Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie wiązania przeciwciał z immobilizowanymi na powierzchni antygenami przy użyciu czułej platformy detekcyjnej bez znakowania, zwanej Iris. Osiąga się to poprzez przygotowanie macierzy sond testowych i kontrolnych na chemicznie funkcjonalizowanej, jednorodnej powierzchni dwutlenku krzemu w celu wychwycenia docelowych białek z roztworu. Immobilizowane sondy mogą być przeciwciałami lub antygenami, DNA lub RNA lub dowolnym innym rodzajem makrocząsteczki kompatybilnej z funkcjonalizowaną, polimerową lub odpowiednią chemią powierzchni.

Przygotowany mikroarray inkubuje się następnie z próbką zawierającą interesujące białka, co umożliwia zajście wiązania w warunkach określonych przez badacza. Następnie cały układ sensorów jest obrazowany przy użyciu światła o różnych długościach fali. W systemie IRIS natężenia światła odbitego dla każdego piksela są przetwarzane za pomocą specjalistycznych algorytmów.

Aby ilościowo określić amount biomateriału związanego w każdym przypadku badawczym lub kontrolnym, uzyskuje się wyniki po inkubacji, które wykazują skuteczną detekcję i bezwzględne oznaczanie ilości przeciwciał w złożonej mieszaninie na podstawie interferometrycznych pomiarów bez znacznika tego systemu. Opierając się na ponad dziesięcioletnich badaniach i rozwoju w zakresie interferencji optycznej oraz urządzeń z wnękami żywicznymi, opracowaliśmy nową metodę, która mogłaby rozwiązać wiele problemów zakłócających, z którymi mierzyliśmy się w naszych poprzednich systemach biosensorów bez znacznika. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy gromadzenia danych wymagają prawidłowej normalizacji oraz przestrzegania procedur kontroli jakości, aby zapewnić dokładne i powtarzalne pozyskiwanie danych.

Aby pokryć podłoża z dwutlenku krzemu warstwą absorbującą z kopolimeru dmma NAS, najpierw należy przygotować roztwór polimeru, dodając 100 mg polimeru do 5 ml wody dejonizowanej. Następnie dodać 5 ml 40% nasyconego siarczanu amonu, aby uzyskać końcowe stężenie siarczanu amonu wynoszące 0,92 M. Po inkubacji chipy należy zanurzyć w roztworze polimeru na 30 minut w inkubatorze z wytrząsaniem.

Dokładnie opłucz chipy wodą dejonizowaną, wysusz je gazem argonowym lub azotem, a następnie wypal w temperaturze 80 °C przez 15 minut. Przechowuj podłoża z chipów powlekonych polimerem w suchym środowisku, np. w eksykatorze próżniowym, przez okres do dwóch-trzech miesięcy, aż do momentu przeprowadzenia procedury naniesienia sond w celu rozcieńczenia każdej sondy. W pierwszej kolejności określ odpowiednią objętość roztworu zapasu sondy oraz buforu, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.

W typowym eksperymencie wykorzystuje się antygen lub IgG w stężeniu 0,5 mg/mL w roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Obliczoną ilość każdego roztworu zapasu sondy dodaje się do małych probówek typu eend orph zawierających odpowiednią ilość buforu PBS, a następnie miesza roztwory. Następnie roztwory sond pipetuje się do płytki 96-dołkowej o niskim wiązaniu białek, która będzie służyć jako płytka źródłowa dla urządzenia do nanoszenia plamek (spottera). W kolejnym kroku ustala się parametry nanoszenia dla drukowanej macierzy, określając liczbę powtórzeń każdego warunku na siatce.

Siatka określa liczbę powtórzeń oraz pożądane miejsce naniesienia próbki na chipie. Umieść podłoże i płytkę źródłową w urządzeniu do nanoszenia próbek (spotterze), a następnie sprawdź butelki z odpadami i zasilające. Rozpocznij proces drukowania.

Po zakończeniu nanoszenia plamek, umieść podłoże w środowisku o wysokiej wilgotności na noc, aby umożliwić przeprowadzenie procesu immobilizacji i dezaktywacji po inkubacji. Przemyj podłoża z wytrząsaniem, umieszczając chip w PBS z 0,1% tween przez trzy minuty, powtarzając tę czynność trzykrotnie. Następnie przeprowadź trzy trzyminuotowe inkubacje w PBS, a potem w wodzie dejonizowanej.

W przypadku pomiaru na sucho, należy dokładnie osuszyć chip gazem argonem. Nieaktywne grupy NHS na powierzchni kopolimeru należy zneutralizować, zanurzając chipy w 50 mM roztworze etanolaminy o pH dostrojonym do 7,4 przez 30 minut na płytce wstrząsowej. Przed rozpoczęciem procedury inkubacji należy dokładnie wypłukać etanolaminę za pomocą PBS, a następnie wody dejonizowanej.

Na potrzeby tego pokazu należy przygotować roztwór białka docelowego o odpowiednim stężeniu w PBS. Stosuje się 500 nanogramów na mililitr przeciwciał przeciwko ludzkiej albuminie surowicy; należy również przygotować równą objętość buforu bez białka docelowego do inkubacji kontrolnej ujemnej. System iris składa się z kilku podstawowych elementów, takich jak źródło światła, komponenty optyczne do właściwego oświetlenia matrycy sond sensorowych, kamera do rejestracji natężenia światła odbitego oraz stolik, na którym umieszcza się próbkę do pomiarów.

Rozpocznij od skanowania lustra krzemowego czystego, nieprzetworzonego chipa krzemowego w celu normalizacji wszystkich danych, które zostaną zebrane podczas późniejszego skanowania. Przygotuj system przysłony, dostosowując parametry do eksperymentu. Obejmuje to pomiar histogramu intensywności światła rejestrowanego przez kamerę oraz ustawienie czasu ekspozycji dla uzyskania optymalnej intensywności.

Po skanowaniu normalizacyjnym załaduj przygotowaną matrycę sond do systemu IRIS i przeprowadź konfigurację analogicznie jak poprzednio, ustawiając ostrość tak, aby uzyskać poprawny obraz powierzchni podłoża. Upewnij się, że stół z próbką jest wypoziomowany, analizując zarejestrowane histogramy natężeń światła odbitego. Na koniec wybierz nazwę pliku, pod którą zostaną zapisane dane.

Uruchom oprogramowanie w celu zeskanowania matrycy, co polega na wielokrotnym oświetleniu powierzchni różnymi długościami fal i uśrednieniu zebranych obrazów. Określona zostaje początkowa optyczna wysokość punktu referencyjnego, co umożliwia prawidłową analizę zmian masy na powierzchni po inkubacji. Po wstępnym skanowaniu zanurz chip w przygotowanym roztworze inkubacyjnym na jedną godzinę na wytrząsarce. Czas inkubacji może znacznie się różnić w zależności od poziomu wegetacji, stężenia wykrywanego celu oraz powinowactwa pary sonda-cel.

Po inkubacji powtórz procedurę płukania zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Zeskanuj tę samą macierz pro przy użyciu systemu iris, aby uzyskać obrazy po inkubacji do porównania z obrazami sprzed inkubacji. Proces ten można powtórzyć dla różnych etapów inkubacji, jeśli jest to konieczne.

Na przykład w formacie testu kanapkowego (sandwich assay), w którym stosowane jest przeciwciało wtórne, należy dopasować zebrane obrazy dla każdego skanowania tęczówki za pomocą komercyjnego oprogramowania, aby uzyskać obraz sondy zawierający formowanie grubości optycznej. Szybka analiza jakościowa wiązania może zostać przeprowadzona poprzez odjęcie obrazów po i przed inkubacją. Wiązanie objawi się jako zmiana intensywności w tych miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy.

W celu przeprowadzenia analizy ilościowej należy wyznaczyć gęstość masy każdej plamki w stosunku do tła, obliczając średnią grubość optyczną dla każdego piksela w obrębie plamki oraz dla pierścienia znajdującego się poza plamką. Następnie należy bezpośrednio porównać te dwa obszary, co przedstawiono tutaj. Jako przykład pokazano schemat warstwowego podłoża z krzemu i dwutlenku krzemu z naniesionym reprezentatywnym macierzystym układem przeciwciał.

Każdy zestaw przeciwciał jest nanoszony w powtórzeniach z swoistością wobec innego epitopu, celując w różne białka. Jako przykładowe cele przedstawiono dwa różne całe wirusy oraz białko wirusowe. Przeciwciała kontrolne negatywne zależą od analizy i mogą być nieswoiste i/lub swoiste względem wirusa.

Poniżej przedstawiono przykład wyników jakościowych dla wiązania swoistych przeciwciał przeciwko ludzkiej albuminie surowiczej z matrycą naniesionych plamek HSA oraz plamek kontrolnych IgG królika, jak pokazano tutaj. Po dopasowaniu i wyznaczeniu grubości optycznej dla obrazów przed i po inkubacji, można stworzyć obraz różnicowy dla matrycy wiązania, aby szybko ocenić stopień wiązania. Dalsza analiza ilościowa wykazuje, że dla stężenia inkubacyjnego anty-HSA wynoszącego 500 nanogramów na mililitr zaobserwowano zmianę średniej wysokości optycznej wynoszącą odpowiednio 2,05 i 0,13 nanometra dla plamek HSA i IgG królika.

Ten wykres słupkowy przedstawia przykład ilościowych danych, jakie mogą dostarczyć pomiary iris. W tym przykładzie zaprezentowano zależność wiązania białek fur od stężenia białka oraz długości dwuniciowego all ligament. Wykres słupkowy ten pokazuje bezwzględne pomiary wysokości optycznej dla początkowych wysokości unieruchomionego all ligament oraz po inkubacji w celu wiązania.

Zwiększenie stężenia białka fur do 5, 100 i 200 nanomolar spowodowało wzrost wiązania z sondami DNA. Przedstawiono tutaj obliczone wiązanie dimeru białka fur na jeden fragment dwuniciowego DNA. Wiązanie dimerów uległo znacznemu zwiększeniu przy stężeniu białka fur wynoszącym 200 nanomolar, co sugeruje wysoki poziom niespecyficznych oddziaływań ze wszystkimi fragmentami lub inny mechanizm wiązania białka fur, taki jak agregacja wielu dimerów.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozpoczęciu pracy z czystymi, jednorodnymi podłożami o odpowiedniej grubości warstwy tlenku oraz o zachowaniu czystości próbek poprzez ostrożne obchodzenie się z nimi za pomocą pęsety. Kluczowe jest również stosowanie odczynników, które były przechowywane w odpowiedni sposób i których funkcjonalność jest potwierdzona. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru oddziaływań biomolekularnych w formacie bez znacznika poprzez przygotowanie funkcjonalnych macierzy sond na powierzchni dwutlenku krzemu, a także na temat akwizycji i analizy danych z wykorzystaniem interferometrycznego obrazowania odbiciowego (IRIS).