Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Mapy losów komórek są tworzone poprzez znakowanie i śledzenie komórek in vivo, aby określić, w jaki sposób komórki progenitorowe przyczyniają się do powstania konkretnych struktur i typów komórek w tkankach rozwijających się oraz u dorosłych osobników. Rozwinięciem tej koncepcji jest genetyczne indukowalne mapowanie losów komórek (GIFM), które łączy profil ekspresji genów z zachowaniami komórek in vivo w celu stworzenia map losów opartych na linii genetycznej. Cześć, nazywam się Deborah Ellisor z laboratorium Mark Services oraz z wydziału biologii molekularnej, biologii komórki i biochemii na Uniwersytecie Brown.

Dzisiaj wraz z moimi współpracownikami — Ashley Brown, Liz Norman, Neen Hagen oraz Steve'em Brownem — zaprezentujemy procedurę indukowalnego genetycznego mapowania losów komórek. Wykorzystujemy tę procedurę w laboratorium do badania wczesnego rozwoju mózgu. Możemy również zastosować tę technikę w badaniach nad inaktywacją genów oraz w modelach zwierzęcych chorób ludzkich.

Zacznijmy zatem. W embrionach X cre, E-R-M-G-F-P, MGFP LAE jest allelem reporterowym obecnym we wszystkich komórkach reprezentowanych przez szare owale X cre, er, gdzie X reprezentuje elementy regulacyjne genu. Kontrola ekspresji C ER jest ograniczona przestrzennie do domeny ekspresji genu X pokazanej na niebiesko, a białko CRE ER jest sekwestrowane w cytoplazmie przez HSP 90.

W przypadku braku tamoksyfenu reporter będzie wyłączony. Podanie tamoksyfenu prowadzi do mapowania losów komórek w domenie X, ponieważ CER zostaje uwolniony z HSP 90, przemieszcza się do jądra komórkowego i usuwa kasetę stop z allelu reportera. Trwała i dziedziczna rekombinacja zapewnia konstytutywną ekspresję MG FP LA Z przez komórki. Kombinacja allelu reportera CER i tamoksyfenu umożliwia znakowanie; gdy populacja komórek zostanie początkowo oznakowana w pierwotnym regionie mózgu zarodka na podstawie ekspresji genu, komórki te zmapowane pod kątem losu są śledzone nawet po wygaśnięciu początkowej ekspresji genu sterującego CER.

W ten sposób można zidentyfikować ostateczną dystrybucję i końcowy los genetycznie zdefiniowanej linii komórkowej w organizmie dorosłym. Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania roztworu tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/mL poprzez rozpuszczenie 200 mg tamoksyfenu w 10 mL podgrzanego oleju kukurydzianego w szklanej fiolce inhalacyjnej.

Następnie inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez dwie godziny na mieszalniku wirówkowym Tator. Przygotowany roztwór zapasowy Tamoksifenu należy chronić przed światłem, owijając fiolkę folią, i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zapasowy można wykorzystać w ciągu miesiąca.

W celu przeprowadzenia eksperymentów z mapowaniem losów komórek, należy utworzyć parę hodowlaną składającą się z samicy Swiss Webster typu dzikiego oraz samca niosącego zarówno allel CreER specyficzny dla genu, jak i allel reporterowy. Na potrzeby niniejszej demonstracji użyjemy samca win to one CreER MG FP. Każdego ranka należy sprawdzać samicę Swiss Webster pod kątem obecności czopu pochwowego.

Przyjmij poranek dnia zaobserwowania czopa pochwowego jako 0,5 dnia po kopulacji i oblicz datę podania tamoksyfenu. W tym eksperymencie, przyjmując ten punkt startowy, tamoksyfen zostanie podany w 8,5 dniu embrionalnym. Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą do karmienia zwierząt, pobierz 200 µL roztworu stokowego tamoksyfenu.

Mocno unieruchom ciążą samicę myszy Swiss Webster, chwytając ją za kark i plecy, aby ustabilizować głowę, a następnie odwróć mysz grzbietem do dołu, tak aby strona brzuszna była skierowana do góry. Trzymaj ogon pomiędzy wolnymi palcami, aby ciało zwierzęcia pozostawało w linii prostej. Następnie wprowadź igłę do karmienia w kącik pyszczka i delikatnie prowadź ją równolegle do podniebienia, aż końcówka igły znajdzie się mniej więcej na wysokości oka.

Delikatnie odchyl głowę do tyłu, aby uzyskać dostęp do przełyku. Poprowadź igłę poza krtanią i w dół przełyku w kierunku żołądka. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły do tchawicy.

Gdy igła do karmienia znajdzie się w żołądku, podaj tamoksyfen i wyjmij igłę. Następnie przenieś samicę z powrotem do klatki domowej aż do dnia sekcji. W dniu sekcji zarodki E 12.5 od samicy w określonym czasie ciąży zostają wypreparowane, a następnie ocenione pod kątem znakowania GFP.

W embrionie dodatnim pod kątem GFP obserwujemy, że neurony pochodzące z linii wind one przyczyniają się do budowy śródmózgowia, końcowego mózgu i rdzenia kręgowego. Reporter MG FP znakuje projekcje aksonalne, które można również zaobserwować, przenosząc embriony dodatnie pod kątem GFP metodą whole mount na szalkę Petriego zawierającą PPS i fotografując je za pomocą ramki do zdjęć. Po sfotografowaniu embrionów należy za pomocą pęsety odciąć mały fragment ogona każdego embrionu i umieścić każdy fragment w probówce PCR. Tkanki zostaną poddane genotypowaniu metodą PCR w celu wykrycia obu alleli, aby potwierdzić wyniki uzyskane w analizie whole mount.

Poniższe procedury umożliwiają analizę sposobu, w jaki komórki znakowane, pochodzące z regionów embrionalnych, zasiedlają dorosły mózg przed rozpoczęciem kraniotomii. Potwierdzono za pomocą ucisku palca u nogi, że mysz jest w pełni znieczulona. Po znieczuleniu nembutalem wykonuje się nacięcia, aby uzyskać dostęp do serca poprzez klatkę piersiową.

Następnie wprowadź igłę motylkową do wierzchołka lub lewej komory serca i zabezpiecz ją zaciskiem C. Za pomocą nożyczek utwórz miejsce odpływu płynu w prawym przedsionku, a następnie przeprowadź perfuzję 10 do 15 mililitrów lodowatego roztworu soli fizjologicznej, aż wypływający płyn będzie przejrzysty. Następnie podaj 20 do 25 mililitrów 4%paraform aldehyde.

Po zakończeniu perfuzji wewnątrzsercowej odciąć głowę nożyczkami, przecinając kręgosłup tuż powyżej barków. Prowadzić skalpel wzdłuż linii środkowej grzbietu głowy, w kierunku rostralnym, aby rozciąć skórę i odsłonić czaszkę. Za pomocą skalpela zeskrobać wszelkie nadmiarowe tkanki lub mięśnie z boków i tylnej części czaszki.

Za pomocą pęsety przebij czaszkę w linii środkowej, tuż rostralnie względem opuszek węchowych i wykonaj mały otwór, aby pomieścić końce drobnych nożyczek. Wprowadź drobne nożyczki do tego otworu i wykonaj dwa bilateralne nacięcia od linii środkowej wzdłuż opuszek węchowych. Cięcie to spowoduje przełamanie czaszki na styku kości nosowej i kości czołowej, zapewniając swobodny dostęp dla nożyczek.

Przetnij czaszkę wzdłuż szwów strzałkowych, dbając o to, aby końcówki nożyczek były skierowane w stronę przeciwną do mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki pod spodem. Następnie delikatnie chwyć czaszkę pęsetą i odwarstw kość wzdłuż cięcia przyśrodkowego, aby odsłonić mózg. Czaszka może odpryskiwać w małych fragmentach lub pękać w większych sekcjach.

Nadal używając pęsety, należy usunąć wszystkie kości czołowo-ciemieniowe, międzyciemieniowe i potyliczne. Uwolnić para oculi znajdujące się wzdłuż bocznych krawędzi mózgu na poziomie móżdżku, delikatnie ściskając kości sferyczne po każdej stronie. Za pomocą nożyczek ostrożnie odciąć grzbietową część kości otaczającą pień mózgu.

Wsuń jedno ostrze nożyczek tuż pod grzbietową krawędź kości, zaczynając od miejsca przecięcia rdzenia kręgowego i tnąc w kierunku móżdżku, aby uwolnić pień mózgu i móżdżek. Usunąć pozostałą część kości z okolic pnia mózgu za pomocą pęsety.

Ostrożnie odsunąć kości, odwrócić głowę grzbietem do dołu i za pomocą pęsety przeciąć nerwy czaszkowe, uwalniając mózg z czaszki. Umieścić mózg w szalce Petriego z lodem. Schłodzony PPS Oceń mózg dorosłego osobnika pod kątem oznakowania GFP, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, i wykonaj fotografię za pomocą ramki do zdjęć.

W tym przykładzie śródmózowie zostało oznakowane białkiem GFP; poza zastosowaniem w analizie linii komórkowych podczas embriogenezy, w dorosłym organizmie GIFM można łączyć z innymi metodami powszechnie stosowanymi w biologii rozwoju, takimi jak mikrodysekcja i eksperymenty na eksplantach tkankowych. Przykładowo, brzuszna część śródmózowia jest strefą progenitorową dla rozwijających się neuronów dopaminergicznych, które wykazują ekspresję genu wind one. Zatem wyizolowanie brzusznej części śródmózowia za pomocą mikrodysekcji pozwala na stworzenie układu in vitro w celu dalszego badania jego rozwoju.

To jest tylko jeden z przykładów wykorzystania metody GIFM do wyizolowania interesującej strefy progenitorowej, zdefiniowanej na podstawie historii genetycznej. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś wcześniej zidentyfikowane embriony GFP-dodatnie do sterylnego, lodowatego PBS w naczyniu do hodowli komórkowej, używając precyzyjnych nożyczek. Usuń część głowy embrionu, wykonując cięcie poprzeczne.

W następnym kroku należy usunąć rostralną część głowy, wykonując cięcie wieńcowe przez cefalon. Ukaże to strukturę rurkową, w której czwarty komor poprzez pęcherzyk śródmózgowia tworzy kanał pomiędzy tkankami grzbietowymi a brzusznymi. Ostrożnie wprowadź końcówki nożyczek do czwartej komory i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietowej w kierunku rostralnym, całkowicie otwierając rurkę i tworząc preparat w układzie „otwartej książki”.

Brzuszna część śródmózgowia zostanie teraz odsłonięta przyśrodkowo. Podczas gdy dwie grzbietowe połowy śródmózgowia będą znajdować się bocznie, konieczne może być usunięcie wszelkiej pozostałej tkanki nienerwowej znajdującej się pod brzuszną częścią śródmózgowia. Aby preparat leżał płasko, powinien on teraz przypominać motyla, w którym grzbietna część śródmózgowia stanowi skrzydła, a thrombo mere one ogon.

Aby dodatkowo wyizolować brzuszny śródmózgowia do analizy fax lub eksperymentów z hodowlą komórkową, należy usunąć boczne części tkanki. Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki GIFM. W tym eksperymencie wizualizowano komórki wykazujące ekspresję WINT one znakowane w stadium E 8.5, aby ustalić, w jaki sposób komórki pochodne wint one przyczyniają się do tworzenia struktur nerwowych w trakcie rozwoju.

Na przykład embriony wnt1 Cre ER MG FP na etapie E 12.5 wykazują fluorescencję GFP głównie w śródmózgowiu, tylnej części rdzenia przedłużonego i rdzeniu kręgowym; przy dużym powiększeniu widoczne są unerwiające go cienkie projekcje neuronalne. Można również zwizualizować i analizować na poziomie komórkowym zaznaczone komórki ściany ciała śródmózgowia, kończyn i regionu kranio-facialnego za pomocą immunohistochemii. Jak pokazano na tym przekroju optycznym o grubości 1 µm embrionu E 12.5, w którym podano tamoksyfen na etapie E 8.5, znakowanie przeciwciałem przeciwko nuklearnej beta-galaktozydazie w kolorze czerwonym oraz przeciwciałem przeciwko GFP w kolorze zielonym wskazuje komórki zmapowane pod kątem losu w brzusznej części śródmózgowia.

W tym przypadku komórki są podwójnie dodatnie ze względu na naturę warunkowego reportera MGFP w dorosłym mózgu. Gęstość dojrzałej tkanki może przesłaniać fluorescencję GFP pochodzącą z wewnętrznych struktur mózgu. W związku z tym mikroskopia fluorescencyjna całego preparatu wykazuje jedynie słabą fluorescencję GFP w górnym CUI dorosłego osobnika podczas oceny wygranej.

Jedna linia komórkowa oznakowana w E 8.5 na przekrojach osobników dorosłych w mikroskopii przy niskim powiększeniu wykazuje, że linia WIN one daje początek strukturom śródmózgia, w tym wzgórkom górnym i dolnym. Na tym obrazie przy wyższym powiększeniu, wykonanym z brzusznej części śródmózgia w sąsiedztwie neuronów dopaminergicznych, widoczne są komórki dodatnie dla beta-kalcyny oraz bogaty splot aksonalny dodatni dla GFP; w przeciwieństwie do tego, oznakowanie w E 9.5 skutkuje znacznym etykietowaniem GFP, które jest łatwo widoczne w dolnych wzgórkach śródmózgia w fluorescencyjnej analizie całego preparatu. Linia WINT one oznakowana w E 9.5 na przekrojach osobników dorosłych jest skoncentrowana w dolnych wzgórkach, co widać w mikroskopii przy niskim powiększeniu.

Na tym obrazie o większym powiększeniu, wykonanym z brzusznej części śródmózgowia w obrębie neuronów dopaminergicznych, widoczne są komórki wykazujące pozytywną reakcję na beta-żel jądrowy oraz bogaty splot aksonalny pozytywny dla GFP. Zatem, podczas gdy neurony pochodzące z linii Win one znakowane w E 8.5 w porównaniu do E 9.5 są stopniowo ograniczane w udziale w tworzeniu grzbietowej części śródmózgowia, linia WIN one nadal przyczynia się do tworzenia brzusznej części śródmózgowia.

Przedstawiliśmy procedurę genetycznego mapowania losów indukowalnych w celu znakowania i śledzenia linii komórkowych in vivo. Pozwala to na znakowanie komórek na podstawie ich linii genetycznej i śledzenie ich w czasie, nawet po wygaśnięciu ekspresji genów. Po podaniu tamoksyfenu w ósmym i pół dniu rozwoju wykazaliśmy, że domena wit 1 przyczynia się do tworzenia rozwijającego się śródmózwia, a ponadto obejmuje całe śródmózwie u osobników dorosłych.

W przeciwieństwie do tego, podanie tamoksyfenu w dziewiątym i pół dniu, kiedy domena wit one staje się ograniczona, skutkuje bardziej ograniczonym wkładem w rozwijający się śródmózgowie podczas embriogenezy, co utrzymuje się w wieku dorosłym. Podczas wykonywania tej procedury należy wziąć pod uwagę, że system znakuje komórki mozaikowo, w związku z czym nie każda komórka w danej strukturze może zostać oznakowana. Jest to prawdopodobnie spowodowane linią CRE er lub stosowanym warunkowym allelem reporterowym.

Ważne jest to, że mimo mozaikowego znakowania komórek, wzór i rozkład komórek mar jest wysoce powtarzalny. Stwierdziliśmy, że podawanie tamoksyfenu poprzez zgłębnik doustny jest korzystniejsze w porównaniu z podaniem dosytrychalnym, ponieważ minimalizuje ono stan zapalny w jamie otrzewnej, a także uszkodzenia mechaniczne embrionów. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.