Name: Biblioteki Illumina mRNA-Seq z pojedynczym odczytem i sparowanym końcem z 10 nanogramów całkowitego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj metodę przygotowania bibliotek mRNA-Seq Illumina z pojedynczym odczytem i sparowanym końcem z zaledwie 10 nanogramów całkowitego RNA. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów z minimalnych ilości materiału biologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Morgridge Institute for Research oraz University of Wisconsin Foundation. Dziękujemy Kristie Eastman za pomoc redakcyjną.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Autorzy ujawniają, że J.A.T. jest założycielem, udziałowcem, konsultantem i członkiem zarządu firmy Cellular Dynamics International (CDI). Pełni on również funkcję doradcy naukowego i posiada interesy finansowe w Tactics II Stem Cell Ventures.

Obecne protokoły przygotowywania bibliotek paired-end wymagają od 1 μg9 do 2,5 μg10 początkowej ilości całkowitego RNA. Przedstawiamy tutaj naszą metodę opartą na liniowej amplifikacji T7 (T7LA) do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania Illumina zarówno typu single read, jak i paired-end, oraz wykazujemy, że metoda ta pozwala na generowanie bibliotek z ilości całkowitego RNA wynoszącej już 10 ng, dostarczając danych porównywalnych z danymi z bibliotek minimalnie amplifikowanych (MinAmp) przygotowanych z 1000-krotnie większej ilości materiału wyjściowego (10 μg całkowitego RNA). Biblioteki z 10 ng nie tylko identyfikują podobną całkowitą liczbę genów, ale także generują podobne sygnatury ekspresji genów (ryciny 3a i b). Co więcej, biblioteki single read i paired-end przygotowane metodą T7LA są do siebie bardzo zbliżone (rycina 3c), co pozwala badaczom na porównywanie danych generowanych przez biblioteki sporządzone według obu protokołów. Ponieważ biblioteki te zostały przygotowane z RNA ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, przeszukaliśmy je pod kątem 30 genów specyficznych dla komórek macierzystych i stwierdziliśmy, że prawie wszystkie te geny (93-100%) są identyfikowane w bibliotekach przygotowanych z co najmniej 10 ng początkowego całkowitego RNA (rycina 4), co potwierdza skuteczność naszego protokołu. Uważamy, że nasz protokół byłby bardzo użyteczny dla badaczy, szczególnie w sytuacjach takich jak analiza komórek sortowanych przepływowo lub tkanek mikrodissekowanych laserowo, gdzie ilość materiału wyjściowego jest ograniczona. W takich okolicznościach nasz protokół pozwoliłby na generowanie danych o ekspresji genów porównywalnych z bibliotekami przygotowanymi z znacznie większych ilości materiału, ponieważ nasza metoda uzyskuje profile ekspresji porównywalne w zakresie co najmniej 3 rzędów wielkości początkowego RNA.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik do fragmentacji</td><td>Ambion</td><td>AM8740</td><td></td></tr><tr><td>Liniowa akrylamid</td><td>Ambion</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MEGAscript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz, niepoddana działaniu DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>metylowane dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0431</td><td>Tylko do przygotowania próbek Single Read</td></tr><tr><td>Zestaw TruSeq SR Cluster Generation v5</td><td>Illumina</td><td>GD-203-5001</td><td>Tylko do przygotowania próbek Single Read</td></tr><tr><td>Zestaw TruSeq Seq Kit v5 36 cykli</td><td>Illumina</td><td>FC-104-5001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Chip Seq Sample Prep</td><td>Illumina</td><td>IP-102-1001</td><td>Tylko do przygotowania próbek Single Read. Można zastąpić zestawem NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 nr kat. E6040S</td></tr><tr><td>Zestaw TruSeq PE Cluster Generation v5</td><td>Illumina</td><td>PE-203-5001</td><td>Tylko do przygotowania próbek paired end</td></tr><tr><td>Zestaw Paired End Sample Prep</td><td>Illumina</td><td>PE-102-1001</td><td>Tylko do przygotowania próbek paired end</td></tr><tr><td>Marker 1kb plus</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNaza H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-014</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do drugiej nici 5x</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>18010-017</td><td></td></tr><tr><td>E-gel SYBR safe 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G521802</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III (z buforem 5X FS i 0,1M DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>12183555</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA Qubit assay</td><td>Invitrogen</td><td>Q32852</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dsDNA HS Qubit assay</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>Invitrogen</td><td>18005-025</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure woda wolna od DNazy i RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Superscript II do syntezy dwuniciowego cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11917-020</td><td></td></tr><tr><td>Losowe primery (Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>Tylko do przygotowania próbek paired end</td></tr><tr><td>Primer Not1Nonamer B</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Tylko do przygotowania próbek Single Read</td></tr><tr><td>Oligo dT T7</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do trawienia Not1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>Tylko do przygotowania próbek Single Read</td></tr><tr><td>Zestaw Rneasy Minelute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNEasy Mini (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania z żelu</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Rneasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania i zagęszczania DNA (250X)</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4014</td><td></td></tr></tbody></table>

biblioteki mrna-seq illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego rna

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Sekwencjonowanie całego transkryptomu metodą mRNA-Seq jest obecnie szeroko stosowane do przeprowadzania globalnych analiz ekspresji genów, mutacji, ekspresji allelo-specyficznej oraz innych analiz w skali całego genomu. mRNA-Seq umożliwia ponadto analizę ekspresji genów w genomach niesekwencjonowanych. mRNA-Seq charakteryzuje się wysoką czułością, szerokim zakresem dynamicznym i pozwala na pomiar liczby kopii transkryptów w próbce. Analizator genomu firmy Illumina przeprowadza sekwencjonowanie dużej liczby (&gt; 107) stosunkowo krótkich odczytów sekwencji (&lt; 150 bp). Podejście &quot;paired end&quot;, w którym pojedynczy długi odczyt jest sekwencjonowany z obu końców, pozwala na śledzenie alternatywnych miejsc splicingu, insercji i delecji oraz jest użyteczne przy składaniu transkryptomu de novo.
Jednym z głównych wyzwań, z jakimi mierzą się badacze, jest ograniczona ilość materiału wyjściowego. Na przykład w eksperymentach, w których komórki są pozyskiwane metodą mikrodysekcji laserowej, dostępna ilość całkowitego RNA na starcie może być liczona w nanogramach. Opisano przygotowanie bibliotek mRNA-Seq z takich próbek1, 2, jednak wiąże się ono ze znaczną amplifikacją PCR, która może wprowadzać błędy systematyczne. Opublikowano również inne procedury konstrukcji bibliotek RNA-Seq z minimalną amplifikacją PCR3, 4, lecz wymagają one mikrogramowych ilości wyjściowego całkowitego RNA.
Opisujemy tutaj protokół przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq na platformie Illumina Genome Analyzer II, który pozwala uniknąć znacznej amplifikacji PCR i wymaga zaledwie 10 ng całkowitego RNA. Choć protokół ten został opisany wcześniej i zwalidowany dla sekwencjonowania jednostronnego (single-end)5, wykazując tworzenie bibliotek kierunkowych bez wprowadzania istotnego błędu amplifikacji, w niniejszej pracy poddajemy go dalszej walidacji pod kątem zastosowania jako protokół dwustronny (paired-end). Wybiórczo amplifikujemy poliadenylowane mRNA z wyjściowego całkowitego RNA, wykorzystując opartą na T7 metodę amplifikacji liniowej Eberwine, nazwaną &quot;T7LA&quot; (liniowa amplifikacja T7). Amplifikowane poli-A mRNA są fragmentowane, poddawane odwrotnej transkrypcji, a następnie ligowane z adapterami w celu uzyskania końcowej biblioteki sekwencjonowania. Zarówno w przypadku odczytów jednostronnych, jak i dwustronnych, sekwencje są mapowane do ludzkiego transkryptomu6 i normalizowane, aby umożliwić porównanie danych z wielu serii pomiarowych. Poziom ekspresji genów raportujemy w jednostkach transkryptów na milion (TPM), co stanowi lepszą miarę niż RPKM przy porównywaniu próbek7.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Sekwencjonowanie całego transkryptomu metodą mRNA-Seq jest obecnie szeroko stosowane do analizy globalnej ekspresji genów, mutacji, ekspresji allelo-specyficznej oraz innych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie bibliotek sekwencji mRNA dla systemu Illumina z niewielkich ilości materiału wyjściowego. Pierwszym krokiem procedury jest odwrotna transkrypcja całkowitego RNA z wykorzystaniem siedmiu starterów DTT w celu otrzymania cDNA. cDNA jest następnie wykorzystywane do amplifikacji RNA poprzez transkrypcję in vitro. Następnie amplifikowane RNA poddawane jest fragmentacji przypadkowej.Odwrotna transkrypcja pofragmentowanego RNA prowadzi do powstania cDNA, które poddawane jest ligacji adapterów, selekcji wielkości oraz amplifikacji PCR. Ostatecznie protokół ten pozwala na określenie profilu ekspresji genów w próbce poprzez pomiar liczby kopii genów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wymaga ona jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego.Jest to wartość o kilka rzędów wielkości mniejsza niż wymagana w innych istniejących protokołach. Co więcej, metoda ta pozwala na generowanie bibliotek parowanych z tak niewielkich ilości wyjściowego RNA. Pozwoli to naukowcom na badanie nowych zagadnień biologicznych poprzez określanie profili ekspresji genów w populacjach komórkowych trudnych do uzyskania, takich jak te pochodzące z mikrodysekcji sterowanej laserem lub z cytometrii przepływowej.Pomysł opracowania tej metody pojawił się, gdy musieliśmy przeprowadzić profilowanie ekspresji genów z bardzo ograniczonej liczby komórek zróżnicowanych z ludzkich macierzystych komórek błony płodowej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy manipulacji RNA są trudne do opanowania ze względu na bardzo małą ilość RNA, która może ulec łatwej degradacji. Procedurę zaprezentują Angela Elwell, Jennifer Bolen i Baal Kimm Wynn z mojego laboratorium.Metoda równoległego przygotowania bibliotek do sekwencjonowania typu single-read oraz paired-end jest procedurą wieloetapową, przedstawioną na tym schemacie. Najpierw z wybranych komórek lub tkanek izoluje się całkowite RNA, które służy do przygotowania dwuniciowego cDNA. Następnie z cDNA, przy użyciu metody liniowej amplifikacji ewin opartej na T7, selektywnie amplifikuje się poliadenylowane mRNA. W kolejnym kroku amplifikowane poly-A jest poddawane fragmentacji losowej.Po oczyszczeniu pofragmentowanego RNA przeprowadza się jego odwrotną transkrypcję do cDNA. Końce cDNA są naprawiane, a do końców 3' fragmentów DNA dołączane są zasady. Następnie do DNA liguje się adaptery i przeprowadza trawienie enzymem NotI. W przypadku biblioteki Single Read, bibliotekę DNA izoluje się poprzez oczyszczanie w żelu, a następnie amplifikuje metodą PCR w celu ligacji adapterów Illumina.Ostatecznie, po określeniu ilości biblioteki DNA, jest ona gotowa do sekwencjonowania. Na potrzeby tego filmu zaprezentowane zostaną jedynie wybrane procedury z niniejszego protokołu. Odpisanie fragmentarycznych mRNA z ogonem polyA na cDNA obejmuje syntezę pierwszej i drugiej nici.W celu syntezy pierwszej nici dla biblioteki odczytów pojedynczych, należy dodać do probówki PCR następujące odczynniki: 10 µL pofragmentowanego poly mRNA oraz 1 µL randomowego primera nonamerowego Not I. Sekwencja primera nonamerowego Not I jest przedstawiona tutaj. Sekwencja proksymalna 5', zaznaczona na zielono, stanowi miejsce restrykcyjne Not I.Podczas gdy sekwencja zaznaczona na niebiesko jest odwrotnym komplementem sekwencji adaptera B firmy Illumina z zestawu do sekwencjonowania chipów, inkubuj mieszaninę w termocyklerze w temperaturze 70 °C przez pięć minut, a następnie szybko schłodź na lodzie. Utrzymując mieszaninę na lodzie, dodaj następujące odczynniki z zestawu SuperScript III: 4 µL buforu do pierwszej nici 5×, 2 µL DTT oraz 1,5 µL mieszaniny dNTP. W mieszaninie dNTP zastosuj 5-methyl-dCTP zamiast dCTP. Umieść probówkę w termocyklerze w temperaturze 42 °C na dwie minuty, a następnie dodaj 1 µL odwrotnej transkryptazy SuperScript III i inkubuj w temperaturze 42 °C przez jedną godzinę.Następnie przygotuj reakcję syntezy pierwszej nici dla biblioteki końców para. Do probówki PCR dodaj następujące odczynniki: 10 µL pofragmentowanego poly NNA oraz 1 µL randomowych primerów heksamerowych. Inkubuj w termocyklerze w temperaturze 65 °C przez pięć minut, a następnie szybko schłodź na lodzie.Trzymając probówkę w lodzie, należy dodać następujące odczynniki z zestawu superscript three First strand: 4 µL buforu 5x first strand, 2 µL DTT oraz 1,5 liters DN NTPs. Próbkę należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 45 °C przez jedną minutę. Następnie należy dodać 1 µL odwrotnej transkryptazy superscript three i inkubować w temperaturze 45 °C przez jedną godzinę.Obie reakcje są przygotowane do syntezy drugiej nici. Do każdej z mieszanin na lodzie dodać następujące odczynniki z zestawu superscript two: 91 µL wody wolnej od nukleaz, 30 µL buforu 5x do syntezy drugiej nici, 3 µL dNTP, 1 µL ligazy DNA z E. coli, 4 µL polimerazy DNA z E. coli oraz 1 µL RNazy H z E. coli. Wymieszać każdą probówkę przez odwracanie, następnie krótko wirować i inkubować w temperaturze 16 °C przez dwie godziny.W celu naprawy końców cDNA dla biblioteki o pojedynczym odczycie, do 40 µL oczyszczonego cDNA dodać następujące odczynniki: 5 µL buforu do ligazy T4 DNA z 10 mM ATP, 2 µL mieszaniny dNTP, 1 µL polimerazy T4 DNA, 1 µL enzymu Klenow oraz 1 µL T4 PNK. W celu naprawy końców cDNA dla biblioteki o odczytach parzystych, do 30 µL oczyszczonego cDNA dodać następujące odczynniki: 45 µL wody wolnej od RNaz i DNaz.10 µL buforu do ligazy DNA T4 z 10 mM ATP, 4 µL mieszaniny dNTP o stężeniu 10 mM, 5 µL polimerazy DNA T4, 1 µL enzymu Klenow oraz 5 µL PNK T4. Obie probówki inkubować w termocyklerze w temperaturze 20 °C przez 30 minut po naprawie końców.Kolejnym krokiem w tym protokole jest dołączenie zasad adeniny do końca 3' fragmentów DNA dla biblioteki do odczytu pojedynczego. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną: 34 µL próbki DNA, 5 µL buforu klino, 10 µL dATP oraz 1 µL klino exo. Dla biblioteki do odczytu parzystego przygotować następującą mieszaninę reakcyjną: 32 µL próbki DNA oraz 5 µL buforu clin out.10 µL dATP oraz trzy µL clin out exo; inkubuj obie mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed przygotowaniem reakcji ligacji adapterów. Rozmroź adaptery na lodzie i rozcieńcz je w stosunku 1:20 dla biblioteki single read. Użyj zestawu Illumina chip sequence sample prep kit, aby przygotować następującą mieszaninę reakcyjną: 10 µL próbki DNA, jeden µL mieszanki oligo adapterów, 15 µL buforu 2X DNA Ligase oraz cztery µL DNA Ligazy; inkubuj przez 15 minut.W temperaturze pokojowej, dla biblioteki typu paired-end, należy użyć zestawu Illumina paired end sample prep kit do przygotowania następującej reakcji. Wymieszać 10 µL próbki DNA, 10 µL mieszaniny oligo PE adapter, 25 µL 2X DNA ligase buffer oraz 5 µL DNA Ligase; inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 °C po zakończeniu odpowiednich inkubacji. Obie reakcje ligacji należy oczyścić przy użyciu kolumn XMO.Eluuj bibliotekę single-read oraz 44 µL wody; bibliotekę paired-end eluuj za pomocą 6 µL buforu elution, a następnie przeprowadź kolejną elucję w 5 µL buforu EB. Wykonaj trawienie Not1 wyłącznie dla biblioteki single-read. Inkubuj przez dwie godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie oczyść produkt reakcji, używając kolumny ZY IMO.Eluuj bibliotekę z pojedynczym odczytem za pomocą 6 µL buforu eb, a następnie przeprowadź drugie rozcieńczenie przy użyciu 5 µL eb. DNA z ligacją adapterów dla obu bibliotek jest teraz gotowe do selekcji wielkości. Procedurę selekcji wielkości dla DNA z ligacją adapterów wykonuje się przy użyciu 2% żelu agarozowego z CyberSafe od firmy Vitrogen; aby rozpocząć tę procedurę, uruchom program zero pre-run na dwie minuty.Po przygotowaniu do rozruchu nanieś 10 µL drabinki 1 KB plus oraz próbek 2D NA. Puste oczka wypełnij 10 µL wody. Uruchom program elektroforezy w żelu 2% na 28 minut.Po zakończeniu elektroforezy, za pomocą nowej żyletki wybierz fragmenty żelu odpowiadające zakresowi od 200 do 300 par zasad. Oceńiono liczbę genów zidentyfikowanych w poszczególnych bibliotekach, a poniższa tabela zawiera informacje o liczbie klastrów. Przedstawiono stopień błędu identyfikacji genów oraz procent dopasowania dla bibliotek typu single read oraz paired end.Biblioteki T seven LA z 10 ng zidentyfikowały niemal taką samą liczbę genów z TPM równym 10 lub więcej, co biblioteki UN amplified z 10 µg. W przypadku bibliotek single read, biblioteka T seven LA z 10 ng zidentyfikowała 100% z 8 500 genów wykrytych przez bibliotekę UN amplified z 10 µg dla bibliotek paradigm. Biblioteka T seven LA z 10 ng zidentyfikowała 86% genów wykrytych przez bibliotekę unpled z 10 µg.Biblioteki przygotowane z mniej niż 10 nanogramów nie pozwoliły na identyfikację tak wielu genów. Na przykład w protokole pojedynczego odczytu biblioteka T seven LA z jednego nanograma zidentyfikowała jedynie około 50% genów rozpoznanych przez bibliotekę min amp z 10 mikrogramów. W związku z tym najniższa ilość całkowitego RNA stosowana w protokole T seven LA powinna być ograniczona do 10 nanogramów mapowania genu konstytutywnego.Wykres GA DH pokazuje, że wszystkie biblioteki T seven LA przygotowane z co najmniej 10 nanogramów RNA wyjściowego zidentyfikowały wszystkie eksony, w tym skrajny ekson 5'. Pasek skali po lewej stronie dla bibliotek single read wskazuje 350 odczytów łącznie. Pasek skali w centrum dla bibliotek DEN wskazuje 5 000 odczytów łącznie.Porównanie bibliotek T7 LA z 10 ng RNA w wersji single read oraz paired-end z bibliotekami min amp wykazuje wysoki stopień podobieństwa. Uzyskano korelację Spearmana na poziomie 0,90 pomiędzy biblioteką T7 LA single read z 10 ng a biblioteką min amp z 10 µg, natomiast korelacja pomiędzy biblioteką T7 LA PEREN z 10 ng a biblioteką min amp z 10 µg wyniosła 0,95. Dodatkowo przeprowadzono porównanie obu typów bibliotek (single read i PEREN) przygotowanych z 10 ng całkowitego RNA; bardzo wysoki współczynnik korelacji dowodzi, że oba rodzaje bibliotek stworzone zgodnie z protokołem T7 LA dają bardzo podobny profil ekspresji genów.Na koniec, ponieważ biblioteki te przygotowano z RNA ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, w bibliotekach wyszukano specyficzne geny. Prawie wszystkie z tych genów zostały zidentyfikowane w bibliotekach przygotowanych z co najmniej 10 ng całkowitego RNA wyjściowego, co potwierdza poprawność tego protokołu. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności przy obchodzeniu się z próbkami małego RNA, aby zapobiec ich degradacji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze rozumieć, jak przygotować biblioteki Illumina, Mr.Aeq single read oraz Paradigm z bardzo małych ilości materiału wyjściowego.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Biblioteki mRNA-Seq typu Single Read oraz Paired End od 10 nanogramów całkowitego RNA firmy Illumina

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Izolacja RNA z komórek neuroprecursorowych z wykorzystaniem zestawu Bio-Rad Total RNA Kit

Poznaj metodę przygotowania bibliotek mRNA-Seq Illumina z pojedynczym odczytem i sparowanym końcem z zaledwie 10 nanogramów całkowitego RNA. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów z minimalnych ilości materiału biologicznego.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Przeglądaj więcej filmów