Name: Wstrzyknięcie dootrzewnowe dorosłemu danio pręgowanemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Naucz się techniki wstrzyknięcia dootrzewnowego u dorosłych Danio rerio przy użyciu mikrostrzykawki i znieczulenia zimną wodą. Ta metoda umożliwia badanie homeostazy glukozy we krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane z grantu 5-2007-97 Juvenile Diabetes Research Foundation (dla V.E.P.), grantów R01DK064973 (dla V.E.P.), R01DK48494 (dla L.H.P.), T32DK07074 (wspierającego S.C.E.), K01DK083552 (dla M.D.K) National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases oraz grantu P60DK20595 dla The University of Chicago Diabetes Research and Training Center. Treść publikacji jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów NIDDK lub NIH.

1. Przygotowania przed wstrzyknięciem
<ol>
 <li> Ryby należy poddać postowi przez co najmniej 24 godziny przed iniekcją. Pozwoli to na opróżnienie treści żołądka (zbiornika jelitowego). Podstawowy protokół postu polega na przeniesieniu ryb, przy zachowaniu ich normalnej gęstości zasiedlenia, do czystego zbiornika, a następnie wstrzymaniu karmienia. W przypadku postu długoterminowego, wymagającego bardziej rygorystycznych warunków (np. do badań glukozy we krwi), należy zapoznać się z dodatkowymi uwagami w sekcji Dyskusja.</li>
 <li> Przygotować roztwór soli Cortlanda (Perry et al., 1984). 
 Dla objętości 100 mL rozpuścić w wodzie destylowanej następujące składniki: 
 725 mg NaCl (124.1 mM) 
 38 mg KCl (5.1 mM) 
 41 mg Na2HPO4 (2.9 mM) 
 24 mg MgSO4∙7H2O (1.9 mM) 
 16 mg CaCl2∙2H2O (1.4 mM) 
 100 mg NaHCO3 (11.9 mM) 
 4 g Poliwinylopirydonu (PVP) (4%) 
 1,000 jednostek USP Heparyny 
 Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 <li> Przygotować mikroskop.
 <ul>
 <li> Podstawę mikroskopu należy przykryć folią spożywczą w celu ochrony przed ewentualnymi rozlaniami.</li>
 <li> Na folii położyć ręcznik papierowy. Na ręczniku papierowym zostanie umieszczony stół chirurgiczny.</li>
 <li> Wstępnie ustawić ostrość, patrząc na stół chirurgiczny i ustawiając fokus na gąbce.</li>
 </ul>
 Wskazówka: Połóż palec na gąbce i ustaw na nim ostrość. Pozwoli to wyeliminować lub zminimalizować konieczność dalszej korekty ostrości po umieszczeniu ryby na stole chirurgicznym.</li>
 <li> Zważyć ryby.
 <ul>
 <li> Napełnić zlewkę o pojemności 500 mL w około 1/3 wodą z hodowli ryb.</li>
 <li> Tarować wagę.</li>
 <li> Odłowić rybę za pomocą siatki. Nadmiar wody z siatki i ryby usunąć, krótko przykładając siatkę do ręczników papierowych. Przenieść rybę do zlewki.</li>
 <li> Zważyć rybę.</li>
 <li> Przenieść rybę do czystego zbiornika.</li>
 <li> Przenieść każdą zważoną rybę do osobnego, oznakowanego zbiornika.</li>
 <li> Obliczyć objętość iniekcji dla każdej ryby na podstawie jej masy.</li>
 </ul>
 </li>
 <li> Przygotować strzykawkę i powiązany sprzęt do iniekcji. Do iniekcji zaleca się stosowanie ściętej igły stalowej 35G oraz mikrostrzykawki NanoFil 10 μl. Przygotować strzykawkę NanoFil i rurkę silflex zgodnie z instrukcją producenta. Ważne jest usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza ze strzykawki i rurki. Po napełnieniu strzykawki i rurki, zamontować strzykawkę na pompie i zaprogramować objętość iniekcji dla pierwszej ryby.</li>
 <li> Przygotować stół chirurgiczny.
 <ul>
 <li> Odciąć miękką gąbkę (np. #L800-D, Jaece Industries) tak, aby miała około 20 mm wysokości. Na płaskiej powierzchni wykonać nacięcie o głębokości 10-15 mm. To nacięcie stanowi rynnę, w której ryba będzie spoczywać podczas iniekcji.</li>
 <li> Umieścić gąbkę w szalce Petriego o średnicy 60 mm.</li>
 <li> Umieścić szalkę Petriego z gąbką w odpowiednio dobranej pokrywce od pudełka z końcówkami do pipet. Pokrywka musi być wystarczająco duża, aby pomieścić wodę pomagającą utrzymać temperaturę gąbki, ale jednocześnie na tyle płytka, by nie przeszkadzała w pracy. Stosujemy pokrywkę z pudełka końcówek P200 o wymiarach 11.4 cm dł. x 7.7 cm szer. x 1.5 cm gł.</li>
 </ul>
 Te trzy elementy złożone razem (gąbka w szalce Petriego w pokrywce pudełka) stanowią stół chirurgiczny.</li>
 <li> Przygotować środek znieczulający.
 <ul>
 <li> Przygotować kruszony lód z kostek wykonanych z wody z hodowli ryb.</li>
 </ul>
 Wskazówka: Przy użyciu typowych foremek do lodu, do znieczulenia 10-12 ryb potrzeba będzie 3 foremek.
 <ul>
 <li> Napełnić czysty kubełek do lodu kruszonym lodem.</li>
 <li> Umieścić stół chirurgiczny w większym pojemniku, np. w pojemniku do przechowywania żywności Rubbermaid o pojemności 2.4 litra.</li>
 <li> Wlać nieco wody z hodowli (ciepłej) do zewnętrznego pojemnika oraz na stół chirurgiczny. W pobliżu należy przygotować zapas ciepłej wody z hodowli.</li>
 <li> Włożyć termometr do zewnętrznego pojemnika.</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
2. Znieczulenie, iniekcja i rekonwalescencja
<ol>
 <li>Umieść zewnętrzny pojemnik do znieczulania wraz ze stołem chirurgicznym obok mikroskopu. Przygotuj w pobliżu wiadro z kruszonym lodem.</li>
 <li>Obniż temperaturę wody do 17°C, dodając kruszony lód. Ważne: w tym kroku nie należy schodzić poniżej 17°C.</li>
 <li>Użyj siatki, aby przenieść rybę do zewnętrznego pojemnika.</li>
 <li>Powoli dodawaj kruszony lód do pojemnika, aby w ciągu kilku minut obniżyć temperaturę do 12°C.</li>
 <li>Monitoruj zachowanie ryby: w temperaturze 17°C lub nieco niższej ryba zazwyczaj rozpościera płetwy piersiowe poziomo, łapie powietrze i wykazuje szybkie ruchy operculum. W miarę spadku temperatury ryba będzie pływać wolniej, aż w końcu przestanie się poruszać. W miarę zbliżania się do chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia łapanie powietrza ustanie, a ruchy operculum spowolnią. Ryba jest gotowa do iniekcji, gdy nie reaguje na manipulację. Dla większości ryb temperatura 12°C jest wystarczająca. Większe ryby mogą wymagać chłodniejszej wody.</li>
 <li>Po osiągnięciu wymaganej temperatury (~12°C lub niższej), naciśnij gąbkę, aby ją nasączyć.</li>
 <li>Trzymaj palce w zimnej wodzie wystarczająco długo, aby nie ogrzać ryby i nie doprowadzić do jej wybudzenia z narkozy podczas manipulacji.</li>
 <li>Zimnymi palcami delikatnie przenieś rybę do rynienki gąbki. Ułóż rybę brzuchem do góry, z skrzelami w rynience.</li>
 <li>Szybko przenieś stół chirurgiczny na stolik mikroskopowy.</li>
 <li>Pracując sprawnie, ostrożnie wprowadź igłę w linię pośrodkową między płetwami brzusznymi. Igła powinna być skierowana kranialnie i wprowadzona bliżej obręczy brzusznej niż odbytu. Powinieneś poczuć moment, w którym igła przebija ścianę ciała. Wstrzyknij odpowiednią objętość i wyjmij igłę.</li>
 <li>Po iniekcji natychmiast przenieś rybę z powrotem do zbiornika z ciepłą wodą (~28.5°C) w celu rekonwalescencji, uwalniając rybę z gąbki nad wodą w zbiorniku. 
 Wskazówka: Jeśli ryba nie zacznie natychmiast pływać, pomóż jej w rekonwalescencji, delikatnie kierując strumień wody w stronę skrzeli.</li>
 <li>Sprawdź igłę. Czasami może do niej przywrzeć łuska, którą należy usunąć przed następną iniekcją.</li>
 <li>W przypadku kolejnych iniekcji użyj ciepłej wody z instalacji, aby przywrócić temperaturę wody w komorze znieczulającej do 17°C przed wprowadzeniem następnej ryby.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="wykres liniowy poziomu glukozy we krwi w funkcji czasu; porównanie: glukoza, nośnik, brak iniekcji; mg/dL" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki po domięśniowej iniekcji 0,5 mg/g glukozy lub nośnika. Ryby były głodzone przez 72 godziny przed iniekcją. Oś x przedstawia czas po iniekcji. Średnia ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Iniekcja doszprownicza składa się z pięciu etapów: głodzenia, ważenia, znieczulenia, iniekcji i rekonwalescencji. Dla każdego z tych etapów istnieją optymalne praktyki, które pozwalają zapewnić sukces. Sukces ten obejmuje zarówno zdrowie pacjenta (ryby), jak i prawidłowy wynik eksperymentu.

Głodzenie: 24-godzinne głodzenie powinno opróżnić cebulkę jelitową. Praktyka ta pochodzi z literatury weterynaryjnej dotyczącej ryb (np. Brown 1993). Dodatkowe kwestie dotyczące głodzenia omówiono poniżej.

Dłuższy post: Stwierdziliśmy, że wymagany jest 72-godzinny post, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do poziomu bazowego przed iniekcją (Eames et al., 2010). Doszliśmy również do wniosku, że w badaniach nad glukozą konieczne jest zastosowanie kilku procedur, aby upewnić się, że ryby są odpowiednio pościły. Należy zacząć od czystego zbiornika (bez osadów na dnie). Zbiorniki powinny być odseparowane od systemu, wyraźnie oznakowane jako „post” i umieszczone w miejscu, w którym entuzjastyczny personel opiekuńczy nie będzie ich karmić. Należy ocenić środowisko zewnętrzne zbiornika i podjąć kroki w celu zapobiegania stresowi ryb wywołanemu zakłóceniami, ponieważ wiadomo, że stres podnosi poziom glukozy we krwi (Chavin and Young, 1970; Groff et al., 1999). Na przykład przeprowadziliśmy eksperyment z postem, podczas którego na stole z akwariami codziennie włączone było radio. Stwierdziliśmy, że poziom glukozy we krwi był niezwykle wysoki i wyciągnęliśmy wniosek, że ryby były zestresowane wibracjami. Innym stresorem jest przeludnienie. Ryby powinny być utrzymywane w zagęszczeniu zgodnym z dobrymi praktykami hodowlanymi. Zalecenia w tym zakresie można znaleźć u Brand et al. (2002) oraz Westerfield (1995). Dobre wyniki osiągnęliśmy, stosując post przy zagęszczeniu 10-12 ryb w zbiorniku o pojemności 9 liter (przy czym 3 warstwy szklanych kulek zajmowały część tej objętości). Separacja płci może powodować stres, dlatego zalecamy utrzymywanie populacji mieszanej podczas postu. Oznacza to, że może dojść do złożenia ikry, którą należy odseparować, aby nie została zjedzona. Prostym sposobem odseparowania ikry jest pokrycie dna zbiornika 2-3 warstwami szklanych kulek. Jakość wody należy utrzymać poprzez usuwanie ikry i odpadów oraz codzienną wymianę około 10-15% wody w zbiorniku. Do usuwania ikry i odpadów dobrze sprawdza się syfonowanie.

Ważenie: Podczas ważenia ryb nieznieczulonych należy zachować ostrożność, aby zminimalizować przenoszenie wody z sieci do zlewki, co zapewni dokładny pomiar masy. Jeśli sieć (z rybą) zostanie osuszona ręcznikami papierowymi, można usunąć większość nadmiaru wody i precyzyjnie zmierzyć wagę. Łatwiejsze może być znieczulenie ryb przed ważeniem, jednak nie badaliśmy możliwych skutków dwukrotnego znieczulania ryby w ciągu jednego dnia. Przetestowaliśmy naszą technikę, ważąc najpierw ryby metodą osuszania sieci, a następnie ważąc je ponownie po znieczuleniu i delikatnym osuszeniu. Nie stwierdzono istotnych różnic w masie między tymi metodami (P = 0.7927, t-test). Dodatkowo sprawdziliśmy, czy metoda osuszania sieci wpływa na poziom glukozy we krwi w porównaniu z prostym przeniesieniem ryby do zlewki natychmiast po złapaniu w sieć (bez osuszania). Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie glukozy we krwi między dwiema metodami przenoszenia (P = 0.2241, t-test).

Znieczulanie: Znieczulenie chemiczne może być odpowiednie dla wielu badań. W niniejszej procedurze zaprezentowaliśmy znieczulenie zimną wodą jako alternatywę, ponieważ wiele środków znieczulających (w tym tricaina/MS-222 (Brown, 1993)) podnosi poziom glukozy we krwi. W poprzednich badaniach ustaliliśmy, że zimna woda nie podnosi poziomu glukozy we krwi u danio pręgowanych (Eames et al., 2010). 
W przypadku znieczulenia zimną wodą temperaturę należy obniżać powoli. Tempo obniżania wydaje się zależeć od wielkości ryby; mniejsze ryby zapadają w stan znieczulenia szybciej niż ryby większe. Po wstrzyknięciu można zaobserwować, że ryba zbyt wolno budzi się z narkozy (patrz. poniżej). Może to wynikać z faktu, że temperatura początkowa była zbyt niska lub temperatura została obniżona zbyt gwałtownie. Temperatura początkowa jest zbyt niska, jeśli ryba wygina się bocznie po zanurzeniu w wodzie. Jeśli temperatura początkowa jest prawidłowa, ryba początkowo zachowa równowagę. Przesunie płetwy piersiowe do pozycji poziomej, będzie łapać powietrze i wykaże szybkie ruchy operculum. Zazwyczaj będzie pływać. W miarę obniżania temperatury ruchy będą słabnąć, a ryba straci równowagę. Chirurgiczny poziom znieczulenia zostaje osiągnięty, gdy ryba nie reaguje na manipulacje. Aby utrzymać rybę w stanie znieczulenia chirurgicznego, palce muszą być zimne, dlatego należy trzymać je w wodzie przed kontaktem z rybą. Gąbka również musi być utrzymywana w niskiej temperaturze, identycznej z temperaturą wody użytej do znieczulenia ryby. Ważne jest, aby nasączyć gąbkę wodą wystarczająco zimną, by utrzymać znieczulenie po umieszczeniu na niej ryby.

Iniekcja: Przed przystąpieniem do iniekcji warto przeprowadzić sekcję co najmniej jednej ryby, aby ocenić grubość ściany ciała. Pomoże to określić, na jaką głębokość należy wprowadzić igłę, aby dostać się do jamy brzusznej. Ponadto podczas wprowadzania igły można wyczuć „opór” ściany ciała w momencie wniknięcia igły do jamy brzusznej. Podczas iniekcji należy podjąć kroki zapewniające dobrostan zwierzęcia. Należy upewnić się, że gąbka jest nasycona zimną wodą o odpowiedniej temperaturze, aby zapobiec wybudzeniu się ryby podczas zabiegu. Dobrze nasączona i miękka gąbka jest istotna dla zminimalizowania uszkodzeń łusek oraz warstwy śluzowej skóry. Dobrze nasączona gąbka jest również kluczowa dla zapewnienia napowietrzania skrzeli. Zdecydowanie zalecamy użycie gąbki piankowej wymienionej poniżej w sekcji Materiały. Na koniec, po znieczuleniu ryby, należy pracować szybko, aby zminimalizować czas przebywania zwierzęcia pod wpływem środka znieczulającego.

Wybudzanie: Ryba powinna dojść do siebie po znieczuleniu niemal natychmiast po wprowadzeniu do ciepłej wody w zbiorniku. Jeśli ryba nie zacznie od razu pływać, należy delikatnie zakręcić wodą w stronę skrzeli, aby przyspieszyć wybudzanie. Powolne wybudzanie świadczy o zbyt szybkim wprowadzeniu w stan znieczulenia i wymaga odpowiedniej korekty procedury znieczulania. Możliwe przyczyny powolnego wybudzania są omówione w sekcji Znieczulanie.

<table><tbody><tr><td>Gąbka piankowa</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa pudełka na końcówki do pipet</td><td></td><td></td><td>niezbyt głęboka, np. 1,5 cm</td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik do przechowywania</td><td></td><td></td><td>głęboki, np. 7 cm</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kruszony lód</td><td></td><td></td><td>przygotowany z wody kranowej</td></tr><tr><td>Ciepła woda kranowa</td><td></td><td></td><td>1 litr lub więcej</td></tr><tr><td>Zlewka 500 ml</td><td></td><td></td><td>do odważania</td></tr><tr><td>Strzykawka NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>lub strzykawka Hamiltona</td></tr><tr><td>Igła G35</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>skośna</td></tr><tr><td>Przewód Silflex</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>Pompa UltraMicroPump III i kontroler Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik nożny</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia spożywcza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli Cortland</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Wygodną metodą chemicznego traktowania rybek zebrafish jest wprowadzenie odczynnika do wody w zbiorniku, skąd zostanie on pobrany przez ryby. Metoda ta utrudnia jednak określenie ilości odczynnika wchłoniętego lub pobranego przez pojedynczą rybę. Niektóre pytania badawcze, szczególnie te związane z badaniami metabolicznymi, mogą zostać lepiej rozwiązane poprzez podanie każdej rybie określonej ilości substancji, w zależności od jej masy ciała. Przedstawiamy tutaj metodę iniekcji doszpikowej (IP) u dorosłych rybek zebrafish. Iniekcję wykonuje się w jamę brzuszną, za obrębiem pasa miednicznego. Procedura ta została zaadaptowana z metod weterynaryjnych stosowanych u większych ryb. Jest ona bezpieczna, ponieważ nie zaobserwowano żadnych śmiertelności. Dodatkowo krwawienie w miejscu iniekcji wystąpiło tylko w 5 ze 127 przypadków, a w każdym z nich krwawienie było krótkotrwałe, trwało kilka sekund, a utracona ilość krwi była niewielka. Sukces tej procedury wymaga delikatnego obchodzenia się z rybami na kilku etapach, w tym podczas głodzenia, ważenia, znieczulania, iniekcji i rekonwalescencji. Wymagane są środki ostrożności w celu zminimalizowania stresu podczas całej procedury. Nasze środki ostrożności obejmują zastosowanie małej objętości iniekcji oraz igły 35G. Jako nośnik stosujemy roztwór soli Cortland, który jest zrównoważony osmotycznie dla ryb słodkowodnych. Napowietrzanie skrzeli podczas procedury iniekcji jest utrzymywane poprzez wprowadzenie ryby w stan znieczulenia chirurgicznego, co pozwala na powolne ruchy pokrywy skrzelowej, a następnie poprzez trzymanie ryby w rynience wewnątrz nasączonej wodą gąbki podczas samej iniekcji. Przydatność iniekcji IP demonstrujemy poprzez podanie glukozy i monitorowanie wzrostu poziomu glukozy we krwi oraz jej późniejszy powrót do normy. Ponieważ wiadomo, że stres zwiększa poziom glukozy we krwi u ryb kostnoszkieletowych, porównujemy poziomy glukozy we krwi u dorosłych osobników po iniekcji nośnika oraz u osobników niepoddanych iniekcji, wykazując, że procedura nie powoduje istotnego wzrostu poziomu glukozy we krwi.

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Wygodną metodą chemicznej obróbki danio pręgowanych jest wprowadzenie odczynnika do wody w zbiorniku, skąd zostanie on pobrany przez ryby. Jednakże...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wstrzyknięcie roztworu do jamy otrzewnej dorosłego danio pręgowanego. W tym przykładzie w naszym laboratorium wstrzykniemy glukozę. Procedurę tę stosujemy w celu badania homeostazy glukozy we krwi.Jest to realizowane poprzez najpierw zważenie ryby w celu określenia ilości roztworu do wstrzyknięcia na gram masy ciała. Drugim krokiem procedury jest znieczulenie ryby zimną wodą. Trzecim krokiem procedury jest przeniesienie ryby na stoлик mikroskopu i wykonanie wstrzyknięcia.Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie ryby z powrotem w zbiorniku w celu rekonwalescencji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w homeostazie glukozy poprzez pomiar poziomu glukozy we krwi. Cześć, nazywam się Mary Kinkle i reprezentuję laboratorium Victorii Prince w Katedrze Biologii i Anatomii Organizmów na Uniwersytecie w Chicago.Jestem Stephanie Ames, również z laboratorium Prince'a. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę iniekcji doprzewnowej u dorosłych danio pręgowanych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji homeostazy glukozy we krwi.Zacznijmy zatem. Aby przygotować ryby do iniekcji, należy najpierw przenieść je do czystego zbiornika i zastosować głodówkę. Ryby należy trzymać bez pokarmu przez 24 godziny, aby opróżnić treść cebulki jelitowej, oraz przez 72 godziny, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do wartości bazowych.Gęstość zastosowana w tym protokole wynosi od 10 do 12 osobników populacji mieszanej płci na dziewięciolitrowy zbiornik z trzema warstwami kulistego żwiru; żwir izoluje jaja, zapobiegając ich zjadaniu. Codziennie usuwaj jaja i nieczystości poprzez syfonowanie zbiornika.Następnie przygotuj roztwór soli Cortland, używając 124,1 mM chlorku sodu, 5,1 mM chlorku potasu, 2,9 mM pirofosforanu sodu, 1,9 mM siarczanu magnezu siedmiowodnego, 1,4 mM chlorku wapnia dwuwodnego, 11,9 mM wodorowęglanu sodu, czterech gramów poliwinylopirorolidonu oraz 1000 jednostek USP heparyny, dołączając wodę dejonizowaną do uzyskania objętości końcowej 100 ml; przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 °C. Następnie rozpuść pięć gramów glukozy w 10 ml roztworu soli Cortland. Aby otrzymać roztwór glukozy o stężeniu 0,5 mg/µL, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 °C.Następnie przygotuj stół chirurgiczny, docinając miękką gąbkę do wysokości około 20 millimeter na płaskiej powierzchni. Wykonaj nacięcie o głębokości od 10 do 15 millimeter, aby unieruchomić rybę podczas wstrzykiwania. Umieść gąbkę w 60 millimeter szalce Petriego, a następnie włóż szalkę z gąbką do pokrywy pudełka na końcówki do pipety P 200.Następnie przygotuj mikroskop, osłaniając jego podstawę folią spożywczą i ręcznikami papierowymi w celu ochrony. Na wypadek rozlania cieczy ustaw stół chirurgiczny na ręczniku papierowym. Wstępnie dostrój ostrość, patrząc na stół chirurgiczny i ustawiając ostrość na gąbce.Połóż palec na gąbce i ustaw na niej ostrość, aby zminimalizować konieczność dalszej regulacji ogniskowej, gdy ryba znajdzie się na stole operacyjnym. Następnie zważ rybę, napełniając zlewkę o pojemności 500 ml w około jednej trzeciej wodą z systemu hodowlanego i tarytując wagę. Przenieś rybę wraz z siatką do zlewki, usuwając jak najwięcej nadmiaru wody, a następnie zapisz masę i przenieś każdą zważoną rybę do wyraźnie oznakowanego zbiornika.Oblicz objętość iniekcji na podstawie masy ciała. W tym przykładzie wstrzykniemy roztwór glukozy rozpuszczonej w roztworze soli Cortlanda w stężeniu 0,5 mg na gram masy ciała. Ponieważ nasz roztwór ma stężenie 0,5 mg/µL, obliczenie wygląda następująco: 1 × masa ryby w gramach = objętość do wstrzyknięcia w µL; przygotuj strzykawkę i powiązany sprzęt do iniekcji.W niniejszym protokole wykorzystuje się ściętą stalową igłę 30 5G, pompę ultra micro pump, procesor micro four processor oraz mikrostrzykawkę nano fill o pojemności 10 µL do iniekcji glukozy. Należy napełnić strzykawkę roztworem glukozy o stężeniu 0,5 mg/µL rozpuszczonej w roztworze soli Cortland. Ważne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza ze strzykawki. Następnie należy zamontować strzykawkę w pompie ultra micro pump i zaprogramować objętość iniekcji dla pierwszej ryby, wprowadzając wartość w nanolitrach za pomocą klawiatury numerycznej procesora micro four processor. Na koniec należy przygotować znieczulenie lodowe, krusząc odpowiednią ilość kostek lodu przygotowanych z wody stosowanej w rybiarni.Aby przygotować wiadro z lodem, umieść stół chirurgiczny w większym pojemniku, na przykład w gumowym pojemniku do przechowywania żywności o pojemności 2,4 litra. Wlej nieco ciepłej wody z sieci do zewnętrznego pojemnika oraz na stół chirurgiczny. W pobliżu należy przygotować zapasowy zbiornik z ciepłą wodą z sieci.Przymocuj termometr do zewnętrznego pojemnika. Umieść zewnętrzny pojemnik z anestetykiem wraz ze stołem chirurgicznym obok mikroskopu. Przygotuj w pobliżu wiadro z kruszonym lodem.Dodawać kawałki lodu, aż temperatura wody osiągnie 17 °C. W tym kroku nie należy schładzać wody poniżej 17 °C. Za pomocą siatki przenieść ryby do zewnętrznego pojemnika.W temperaturze 17 stopni lub nieco niższej ryba zazwyczaj rozpościera płetwy piersiowe poziomo, łapie powietrze i wykazuje szybkie ruchy skrzelami. Powoli dodawaj kostki lodu do naczynia, aby obniżyć temperaturę do 12 stopni Celsius w ciągu kilku minut. W miarę spadku temperatury ryba będzie pływać wolniej, aż w końcu przestanie się poruszać.Z czasem ryba przestanie gwałtownie otwierać pysk, a ruchy skrzela zwolnią. Ryba jest gotowa do iniekcji, gdy nie reaguje na manipulację. Po osiągnięciu wymaganej temperatury należy nacisnąć gąbkę, aby ją nasycić.Trzymaj palce w zimnej wodzie wystarczająco długo, aby nie ogrzały ryby i nie doprowadziły do jej wybudzenia z anestezji. Manipulując rybą zimnymi palcami, delikatnie przenieś ją do rynienki z gąbką. Ułóż rybę brzuchem do góry, tak aby skrzela znajdowały się w rynience.Szybko przenieś stół chirurgiczny na stolik mikroskopu. Pracując sprawnie, ostrożnie ustaw igłę tak, aby jej czubek był skierowany kranialnie i znajdował się bliżej obręczy miednicznej niż odbytu. Wprowadź igłę w linii środkowej pomiędzy płetwami brzusznymi.Powinieneś wyczuć moment, w którym igła przebija ścianę ciała. Podczas wprowadzania igły można poczuć opór ściany ciała, który następnie ustępuje. Gdy igła wniknie do jamy brzusznej, wstrzyknij odpowiednią objętość za pomocą mikroprocesora.Użyj pedału sterującego, aby wstrzyknąć 1 µL na gram masy ciała ryby. Po wstrzyknięciu wyjmij igłę i natychmiast przenieś rybę z powrotem do zbiornika z ciepłą wodą w celu rekonwalescencji. Po zwolnieniu ryby z gąbki nad wodą w zbiorniku, sprawdź igłę pod mikroskopem. Sporadycznie może do niej przywrzeć łuska, którą należy usunąć przed kolejnym wstrzyknięciem.Po odpowiednim czasie przystąp do dalszej analizy. Stwierdzono, że do obniżenia poziomu glukozy we krwi do poziomu bazowego przed wstrzyknięciem wymagany jest 72-godzinny post. Na tym rysunku dane kontrolne dla grupy niewstrzykniętej, przedstawione na zielono, wykazują wartości glukozy we krwi, które nie różnią się znacząco od danych kontrolnych dla grupy wstrzykniętej nośnikiem, przedstawionych tutaj na czerwono.Niebieska linia przedstawia wartości glukozy we krwi ryb, którym wstrzyknięto glukozę, oraz ukazuje wzrost i spadek poziomu glukozy w krwiobiegu. Z biegiem czasu zarówno zwierzęta, którym wstrzyknięto glukozę, jak i te, którym podano placebo, znajdowały się pod wpływem znieczulenia chirurgicznego podczas procedury iniekcji, podczas gdy kontrole nieiniekcyjne nie były znieczulone chirurgicznie. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania iniekcji dosytnnej u dorosłych rybek zebrafish.W naszym laboratorium badamy zmiany stężenia glukozy we krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu dojamowym (IP) roztworu glukozy. Jednak technika, którą właśnie zaprezentowaliśmy, może być wykorzystana do podania dowolnego interesującego badacza roztworu. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o powolnym znieczuleniu ryby i delikatnym obchodzeniu się z nią.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie do jamy otrzewnej u dorosłych danio pręgowanego

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania domięśniowego w celu dostarczania związków do mięśni grzbietowych dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie domięśniowe (IM): Podanie związku do mięśnia grzbietowego dorosłego danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę dostarczania związków do serca dorosłego danio pręgowanego za pomocą iniekcji dopiersiowej.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej: podanie związku do serca dorosłego danio pręgowanego

Ta metoda polega na wstrzyknięciu 0,5−3 μL roztworu do klatki piersiowej dorosłego danio pręgowanego. Procedura skutecznie dostarcza białka i związki chemiczne w pobliże serca danio pręgowanego, nie uszkadzając przy tym narządu. Podejście to nadaje się do badania wpływu czynników egzogennych na różne tkanki serca.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej w celu zbadania serca dorosłego danio pręgowanego

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Podejścia genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Jamesa do wstrzykiwania dsRNA samicom komarów A. aegypti, będących nosicielami wirusa dengue. Przedstawiono technikę kalibracji igieł wstrzykujących, obsługi zestawu do iniekcji oraz wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej.

Iniekcja dsRNA do samic komarów A. aegypti

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Naucz się techniki wstrzyknięcia dootrzewnowego u dorosłych Danio rerio przy użyciu mikrostrzykawki i znieczulenia zimną wodą. Ta metoda umożliwia badanie homeostazy glukozy we krwi.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Przeglądaj więcej filmów