Name: Kwantyfikacja ognisk γH2AX w próbkach tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania i kwantyfikacji ognisk γH2AX w tkankach myszy. Ta technika pozwala ocenić uszkodzenia DNA in vivo w modelach chorób oraz odpowiedź na promieniowanie jonizujące.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania kierujemy do Australian Institute of Nuclear Science and Engineering za udzielone wsparcie. TCK otrzymał nagrody AINSE. Epigenomic Medicine Lab jest wspierany przez National Health and Medical Research Council of Australia (566559). LM korzysta ze wsparcia w ramach stypendiów Melbourne Research (University of Melbourne) oraz Biomedical Imaging CRC. Nieocenionym wsparciem dla niniejszej pracy była pomoc Monash Micro Imaging (dr Stephen Cody i dr Iśka Carmichael). MMT jest wdzięczny za ekspercką pomoc i porady dr Olgi Sedelnikovej z National Institutes of Health.

Tkanki
<ol>
 <li>Tkankę płucną, zatopioną w formach w związku OCT (optimal cutting temperature) 4583, przekrojono (5 μm) przy użyciu kriostatu CM Leica 1950 i osadzono na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną.</li> 
</ol>
Zamrożone próbki otrzymano od dr. Simona Royce'a z Murdoch Children's Research Institute. Tkanka płuc pochodziła z nieleczonych myszy Balb/c oraz z modelu mysiego przewlekłej alergicznej choroby dróg oddechowych, który wykazuje wiele patologicznych cech ludzkiej astmy6. Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Murdoch Children's Research Institute, który przestrzega australijskiego Kodeksu Praktyk w zakresie opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych do celów naukowych.
<ol start="2">
 <li>Przekroje pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li> 
</ol>
Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Przekroje utrwalono 2% (w/v) paraformaldehydem w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przez 20 minut.</li>
	 <li>Przekroje poddano równoważeniu poprzez dwukrotne przemycie w PBS, po 15 minut każdy.</li> 
	 <li>Przekroje potraktowano 70% etanolem (schłodzonym do -20°C) przez 20 minut, a następnie trzykrotnie przemyto w PBS po 10 minut każde przemycie.</li>
</ol>
Na tym etapie preparaty można przechowywać w szczelnych pojemnikach w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
<ol start="4">
	<li>Przekroje płukano trzykrotnie w PBS po 10 minut każdorazowo, a następnie blokowano za pomocą 100μL świeżo przygotowanego roztworu 8% BSA w PBS zawierającym 0,5% Tween-20 i 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Wszystkie inkubacje przeprowadzano w nawilżonej kuwecie do barwienia.</li>
	<li>Przekroje płukano w PBS-TT przez 5 minut, a wokół tkanki wyznaczono obrys hydrofobowy za pomocą pisaka Pap pen.</li>
	<li>Nadmiar buforu odlano i do każdego przekroju dodano 100μl pierwszorzędowego króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-γH2AX (rozcieńczonego 1:500 w 1% BSA w PBS; Millipore) i inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej. Inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym można przeprowadzać przez noc w temperaturze 4°C. Aby dostarczyć dodatkowych dowodów na to, że ogniska γH2AX reprezentują DSB, można zastosować przeciwciało pierwszorzędowe rozpoznające białko naprawy DSB. Przykładowo, często stosowaną kombinacją jest kolokalizacja γH2AX i phospho-ATM.</li>
	<li>Przekroje płukano dwukrotnie w PBS-TT po 5 minut każdorazowo, a następnie inkubowano z 100μl przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488 kozi anty-rabbit IgG rozcieńczonego 1:500 w 1% BSA; Invitrogen) przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. (Rozcieńczone przeciwciało przechowywano w ciemności przez cały czas trwania procedury).</li>
	<li>Przekroje płukano trzykrotnie w PBS-TT po 5 minut każdorazowo, a następnie inkubowano z RNAse A w stężeniu 0,5mg/mL przez 30 min w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Przeciwbarwienie jąder komórkowych i montowanie wykonano przy użyciu medium Vectashield zawierającego jodek propidyny.</li>
	<li>Preparaty uszczelniono lakierem do paznokci i przechowywano przez noc w temperaturze 4°C w ciemności przed analizą.</li>
</ol>
Mikroskopia / Analiza
<ol>
	<li>Do pozyskania obrazów wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM510 Meta, stosując standardowe lasery GFP (dla γH2AX - Alexa Fluor 488 kozi przeciwciało przeciw króliczym IgG) oraz PI (543 nm).</li>
</ol>
Obrazy pozyskano w serii Z z wielkością kroku 0,5 μm. Podczas analizy poszczególne płaszczyzny poddano dekonwolucji, a następnie zestawiono w stosie w celu uzyskania obrazu o maksymalnej projekcji, aby zminimalizować nakładanie się ognisk.
Metodę tworzenia obrazu maksymalnej projekcji przed przeliczeniem cząsteczek należy stosować wyłącznie w sytuacjach, gdy używany jest cienki przekrój (np. 5μm) i gdy barwienie tła jest nieznaczne. W przypadku konieczności analizy grubszych przekrojów z wyraźnym tłem należy zastosować bardziej złożoną analizę, taką jak 3D Object Counter, opisaną przez Bolte i Cordelieres (2006)7.
<ol start="2"> <li>Do stworzenia obrazów złączonych (czerwonych i zielonych) w celu ilościowego określenia liczby ognisk wykorzystano program Metamorph (Molecular Devices, USA).</li>
</ol>
Chociaż program Metamorph może być wykorzystywany do ilościowego określania liczby ognisk, w przypadku stosowania przekrojów tkanek ognisk zazwyczaj dokonuje się zliczenia ręcznego (wzrokowego), aby zapewnić większą dokładność.
Do kwantyfikacji można wybrać konkretne, interesujące typy komórek, na przykład komórki nabłonkowe płuc. Można to zrobić na podstawie histologii, odnosząc się do seryjnych skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystaliśmy tkankę płuc myszy z nieleczonych myszy Balb/c oraz z mysiego modelu przewlekłej alergicznej choroby dróg oddechowych. Ilościowo określono różnice w liczbie ognisk na komórkę, obserwując nieco wyższe średnie w uszkodzonych płucach w porównaniu z nieleczonymi przekrojami. Konkretnie, analiza ilościowa wykazała odpowiednio 6,5 ognisk/komórkę oraz 9,4 ognisk/komórkę (ręczne przeliczanie 20 komórek na przekrój) w tkance nieleczonej i tkance z przewlekłą allergiczną chorobą d...

<table><tbody><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) jest stosowany w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe są rozcieńczane w BSA.</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca2+)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Szkiełka z poli-L-lizyną</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Elektrostatycznie przyciąga zamrożone skrawki tkanek, co ogranicza konieczność stosowania dodatkowych powłok i substancji klejących.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Odczynnik</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5%) jest detergentem służącym do permeabilizacji komórek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Do permeabilizacji komórek zastosowano Triton X-100 (0,1%).</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynniki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko fosfo-&amp;#947;H2AX (królicze przeciwciało poliklonalne)</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwkrólicze przeciwciało IgG (H+L)</td><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała wtórnego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Odczynniki</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield z jodkiem propidyny</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Medium montażowe na bazie glicerolu zawierające jodek propidyny (czerwony barwnik jądrowy). Medium to należy stosować z obiektywem olejowym o odpowiadającym mu współczynniku załamania światła.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Uwaga: powszechnie stosowany barwnik DNA: dihydrochlorek 4,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Można go stosować wyłącznie w mikroskopach wyposażonych w odpowiedni laser wzbudzenia.</td></tr><tr><td>Mini PAP Pen</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (22x50 mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>naczynie Coplina, szklane</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510 Meta</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat CM Leica 1950</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$h2ax w próbkach tkanek

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Pęknięcia obu nici DNA (DSBs) są szczególnie letalnymi i genotoksycznymi uszkodzeniami, które mogą powstawać w wyniku procesów endogennych (fizjologicznych lub patologicznych) lub czynników egzogennych, w szczególności promieniowania jonizującego oraz związków radiomimetycznych. Fosforylacja wariantu histony H2A, H2AX, w reszcie seryny-139 w wysoce konserwatywnym motywie SQEY na C-końcu, prowadząca do powstania γH2AX, stanowi wczesną odpowiedź na pęknięcia obu nici DNA1Proces fosforylacji ten jest pośredniczony przez białka z rodziny kinazy 3-fosfoinosydylowej (PI3K), kinazę ATM (ataxia telangiectasia mutated), katalityczną podjednostkę kinazy białkowo-DNA oraz kinazę ATR (ATM and RAD3-related).2Ogólnie indukcja DSB prowadzi do powstania wyraźnych jądrowych ognisk γH2AX, które można łatwo wykryć i ilościowo określić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej2Biorąc pod uwagę wyjątkową specyficzność i czułość tego markera, analiza ognisk γH2AX znalazła szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych, szczególnie w radiobiologii i medycynie nuklearnej. Ilościowe oznaczanie ognisk γH2AX było najczęściej badane w systemach hodowli komórkowych w kontekście pęknięć DSB indukowanych promieniowaniem jonizującym. Poza radiowrażliwością komórkową, testy oparte na immunofluorescencji stosowano również do oceny skuteczności związków modyfikujących działanie promieniowania. Ponadto γH2AX był wykorzystywany jako marker molekularny do badania skuteczności różnych związków indukujących pęknięcia DSB, a ostatnio jest uznawany za istotny marker starzenia się i chorób, w szczególności nowotworów.3Ponadto metody oparte na immunofluorescence zostały dostosowane do wykrywania i kwantyfikacji ognisk γH2AXex vivoiin vivo4,5W niniejszej pracy prezentujemy typową metodę immunofluorescencji do wykrywania i oznaczania ilościowego ognisk γH2AX w tkankach mysich.

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Pęknięcia obu nici DNA (DSB) są szczególnie letalnymi i genotoksycznymi uszkodzeniami, które mogą powstawać w wyniku czynników endogennych (fizjologicznych lub patologicznych) ...

Witajcie, nazywam się Michelle Tang z Laboratoriów Medycyny Epigenomowej i Epigenetyki Ludzkiej, kierowanych przez dr Tom Carianne, profesora pomocniczego ASAM Holster w Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Dzisiaj zaprezentuję badanie immunofluorescencyjne gamma H2AX in vivo, służące do określenia stopnia uszkodzenia DNA w tkankach chorobowych.H2AX jest wariantem histony, który stanowi około 2 do 10% całkowitej puli histon H2A w komórkach ssaków i ulega szybkiej fosforylacji w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Fosforylowana forma H2AX, znana również jako gamma H2AX, powstaje w reakcji na uszkodzenia DNA; wykazano, że istnieje bezpośrednia korelacja między liczbą pęknięć dwuniciowych a poziomem gamma H2AX. Gamma H2AX jest czułym markerem molekularnym i udowodniono, że stanowi wczesny wskaźnik występowania pęknięć dwuniciowych. W związku z tym jest to użyteczna technika wykrywania uszkodzeń DNA.Gamma H2AX można wizualizować jako ogniska jądrowe w miejscach uszkodzeń DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na potrzeby tego eksperymentu wykorzystam tkanki płuc myszy otrzymane od dr. Simona Royce'a z Murdoch Children's Research Institute. Będę badać uszkodzenia DNA w tkankach płucnych z mysiego modelu przewlekłej alergicznej choroby dróg oddechowych, który wykazuje wiele patologicznych cech astmy u ludzi, w tym nadreaktywność dróg oddechowych, przebudowę dróg oddechowych oraz zapalenie dróg oddechowych.Przejdźmy zatem do eksperymentu. Rozpoczynamy od schłodzenia próbek do -20 °C poprzez umieszczenie ich w kriotomacie na około 20 minut. W celu uzyskania optymalnej temperatury cięcia SRO stosuje się szkiełka przedmiotowe, aby sekcje tkanek nie oddzielały się od podłoża.Podczas barwienia immunofluorescencyjnego OCT jest używany do przymocowania próbek do adaptera; umieść adapter na bloku tnącym, upewniając się, że jest on stabilnie zamocowany. Ustaw kriostat tak, aby wycinać przekroje tkanek o grubości 5 µm. Ostrożnie rozpocznij sekcjonowanie, przesuwając próbki w swoją stronę za pomocą pędzla. Umieść szkiełko przedmiotowe nad przekrojami, tak aby przylgnęły one do szklanej powierzchni. Pozostaw przekroje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby upewnić się, że cała wilgoć została usunięta przed przejściem do kolejnych etapów.W pierwszej kolejności utrwalamy skrawki tkanek w 2% paraldehydzie przygotowanym w buforze PBS bez wapnia i magnezu przez 20 minut. Odlewamy nadmiar paraldehydu i umieszczamy preparaty w naczyniu typu Copeland, aby dwukrotnie przemyć je w PBS przez 15 minut w celu permeabilizacji. Po etapie permeabilizacji próbki traktuje się 70% etanolem w temperaturze -20 °C przez 20 minut. Próbki płucze się trzykrotnie w PBS, po 10 minut za każdym razem.Usuwaj każde miejsce pojedynczo, aby zapobiec wysychaniu skrawków tkanek. Odsącz nadmiar PBS z preparatu, a następnie zablokuj skrawki za pomocą 8% BSA w PBS zawierającym od 0,5% do 0,1% Triton X 100, znanego również jako P-B-S-T-T. Preparaty inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, po czym próbki płucze się w P-B-S-T-T przez pięć minut.PBS TT stosuje się w celu ułatwienia przenikania przeciwciał do jądra komórkowego. Następnie preparaty są osuszane, aby usunąć nadmiar P-B-S-T-T. Wokół sekcji rysuje się okrąg za pomocą pisaka do cytologii, aby zmniejszyć ilość zużytych odczynników.Jako przeciwciało pierwszorzędowe zastosowano szybkie przeciwciało poliklonalne anty-phospho gamma H tox. Przygotowano rozcieńczenie 1:500 w 1% BSA w P-B-S-T-T. Przetoki umieszczono w komorze wilgotnościowej i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Zlej nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie wykonaj dwa pięciominutowe przemycia w P-B-S-T-T w celu usunięcia resztek przeciwciała pierwszorzędowego. Wyjmij slajdy i osusz je z nadmiaru P-B-S-T-T. Zastosowano przeciwciało kozie anty-Reid IJJ (floor 4 88).Do próbek dodano przeciwciało wtórne w rozcieńczeniu 1:500, przygotowane w 1% BSA w P-B-S-T-T. Następnie skrawki inkubowano przez jedną godzinę w komorze wilgotnościowej; po tym czasie odpiło się przeciwciało wtórne, a następnie wykonano trzy pięciominutowe przemycia w N-P-B-S-T-T w celu usunięcia nadmiaru przeciwciała wtórnego.Przykryj słoik Copelanda folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło podczas każdego etapu mycia. Wyjmij preparaty i odsącz nadmiar P-B-S-T-T. W celu zredukowania barwienia cytoplazmatycznego zastosowano dodatek 0,5 mg/mL RNAs A w PBS.Następnie próbki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji RNA A jest odpipowany, a próbki są krótko płukane w P-B-S-T-T, aby zapobiec wysychaniu przekrojów. Próbki należy przechowywać owinięte w folię aluminiową do momentu dodania medium montażowego.Wyjmujaj po jednym szkiełku i osusz nadmiar P-B-S-T-T. Na każdy przekrój nanieś medium montażowe Vector Shield zawierające jodek propidyny, który jest czerwonym barwnikiem jąder komórkowych. Następnie ostrożnie nałóż szkiełko nakrywką, starając się nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, a nadmiar Vector Shield usuń za pomocą papieru absorpcyjnego.Następnie wypoleruj krawędzie szkiełka nakrywki, aby uszczelnić preparat i zapobiec wysychaniu próbek. Na koniec przechowuj próbki w ciemnym miejscu w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia mikroskopii. Do wykonania obrazowania cyfrowego wykorzystano mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 Meta z obiektywem imersyjnym 63×; jako źródła wzbudzenia zastosowano lasery argonowy i helowo-neonowy o długościach fal odpowiednio 488 nm dla Alexa Fluor 488 oraz 543 nm dla jodku propidyny.Każde pole obejmowało od ośmiu do 15 optycznych serii Z z rozmiarem kroku 0,5 micrometers i jednorazowym powiększeniem. Obrazy są eksportowane jako poszczególne pliki TIF i analizowane za pomocą programu metamorph Images. Obrazy pozyskane z mikroskopu zes LSM five 10 meta focal są otwierane w programie metamorph w celu analizy obrazu i wstępnego przeliczania obiektów. Obrazy fluorescencyjne pozyskane jako seria Z są poddawane dekonwolucji i składane w obraz 2D przy użyciu filtrów maksymalnej projekcji.Przeprowadzono to w celu zminimalizowania utraty ognisk o mniejszej intensywności. Maksymalne obrazy projekcyjne przekształcono w obraz binarny i zastosowano filtry morfologiczne, takie jak filtr top hat, aby zredukować tło oraz poprawić czułość wykrywania ognisk. Następnie wczytano odpowiadające im obrazy z jodekkiem propidyny i zidentyfikowano obszary jąder komórkowych.Obszary te są wyróżniane poprzez ręczne obrysowanie regionów wokół jąder w celu zliczenia liczby ognisk w polu. Wyznaczone obszary są przenoszone na obrazy typu top hat, a następnie stosuje się filtry progu jasności. Próg został dobrany starannie poprzez porównanie wizualne, zgodnie z rozmieszczeniem ognisk, aby uniknąć włączenia tła w obrębie każdego pola.Do zliczenia ognisk wykorzystano zintegrowaną analizę morfologiczną IMA. Alternatywnie można przeprowadzić zliczenia ręczne, aby zapewnić wiarygodność wyników. To kończy protokół barwienia immunofluorescencyjnego in vivo w celu oznaczenia stopnia uszkodzenia DNA w tkankach chorobowych.Technika ta nadaje się do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez różne bodźce. Jest ona jednak najbardziej odpowiednia do oceny odpowiedzi na promieniowanie jonizujące oraz radiowrażliwości. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie.

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Okreslanie ilości γH2AX Foci w próbkach tkankowych

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania i kwantyfikacji ognisk γH2AX w tkankach myszy. Ta technika pozwala ocenić uszkodzenia DNA in vivo w modelach chorób oraz odpowiedź na promieniowanie jonizujące.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Przeglądaj więcej filmów