Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbicia (IRIS)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie wiązania przeciwciał z antygenami unieruchomionymi powierzchniowo za pomocą czułej i bezznacznikowej platformy detekcyjnej zwanej Iris. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw zestawu sond testowych i kontrolnych na chemicznie funkcjonalizowanej jednolitej powierzchni dwutlenku krzemu w celu wychwycenia docelowych białek z roztworu. Unieruchomione sondy mogą być przeciwciałami lub antygenami, DNA lub RNA lub dowolnym innym rodzajem makrocząsteczki, która jest kompatybilna z funkcjonalizowaną, polimerową lub rozsądną chemią powierzchni.

Przygotowana mikromacierz jest następnie inkubowana z próbką zawierającą interesujące nas białka, co pozwala na wiązanie w warunkach określonych przez badacza. Następnie cała matryca czujników jest obrazowana na różnych długościach fal światła. W systemie IRIS intensywność odbicia dla każdego piksela jest przetwarzana za pomocą niestandardowych algorytmów kodowania.

W celu ilościowego określenia ilości biomateriału związanego z każdym stanem testowym lub kontrolnym, uzyskuje się wyniki po inkubacji, które wykazują skuteczne wykrywanie i bezwzględne oznaczanie ilościowe przeciwciał w złożonej mieszaninie w oparciu o interferometryczne pomiary tego systemu bez znaczników Opierając się na ponad dekadzie badań i rozwoju w zakresie urządzeń do interferencji optycznej i wnęki żywicznej, Opracowujemy tę nową metodę, która może przezwyciężyć wiele kłopotliwych problemów, które napotkaliśmy w przypadku naszych poprzednich systemów biosensorów oznaczonych jako bezpłatne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy zbierania danych wymagają prawidłowej normalizacji i przestrzegane są procedury kontroli jakości. Aby zapewnić dokładne i powtarzalne pozyskiwanie danych.

Aby współzłożyć podłoża z dwutlenku krzemu z samowchłaniającymi się mapami copo dmma NAS, najpierw napraw roztwór polimeru, dodając 100 miligramów polimeru do pięciu mililitrów wody dejonizowanej. Następnie dodaj pięć mililitrów 40% nasyconego siarczanu amonu, aby uzyskać końcowe stężenie siarczanu amonu wynoszące 0,92 mola. Po inkubacji zanurzyć wióry w roztworze polimeru na 30 minut na wytrząsarce.

Frytki dokładnie opłucz wodą dejonizowaną, osusz frytki argonem lub azotem, a następnie piecz je w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przechowuj wióry podłoża pokryte polimerem w suchym środowisku, takim jak osuszacz próżniowy, przez okres do dwóch do trzech miesięcy, aż do procedury wykrywania sondy w celu rozcieńczenia każdej sondy. Najpierw określ prawidłową objętość roztworu podstawowego sondy i buforu, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe.

Typowy eksperyment wykorzystuje antygen lub IgG jako stężenie 0,5 miligrama na mililitr w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem w obliczonej ilości roztworu podstawowego każdej sondy do małych eend probówek orph zawierających żądaną ilość buforu PBS, mieszając roztwory. Następnie pipetuj roztwory sondy do 96-dołkowej płytki o niskiej zawartości białka, która będzie używana jako płytka źródłowa dla obserwatora. Następnie skonfiguruj parametry wykrywania dla drukowanej tablicy, określając liczbę powtórzeń każdego warunku na siatkę.

Siatka określa liczbę powtórzonych siatek i żądane miejsce wykrywania na chipie. Umieść podłoże i płytę źródłową w spotterze, a następnie sprawdź butelki z odpadami i zapasami. Rozpocznij drukowanie.

Po zakończeniu plamienia umieść substrat na noc w środowisku o wysokiej wilgotności, aby umożliwić postęp procesu immobilizacji i dezaktywacji po inkubacji. Umyj podłoża mieszaniem, umieszczając najpierw chip w PBS z 0,1% tween na trzy minuty, trzy razy oddzielnie. Następnie wykonaj trzy trzyminutowe inkubacje w PBS, a następnie w wodzie dejonizowanej.

Jeśli wykonujesz pomiar na sucho, dokładnie osusz chip argonem. Dezaktywuj pozostałe grupy NHS na powierzchni kopolimeru, zanurzając wióry w 50-milimolowym roztworze aminy etanolowej o pH dostosowanym do 7,4 na 30 minut na płytce wytrząsającej. Dokładnie wypłucz aminę etylową za pomocą PBS, a następnie wody dejonizowanej przed rozpoczęciem procedury inkubacji.

Do tej demonstracji należy przygotować roztwór o odpowiednim stężeniu białka docelowego w PBS. Stosuje się 500 nanogramów na mililitr albuminy surowicy antyludzkiej oraz równoważną objętość buforu bez celu do inkubacji kontroli ujemnej. System irysów składa się z kilku podstawowych elementów, takich jak źródło oświetlenia, elementy optyczne do prawidłowego oświetlenia układu sond sensorowych, kamera do rejestracji natężenia światła odbitego oraz stolik, w którym umieszczana jest próbka do pomiarów.

Rozpocznij od skanowania lustrzanego krzemu gołego, czystego chipa krzemowego, aby znormalizować wszystkie później zebrane dane przed wykonaniem skanowania. Przygotuj system tęczówki, dostosowując parametry eksperymentu. Obejmuje to pomiar histogramu natężenia światła, który rejestruje aparat, oraz ustawienie czasu ekspozycji w celu uzyskania optymalnych intensywności.

Po skanowaniu normalizacyjnym załaduj przygotowany układ sond do systemu przysłony i wykonaj konfigurację jak poprzednio, ustaw ostrość, aby poprawnie zobrazować powierzchnię podłoża. Upewnij się, że sample stage jest wypoziomowany, sprawdzając zarejestrowane histogramy pod kątem natężenia światła odbitego. Na koniec wybierz nazwę pliku, w którym chcesz zapisać dane.

Zainicjuj oprogramowanie, aby zeskanować matrycę, która wielokrotnie oświetla powierzchnię na różnych długościach fal i uśrednia zebrane obrazy. Określa się początkowy optyczny haj do nauczenia miejsca, co pozwala na właściwą analizę zmian masy na powierzchni po inkubacji, po wstępnym skanowaniu, zanurza się chip w przygotowanym roztworze inkubacyjnym na godzinę na płytce wytrząsającej. Czas inkubacji może się znacznie różnić w zależności od poziomu roślinności, stężenia wykrywanego celu i powinowactwa docelowej pary sondy.

Po inkubacji powtórzyć procedurę mycia, jak poprzednio. Zeskanuj tę samą profesjonalną macierz za pomocą systemu irys, aby uzyskać obrazy po inkubacji do porównania przed inkubacją. W razie potrzeby proces ten można powtórzyć dla różnych etapów inkubacji.

Na przykład w formacie testu kanapkowego, w którym stosuje się przeciwciało drugorzędowe, dopasuj zebrane obrazy do każdego skanu tęczówki za pomocą komercyjnie opracowanego oprogramowania, aby uzyskać obraz sondy zawierającej tworzenie grubości optycznej. Szybką analizę jakościową wiązania można przeprowadzić, odejmując obrazy po i przed inkubacją. Wiązanie pojawi się jako zmiana intensywności w tych miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy.

W przypadku analizy ilościowej należy określić gęstość masy każdej plamki w porównaniu z tłem, uśredniając informacje o grubości optycznej dla każdego piksela w plamce i dla pierścienia na zewnątrz plamki. Potem dokonaj bezpośredniego porównania tych dwóch pokazanych tutaj obszarów. Na przykład schemat warstwowego krzemu, substratu tęczówki z dwutlenku krzemu nakrapianego reprezentatywnym układem przeciwciał.

Każdy zestaw przeciwciał jest wykrywany w replikacji ze swoistością dla innego epitopu, ukierunkowanego na inne białko. Jako przykład przedstawiono dwa różne całe wirusy i białko wirusowe. Cele. Przeciwciała kontroli ujemnej zależą od testu i mogą być nieswoiste i/lub specyficzne dla wirusa.

Oto przykład wyników jakościowych dotyczących wiązania przeciwciał specyficznych dla albuminy ludzkiej surowicy z szeregiem plamek kontrolnych HSA i króliczej IgG, jak pokazano tutaj. Po dopasowaniu i określeniu grubości optycznej dla obrazów przed i po inkubacji, można utworzyć obraz różnicowy dla macierzy wiążącej, aby szybko ocenić wiązanie. Bardziej ogólna analiza ilościowa ujawnia, że średnią zmianę wysokości optycznej o 2,05 i 0,13 nanometra zaobserwowano odpowiednio dla plamek HSA i króliczej IgG dla stężenia inkubacji anty HSA wynoszącego 500 nanogramów na mililitr.

Ten wykres słupkowy przedstawia przykład danych ilościowych, które mogą dostarczyć pomiary tęczówki. W tym przykładzie przedstawiono zależność wiązania białek futra od stężenia białka i podwójnej nici o całej długości więzadeł. Ten wykres słupkowy przedstawia bezwzględne pomiary wysokości optycznej dla początkowego unieruchomienia wszystkich wysokości podpór więzadeł i po inkubacji w celu wiązania.

Zwiększenie stężenia białka futra do 5, 100 i 200 nanomolowców spowodowało zwiększone wiązanie z sondami DNA. Tutaj pokazano obliczone wiązanie dimerów białka futra na dwuniciowe więzadło DNAA. Wiązanie dimerów było znacznie zwiększone przy stężeniu białka futra wynoszącym 200 nanomolowych, co sugeruje wysoki poziom niespecyficznych interakcji wszystkich więzadeł lub inny mechanizm wiązania białek futra, taki jak agregacja wielu dimerów.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od czystych, jednolitych podłoży o odpowiedniej grubości tlenku oraz utrzymywać próbki w czystości, ostrożnie dotykając ich pęsetą. Kluczowe jest również stosowanie odczynników, które były odpowiednio przechowywane i są znane z działania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć działania biomolekularne w formacie bez etykiet poprzez przygotowanie funkcjonalnych układów sond na powierzchni dwutlenku krzemu, a także akwizycję i analizę danych za pomocą interferometrycznego czujnika obrazowania odbicia lub przysłony.