Wstrzyknięcie dootrzewnowe dorosłemu danio pręgowanemu

Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie roztworu do jamy otrzewnowej dorosłej ryby danio pręgowanego. W tym przykładzie wstrzykniemy glukozę w naszym laboratorium. Używamy tej procedury do badania zastoju glukozy we krwi.

Osiąga się to poprzez pierwsze zważenie ryby, aby określić, ile roztworu należy wstrzyknąć na gram masy ciała. Drugim krokiem zabiegu jest znieczulenie ryby zimną wodą. Trzecim krokiem procedury jest przeniesienie ryby do etapu mikroskopu i wstrzyknięcie.

Ostatnim krokiem procedury jest powrót ryby do zbiornika w celu odzyskania zdrowia. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w homeostazie glukozy poprzez pomiar poziomu glukozy we krwi. Cześć, nazywam się Mary Kinkle i pracuję w Laboratorium Wiktorii Prince na Wydziale Biologii i Anatomii Organizmów na Uniwersytecie w Chicago.

Nazywam się Stephanie Ames i również pochodzę z Prince Lab. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wstrzykiwania dootrzewnowego dorosłemu danio pręgowanemu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji homeostazy glukozy we krwi.

Więc zacznijmy. Aby przygotować rybę do wstrzyknięcia, zacznij od przeniesienia ryby do czystego zbiornika i szybko wstrzymaj jedzenie. Ryby przez 24 godziny, aby opróżnić zawartość bańki jelitowej i 72 godziny, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do poziomu wyjściowego.

Gęstość stosowana w tym protokole wynosi od 10 do 12 populacji mieszanej płci. Ryby na dziewięciolitrowy zbiornik z trzema warstwami kulek, marmur sekwestruje jaja, aby nie zostały zjedzone. Codziennie usuwaj jajka i odpady, zasysając zbiornik.

Na dole następnie przygotuj roztwór soli Cortland, używając 124,1 milimolowego chlorku sodu, 5,1 milimolowego chlorku potasu, 2,9 milimolowego pirofosforanu sodu, 1,9 milimolowego siarczanu magnezu siedmiowodnego, 1,4 milimolowego dwuwodnego chlorku wapnia 11,9 milimolowego wodorowęglanu sodu, czterech gramów poliwinylu roone i 1000 jednostek USP heparyny do końcowej objętości 100 mililitrów z dejonizowanym filtrem wodnym, sterylizować i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozpuść pięć gramów glukozy w 10 mililitrach roztworu soli cottyny. Aby uzyskać 0,5 miligrama na mikrolitr roztworu glukozy, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przygotuj stół chirurgiczny, przycinając miękką gąbkę do wysokości około 20 milimetrów na płaskiej powierzchni. Wykonaj nacięcie o głębokości od 10 do 15 milimetrów, aby przytrzymać rybę do wstrzyknięcia. Umieść gąbkę w 60-milimetrowej szalce Petriego i umieść szalkę Petriego z gąbką w pokrywie pudełka z końcówką do pipet P 200.

Następnie przygotuj mikroskop, przykrywając podstawę mikroskopu folią i ręcznikami papierowymi w celu ochrony. W przypadku rozlania należy położyć stół chirurgiczny na ręczniku papierowym. Wstępnie dostosuj ostrość, viewstół chirurgiczny i ustaw ostrość na gąbce.

Połóż palec na gąbce i skup się na niej, aby zminimalizować dalszą regulację ogniskowej, gdy ryba znajduje się na stole operacyjnym. Po zważeniu ryby, wypełniając 500-mililitrową zlewkę około jednej trzeciej wodą z obiektu rybnego i rozerwij. Na siatce wagowej przenieść rybę z jak najmniejszym nadmiarem wody do zlewki i zapisać przeniesienie wagi każdej zważonej ryby do wyraźnie oznakowanego zbiornika.

Oblicz objętość wtrysku na podstawie masy. W tym przykładzie wstrzykniemy roztwór 0,5 miligrama na gram masy ciała glukozy rozpuszczonej w roztworze soli Cortland. Ponieważ nasz roztwór wynosi 0,5 miligrama na mikrolitr, obliczenia są jednokrotnością wagi ryby w gramach równej objętości do wstrzyknięcia w mikrolitrach, przygotowania strzykawki i odpowiedniego sprzętu do wstrzykiwania.

Protokół ten wykorzystuje stalową igłę ze skosem 30 5G, ultra mikropompę i mikro procesor czterocylindrowy oraz mikrostrzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów nano fill do wstrzykiwania glukozy, napełnij strzykawkę 0,5 miligrama na mikrolitr glukozy rozpuszczonej w roztworze soli Cortland. Ważne jest, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki, zamontować strzykawkę na ultra mikropompie i zaprogramować objętość wstrzyknięcia dla pierwszej ryby, wprowadzając objętość w nanolitrach, za pomocą numerycznej klawiatury na procesorze mikro czwórki. Na koniec przygotuj środek znieczulający do lodu, krusząc wystarczającą ilość kostek lodu wykonanych z wody z obiektu rybnego.

Aby napełnić wiadro z lodem, umieść stół chirurgiczny w większym pojemniku, takim jak gumowy pojemnik do przechowywania żywności o pojemności 2,4 litra. Wlej trochę ciepłej wody do zewnętrznego pojemnika i stołu chirurgicznego. Trzymaj w pobliżu zbiornik rezerwowy ciepłej wody w obiekcie.

Przymocuj termometr do zewnętrznego pojemnika. Umieść zewnętrzny pojemnik znieczulający wraz ze stołem chirurgicznym obok mikroskopu. Miej w pobliżu wiadro z kawałkami lodu.

Zacznij dodawać wiórki lodu, aż temperatura wody osiągnie 17 stopni Celsjusza. Na tym etapie nie schodź poniżej 17 stopni Celsjusza. Użyj siatki, aby przenieść rybę do zewnętrznego pojemnika.

Pod kątem 17 stopni lub nieco niższym ryba zazwyczaj rozkłada płetwy piersiowe poziomo, sapie i ma szybkie ruchy uszne. Powoli dodawaj wiórki lodu do pojemnika, aby w ciągu kilku minut obniżyć temperaturę do 12 stopni Celsjusza. Wraz ze spadkiem temperatury ryba będzie pływać wolniej i w końcu przestanie pływać.

W końcu sapanie ustanie, a ruchy uszu zwolnią. Ryba jest gotowa do wstrzyknięcia, gdy nie reaguje na dotykanie. Po osiągnięciu wymaganej temperatury naciśnij gąbkę, aby ją nasączić.

Trzymaj palce w zimnej wodzie na tyle, aby nie rozgrzały ryby i nie wyjęły jej ze znieczulenia. Podczas obchodzenia się zimnymi palcami delikatnie przenieś rybę do koryta gąbki. Umieść rybę z brzuchem do góry, a skrzelami w korycie.

Szybko przenieś stół operacyjny na scenę mikroskopu. Pracując szybko, ostrożnie ustaw igłę tak, aby końcówka była skierowana w stronę obręczy miednicznej i znajdowała się bliżej obręczy miednicznej niż odbytu. Włóż igłę w linię środkową między płetwami brzusznymi.

Powinieneś być w stanie wyczuć, kiedy igła jest głęboko wbita w ścianę ciała. Podczas wkłuwania igły możesz poczuć, jak ugina się ściana ciała. Gdy igła dostanie się do jamy brzusznej, wstrzyknąć odpowiednią objętość za pomocą mikroprocesora.

Za pomocą pedału nożnego wstrzyknąć jeden mikrolitr na gram masy ciała ryby po wstrzyknięciu, wyjąć igłę i natychmiast przenieść rybę z powrotem do zbiornika z ciepłą wodą w celu odzyskania. Uwalniając rybę z gąbki nad wodą w zbiorniku, sprawdź igłę pod mikroskopem. Od czasu do czasu zakłada się łusk, którą należy usunąć przed następnym wstrzyknięciem.

Po upływie odpowiedniego czasu przystąp do dalszego testu. Odkryliśmy, że 72-godzinny post jest wymagany, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do poziomu wyjściowego przed wstrzyknięciem. Na tym rysunku dane kontrolne bez wstrzyknięć pokazane na zielono przedstawiają wartości stężenia glukozy we krwi nieróżniące się znacząco od kontroli z wstrzyknięciem pojazdu pokazanych tutaj na czerwono.

Jednak niebieska linia wyświetla wartości stężenia glukozy we krwi dla ryb, którym wstrzyknięto glukozę, oraz wyświetla wzrost i spadek krążącej glukozy. Z biegiem czasu zarówno zwierzęta, którym wstrzyknięto glukozę, jak i wstrzyknięto nośnik, były pod znieczuleniem chirurgicznym podczas procedury wstrzyknięcia, podczas gdy grupy kontrolne bez wstrzyknięć nie były pod znieczuleniem chirurgicznym. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe dorosłemu danio pręgowanemu.

W naszym laboratorium badamy zmiany stężenia glukozy we krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu roztworu glukozy IP. Jednak ta technika, którą właśnie pokazaliśmy, może być użyta do wstrzyknięcia interesującego Cię roztworu. Wykonując tę procedurę, pamiętaj, aby znieczulać rybę powoli i obchodzić się z nią delikatnie.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.