Name: Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbicia (IRIS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj metodę detekcji biomolekularnej z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbicia (IRIS). Technika umożliwia bezetykietową, wysokoprzepustową ilościową analizę wiązań przeciwciał z antygenami na powierzchni dwutlenku krzemu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować firmie Zoiray Technologies Inc., współsponsorowi i partnerowi w komercjalizacji, za udzielone wsparcie.

1. Przygotowanie podłoża
<ol>
<li>Pokryj warstwowe podłoża krzemowe-SiO2 samoprzysiadającym kopolimerem (DMA-NAS-MAPS):
 <ol>
 <li>Synteza kopolimeru, jego struktura chemiczna oraz proces powlekania zostały opisane w publikacji: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, L.E. Depero. Characterization of A Polymeric Adsorbed Coating for DNA Microarray Glass Slides. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.</li>
 <li>W skrócie: przygotuj roztwór polimeru, dodając 10 mg polimeru do 5 mL wody dejonizowanej (DI), a następnie dodaj 5 mL 40% nasyconego roztworu siarczanu amonu ((NH4)2SO4), aby uzyskać końcowe stężenie 0,92 M.</li>
 <li>Zanurz chipy w roztworze na 30 min na wstrząsarce, a następnie dokładnie wypłucz wodą DI. Wysusz dokładnie gazem Argon/N2.</li>
 <li>Wypalaj chipy w temperaturze 80 °C przez 15 min.</li> 
</ol>
</li>
<li>Przechowuj podłoża/chipy pokryte polimerem w suchym środowisku (desykator próżniowy) do 3 miesięcy do momentu przeprowadzenia procedury nanoszenia sond.</li>
</ol>
2. Przygotowanie macierzy sond: przeciwciała, antygeny, ss/dsDNA, RNA itp.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć sondy do odpowiedniego stężenia w wybranym buforze. Ten etap może się znacznie różnić, ale w typowym eksperymencie wykorzystuje się antygen lub IgG o stężeniu 0.5 mg/mL (zakres 0.1 -1 mg/mL) w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH≈7.4.</li>
	<li>Przenieść roztwory do płytki 96- lub 384-dołkowej (lub standardowej płytki źródłowej dla używanego urządzenia do nanoszenia próbek)</li>
	<li>Skonfigurować parametry nanoszenia dla pożądanej macierzy: ustalić odpowiednie parametry nanoszenia dla stosowanej powierzchni i roztworów (czas kontaktu, prędkości zbliżania itp.). Określić liczbę powtórzeń każdego warunku w obrębie siatki, układ siatki, liczbę powtórzonych siatek oraz pożądane miejsce nanoszenia na chipie. Umieścić podłoża i płytkę źródłową w odpowiednich miejscach, sprawdzić gotowość butelek z odpadami i odczynnikami, a następnie rozpocząć proces drukowania.</li>
	<li>Po zakończeniu nanoszenia umieścić podłoża w środowisku o wysokiej wilgotności na noc (4-18 godzin), aby umożliwić zajście procesom immobilizacji i dezaktywacji.</li>
	<li>Przepłukać podłoża: umieścić je w następujących roztworach po trzy minuty podczas trzech oddzielnych przemyć: PBS z 0.1% Tween (PBST), PBS, a na koniec w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju eksperymentu (metoda mokra vs sucha), dokładnie wysuszyć chip gazem argonowym i rozpocząć inkubację lub umieścić chip w komorze przepływowej i złożyć układ.</li>
	<li>Zdezaktywować pozostałe grupy NHS na powierzchni kopolimeru, zanurzając chipy w 50 mM roztworze etanolaminy z pH dostosowanym do 7.4 przez 30 minut na wytrząsarce. Można również zastosować związek zawierający aminę pierwszorzędową, taki jak hydroksamina lub Tris, pod warunkiem, że przygotowany roztwór jest bezpieczny w kontakcie z białkami. Dokładnie wypłukać roztwór dezaktywujący, używając PBS, a następnie wody DI.</li>
	<li>Krok opcjonalny (w zależności od zastosowanej chemii powierzchni): Zablokować powierzchnię za pomocą roztworu BSA, kazeiny lub rehydratowanej mleka przez 30 minut. W przypadku obecnie stosowanej przez nas polimerowej chemii powierzchni nie wykonujemy tego kroku, ponieważ szkielet polimerowy zapobiega niespecyficznemu wiązaniu białek.</li>
</ol>
3. Procedura pozyskiwania danych i inkubacji: format końcowy (endpoint)
<ol>
<li>Przygotuj roztwór badanego celu w odpowiednim buforze. W tym przypadku będzie to roztwór odpowiedniego stężenia Anti-BSA w PBS (np. przygotuj 1-10 mL roztworu Anti-BSA o stężeniu 10 ng/mL w PBS). Należy również przygotować równą ilość buforu (bez celu) do inkubacji kontroli negatywnej.</li>
<li>Wykonaj skan lustra krzemowego w celu normalizacji wszystkich danych zbieranych w dalszej części procesu.</li>
<li>Przed etapem inkubacji przeskanuj przygotowaną macierz sond za pomocą systemu IRIS, aby określić początkową wysokość optyczną (masę) w każdym punkcie. Pozwoli to na właściwą analizę zmian masy na powierzchni, tzn. poziomu wiązania, po inkubacji. Na tym etapie zostaną dostosowane parametry dla aktualnego eksperymentu, takie jak czas ekspozycji, pole widzenia, precyzyjne ogniskowanie itp.</li>
<li>Zanurz chip(y) w przygotowanym roztworze na 1 godzinę na wytrząsarce. Czas inkubacji może znacznie różnić się w zależności od stopnia wytrząsania, stężenia wykrywanego celu, charakterystyki transportu w komorze przepływowej (jeśli stosowany jest tryb detekcji w czasie rzeczywistym), powinowactwa pary cel-sonda itp.</li>
<li>Po inkubacji powtórz procedurę płukania opisaną w kroku 2.5)</li>
<li>Przeskanuj tę samą macierz sond za pomocą systemu IRIS i uzyskaj obrazy po inkubacji w celu porównania z obrazami przed inkubacją.</li>
<li>W razie potrzeby powtórz ten proces dla kolejnych etapów inkubacji, na przykład w formacie testu kanapkowego (sandwich assay), w którym stosowane jest przeciwciało wtórne.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
<li>Dopasuj zebrane obrazy dla każdego skanu IRIS (sekwencji obrazów intensywności), korzystając z opracowanego w laboratorium oprogramowania, aby uzyskać obraz macierzy sond zawierający informacje o grubości optycznej. Szybką analizę jakościową wiązania można przeprowadzić poprzez odjęcie (zarejestrowanych) obrazów po i przed inkubacją. Wiązanie objawi się jako zmiana intensywności w miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy. W analizie ilościowej wyznacz gęstość masy każdego punktu w porównaniu z tłem, uśredniając informacje o grubości optycznej dla każdego piksela w obrębie punktu oraz w pierścieniu wokół punktu, a następnie dokonując bezpośredniego porównania tych dwóch obszarów.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Rysunek 1 przedstawia przykładowy schemat warstwowej podłoża Si-SiO2 IRIS z naniesionym reprezentatywnym macierzysem przeciwciał. Każdy zestaw przeciwciał jest naniesiony w powtórzeniach, wykazując swoistość względem innego epitopu skierowanego przeciwko różnym białkom. Jako przykładowe cele przedstawiono dwa różne całe wirusy oraz białko wirusowe. Przeciwciała kontrolne ujemne zależą od analizy i mogą być nieswoiste i/lub swoiste względem wirusa.
Rycina 2 przedstawia wiązanie przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) z macierzą naniesionych punktów HSA oraz IgG królika (kontrola). Jak widać, po dopasowaniu i wyznaczeniu grubości optycznej dla obrazów przed i po inkubacji, można utworzyć obraz różnicowy dla macierzy wiązań, aby jakościowo ocenić stopień wiązania. Analiza ilościowa wykazuje, że przy stężeniu inkubacyjnym anty-HSA wynoszącym 50 ng/mL, średnia zmiana wysokości optycznej wyniosła odpowiednio 2,05 nm dla punktów HSA oraz 0,13 nm dla punktów IgG królika.
Rysunek 3 przedstawia pomiar IRIS zależności wiązania białka Fur od stężenia białka i długości oligomeru dsDNA. Górny wykres pokazuje pomiary bezwzględnej wysokości optycznej dla początkowych wysokości unieruchomionych sond oligomerowych oraz wiązania białka Fur po inkubacji. Zwiększenie stężeń Fur (50, 10, 20 nM) doprowadziło do zwiększonego wiązania z sondami DNA. Długość oligomerów również wpływa na wiązanie Fur, przy czym dłuższe sekwencje skutkują większym wiązaniem. Słupki błędów reprezentują tutaj jedno odchylenie standardowe od średniej. Dolny wykres przedstawia obliczone wiązanie dimerów białka Fur na jedną nić dsDNA. Wiązanie dimerów znacznie wzrosło przy stężeniu białka Fur wynoszącym 20 nM, co sugeruje wysoki poziom wiązania niespecyficznego.
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Schemat macierzy przeciwciał; detekcja swoistości; warstwowy podłoże Si-SiO2; identyfikacja wirusa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat przykładowej macierzy sond zazwyczaj stosowanej w badaniu do jednoczesnej detekcji specyficznych wirusów i komponentów wirusowych przy użyciu systemu IRIS.
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Schemat eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy, przedstawiający detekcję białka podczas inkubacji z anty-HSA i królikiem IgG." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Obraz różnicowy po inkubacji dla wiązania przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) do naniesionych kroplami HSA, pobrany za pomocą tego systemu bezetykietowego w stężeniu 50 ng/mL. Gęstość masy biomateriału dla każdej kropki jest wyznaczana poprzez uśrednienie informacji o grubości optycznej w obrębie kropki, a następnie porównanie tej wartości ze średnią z pierścienia wokół kropki reprezentującego tło.
<img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy wysokości optycznej w zależności od stanu sondy; analiza białka Fur i DNA; zmienność stężeń." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Wykres danych wiązania białka Fur z naniesionymi dwuniciowymi oligomerami o znanej sekwencji konsensus w zależności od długości oligomeru, położenia sekwencji konsensus w obrębie oligomeru oraz stężenia białka Fur. Informacje o bezwzględnej ilości białka Fur związanego z każdą naniesioną sekwencją (góra) mogą posłużyć do oszacowania liczby dimerów Fur związanych z każdym typem oligomeru (dół).

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Platforma IRIS to prosty i szybki system służący do gromadzenia wysokoprzepływowych danych o wiązaniu w formacie mikromacierzy. Poprzez kowalencyjne unieruchomienie różnych funkcjonalnych sond białkowych lub DNA na powierzchni, możliwe jest wychwytywanie docelowych antygenów/biomarkerów itp. z roztworu, podobnie jak w testach immunoologicznych. Pomiar tych oddziaływań w różnych warunkach sond w formacie punktu końcowego lub w czasie rzeczywistym za pomocą systemu IRIS pozwala na gromadzenie wysoce czułych i ilościowych informacji dla każdego oddziaływania. Reprezentatywny eksperyment opisany w niniejszym materiale jest jedynie przykładem rodzajów oddziaływań, które można badać za pomocą tej techniki. Wcześniej wykazano możliwość wykrywania czynników transkrypcyjnych, antygenów wirusowych oraz całych wirusów, co stanowi jedynie kilka przykładów analiz, które system IRIS może z łatwością przeprowadzić.

<table><tbody><tr><td>Wafle krzemowe z 500 nm termicznie wyhodowanego dwutlenku krzemu</td><td>Silicon Valley Microelectronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Gotowy koncentrat 10X roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej albuminie surowiczej (Anti-HSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0433</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka albumina surowicza (HSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>Argon lub azot (ultra-wysokiej czystości)</td><td>Airgas</td><td>AR UHP300 or NI UHP300</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Desykator próżniowy Scienceware&amp;#174;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, o niskim wiązaniu komórek</td><td>Nalge Nunc international</td><td>145399</td><td></td></tr><tr><td>BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Rotator wielozadaniowy, model # 2314</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314Q</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Retiga 2000R</td><td>QImaging</td><td>01-RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Źródło oświetlenia AcuLED</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komponenty optyczne (soczewki, obiektywy, przysłony, szyny, wsporniki itp.)</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Czuły pomiar oddziaływań biomolekularnych znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach i przemysłach, takich jak biologia podstawowa i mikrobiologia, monitorowanie środowiska, rolnictwa i obrony biologicznej, nanobiotechnologia i inne. W zastosowaniach diagnostycznych monitorowanie (wykrywanie) obecności, braku lub nieprawidłowej ekspresji celowanych biomarkerów proteomicznych lub genomicznych w próbkach pacjentów może być wykorzystane do określenia metod leczenia lub skuteczności terapii. W badaniach naukowych informacje o powinowactwie i specyficzności cząsteczek są przydatne do pełnej charakterystyki badanych układów.
Wiele z obecnie stosowanych systemów służących do określania stężeń lub powinowactw cząsteczkowych opiera się na zastosowaniu znaczników. Przykładami takich systemów są analizy immunologiczne, takie jak enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), analizy elektroforezy żelowej oraz spektrometria mas (MS). Zazwyczaj znaczniki te mają charakter fluorescencyjny, radiologiczny lub kolorymetryczny i są przyłączone bezpośrednio lub pośrednio do interesującej nas cząsteczki docelowej. Chociaż stosowanie znaczników jest powszechnie akceptowane i niesie ze sobą pewne korzyści, istnieją wady, które stymulują rozwój nowych metod bez użycia znaczników (label-free) do pomiaru tych oddziaływań. Wady te obejmują aspekty praktyczne, takie jak zwiększony koszt analizy, ograniczony okres trwałości i użyteczność odczynników, kwestie przechowywania i bezpieczeństwa, czas i wysiłek poświęcony na znakowanie oraz zmienność między różnymi odczynnikami wynikająca z procesów znakowania lub samych znaczników. Z naukowego punktu widzenia stosowanie tych znaczników może również powodować trudności, takie jak obawy dotyczące wpływu na funkcjonalność lub strukturę białek w wyniku obecności przyłączonych znaczników oraz niemożność bezpośredniego pomiaru oddziaływań w czasie rzeczywistym.
Przedstawiono tutaj zastosowanie nowego bezznacznika optycznego biosensora odpowiedniego do badań mikroarray, nazwanego Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), do wykrywania białek, DNA, materiału antygenowego, całych patogenów (wirionów) oraz innego materiału biologicznego. Wykazano, że system IRIS charakteryzuje się wysoką czułością, precyzją i powtarzalnością dla różnych oddziaływań biomolekularnych [1-3]. Do zalet należą możliwości obrazowania multipleksowego, pomiary w czasie rzeczywistym i końcowe, a także inne cechy wysokoprzepustowe, takie jak zmniejszone zużycie odczynników i skrócenie czasu trwania analizy. Ponadto platforma IRIS jest prosta w obsłudze, wymaga niedrogiego sprzętu i wykorzystuje komponenty do analiz w fazie stałej na bazie krzemu, co czyni ją kompatybilną z wieloma współczesnymi podejściami w zakresie chemii powierzchni.
W niniejszym materiale przedstawiamy zastosowanie systemu IRIS, od przygotowania macierzy sond, przez inkubację i pomiar wiązania celu, aż po analizę wyników w formacie punktu końcowego. Systemem modelowym będzie wychwytywanie przeciwciał docelowych specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) na podłożach z naniesioną HSA.

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Czuły pomiar oddziaływań biomolekularnych znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach i gałęziach przemysłu, takich jak biologia podstawowa i mikrobiologia, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie wiązania przeciwciał z immobilizowanymi na powierzchni antygenami przy użyciu czułej platformy detekcyjnej bez znakowania, zwanej Iris. Osiąga się to poprzez przygotowanie macierzy sond testowych i kontrolnych na chemicznie funkcjonalizowanej, jednorodnej powierzchni dwutlenku krzemu w celu wychwycenia docelowych białek z roztworu. Immobilizowane sondy mogą być przeciwciałami lub antygenami, DNA lub RNA lub dowolnym innym rodzajem makrocząsteczki kompatybilnej z funkcjonalizowaną, polimerową lub odpowiednią chemią powierzchni.Przygotowany mikroarray inkubuje się następnie z próbką zawierającą interesujące białka, co umożliwia zajście wiązania w warunkach określonych przez badacza. Następnie cały układ sensorów jest obrazowany przy użyciu światła o różnych długościach fali. W systemie IRIS natężenia światła odbitego dla każdego piksela są przetwarzane za pomocą specjalistycznych algorytmów.Aby ilościowo określić amount biomateriału związanego w każdym przypadku badawczym lub kontrolnym, uzyskuje się wyniki po inkubacji, które wykazują skuteczną detekcję i bezwzględne oznaczanie ilości przeciwciał w złożonej mieszaninie na podstawie interferometrycznych pomiarów bez znacznika tego systemu. Opierając się na ponad dziesięcioletnich badaniach i rozwoju w zakresie interferencji optycznej oraz urządzeń z wnękami żywicznymi, opracowaliśmy nową metodę, która mogłaby rozwiązać wiele problemów zakłócających, z którymi mierzyliśmy się w naszych poprzednich systemach biosensorów bez znacznika. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy gromadzenia danych wymagają prawidłowej normalizacji oraz przestrzegania procedur kontroli jakości, aby zapewnić dokładne i powtarzalne pozyskiwanie danych.Aby pokryć podłoża z dwutlenku krzemu warstwą absorbującą z kopolimeru dmma NAS, najpierw należy przygotować roztwór polimeru, dodając 100 mg polimeru do 5 ml wody dejonizowanej. Następnie dodać 5 ml 40% nasyconego siarczanu amonu, aby uzyskać końcowe stężenie siarczanu amonu wynoszące 0,92 M. Po inkubacji chipy należy zanurzyć w roztworze polimeru na 30 minut w inkubatorze z wytrząsaniem.Dokładnie opłucz chipy wodą dejonizowaną, wysusz je gazem argonowym lub azotem, a następnie wypal w temperaturze 80 °C przez 15 minut. Przechowuj podłoża z chipów powlekonych polimerem w suchym środowisku, np. w eksykatorze próżniowym, przez okres do dwóch-trzech miesięcy, aż do momentu przeprowadzenia procedury naniesienia sond w celu rozcieńczenia każdej sondy. W pierwszej kolejności określ odpowiednią objętość roztworu zapasu sondy oraz buforu, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.W typowym eksperymencie wykorzystuje się antygen lub IgG w stężeniu 0,5 mg/mL w roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Obliczoną ilość każdego roztworu zapasu sondy dodaje się do małych probówek typu eend orph zawierających odpowiednią ilość buforu PBS, a następnie miesza roztwory. Następnie roztwory sond pipetuje się do płytki 96-dołkowej o niskim wiązaniu białek, która będzie służyć jako płytka źródłowa dla urządzenia do nanoszenia plamek (spottera). W kolejnym kroku ustala się parametry nanoszenia dla drukowanej macierzy, określając liczbę powtórzeń każdego warunku na siatce.Siatka określa liczbę powtórzeń oraz pożądane miejsce naniesienia próbki na chipie. Umieść podłoże i płytkę źródłową w urządzeniu do nanoszenia próbek (spotterze), a następnie sprawdź butelki z odpadami i zasilające. Rozpocznij proces drukowania.Po zakończeniu nanoszenia plamek, umieść podłoże w środowisku o wysokiej wilgotności na noc, aby umożliwić przeprowadzenie procesu immobilizacji i dezaktywacji po inkubacji. Przemyj podłoża z wytrząsaniem, umieszczając chip w PBS z 0,1% tween przez trzy minuty, powtarzając tę czynność trzykrotnie. Następnie przeprowadź trzy trzyminuotowe inkubacje w PBS, a potem w wodzie dejonizowanej.W przypadku pomiaru na sucho, należy dokładnie osuszyć chip gazem argonem. Nieaktywne grupy NHS na powierzchni kopolimeru należy zneutralizować, zanurzając chipy w 50 mM roztworze etanolaminy o pH dostrojonym do 7,4 przez 30 minut na płytce wstrząsowej. Przed rozpoczęciem procedury inkubacji należy dokładnie wypłukać etanolaminę za pomocą PBS, a następnie wody dejonizowanej.Na potrzeby tego pokazu należy przygotować roztwór białka docelowego o odpowiednim stężeniu w PBS. Stosuje się 500 nanogramów na mililitr przeciwciał przeciwko ludzkiej albuminie surowicy; należy również przygotować równą objętość buforu bez białka docelowego do inkubacji kontrolnej ujemnej. System iris składa się z kilku podstawowych elementów, takich jak źródło światła, komponenty optyczne do właściwego oświetlenia matrycy sond sensorowych, kamera do rejestracji natężenia światła odbitego oraz stolik, na którym umieszcza się próbkę do pomiarów.Rozpocznij od skanowania lustra krzemowego czystego, nieprzetworzonego chipa krzemowego w celu normalizacji wszystkich danych, które zostaną zebrane podczas późniejszego skanowania. Przygotuj system przysłony, dostosowując parametry do eksperymentu. Obejmuje to pomiar histogramu intensywności światła rejestrowanego przez kamerę oraz ustawienie czasu ekspozycji dla uzyskania optymalnej intensywności.Po skanowaniu normalizacyjnym załaduj przygotowaną matrycę sond do systemu IRIS i przeprowadź konfigurację analogicznie jak poprzednio, ustawiając ostrość tak, aby uzyskać poprawny obraz powierzchni podłoża. Upewnij się, że stół z próbką jest wypoziomowany, analizując zarejestrowane histogramy natężeń światła odbitego. Na koniec wybierz nazwę pliku, pod którą zostaną zapisane dane.Uruchom oprogramowanie w celu zeskanowania matrycy, co polega na wielokrotnym oświetleniu powierzchni różnymi długościami fal i uśrednieniu zebranych obrazów. Określona zostaje początkowa optyczna wysokość punktu referencyjnego, co umożliwia prawidłową analizę zmian masy na powierzchni po inkubacji. Po wstępnym skanowaniu zanurz chip w przygotowanym roztworze inkubacyjnym na jedną godzinę na wytrząsarce. Czas inkubacji może znacznie się różnić w zależności od poziomu wegetacji, stężenia wykrywanego celu oraz powinowactwa pary sonda-cel.Po inkubacji powtórz procedurę płukania zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Zeskanuj tę samą macierz pro przy użyciu systemu iris, aby uzyskać obrazy po inkubacji do porównania z obrazami sprzed inkubacji. Proces ten można powtórzyć dla różnych etapów inkubacji, jeśli jest to konieczne.Na przykład w formacie testu kanapkowego (sandwich assay), w którym stosowane jest przeciwciało wtórne, należy dopasować zebrane obrazy dla każdego skanowania tęczówki za pomocą komercyjnego oprogramowania, aby uzyskać obraz sondy zawierający formowanie grubości optycznej. Szybka analiza jakościowa wiązania może zostać przeprowadzona poprzez odjęcie obrazów po i przed inkubacją. Wiązanie objawi się jako zmiana intensywności w tych miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy.W celu przeprowadzenia analizy ilościowej należy wyznaczyć gęstość masy każdej plamki w stosunku do tła, obliczając średnią grubość optyczną dla każdego piksela w obrębie plamki oraz dla pierścienia znajdującego się poza plamką. Następnie należy bezpośrednio porównać te dwa obszary, co przedstawiono tutaj. Jako przykład pokazano schemat warstwowego podłoża z krzemu i dwutlenku krzemu z naniesionym reprezentatywnym macierzystym układem przeciwciał.Każdy zestaw przeciwciał jest nanoszony w powtórzeniach z swoistością wobec innego epitopu, celując w różne białka. Jako przykładowe cele przedstawiono dwa różne całe wirusy oraz białko wirusowe. Przeciwciała kontrolne negatywne zależą od analizy i mogą być nieswoiste i/lub swoiste względem wirusa.Poniżej przedstawiono przykład wyników jakościowych dla wiązania swoistych przeciwciał przeciwko ludzkiej albuminie surowiczej z matrycą naniesionych plamek HSA oraz plamek kontrolnych IgG królika, jak pokazano tutaj. Po dopasowaniu i wyznaczeniu grubości optycznej dla obrazów przed i po inkubacji, można stworzyć obraz różnicowy dla matrycy wiązania, aby szybko ocenić stopień wiązania. Dalsza analiza ilościowa wykazuje, że dla stężenia inkubacyjnego anty-HSA wynoszącego 500 nanogramów na mililitr zaobserwowano zmianę średniej wysokości optycznej wynoszącą odpowiednio 2,05 i 0,13 nanometra dla plamek HSA i IgG królika.Ten wykres słupkowy przedstawia przykład ilościowych danych, jakie mogą dostarczyć pomiary iris. W tym przykładzie zaprezentowano zależność wiązania białek fur od stężenia białka oraz długości dwuniciowego all ligament. Wykres słupkowy ten pokazuje bezwzględne pomiary wysokości optycznej dla początkowych wysokości unieruchomionego all ligament oraz po inkubacji w celu wiązania.Zwiększenie stężenia białka fur do 5, 100 i 200 nanomolar spowodowało wzrost wiązania z sondami DNA. Przedstawiono tutaj obliczone wiązanie dimeru białka fur na jeden fragment dwuniciowego DNA. Wiązanie dimerów uległo znacznemu zwiększeniu przy stężeniu białka fur wynoszącym 200 nanomolar, co sugeruje wysoki poziom niespecyficznych oddziaływań ze wszystkimi fragmentami lub inny mechanizm wiązania białka fur, taki jak agregacja wielu dimerów.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozpoczęciu pracy z czystymi, jednorodnymi podłożami o odpowiedniej grubości warstwy tlenku oraz o zachowaniu czystości próbek poprzez ostrożne obchodzenie się z nimi za pomocą pęsety. Kluczowe jest również stosowanie odczynników, które były przechowywane w odpowiedni sposób i których funkcjonalność jest potwierdzona. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru oddziaływań biomolekularnych w formacie bez znacznika poprzez przygotowanie funkcjonalnych macierzy sond na powierzchni dwutlenku krzemu, a także na temat akwizycji i analizy danych z wykorzystaniem interferometrycznego obrazowania odbiciowego (IRIS).

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykrywanie biomolekularne z wykorzystaniem czujnika interferencyjnego obrazu odbicia (IRIS)

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Poznaj metodę detekcji biomolekularnej z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbicia (IRIS). Technika umożliwia bezetykietową, wysokoprzepustową ilościową analizę wiązań przeciwciał z antygenami na powierzchni dwutlenku krzemu.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Przeglądaj więcej filmów