Name: Wyprowadzenie linii komórek T chłoniaka grasicy od myszy Atm-/- i p53-/- (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 59 s
Description: Poznaj protokół wyprowadzania linii komórkowych chłoniaka grasicy od myszy Atm-/- i p53-/-. Ta metoda umożliwia badanie biologii nowotworów T-komórkowych i mechanizmów supresji guzów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr. Borisowi Reizisowi z Katedry Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Columbia za pomocne dyskusje. Pragniemy również podziękować dr Margaret Bynoe, dr. Rodmanowi Getchellowi oraz Deequi Mahamed z Katedry Mikrobiologii i Immunologii w College of Veterinary Medicine na Uniwersytecie Cornella za pomoc techniczną w zakresie cytometrii przepływowej oraz Lu Huang za pomoc w montażu wideo. Autorzy dziękują również członkom laboratoriów Duhamela i Weissa za krytyczną recenzję manuskryptu i produkcji wideo, a Stephanie Yazinski z laboratorium Weissa za hodowlę i genotypowanie myszy p53-/- . Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella. Niniejsze badania były częściowo finansowane ze środków przekazanych przez Departament Rolnictwa USA, Cooperative State Research, Education, and Extension Service, Animal Health and Disease Research Program (dla G.E.D. i R.S.W.) oraz z grantów NIH R03 HD058220 i R01CA108773 (dla R.S.W). Materiał wideo został zrealizowany we własnych zasobach przez personel laboratoriów Duhamela i Weissa.

1. Wycięcie guza
<ol>
	<li>Do wycięcia guza należy użyć czystego ręcznika papierowego lub jednorazowej ściereczki chirurgicznej umieszczonej na podkładce do sekcji i spryskać ją 70% etanolem.</li>
	<li>Myszy w tym protokole są rutynowo uśmiercane za pomocą CO2. Uśmierconą mysz należy umieścić na podkładce do sekcji i spryskać obie strony ciała etanolem. Myszy unieruchamia się na podkładce za pomocą czterech lub więcej pinezek wbitych w kończyny, a następnie dokładnie spryskuje 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek należy wykonać cięcie skóry wzdłuż linii środkowej od łonka do podstawy głowy, unikając uszkodzenia leżących poniżej mięśni i penetracji jam ciała.</li>
	<li>Otworzyć jamę brzuszną za pomocą nowej pary sterylnych nożyczek i pęsety, uważając, aby nie uszkodzić narządów wewnętrznych.</li>
	<li>Otworzyć jamę klatki piersiowej, rozcinając i odchylając klatkę piersiową, aby odsłonić guz, nie uszkadzając naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Oddzielić guz od innych narządów i przenieść fragment stanowiący około 40-50% całkowitej masy guza (wielkością do około 1,5 X 0,8 X 0,8 cm) do zimnego PBS przechowywanego w lodzie.</li>
	<li>Pozostałą część guza można zachować do innych analiz; w tym czasie można również przeprowadzić pełną nekropsję.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek chłoniaka
<ol>
	<li>Spryskać probówkę zawierającą wypreparowany guza 70% etanolem i przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Dodać 10 mL pożywki hodowlanej do sterylnej szalki Petriego o powierzchni 150 mm2.</li>
	<li>Przenieść fragment guza do szalki Petriego, delikatnie odsysając go pipetą.</li>
	<li>Zgiąć dwie sterylne igły o rozmiarze 18 G tak, aby ścięta strona była skierowana na zewnątrz.</li>
	<li>Rozdrobić guz za pomocą zgiętych igieł.</li>
	<li>Zawirować szalką, delikatnie postukać i ustawić pod kątem, aby zebrać zawiesinę komórkową z boku, unikając przy tym dużych fragmentów guza.</li>
	<li>Odssać zawiesinę komórkową i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mL, unikając dużych fragmentów guza.</li>
	<li>Przepłukać szalkę 10 mL pożywki i przenieść płyn do tej samej probówki, unikając dużych fragmentów guza.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową składającą się z limfocytów i komórek zrębu, a następnie przenieść 5 mL do kolby hodowlanej T-25 oraz 10 mL do kolby hodowlanej T-75. Delikatnie zakręcić kolbami.</li>
	<li>Wykorzystać pozostałą zawiesinę komórkową do przygotowania rozcieńczeń 2-, 4-, 10-, 100- i 1000-krotnych w końcowej objętości 2,5 mL (hodowanie komórek przy różnych gęstościach z użyciem kilku rodzajów naczyń hodowlanych maksymalizuje szansę na ustanowienie linii komórek T).</li>
	<li>Nanieść po 2,0 mL każdego rozcieńczenia do poszczególnych studni płytki 6-dołkowej. Delikatnie zakręcić płytką.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 48 h w nawilżonej atmosferze CO2.</li>
</ol>
3. Karmienie komórek chłoniaka
<ol>
	<li>Po 48 h inkubacji dodać 5 mL pożywki do kolby T-25 oraz 10 mL pożywki do kolby T-75, wlewając płyn po ściance, aby zminimalizować zakłócanie komórek.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodać 2 mL pożywki, wlewając płyn po ściance, aby zminimalizować zakłócanie komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki przez kolejne 72 h.</li>
</ol>
4. Pasażowanie komórek chłoniaka
<ol>
<li>Pierwsze pasażowanie
<ol>
<li>Pod koniec piątego dnia inkubacji komórki są pasażowane w stosunku 1:1, przy zachowaniu oryginalnych kolb i płytek (utrzymanie gęstości komórek na poziomie około 3x106/ mL podczas pierwszych pasażowań sprzyja pomyślnemu ustanowieniu ciągłej linii komórkowej).
<ol class="lalpha">
<li>W przypadku kolby T-25, przenieś 5 mL zawiesiny komórkowej do nowej kolby zawierającej 5 mL medium. Do oryginalnej kolby dodaj 5 mL medium.</li>
<li>W przypadku kolby T-75, przenieś 10 mL zawiesiny komórkowej do nowej kolby zawierającej 10 mL medium. Do oryginalnej kolby dodaj 10 mL medium.</li>
<li>W przypadku płytki 6-dołkowej, przenieś 2 mL zawiesiny komórkowej z każdego dołka do odpowiadających im dołków nowej płytki zawierającej 2 mL medium w każdym dołku. Do każdego z oryginalnych dołków dodaj 2 mL medium.</li>
</ol>
</li>
<li>Inkubuj wszystkie kolby i płytki przez kolejne 72 h. Z naszego doświadczenia wynika, że większość linii komórkowych zostaje ustanowiona z tych kultur z pierwszego pasażu (obecność słabo przylegających agregatów komórek w zawiesinie nad przytwierdzonymi komórkami zrębowymi jest wczesnym wskaźnikiem ustanowienia linii komórkowej).</li>
<li>W przypadku kultur z mniejszą liczbą lub brakiem słabo przylegających agregatów komórek w zawiesinie, odnawiaj medium w kolbach lub płytkach, ostrożnie wymieniając około 50% medium co 72 h. Aby uniknąć usunięcia komórek z oryginalnej kultury, naczynia hodowlane pozostawia się w spoczynku przez co najmniej 5 min, aby komórki mogły osiąść na dnie pod wpływem grawitacji przed delikatną aspiracją supernatantu medium.</li>
</ol>
</li>
<li>Utrzymywanie ustanowionych linii komórkowych
<ol>
<li>Ustanowione linie komórkowe są pasażowane do nowych kolb i płytek. Dla kolb T-25 i T-75 dodaj 5 mL oryginalnej zawiesiny lub zawiesiny z pierwszego pasażu do 5 mL medium. Dla płytek 6-dołkowych dodaj 3 mL oryginalnej zawiesiny komórkowej lub zawiesiny z pierwszego pasażu do 7 mL medium w kolbie T-25. Odnawiaj i zachowuj oryginalną kulturę lub kulturę z pierwszego pasażu, zastępując usuniętą objętość świeżym medium hodowlanym.</li>
<li>Pasażuj ustanowione linie komórkowe do nowych kolb T-25. Linie komórkowe mają czas podwojenia wynoszący 18-24 h. Kultury są rutynowo utrzymywane przy gęstości 1-3x106/ mL i pasażowane co 3 dni. Dodaj wymaganą objętość kultury z poprzedniego pasażu do nowego medium, aby uzyskać łącznie 10 mL. Odnawiaj i zachowuj oryginalną kulturę.</li>
<li>Po kilku pasażach komórki nieprzylegające będą samopodtrzymujące się bez przylegających komórek zrębowych, a z każdym pasażem przenoszona będzie mniejsza liczba komórek przylegających. Od tego momentu kultury mogą być utrzymywane w kolbach T-25 nieprzeznaczonych do hodowli tkanek (non-tissue culture treated).</li>
</ol>
</li>
</ol>
5. Mrożenie i regeneracja linii komórkowych chłoniaka
<ol>
	<li>Linie komórkowe mrozi się w świeżo przygotowanej pożywce RPMI 1640 zawierającej 20% FBS i 10% DMSO.</li>
	<li>Komórki z 48-godzinnej hodowli w kolbie T-25 (około 1,5x106 komórek/mL) wiruje się przy 1500 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po odlaniu supernatantu komórki resuspenduje się w 2 mL zimnej pożywki do mrożenia. Dwie objętości po 1,0 mL zawiesiny komórkowej z każdej kolby przenosi się do fiolek do mrożenia, natychmiast zamraża w -80°C, a następnego dnia przenosi do ciekłego azotu.</li>
	<li>Komórki odzyskuje się z przechowywania w ciekłym azocie poprzez szybkie rozmrażanie i resuspensję zawartości w 10 mL świeżej pożywki hodowlanej. Alternatywnie, świeżo rozmrożone komórki przemywa się raz w ciepłej pożywce hodowlanej w celu usunięcia DMSO przed resuspensją w 10 mL świeżej pożywki hodowlanej. Komórki hoduje się przez co najmniej 72 h przed kolejnym pasażem.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Linia komórek T Atm-/- opracowana zgodnie z tym protokołem i oznaczona jako DWJ-Atm-1 została scharakteryzowana poprzez barwienie przeciwciałami anty-CD3-FITC, anty-CD4-APC i anty-CD8-PE oraz analizę cytometryczną (Rycina 1). Ponad 90% komórek T było potrójnie dodatnich dla CD3, CD4 i CD8.
<img src="/files/ftp_upload/2598/2598fig1.jpg" alt="Wykres kropkowy i tabela z cytometrii przepływowej; analiza markerów CD; CD8-PE vs. CD4-APC; ekspresja powierzchniowa komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Charakterystyka linii komórek T opracowanej zgodnie z niniejszym protokołem.
Markery powierzchniowe ustalonej linii komórkowej Atm-/- oznaczonej jako DWJ-Atm-1 scharakteryzowano poprzez barwienie przeciwciałami anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE oraz analizę cytometryczną. W skrócie, 1X106 świeżych komórek przemyto raz w zimnym PBS (1500 rpm/5 min), a następnie inkubowano w temperaturze 4°C przez 10 min z 200 μL koktajlu przeciwciał (każde przeciwciało w rozcieńczeniu 1:200 w PBS z 1% BSA). Komórki można analizować natychmiast po przygotowaniu lub utrwalić do późniejszej analizy. Komórki utrwalone przygotowuje się poprzez dodanie neutralnego buforowanego formaliny do końcowego stężenia 4% (obj./obj.) i inkubowanie w temperaturze 4°C przez 30 min, a następnie odwirowanie (1500 rpm/5 min) i resuspensję w 200 μL PBS z 1% BSA. Łącznie 1 X 104 komórek przeanalizowano przy użyciu analizatora BD FACS Calibur oraz oprogramowania CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA).

<ol><li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm-deficient+mice%3A+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li>
<li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li>
<li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Atm-%2F-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li>
<li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li>
<li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li>
<li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL%2FLMO1+double+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li>
<li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li>
<li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole przedstawiamy szczegółowe procedury ustanawiania mysich linii komórkowych limfocytów T pochodzących z dwóch różnych genotypów myszy: Atm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] oraz p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J]. Stosując ten protokół, w naszym laboratorium ustanowiono łącznie 6 (z 7 prób) mysich linii T Atm-/- oraz trzy (z 5 prób) mysie linie T p53-/-. Reprezentatywne dane wykazujące, że linia ko...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Pojemnik z lodem&lt;/li&gt;&lt;li&gt;70% etanol&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Podkładka do sekcji składająca się z bloku piankowego pokrytego folią aluminiową oraz szpilek&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Dwa zestawy małych sterylnych nożyczek i pincet&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylne 150 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; szalka Petriego (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; kat. nr 08-757-13)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylne igły o rozmiarze 18 G&lt;/li&gt;&lt;li&gt;probówki stożkowe 50 mL (Corning Inc., Corning NY; kat. nr 430829)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10% buforowana formalina&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Kolby do hodowli tkanek &lt;ul&gt;&lt;li&gt;T-25 (TPP, Trasadingen, Szwajcaria; kat. nr 90025)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;T-75 (TPP, Trasadingen, Szwajcaria; kat. nr 90075)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;płytki 6-dołkowe (Corning Inc., Corning NY; kat. nr 3506)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylny roztwór soli fosforanowo-buforowy pH 7,2 (PBS)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Pożywka hodowlana &lt;ul&gt;&lt;li&gt;RPMI 1640 z 25 mM HEPES, 200 mM L-glutaminą (Lonza, Walkersville, MD; nr kat. 12-115F) uzupełnione o następujące składniki:&lt;ul&gt;&lt;li&gt;10% inaktywowanego ciepłem (56&amp;#x00B0;C, 30 min) płatowa surowica bydlęca (FBS; Hyclone, Logan, UT; kat# SH30088.03)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;1% penicyliny i streptomycyny (Mediatech, Manassas, VA; kat# 30-002-CI)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;1% nieistotnych aminokwasów (Mediatech; kat#25-025-CI)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;55 mM 2&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol (Sigma, St Louis, MO; kat#M752)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Dimetylosulfotlenek (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; nr kat. 317275)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Przeciwciała (eBioScience, San Diego, CA)&lt;ul&gt;&lt;li&gt;anty-CD3-FITC (kat. #11-0031-85)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;anty-CD4-APC (kat. nr 17-0041-83)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;anty-CD8-PE (kat. nr 12-081-85)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Albumin surowicy bydlęcej (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; nr kat. 11018-017)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Konkanawalina A (Sigma kat. nr C5275)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;probówki do mrożenia 1,8 ml (Nunc, Roskilde, Dania; nr kat. 368632)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie linii komórkowych limfomy grasicy z myszy atm-/- i p53-/-

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Ustanowione linie komórkowe są krytycznym narzędziem badawczym, które może ograniczyć wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych w badaniach. Pewne szczepy genetycznie zmodyfikowanych myszy, takie jak Atm-/- i p53-/-, konsekwentnie rozwijają chłoniaka grasicy wczesną fazą życia 1,2, a tym samym mogą służyć jako niezawodne źródło do wyprowadzania mysich linii komórek T. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół opracowania ustanowionych mysich linii komórek T z chłoniaka grasicy bez konieczności dodawania interleukiny, co było opisane w poprzednich protokołach 1,3. Guzy pobierano od myszy w wieku od trzech do sześciu miesięcy, przy pierwszych oznakach widocznych nowotworów, opierając się na obserwacji zgarbionej postawy, trudnościach w oddychaniu, zaniedbaniu pielęgnacji oraz wyniszczeniu organizmu u szczepów podatnych 1,4. Z sukcesem ustanowiliśmy kilka linii komórek T, stosując ten protokół i inbredowe szczepy myszy Atm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 oraz p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5. Wykazaliśmy ponadto, że ponad 90% ustanowionej populacji komórek T wykazuje ekspresję CD3, CD4 i CD8. Zgodnie z cechami stabilnie ustanowionych linii komórkowych, komórki T wygenerowane przy użyciu niniejszego protokołu były pasażowane przez ponad rok.

W tym filmie prezentujemy protokół tworzenia linii komórkowych chłoniaka grasiczego myszy. Postępując zgodnie z tym protokołem, z sukcesem stworzyliśmy kilka linii komórek T z myszy Atm-/- i p53-/- z chłoniakiem grasiczym.

Wytwarzanie linii komórkowych limfomy grasicy z myszy Atm-/- i p53-/-

Ustanowione linie komórkowe są krytycznym narzędziem badawczym, które może ograniczyć wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych w badaniach. Niektóre szczepy genetycznie zmodyfikowanych...

W tym filmie prezentujemy protokół tworzenia linii chłoniaka grasicy myszy. Linie komórkowe. Guzy pobrano od myszy w wieku od trzech do sześciu miesięcy, w momencie najwcześniejszego pojawienia się widocznych zmian nowotworowych.Na podstawie obserwacji zgarbionej postawy, utrudnionego oddychania, zaniedbania pielęgnacji ciała oraz wyniszczenia organizmu, z powodzeniem ustanowiliśmy kilka linii komórkowych chłoniaka grasicy ATM null i P 53 null, stosując niniejszy protokół. W pierwszej części opisujemy sposób pobierania chłoniaka grasicy od myszy z nowotworem. Myszy w tym protokole są rutynowo uśmiercane za pomocą dwutlenku węgla.Połóż czysty ręcznik papierowy na podkładce sekcyjnej i spryskaj go 70% etanolem. Umieść uśpioną mysz na podkładce sekcyjnej. Spryskaj zwierzę etanolem z obu stron.Przytwierdź mysz do podkładki sekcyjnej za pomocą szpilek i dokładnie spryskaj 70% etanolem. Rozetnij skórę, używając sterylnych nożyczek i pęsety, uważając, aby nie uszkodzić jam ciała. Otwórz jamę brzuszną, używając nowej pary sterylnych narzędzi.Należy uważać, aby nie uszkodzić żadnego z organów. Otwórz jamę klatki piersiowej, rozcinając i odchylając klatkę piersiową, aby odsłonić guz, nie usz

derivation-of-thymic-lymphoma-t-cell-lines-from-atm-and-p53-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pochodzenie linii komórek chłoniaka tymusowego z myszy Atm-/- i p53-/-

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Poznaj protokół wyprowadzania linii komórkowych chłoniaka grasicy od myszy Atm-/- i p53-/-. Ta metoda umożliwia badanie biologii nowotworów T-komórkowych i mechanizmów supresji guzów.

Wytwarzanie linii komórkowych limfomy grasicy z myszy Atm^-/- i p53^-/-

Przeglądaj więcej filmów