Name: Mysi model testu kieszeni rogówkowej do badania angiogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj metodę kieszeni rogówkowej do badania angiogenezy z użyciem mysiego modelu i czynnika basic FGF. Technika ta pozwala na kontrolowane indukowanie wzrostu naczyń krwionośnych w rogówce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nasze badania są wspierane przez Program Badań Wewnątrzinstytucjonalnych NIH, National Eye Institute.

Wszystkie użyte urządzenia i odczynniki są sterylne. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee, ACUC) w NEI/NIH (protokół badań na zwierzętach NEI-553) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi oraz regulacjami NIH.
1. Przygotowanie peletek zawierających czynnik angiogenny
W tej części przygotowywane są pelety zawierające interesujący nas czynnik angiogenny.
 <ol>
 <li>Przygotować 10% (w/v) roztwór sukralfalatu w PBS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować 12% (w/v) poly-HEMA w bezwodnym etanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować roztwór bFGF o stężeniu 1 μg/μl. Przechowywać w -80 °C.</li>
 <li>Aby przygotować 50 peletów, zmieszać 5 μl poly-HEMA, 1 μl sukralfalatu oraz 4 μl roztworu bFGF i dokładnie wymieszać na wortexie.</li>
 <li>Umieścić kawałek czystej parafilmy w szalce Petriego i naświetlać światłem UV przez 15 min w komorze do hodowli tkanek. Na parafilmę nanieść kroplą 0,2 μl mieszaniny roztworów na jeden pelet. W ten sposób 10 μl mieszaniny powinno pozwolić na uzyskanie 50 peletów. Pozostawić pelety do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Wysuszone pelety można przechowywać w 4 °C przez kilka dni lub w -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
 <li>W celu użycia, ostrożnie podważyć i podnieść pelety końcówkami pęsety. Należy zachować szczególną ostrożność, aby ich nie złamać ani nie doprowadzić do ich odskoczenia.</li>
</ol>
2. Wykonywanie testu kieszonkowego w rogówce myszy
W tej części zademonstrujemy, jak wykonać kieszonkę w rogówce myszy oraz jak wprowadzić do niej pellet. Czynnik angiogenny zawarty w pellecie będzie stopniowo uwalniany do okolicznych obszarów rogówki (Rys. 1). W tym pokazie wykorzystujemy 8-tygodniowe samice myszy C57/Bl6.

 <ol>
 <li>Myszy poddaje się głębokiej anestezji systemowej mieszaniną ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg, wstrzyknięcie d.o.). Pozwoli to utrzymać mysz w stanie znieczulenia przez 30-60 min. Na rogówkę nakłada się miejscowy środek znieczulający (0,5% HCl proparakainy). Po 5 min unieruchamia się jedno oko pod mikroskopem dissectingowym.</li>
 <li>Za pomocą noża do zaćmy von Graefe wykonuje się bardzo delikatne nacięcie w środkowej części rogówki, 1,2-1,4 mm od limbusa rogówki (jak pokazano na Rysunku 1). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przeciąć rogówki na wylot.</li>
 <li>Pod warstwą nabłonka rogówki tworzy się kieszonkę, wprowadzając poziomo nóż w środek rogówki i ostrożnie przesuwając go w stronę limbusa (Rys. 1). Rozmiar kieszonki musi być wystarczający, aby pomieścić jeden pellet zawierający czynnik angiogenny. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić rogówki.</li>
 <li>Za pomocą pęsety powoli wprowadza się pellet do kieszonki. Należy starać się, aby pellet był jak najbardziej płaski.</li>
 <li>Po implantacji pelletu na oko nakłada się miejscową okulistyczną maść z antybiotykiem. Narzędzia przeciera się wacikami nasączonymi 70% alkoholem pomiędzy zwierzętami.</li>
 <li>Mysz przenosi się w ciepłe i suche miejsce i monitoruje do momentu, aż będzie w stanie utrzymać wyprostowaną postawę, a następnie umieszcza się ją z powrotem w klatce domowej. Przeciwbólowe leki systemowe (np. buprenorfina, 2 mg/kg, wstrzyknięcie d.o.) oraz miejscową maść z antybiotykiem (np. gentamycynę) podaje się dwa razy dziennie przez 2 dni po operacji, a stan myszy monitoruje się ściśle przez 3 dni. Oczekuje się, że gojenie zakończy się w ciągu pierwszych 48 godzin po operacji. Oko z kieszonką będzie badane za pomocą biomikroskopu lampowego między 4. a 10. dniem po implantacji pelletu.</li>
 </ol>
3. Reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li>Siedem dni po implantacji pelletu mysz zostaje znieczulona ogólnie i miejscowo zgodnie z opisem w punkcie 2.1.</li>
 <li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego obserwuje się naczynia krwionośne w rogówce indukowane przez czynnik angiogenny. W rogówce traktowanej nośnikiem nie obserwuje się wzrostu naczyń krwionośnych (Rys. 2A, rogówka traktowana nośnikiem). W rogówce traktowanej bFGF widoczna jest intensywna angiogeneza (Rys. 2B). Wzrost naczyń krwionośnych można ocenić, mierząc maksymalną długość naczyń (od prawidłowych naczyń limbalnych do wierzchołka nowych naczyń) oraz całkowitą powierzchnię naczyń krwionośnych (Rys. 2B, zaznaczoną czerwoną przerywaną linią w rogówce traktowanej bFGF). Opisano również inne metody ilościowe 2,5.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="Schemat procesu angiogenezy rogówkowej przedstawiający tworzenie kieszonki i osadzanie pelletu, z opisanymi warstwami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. A. Prawidłowa rogówka z barwieniem H&amp;E. W prawidłowej rogówce nie występują naczynia krwionośne. B. Wykonanie kieszonki pod warstwą nabłonka rogówki. C. Osadzenie pelletu w kieszonce. D. Czynnik angiogenny uwalniany jest z pelletu, a nowe naczynia krwionośne wyrastają z prawidłowych naczyń zakątka rogówki.
<img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="Eksperyment na rogówce, schemat angiogenezy, grupa kontrolna vs. grupa traktowana bFGF, pokazano pellet i naczynia lembalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny wynik pięć dni po implantacji pelletu. A. Rogówka z pelletem zawierającym wyłącznie nośnik. Brak tworzenia nowych naczyń krwionośnych w rogówce. Widoczne są jedynie istniejące wcześniej prawidłowe naczynia lembalne. B. Rogówka z pelletem zawierającym bFGF. Z istniejących wcześniej prawidłowych naczyń lembalnych wyrosły liczne nowe naczynia krwionośne (zaznaczone linią przerywaną).

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Model testu z kieszonką w rogówce myszy został po raz pierwszy opisany w 1979 roku przez Muthukkaruppan VR i Auerbach R 6. Szczegółowe protokoły zostały opublikowane przez różne laboratoria 2,3,7,8. Nasze laboratorium modyfikowało i stosowało tę metodę w badaniach przez wiele lat 4. Test z kieszonką w rogówce myszy jest stosunkowo prostym modelem o dużej powtarzalności. Inną zaletą tego modelu jest fakt, że ponieważ rogówka normalnie nie posiada naczyń krwionośnych, poziom tła w tym teści...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PZMIV-BS</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do katarakty Von Graefe (ostrze 1,5x25mm, płaskie)</td><td>Ambler Surgical</td><td>3401E</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Lampa szczelinowa</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>30 SL-M</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Sprzęt</td></tr><tr><td>bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Sukralfat (kompleks sacharozy oktasiarczanu&amp;mdash;glinu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0652</td><td>10% w PBS</td></tr><tr><td>poly-HEMA (poli(metakrylan 2-hydroksyetylu))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3932</td><td>12% w etanolu</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Odczynniki i materiały</td></tr></tbody></table>

myszowy model testu kieszonki rogówkowej do badań angiogenezy

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Normalna rogówka nie zawiera tkanek naczyniowych. Jednak w rogówce można wywołać wzrost i przeżycie naczyń krwionośnych po podaniu silnych czynników angiogennych 1. Ta unikalna cecha sprawiła, że test kieszonkowy rogówki stał się jednym z najczęściej stosowanych modeli w badaniach nad angiogenezą. Rogówka składa się z wielu warstw komórek. Można zatem osadzić w niej pellet zawierający badany czynnik angiogenny, aby zbadać jego efekt angiogenny 2,3. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółową instrukcję, jak (I) przygotować pellet zawierający czynnik angiogenny, (II) osadzić pellet w rogówce oraz (III) przeanalizować angiogenezę indukowaną przez badany czynnik angiogenny. Ponieważ podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) jest znany jako jeden z najsilniejszych czynników angiogennych 4, został on tutaj wykorzystany do indukowania angiogenezy w rogówce.

Rogówka jest wyjątkowa ze względu na brak tkanek naczyniowych. Niemniej jednak, silne czynniki angiogenne mogą indukować intensywny wzrost i przeżywalność naczyń krwionośnych w rogówce. W związku z tym rogówka może stanowić cenne narzędzie w badaniach nad angiogenezą. Niniejszy protokół demonstruje, jak wykonać model kieszonkowy w rogówce myszy oraz jak ocenić indukowaną przez czynniki angiogenne angiogenezę z wykorzystaniem tego modelu.

Myszowy model testu kieszonki rogówkowej do badań angiogenezy

Prawidłowa rogówka jest wolna od tkanek naczyniowych. Jednakże, w obecności silnych czynników angiogennych, można indukować wzrost i przeżywalność naczyń krwionośnych w rogówce, gdy ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie modelu testu kieszonkowego w rogówce do zbadania efektu angiogennego podstawowego FGF. Osiąga się to poprzez wykonanie kieszonki w rogówce i umieszczenie w niej pelletu z podstawowym FGF. Następnie podstawowy FGF uwalnia się z pelletu, co indukuje wzrost nowych naczyń krwionośnych z naczyń limbalnych.Ostatecznie protokół ten pozwala na uzyskanie silnego wzrostu nowych naczyń krwionośnych z naczyń zakątka w kierunku pelletu bFGF. Cześć, jestem Shuan z laboratorium dr Shiley w Narodowym Instytucie INIH. Główną zaletą tego modelu jest jego względna prostota oraz wysoka powtarzalność.Kolejną zaletą jest fakt, że normalna rogówka nie posiada naczyń krwionośnych, dzięki czemu tło jest bardzo przejrzyste. Mamy już ogólne pojęcie o modelu. Pokażę teraz krok po kroku, jak stworzyć model choroby rogówki.Zacznijmy. Aby przygotować się do tej procedury, należy sporządzić następujące roztwory: 10% w/v sate i PBS 12% w/v poly hema oraz etanol, a także basic FGF w stężeniu 1 g/µL. basic FGF musi być przechowywany w temperaturze -80 °C, natomiast pozostałe dwa roztwory można przechowywać w temperaturze pokojowej.Aby przygotować 50 peletek czynn

a-mouse-model-of-the-cornea-pocket-assay-for-angiogenesis-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model myszy kieszeni rogówki do badania angiogeneszy

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Ten film demonstruje rozwój modelu kiełkowania naczyniówki ex vivo do badania angiogenezy mikronaczyniowej oka. Test polega na hodowli eksplantatów oka myszy zawierających tkankę naczyniówki przyczepioną do twardówki i nabłonka barwnikowego siatkówki w określonych warunkach, które sprzyjają kiełkowaniu mikronaczyniówki przez naczyniówkę.

Test kiełkowania naczyniówki w celu zbadania proliferacji mikrokrążenia gałki ocznej ex vivo

Neowaskularyzacja (NV) rogówki może komplikować wiele patologii wzrokowych. Wykorzystując kontrolowany model uszkodzeń spowodowanych oparzeniami zasadowymi, można uzyskać wymierny poziom NV rogówki do mechanistycznego badania NV rogówki i oceny potencjalnych terapii zaburzeń neowaskularnych.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Neowaskularyzacja tęczówki, częste powikłanie choroby niedokrwiennej siatkówki, może prowadzić do zagrażającej wzrokowi jaskry neowaskularnej. W tym miejscu opisujemy mysi protokół indukowania eksperymentalnej neowaskularyzacji tęczówki, który może być wykorzystany do nieinwazyjnej oceny substancji modulujących angiogenezę.

Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka

Ten protokół skupia się na neowaskularyzacji rogówki wywołanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Metoda ta pozwala na stworzenie powtarzalnego i kontrolowanego modelu choroby rogówki w celu zbadania patologicznej angiogenezy i związanych z nią mechanizmów molekularnych oraz przetestowania nowych środków farmakologicznych zapobiegających neowaskularyzacji rogówki.

Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metodę kieszeni rogówkowej do badania angiogenezy z użyciem mysiego modelu i czynnika basic FGF. Technika ta pozwala na kontrolowane indukowanie wzrostu naczyń krwionośnych w rogówce.

Myszowy model testu kieszonki rogówkowej do badań angiogenezy

Przeglądaj więcej filmów