzy kanał pomiędzy tkankami grzbietowymi a brzusznymi. Ostrożnie wprowadź końcówki nożyczek do czwartej komory i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietowej w kierunku rostralnym, całkowicie otwierając rurkę i tworząc preparat w układzie „otwartej książki”.Brzuszna część śródmózgowia zostanie teraz odsłonięta przyśrodkowo. Podczas gdy dwie grzbietowe połowy śródmózgowia będą znajdować się bocznie, konieczne może być usunięcie wszelkiej pozostałej tkanki nienerwowej znajdującej się pod brzuszną częścią śródmózgowia. Aby preparat leżał płasko, powinien on teraz przypominać motyla, w którym grzbietna część śródmózgowia stanowi skrzydła, a thrombo mere one ogon.Aby dodatkowo wyizolować brzuszny śródmózgowia do analizy fax lub eksperymentów z hodowlą komórkową, należy usunąć boczne części tkanki. Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki GIFM. W tym eksperymencie wizualizowano komórki wykazujące ekspresję WINT one znakowane w stadium E 8.5, aby ustalić, w jaki sposób komórki pochodne wint one przyczyniają się do tworzenia struktur nerwowych w trakcie rozwoju.Na przykład embriony wnt1 Cre ER MG FP na etapie E 12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części rdzenia przedłużonego i rdzeniu kręgowym; przy dużym powiększeniu widoczne są unerwiające go cienkie projekcje neuronalne. Można również zwizualizować i analizować na poziomie komórkowym zaznaczone komórki ściany ciała śródmózgowia, kończyn i regionu kranio-facialnego za pomocą immunohistochemii. Jak pokazano na tym przekroju optycznym o grubości 1 µm embrionu E 12.5, w którym podano tamoksyfen na etapie E 8.5, znakowanie przeciwciałem przeciwko nuklearnej beta-galaktozydazie w kolorze czerwonym oraz przeciwciałem przeciwko GFP w kolorze zielonym wskazuje komórki zmapowane pod kątem losu w brzusznej części śródmózgowia.W tym przypadku komórki są podwójnie dodatnie ze względu na naturę warunkowego reportera MGFP w dorosłym mózgu. Gęstość dojrzałej tkanki może przesłaniać fluorescencję GFP pochodzącą z wewnętrznych struktur mózgu. W związku z tym mikroskopia fluorescencyjna całego preparatu wykazuje jedynie słabą fluorescencję GFP w górnym CUI dorosłego osobnika podczas oceny wygranej.Jedna linia komórkowa oznakowana w E 8.5 na przekrojach osobników dorosłych w mikroskopii przy niskim powiększeniu wykazuje, że linia WIN one daje początek strukturom śródmózgia, w tym wzgórkom górnym i dolnym. Na tym obrazie przy wyższym powiększeniu, wykonanym z brzusznej części śródmózgia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych, widoczne są komórki dodatnie dla beta-kalcyny oraz bogaty splot aksonalny dodatni dla GFP; w przeciwieństwie do tego, oznakowanie w E 9.5 skutkuje znacznym etykietowaniem GFP, które jest łatwo widoczne w dolnych wzgórkach śródmózgia w fluorescencyjnej analizie całego preparatu. Linia WINT one oznakowana w E 9.5 na przekrojach osobników dorosłych jest skoncentrowana w dolnych wzgórkach, co widać w mikroskopii przy niskim powiększeniu.Na tym obrazie o większym powiększeniu, wykonanym z brzusznej części śródmózgowia w obrębie neuronów dopaminergicznych, widoczne są komórki wykazujące pozytywną reakcję na beta-żel jądrowy oraz bogaty splot aksonalny pozytywny dla GFP. Zatem, podczas gdy neurony pochodzące z linii Win one znakowane w E 8.5 w porównaniu do E 9.5 są stopniowo ograniczane w udziale w tworzeniu grzbietowej części śródmózgowia, linia WIN one nadal przyczynia się do tworzenia brzusznej części śródmózgowia.Przedstawiliśmy procedurę genetycznego mapowania losów indukowalnych w celu znakowania i śledzenia linii komórkowych in vivo. Pozwala to na znakowanie komórek na podstawie ich linii genetycznej i śledzenie ich w czasie, nawet po wygaśnięciu ekspresji genów. Po podaniu tamoksyfenu w ósmym i pół dniu rozwoju wykazaliśmy, że domena wit 1 przyczynia się do tworzenia rozwijającego się śródmózwia, a ponadto obejmuje całe śródmózwie u osobników dorosłych.W przeciwieństwie do tego, podanie tamoksyfenu w dziewiątym i pół dniu, kiedy domena wit one staje się ograniczona, skutkuje bardziej ograniczonym wkładem w rozwijający się śródmózgowie podczas embriogenezy, co utrzymuje się w wieku dorosłym. Podczas wykonywania tej procedury należy wziąć pod uwagę, że system znakuje komórki mozaikowo, w związku z czym nie każda komórka w danej strukturze może zostać oznakowana. Jest to prawdopodobnie spowodowane linią CRE er lub stosowanym warunkowym allelem reporterowym.Ważne jest to, że mimo mozaikowego znakowania komórek, wzór i rozkład komórek mar jest wysoce powtarzalny. Stwierdziliśmy, że podawanie tamoksyfenu poprzez zgłębnik doustny jest korzystniejsze w porównaniu z podaniem dosytrychalnym, ponieważ minimalizuje ono stan zapalny w jamie otrzewnej, a także uszkodzenia mechaniczne embrionów. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Praktyczne podejście do genetycznej indukcyjnej mapy losu: Wizualny przewodnik po znaczeniu i śledzeniu komórek in vivo

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Opisany tutaj protokół wykorzystuje metodę fotoznakowania u nowonarodzonych myszy do specyficznej identyfikacji komórek odpornościowych, które migrują z jelita grubego do miejsc pozajelitowych. Strategia ta będzie przydatna do badania interakcji gospodarz-mikrobiom we wczesnym okresie życia.

In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj technikę GIFM do oznaczania i śledzenia komórek in vivo w zarodkach myszy E12.5. Metoda ta umożliwia badanie pochodzenia genetycznego komórek w rozwoju mózgu i modelowaniu chorób.

Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Przeglądaj więcej filmów