Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych
30 sierpnia 2010
Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wstrzyknięcie roztworu do jamy otrzewnej dorosłego danio pręgowanego. W tym przykładzie w naszym laboratorium wstrzykniemy glukozę. Procedurę tę stosujemy w celu badania homeostazy glukozy we krwi.
Jest to realizowane poprzez najpierw zważenie ryby w celu określenia ilości roztworu do wstrzyknięcia na gram masy ciała. Drugim krokiem procedury jest znieczulenie ryby zimną wodą. Trzecim krokiem procedury jest przeniesienie ryby na stoлик mikroskopu i wykonanie wstrzyknięcia.
Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie ryby z powrotem w zbiorniku w celu rekonwalescencji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w homeostazie glukozy poprzez pomiar poziomu glukozy we krwi. Cześć, nazywam się Mary Kinkle i reprezentuję laboratorium Victorii Prince w Katedrze Biologii i Anatomii Organizmów na Uniwersytecie w Chicago.
Jestem Stephanie Ames, również z laboratorium Prince'a. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę iniekcji doprzewnowej u dorosłych danio pręgowanych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji homeostazy glukozy we krwi.
Zacznijmy zatem. Aby przygotować ryby do iniekcji, należy najpierw przenieść je do czystego zbiornika i zastosować głodówkę. Ryby należy trzymać bez pokarmu przez 24 godziny, aby opróżnić treść cebulki jelitowej, oraz przez 72 godziny, aby obniżyć poziom glukozy we krwi do wartości bazowych.
Gęstość zastosowana w tym protokole wynosi od 10 do 12 osobników populacji mieszanej płci na dziewięciolitrowy zbiornik z trzema warstwami kulistego żwiru; żwir izoluje jaja, zapobiegając ich zjadaniu. Codziennie usuwaj jaja i nieczystości poprzez syfonowanie zbiornika.
Następnie przygotuj roztwór soli Cortland, używając 124,1 mM chlorku sodu, 5,1 mM chlorku potasu, 2,9 mM pirofosforanu sodu, 1,9 mM siarczanu magnezu siedmiowodnego, 1,4 mM chlorku wapnia dwuwodnego, 11,9 mM wodorowęglanu sodu, czterech gramów poliwinylopirorolidonu oraz 1000 jednostek USP heparyny, dołączając wodę dejonizowaną do uzyskania objętości końcowej 100 ml; przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 °C. Następnie rozpuść pięć gramów glukozy w 10 ml roztworu soli Cortland. Aby otrzymać roztwór glukozy o stężeniu 0,5 mg/µL, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 °C.
Następnie przygotuj stół chirurgiczny, docinając miękką gąbkę do wysokości około 20 millimeter na płaskiej powierzchni. Wykonaj nacięcie o głębokości od 10 do 15 millimeter, aby unieruchomić rybę podczas wstrzykiwania. Umieść gąbkę w 60 millimeter szalce Petriego, a następnie włóż szalkę z gąbką do pokrywy pudełka na końcówki do pipety P 200.
Następnie przygotuj mikroskop, osłaniając jego podstawę folią spożywczą i ręcznikami papierowymi w celu ochrony. Na wypadek rozlania cieczy ustaw stół chirurgiczny na ręczniku papierowym. Wstępnie dostrój ostrość, patrząc na stół chirurgiczny i ustawiając ostrość na gąbce.
Połóż palec na gąbce i ustaw na niej ostrość, aby zminimalizować konieczność dalszej regulacji ogniskowej, gdy ryba znajdzie się na stole operacyjnym. Następnie zważ rybę, napełniając zlewkę o pojemności 500 ml w około jednej trzeciej wodą z systemu hodowlanego i tarytując wagę. Przenieś rybę wraz z siatką do zlewki, usuwając jak najwięcej nadmiaru wody, a następnie zapisz masę i przenieś każdą zważoną rybę do wyraźnie oznakowanego zbiornika.
Oblicz objętość iniekcji na podstawie masy ciała. W tym przykładzie wstrzykniemy roztwór glukozy rozpuszczonej w roztworze soli Cortlanda w stężeniu 0,5 mg na gram masy ciała. Ponieważ nasz roztwór ma stężenie 0,5 mg/µL, obliczenie wygląda następująco: 1 × masa ryby w gramach = objętość do wstrzyknięcia w µL; przygotuj strzykawkę i powiązany sprzęt do iniekcji.
W niniejszym protokole wykorzystuje się ściętą stalową igłę 30 5G, pompę ultra micro pump, procesor micro four processor oraz mikrostrzykawkę nano fill o pojemności 10 µL do iniekcji glukozy. Należy napełnić strzykawkę roztworem glukozy o stężeniu 0,5 mg/µL rozpuszczonej w roztworze soli Cortland. Ważne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza ze strzykawki. Następnie należy zamontować strzykawkę w pompie ultra micro pump i zaprogramować objętość iniekcji dla pierwszej ryby, wprowadzając wartość w nanolitrach za pomocą klawiatury numerycznej procesora micro four processor. Na koniec należy przygotować znieczulenie lodowe, krusząc odpowiednią ilość kostek lodu przygotowanych z wody stosowanej w rybiarni.
Aby przygotować wiadro z lodem, umieść stół chirurgiczny w większym pojemniku, na przykład w gumowym pojemniku do przechowywania żywności o pojemności 2,4 litra. Wlej nieco ciepłej wody z sieci do zewnętrznego pojemnika oraz na stół chirurgiczny. W pobliżu należy przygotować zapasowy zbiornik z ciepłą wodą z sieci.
Przymocuj termometr do zewnętrznego pojemnika. Umieść zewnętrzny pojemnik z anestetykiem wraz ze stołem chirurgicznym obok mikroskopu. Przygotuj w pobliżu wiadro z kruszonym lodem.
Dodawać kawałki lodu, aż temperatura wody osiągnie 17 °C. W tym kroku nie należy schładzać wody poniżej 17 °C. Za pomocą siatki przenieść ryby do zewnętrznego pojemnika.
W temperaturze 17 stopni lub nieco niższej ryba zazwyczaj rozpościera płetwy piersiowe poziomo, łapie powietrze i wykazuje szybkie ruchy skrzelami. Powoli dodawaj kostki lodu do naczynia, aby obniżyć temperaturę do 12 stopni Celsius w ciągu kilku minut. W miarę spadku temperatury ryba będzie pływać wolniej, aż w końcu przestanie się poruszać.
Z czasem ryba przestanie gwałtownie otwierać pysk, a ruchy skrzela zwolnią. Ryba jest gotowa do iniekcji, gdy nie reaguje na manipulację. Po osiągnięciu wymaganej temperatury należy nacisnąć gąbkę, aby ją nasycić.
Trzymaj palce w zimnej wodzie wystarczająco długo, aby nie ogrzały ryby i nie doprowadziły do jej wybudzenia z anestezji. Manipulując rybą zimnymi palcami, delikatnie przenieś ją do rynienki z gąbką. Ułóż rybę brzuchem do góry, tak aby skrzela znajdowały się w rynience.
Szybko przenieś stół chirurgiczny na stolik mikroskopu. Pracując sprawnie, ostrożnie ustaw igłę tak, aby jej czubek był skierowany kranialnie i znajdował się bliżej obręczy miednicznej niż odbytu. Wprowadź igłę w linii środkowej pomiędzy płetwami brzusznymi.
Powinieneś wyczuć moment, w którym igła przebija ścianę ciała. Podczas wprowadzania igły można poczuć opór ściany ciała, który następnie ustępuje. Gdy igła wniknie do jamy brzusznej, wstrzyknij odpowiednią objętość za pomocą mikroprocesora.
Użyj pedału sterującego, aby wstrzyknąć 1 µL na gram masy ciała ryby. Po wstrzyknięciu wyjmij igłę i natychmiast przenieś rybę z powrotem do zbiornika z ciepłą wodą w celu rekonwalescencji. Po zwolnieniu ryby z gąbki nad wodą w zbiorniku, sprawdź igłę pod mikroskopem. Sporadycznie może do niej przywrzeć łuska, którą należy usunąć przed kolejnym wstrzyknięciem.
Po odpowiednim czasie przystąp do dalszej analizy. Stwierdzono, że do obniżenia poziomu glukozy we krwi do poziomu bazowego przed wstrzyknięciem wymagany jest 72-godzinny post. Na tym rysunku dane kontrolne dla grupy niewstrzykniętej, przedstawione na zielono, wykazują wartości glukozy we krwi, które nie różnią się znacząco od danych kontrolnych dla grupy wstrzykniętej nośnikiem, przedstawionych tutaj na czerwono.
Niebieska linia przedstawia wartości glukozy we krwi ryb, którym wstrzyknięto glukozę, oraz ukazuje wzrost i spadek poziomu glukozy w krwiobiegu. Z biegiem czasu zarówno zwierzęta, którym wstrzyknięto glukozę, jak i te, którym podano placebo, znajdowały się pod wpływem znieczulenia chirurgicznego podczas procedury iniekcji, podczas gdy kontrole nieiniekcyjne nie były znieczulone chirurgicznie. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania iniekcji dosytnnej u dorosłych rybek zebrafish.
W naszym laboratorium badamy zmiany stężenia glukozy we krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu dojamowym (IP) roztworu glukozy. Jednak technika, którą właśnie zaprezentowaliśmy, może być wykorzystana do podania dowolnego interesującego badacza roztworu. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o powolnym znieczuleniu ryby i delikatnym obchodzeniu się z nią.
To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia procedurę wstrzykiwania dos Tritonowych u dorosłych danio-zebry z wykorzystaniem mikrostrzykawki NanoFil oraz znieczulenia zimną wodą. Metoda ta jest ukierunkowana na badanie homeostazy glukozy we krwi poprzez precyzyjne iniekcje.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Fizjologia
Wprowadzenie
- Iniekcje doszpikowe są niezbędne do dostarczania substancji bezpośrednio do jamy otrzewnej.
- Danio przebrósław (Zebrafish) stanowią cenny model organizmu do badania procesów metabolicznych.
- Zrozumienie regulacji glikemii jest kluczowe dla uzyskania wglądu w zaburzenia metaboliczne.
- Stosowanie znieczulenia jest konieczne w celu zminimalizowania stresu podczas procedury.
Cel badania
- Zaprezentowanie niezawodnej metody iniekcji doprzewnowej u rybek zebrafish.
- Ułatwienie badań nad homeostazą glukozy i jej regulacją.
- Dostarczenie protokołu, który może być powtórzony w innych laboratoriach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ryb poprzez głodzenie i ważenie w celu ustalenia objętości wstrzykiwanej substancji.
- Znieczulenie ryb zimną wodą w celu zapewnienia minimalnej ruchomości podczas wstrzykiwania.
- Wstrzyknięcie roztworu glukozy do jamy otrzewnej przy użyciu precyzyjnej mikrostrzykawki.
- Monitorowanie rekonwalescencji ryb po wstrzyknięciu w celu oceny wpływu procedury.
Główne wyniki
- Procedura ta pozwala na skuteczne wstrzykiwanie substancji dorosłym danio prążkowanym.
- Po wstrzyknięciu można zmierzyć poziom glukozy we krwi w celu zbadania zmian metabolicznych.
- Ryby dobrze regenerują się po zabiegu, co świadczy o skuteczności zastosowanej anestezji.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia homeostazy glukozy u danio prążkowanego.
Wnioski
- Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie dla badaczy analizujących procesy metaboliczne u danio przebraniego.
- Iniekcja doszpikowa jest wykonalną i skuteczną techniką podawania roztworów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu zbadania różnych stanów metabolicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne dostarczanie związków w organizmie danio przebraniego umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka celów metabolicznych poprzez ustanowienie zależności dawka-odpowiedź w systemie kręgowców. Podejście to wspomaga walidację celu poprzez kontrolowaną perturbację homeostazy glukozy, co zmniejsza niejednoznaczność w badaniu szlaków sygnałowych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, zapewniając ilościowe i powtarzalne odczyty fenotypowe istotne dla modelowania chorób metabolicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez podawanie określonych dawek w celu oceny zaangażowania celu w szlakach regulacji glukozy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną administrację związku w celu zminimalizowania zmienności w ocenie fenotypu metabolicznego.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośredni pomiar zmian poziomu glukozy we krwi jako funkcjonalnego odczytu modulacji celu metabolicznego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe pomiary zmiennej zależnej (poziom glukozy we krwi), co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź w celu identyfikacji związków wiodących.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje objętość iniekcji w zależności od masy ryby, co poprawia powtarzalność testu w różnych seriach eksperymentalnych.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analiz w ramach workflow screeningu metabolicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Przystaje do systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez modelowanie zaburzeń homeostazy glukozy związanych z patofizjologią cukrzycy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójność proceduralną dzięki standaryzowanym protokołom głodzenia, znieczulenia i iniekcji, co wspiera powtarzalność wyników między laboratoriami.
- Wartość naukowa: Umożliwia mechaniczną ocenę ryzyka poprzez odizolowanie efektu wstrzykniętych związków od wzrostu poziomu glukozy wywołanego stresem dzięki zastosowaniu kontroli nośnika.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – zapewniając niezawodny sposób podawania związków w badaniach metabolicznych na rybakach danaonach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków regulacji glukozy poprzez umożliwienie precyzyjnego podawania związków dorosłym danio pręgowanym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanym, opartym na masie ciele objętościom iniekcji, co gwarantuje spójną ekspozycję na związek.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów glukozy we krwi, co umożliwia porównanie odpowiedzi metabolicznych w różnych grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu modelu kręgowca o zachowanych mechanizmach homeostazy glukozy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość powtarzalnego przesiewania fenotypów metabolicznych dla wielu serii związków i klas celów molekularnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w analizie szlaków metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki określonym objętościom iniekcji i kontrolowanym procedurom znieczulenia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie jasnych danych o zależności dawka-odpowiedź w modulacji homeostazy glukozy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane efekty metaboliczne w systemie całego organizmu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi rybek danio-ostrobramowych, anestezji oraz technik wstrzykiwania za pomocą mikrostrzykawek.
- Metoda zależy od dostępu do nanopomp, strzykawek NanoFil oraz zestawów do anestezji z kontrolą temperatury.
- Konieczna jest standaryzacja czasu głodówki, pomiaru masy oraz obliczania objętości iniekcji pomiędzy zespołami.
- Wymagane jest uwzględnienie dostosowań w zależności od rozpuszczalności różnych związków i objętości iniekcji w nośniku w postaci roztworu soli Cortlanda.
- Ograniczeniem są umiejętności techniczne niezbędne do utrzymania napowietrzania skrzeli i uniknięcia urazów w miejscu wstrzyknięcia podczas wykonywania procedury.
