Name: Długoterminowy posiew wycinków ludzkiego raka piersi i ich analiza za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę długoterminowej hodowli wycinków raka piersi w kolagenie i analizy ich trójwymiarowego wzrostu za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej. Technika umożliwia ocenę odpowiedzi na leki w indywidualnych próbkach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lorny Renshaw (Edinburgh Breast Unit) za nieocenioną pomoc w pozyskaniu próbek klinicznych.
Wykorzystanie materiału nowotworowego zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Lothian (08/S1101/41) i pozyskane w ramach programu Experimental Cancer Medicine Centre (Edynburg).
Niniejsza praca jest finansowana przez Scottish Funding Council. A.D.L. jest stypendystą klinicznym fundacji Miss Margaret Butters Reekie Trust.

1. Wyodrębnianie kolagenu z ogonów szczura
<ol>
<li>Umieścić zamrożone, świeże ogony szczurów w 70% etanolu.</li>
<li>Usunąć skalpelem skórę, aby odsłonić ścięgna.</li>
<li>Oddzielić ścięgna od ogona i umieścić w 70% etanolu w celu sterylizacji.</li>
<li>Zważyć zebrane ścięgna i przenieść do kwasu octowego (1g ścięgna na 250ml 0.5M kwasu octowego). Mieszać przez 48hr w 4°C.</li>
<li>Odwirować mieszaninę ścięgien i kwasu octowego przy 10,000g przez 30min, a następnie odrzucić osad.</li>
<li>Do supernatantu dodać taką samą objętość 10% (w/v) NaCl i pozostawić mieszaninę przez noc w 4°C.</li>
<li>Zebrać bogatą w kolagen, nierozpuszczalną warstwę dolną i wirować przez kolejne 30min przy 10,000g.</li>
<li>Resuspendować materiał bogaty w kolagen w 0.25M kwasie octowym w 4°C i dializować przeciwko kwasowi octowemu w proporcji 1:1000 w 4°C przez 3 dni, zmieniając bufor do dializy dwa razy dziennie.</li>
<li>Dalszą sterylizację roztworu kolagenu przeprowadzić poprzez wirowanie (20,000g przez 2hr) i przechowywać w 4°C.</li>
<li>Rozcieńczyć kolagen w razie potrzeby, dodając sterylny kwas octowy 1:1000, aż do uzyskania stężenia zapasu 1mg/ml.</li>
</ol>

2. Tworzenie testu 3D
Test 3D opiera się na teście z wykorzystaniem linii komórkowej, opublikowanym wcześniej2.
<ol>
<li>Wielokrotne biopsje gruboigłowe pobiera się od pacjentek wyrażających zgodę w czasie radykalnej resekcji chirurgicznej w przebiegu inwazyjnego raka piersi.</li>
<li>Za pomocą skalpela podzieli się rdzenie na fragmenty o objętości 1mm3, oceniając to wizualnie. Odcina się i usuwa makroskopowo wyraźną tkankę tłuszczową.</li>
<li>Fragmenty zanurza się w pożywce MEGM Complete. Tkankę można przechowywać w tym stanie do 1hr.</li>
<li>Aby przygotować żel kolagenowy, miesza się w lodzie kolagen z ogona szczura (1mg/ml), przefiltrowany kwas octowy (1:1000), 10x DMEM/F12 oraz 0.22M NaOH w stosunku 3:5:1:1, aby uzyskać końcowe stężenie kolagenu 0.3mg/ml.</li>
<li>Do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej wstrzykuje się 1.2ml mieszaniny kolagenowej, a następnie umieszcza ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10min w celu zainicjowania żelowania.</li>
<li>Po 10min wyjmuje się płytkę 24-dołkową z inkubatora. Kawałki guza układa się na żelującym kolagenie i delikatnie wpycha do centrum żelu za pomocą końcówki pipety 10μl. Płytkę 24-dołkową zawraca się do inkubatora na 1hr.</li>
<li>W przypadku guzów ER+, pożywkę MEGM Complete uzupełnia się β-oestradiol do stężenia 3.2x10-10 M. Po 1hr żelowania układów, ostrożnie wprowadza się 1.2ml uzupełnionej pożywki do każdego dołka. Końcowe stężenie β-oestradiol w układzie wyrówna się do poziomu 1.6x10-10 M, aby odtworzyć fizjologiczne poziomy estrogenu występujące w tkance piersi3.</li>
<li>Końcówką pipety 10μl przesuwa się wzdłuż wewnętrznej krawędzi każdego dołka, uwalniając obwodowo każdy żel, co pozwala im swobodnie pływać w pożywce. Płytkę 24-dołkową zawraca się do inkubatora.</li>
<li>Uzupełnioną pożywkę wymienia się dwa razy w tygodniu aż do zakończenia eksperymentu. Eksperyment kończy się poprzez usunięcie pożywki i dodanie utrwalacza z formaliną.</li>
</ol>

3. Barwienie przeciwciałami prób do tomografii projekcyjnej optycznej
Zastosowano wcześniej opisaną metodę barwienia całych próbek4.
<ol>
<li>Próbki utrwalone formaliną płukać przez 30min w PBS. Odwadniać żele stopniowo w metanolu rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% i 100% przez ≥15min na każdym etapie. </li>
<li>Tkankę inkubować w świeżo przygotowanej mieszaninie MeOH: DMSO: 30%H2O2 w stosunku 2:1:3 (15% v/v H2O2) w temperaturze pokojowej przez 24hr w celu wygaszenia autofluorescencji. </li>
<li>Próbki płukać dwukrotnie przez 30min w metanolu. Próbki mrozić do -80°C pięciokrotnie, za każdym razem przez co najmniej 1hr, a następnie ogrzewać do temperatury pokojowej (RT), aby zapewnić dostęp do antygenów w głębszych partiach tkanki. </li>
<li>Rehydratować tkankę z powrotem do 0,05% PBST, używając metanolu jako rozcieńczalnika (33%, 66% i 100% przez 15min na każdym etapie). </li>
<li>Blokować tkankę w roztworze blokującym (10% surowicy w 0,05% PBST) przez 24hr. </li>
<li>Tkankę inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w celu identyfikacji komponentu nabłonkowego, używając królika przeciwko cytokeratynie w stężeniu 1:500 rozcieńczonym w 1,5ml roztworu blokującego zawierającego 5% DMSO przez 48hr. </li>
<li>Próbki płukać czterokrotnie w 0,05% PBST przez 30min każdorazowo. </li>
<li>Tkankę inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym (1:100 koza przeciwko królikowi Alexa555), rozcieńczonym w 1,5ml roztworu blokującego zawierającego 5% DMSO przez 48hr. </li>
<li>Próbki płukać ponownie w 0,05% PBST czterokrotnie przez 30min każdorazowo. </li>
</ol>

4. Optyczna tomografia projekcyjna
Optyczna tomografia projekcyjna to technika mikroskopowa opracowana wcześniej w celu uzyskiwania wysokorozdzielczych obrazów 3D fluorescencyjnych preparatów biologicznych o grubości do 15 milimetrów5.
<ol>
<li>Osadź zabarwiony żel w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i odwadniaj w 100% metanolu przez 24h. Przejrzyść preparat w roztworze BABB (1:2 alkohol benzylowy, benzoesan benzylu) przez 48h, a następnie przeskanuj przy użyciu skanera OPT 3001M (Bioptonics).</li>
<li>Sygnał docelowy oraz autofluorescencję rejestruje się odpowiednio przy użyciu zestawu filtrów Cy3 (wzbudzenie 545nm/30 nm, emisja 610/75 nm) oraz zestawu filtrów GFP1 (wzbudzenie 425nm/40 nm, emisja LP475 nm).</li>
</ol>

5. Rekonstrukcja i kwantyfikacja 3D
<ol>
<li>Zestaw projekcji kątowych uzyskanych za pomocą OPT można zrekonstruować przy użyciu oprogramowania NRecon (SkyScan), aby stworzyć serię przekrojów poprzecznych testu inwazji. Oprogramowanie to jest dostępne do bezpłatnego pobrania pod adresem <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a>.</li>
<li>Przeanalizuj zrekonstruowane dane przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer). Bezpłatne oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne do pobrania pod adresem <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a>.</li>
<li>W celu ilościowego oznaczenia objętości nabłonka na podstawie barwienia cytokeratyną, ustaw minimalny próg intensywności woksela, aby zredukować zakłócenia wynikające z fluorescencji tła w kanale docelowym. Próg ten zdefiniowaliśmy empirycznie na poziomie 9000 a.u. Korzystając z listy dostępnych parametrów w aplikacji pomiarowej, określiliśmy objętość nabłonka pozostającego w ciągłości z oryginalnym rdzeniem (wyznaczonym w kanale autofluorescencyjnym). Pozwoliło to na ilościowe porównanie objętości przerostu nabłonka pomiędzy różnymi próbkami nowotworowymi.</li>
</ol>

6. Reprezentatywne wyniki:
Podczas opracowywania testu wykorzystano łącznie 52 próbki biopsji raka piersi o szerokim spektrum histopatologicznym. Z tej liczby &lt;U 10% (5/52) pacjentów nie udało się uzyskać co najmniej jednego wykonalnego testu inwazyjności. Niepowodzenie testu wynikało z nadkażenia bakteryjnego lub niewystarczającej ilości materiału z biopsji guza. Zatem zastosowanie testu nie jest ograniczone do konkretnego podtypu raka piersi.
Typowe analizy (rycina 1) utrwalone po 20 dniach w hodowli kolagenowej, a następnie zabarwione na cytokeratynę. Oprogramowanie Volocity pozwala na rozpoznanie zarówno masy nabłonkowej ciągle połączonej z oryginalnym rdzeniem, jak i oddzielnych grup naciekających komórek, oraz na oddzielne ilościowe określenie każdej z tych objętości.
<img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Analiza autofluorescencji nabłonka; modele 3D przedstawiają rdzeń i powierzchnię, wyniki mikroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Testy inwazji po utrwaleniu i kwantyfikacji. Test obejmuje próbki pobrane z wielu podtypów raka piersi: a) ER+ b) HER2+ oraz c) ER- .

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW i JF są zatrudnieni w MRC Technology, która komercjalizuje skanery OPT Bioptonics. Pozostali autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

Testy oparte na kolagenie do badania zachowania linii komórkowych nowotworów są obecnie szeroko stosowane 6,7,8. Niemniej jednak testy te nie odzwierciedlały w pełni złożoności guza i jego środowiska. W niniejszym badaniu wykazujemy, że materiały z raka piersi u ludzi mogą być wykorzystane w podobny sposób, ex vivo. Ponadto OPT jest użytecznym narzędziem do charakteryzacji trójwymiarowej ekspansji raka piersi. Stwierdzono, że głównym ograniczeniem tej techniki jest dostępność materiału nowotworowego (pojedyncza biopsja gruboigłowa jest wystarczająca do przeprowadzenia 4-6 testów). Innym czynnikiem ograniczającym jest fakt, że inwazja strukturalna występuje tylko w około 40% testów. Aby temu zaradzić, około 7. dnia regularnie dodajemy dowolną pożądaną substancję leczniczą do wszystkich testów z widocznym wzrostem.
Zastosowanie OPT mogłoby zostać w przyszłości rozszerzone o wykrywanie zmian masowych, ex vivo, wynikających z leczenia farmakologicznego. Mogłoby to z kolei ułatwić bardziej zindywidualizowaną terapię nowotworową, niezależną od modeli zwierzęcych. Obecnie badamy odpowiedź guzów ER+ na tamoksyfen ex vivo.

<table><tbody><tr><td>MEGM Complete</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8900 10X1L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-&amp;#8211;estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-cytokeratynowe</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich.</td></tr></tbody></table>

długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Rak piersi jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności w świecie zachodnim. Powszechnie wiadomo, że rozprzestrzenianie się raka piersi, najpierw miejscowo, a następnie w odległych organach, jest kluczowym czynnikiem wpływającym na rokowania pacjentek. Eksperymentalne systemy badania raka piersi opierają się na liniach komórkowych, zwykle pochodzących z guzów pierwotnych lub wysięków opłucnowych. Badania te ograniczają dwie główne przeszkody: (i) niektóre znane podtypy raka piersi (zwłaszcza guzy luminalne B o złych rokowaniach) nie są reprezentowane w obecnych kolekcjach linii komórkowych; (ii) zazwyczaj nie bierze się pod uwagę wpływu mikrośrodowiska guza.
Prezentujemy technikę hodowli pierwotnych próbek raka piersi wszystkich podtypów. Osiąga się to poprzez zastosowanie trójwymiarowego (3D) systemu hodowli, w którym niewielkie fragmenty guza są zatapiane w miękkich poduszkach z kolagenu I szczura. W ciągu 2-3 tygodni komórki nowotworowe rozprzestrzeniają się w kolagenie i tworzą różnorodne struktury podobne do tych obserwowanych w guzach ludzkich1. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność żywych adipocytów, komórek nabłonkowych i fibroblastów w obrębie pierwotnego rdzenia. Wykazano, że złośliwe komórki nabłonkowe o morfologii płaskonabłonkowej naciekają do otaczającego kolagenu. W komórkach tych widoczny był pleomorfizm jądrowy, a także figury mitotyczne i ciałka apoptotyczne.
Wykorzystaliśmy optyczną tomografię projekcyjną (OPT), technologię obrazowania 3D, aby określić stopień rozprzestrzeniania się guza w hodowli. Użyliśmy OPT do pomiaru całkowitej objętości hodowli nowotworowej, parametru rutynowo mierzonego podczas leczenia neoadjuwantowego pacjentek z rakiem piersi w celu oceny odpowiedzi na terapię lekową.
W niniejszej pracy przedstawiamy możliwość hodowli ludzkich guzów piersi bez stronniczości względem podtypów oraz kwantyfikacji ich rozprzestrzeniania się ex vivo. Metoda ta mogłaby zostać wykorzystana w przyszłości do oceny wrażliwości na leki w oryginalnym guzie. Może to zapewnić model o większej wartości prognostycznej niż obecnie stosowane linie komórkowe.

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Rak piersi jest główną przyczyną śmiertelności w świecie zachodnim. Jest dobrze udokumentowane, że rozprzestrzenianie się raka piersi, najpierw miejscowo, a później...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie długoterminowej hodowli pierwotnej tkanki raka piersi oraz ilościowe określenie trójwymiarowego wzorca wzrostu. W tym celu w pierwszej kolejności ekstrahuje się kolagen typu I z ogonów szczurów. Następnie przygotowuje się próbkę biopsji nowotworowej i osadza ją w macierzy kolagenowej.Po 20 dniach hodowli tkanka raka piersi zostaje poddana barwieniu immunofluorescencyjnemu i zeskanowana za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej, a następnie dane są rekonstruowane i ilościowo analizowane. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące wzorzec naciekania guza u konkretnego pacjenta, co może zostać dalej poddane analizie ilościowej w trzech wymiarach. Główną zaletą hodowli ex vivo jest wykorzystanie rzeczywistego materiału nowotworowego w kontekście fizjologicznym.W przeciwieństwie do kultur linii komórkowych, wizualna demonstracja tej techniki jest istotna, ponieważ pozyskanie pierwotnej tkanki nowotworowej jest trudne. Prawidłowa technika zoptymalizuje szanse na pomyślny wynik eksperymentu. Technikę tę zaprezentujemy ja oraz Joanne Farrell z MRC Technology, aby rozpocząć ekstrakcję kolagenu typu I.Umieścić zamrożone ogony szczurów w 70% etanolu aż do rozmrożenia. Za pomocą skalpela usunąć skórę, aby odsłonić ścięgna, oddzielić ścięgna od ogona i umieścić je w 70% etanolu w celu sterylizacji. Zważyć zebrane ścięgna i przenieść je do kwasu octowego.Mieszać przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Następnie odwirować mieszaninę ścięgna z kwasem octowym przy 10 000 ×g przez 30 minut i usunąć pellet.Do nadnadkładu S dodać taką samą objętość 10% chlorku sodu i pozostawić mieszaninę na noc w temperaturze 4°C. Odpipetować i usunąć górną warstwę. Następnie zebrać bogatą w kolagen nierozpuszczalną warstwę dolną i wirować przez 30 minut przy 10 000 ×g.Następnie pod wpływem grawitacji resuspendować materiał bogaty w kolagen w 0,25 M kwasie octowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść za pomocą pipety do worka dializacyjnego. Dializować przeciwko 1:1000 kwasu octowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni.Wymiana buforu do dializy dwa razy dziennie. Kolagen można dodatkowo wysterylizować poprzez kolejny etap wirowania i resuspensję w kwasie octowym na potrzeby tego testu. Należy rozpocząć od kilku biopsji rdzeniowych, pobranych od pacjentów wyrażających zgodę w czasie radykalnej resekcji chirurgicznej z powodu inwazyjnego raka piersi, wykonanej metodą wizualną przy użyciu skalpela.Podziel tkankę na fragmenty o wielkości jednego milimetra sześciennego, odcinając i usuwając wszelki makroskopowo widoczny tłuszcz. Umieszczenie próbki na ostrzu skalpela pozwala na lepszą wizualizację wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza i sprawia, że sekcja jest zarówno precyzyjna, jak i bezpieczna. Zanurz fragmenty w pełnej pożywce MEGM.Tkankę można przechowywać w tym stanie do jednej godziny, aby przygotować mieszaninę żelu kolagenowego o stężeniu 0,3 mg/ml na lodzie, używając kolagenu z ogona szczura w stężeniu 1 mg/ml, filtrowanego kwasu octowego 1:1000, 10x DMEM/F-12 oraz 0,22 M wodorotlenku sodu. Do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej pipetujemy 1,2 ml mieszaniny kolagenowej i umieszczamy w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut. Aby rozpocząć proces żelowania, należy wyjąć płytkę z inkubatora.Umieść fragmenty guza na żelującym kolagenie i za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 µL delikatnie wciśnij je do wnętrza żelu. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na jedną godzinę. Uzupełnij pełną pożywkę A-M-E-G-M beta-estradiolem do stężenia końcowego 3,2 × 10⁻¹⁰ M.Po jednej godzinie inkubacji testów żelowych ostrożnie wprowadź 1,2 mililitra uzupełnionej pożywki do każdego dołka. Końcowe stężenie beta-estradiolu zostanie wyrównane do poziomu 1,6 × 10⁻¹⁰ M, aby odwzorować fizjologiczne poziomy estrogenu występujące w tkance piersi. Przesuń końcówkę pipety 10 µL wzdłuż wewnętrznej krawędzi każdego dołka, uwalniając obwodowo każdy żel, co pozwoli im swobodnie pływać w pożywce.Umieść płytkę 24-dołkową z powrotem w inkubatorze; wymieniaj medium suplementowane dwa razy w tygodniu aż do zakończenia eksperymentu. Wzrost naciekowy można obserwować w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu w jasnym polu. Wideo z opóźnionym przechwytywaniem klatek z rozszerzoną głębią ostrości pokazuje naciekanie nabłonka z krawędzi guza do otaczającego kolagenu w ciągu 60 godzin, od siódmego do dziewiątego dnia.Zakończ eksperyment, usuwając medium i dodając preparat fiksacyjny na 48 godzin w celu przeprowadzenia immunobarwienia próbek z testu 3D do optycznej tomografii projekcyjnej. Najpierw przenieś utrwalone formaliną preparaty z dołków do probówki.Następnie płukać je przez 30 minut. W PBS przeprowadzić stopniowe odwodnienie żeli, używając metanolu rozcieńczonego w PBS zawierającym 0,05% Tween 20, a następnie inkubować tkankę w świeżo przygotowanej mieszaninie metanolu, DMSO i 30% nadtlenku wodoru w stosunku dwa do jednego do trzech w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w celu wygaszenia autofluorescencji. Następnie próbki płukać dwukrotnie przez 30 minut.W metanolu poddaj próbki pięciokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania od -80 °C do temperatury pokojowej, przez co najmniej jedną godzinę w każdym cyklu, aby zapewnić dostępność antygenów znajdujących się w głębszych partiach tkanki. Następnie rehydratuj tkankę do PBS z 0,05%T 20, używając metanolu jako rozcieńczalnika, inkubuj tkankę w roztworze blokującym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C w celu identyfikacji treści nabłonkowej, a następnie inkubuj próbki w królika przeciwciałach pierwszorzędowych przeciwko cytokeratynie, rozcieńczonych w 1,5 ml roztworu blokującego z 5%DMSO, przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Przemyj próbki w PBS z 0,05%T 20 przez 24 razy po 30 minut każde.Inkubować tkankę z fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi, rozcieńczonymi w 1,5 mililitrach roztworu blokującego zawierającego 5% DMSO, przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie przemyć próbki w PBS z 0,05% 24 razy, po 30 minut za każdym razem. Aby przygotować próbki do optycznej tomografii projekcyjnej, zamontować zabarwiony żel w 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia i odwodnić w 100% metanolu przez 24 godziny.Następnie przeprowadź proces przejrzyszczania preparatu w roztworze BABB przez 48 godzin. Przeskanuj próbki za pomocą skanera OPT 3001 M. Zarówno obraz docelowy, jak i autofluorescencję zarejestruj odpowiednio przy użyciu zestawów filtrów SI three oraz GFP one.Próbkę umieszcza się w przezroczystym cylindrze z aerogelem i obraca w krokach kątowych wynoszących 0,9 stopnia. W każdej z 400 pozycji obrotu wykonuje się cyfrowy obraz statycznej próbki. Należy użyć oprogramowania n recon do rekonstrukcji zestawu projekcji kątowych uzyskanych w OPT poprzez utworzenie serii przekrojów poprzecznych testu inwazji.Przeanalizuj zrekonstruowane dane za pomocą oprogramowania velocity, aby określić objętość nabłonka na podstawie barwienia cytokieratyną. Ustaw minimalny próg intensywności wokseli, aby zredukować zakłócenia wynikające z fluorescencji tła w kanale docelowym. Próg ten został określony empirycznie na poziomie 9 000 jednostek arbitralnych.Na koniec należy wykorzystać listę dostępnych parametrów w aplikacji pomiarowej oraz dane z kanału autofluorescencji, który wyznacza nabłonek ciągły z oryginalnym rdzeniem, aby ilościowo określić objętość nabłonka w obręstwie wzrostu guza. Przedstawiono tutaj typowy test po 20 dniach hodowli w kolagenie i późniejszym barwieniu na cytokeratynę. Oprogramowanie Velocity pozwala rozpoznać zarówno masę nabłonkową, ciągłą z oryginalnym rdzeniem, jak i oddzielne grupy naciekających komórek, a następnie oddzielnie wyliczyć objętość każdego z tych obszarów.Pobrane pierwotne biopsje pochodziły z różnorodnych guzów po hodowlach ex vivo. Do określenia tempa proliferacji, apoptozy lub zjawisk pokrewnych można wykorzystać również inne techniki, takie jak immunohistochemia lub immunofluorescencja. Opracowanie tej metody pozwoliło badaczom w dziedzinie translacyjnych badań nad rakiem piersi na poszukiwanie sposobów identyfikacji oporności na leki u osób chorych na raka piersi.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Długotrwała kultura ludzkich próbek raka piersi i ich analiza za pomocą tomografii projekcyjnej optycznej

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych,...

Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii 

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Poznaj metodę długoterminowej hodowli wycinków raka piersi w kolagenie i analizy ich trójwymiarowego wzrostu za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej. Technika umożliwia ocenę odpowiedzi na leki w indywidualnych próbkach nowotworowych.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Przeglądaj więcej filmów