Name: Mikromacierze polimerowe do wysokowydajnego odkrywania biomateriałów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Poznaj metodę generowania mikromacierzy polimerowych przy użyciu fotopolimeryzacji na chipie. Technika umożliwia równoległe badanie setek materiałów pod kątem przyczepności bakterii i wsparcia ekspansji komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością potwierdzamy finansowanie z Wellcome Trust (numer grantu 085245/Z/08/Z). Podziękowania kierujemy do Nottingham Nanotechnology and Nanoscience Centre za udostępnienie systemu Raman oraz do East Midlands Development Agency za sfinansowanie tego sprzętu.

<ol><li>Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+methods+applied+in+biomaterial+development+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High throughput methods applied in biomaterial development and discovery.</a> Biomaterials. 31, 187-198 (2010).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).</li>
<li>Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 9, 768-778 (2010).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).</li>
<li>Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+surface+functionalities+that+control+human+embryoid+body+cell+adhesion+revealed+by+high+throughput+surface+characterization+of+combinatorial+material+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays.</a> Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).</li>
<li>Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+surface+characterisation+of+a+combinatorial+material+library%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">High throughput surface characterisation of a combinatorial material library.</a> Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).</li>
<li>Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+water+contact+angle+measurement+on+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Picoliter water contact angle measurement on polymers.</a> Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).</li>
<li>Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS+analysis+of+a+576+micropatterned+copolymer+array+to+reveal+surface+moieties+that+control+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability.</a> Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).</li>
<li>Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylate+polymers+with+hydro-responsive+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Acrylate polymers with hydro-responsive topography.</a> Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3, (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Mikromacierzy polimerowe z powodzeniem wykorzystuje się do odkrywania nowych materiałów poprzez przesiewanie setek nowych polimerów w testach biologicznych i identyfikację materiałów typu „hit”, które mogą być następnie skalowane do przydatnych urządzeń. W tym przypadku opisana charakterystyka powierzchni może zostać zastosowana po teście biologicznym i wyłącznie w odniesieniu do materiałów typu „hit” w celu dokładniejszego zbadania tych substancji. Strategia ta może być interesująca, jeśli badacz stosujący to podejście nie ma dostępu do HTSC. Jednakże, aby w pełni wykorzystać mikromacierzy polimerowe do badania oddziaływań biologiczno-materiałowych, cała macierz obejmująca setki materiałów powinna zostać przeanalizowana przed testami biologicznymi przy użyciu metodologii HTSC, co może w dalszej kolejności służyć do obserwacji ogólnych trendów zależności struktura-funkcja.
Druk kontaktowy opiera się na swobodnym przesuwaniu się metalowego pinu w górę i w dół wewnątrz uchwytu pinu. Czystość pinu oraz uchwytu pinu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pomyślnego przebiegu druku i powinna być rygorystycznie przestrzegana. Przed rozpoczęciem serii drukowania można sprawdzić prawidłowość ruchu pinu w uchwycie, wykonując próbny rozruch na sucho, bez obecności monomerów. Etap czyszczenia należy powtarzać do momentu uzyskania powtarzalnego ruchu pinu.
Znaczna uwaga powinna zostać poświęcona projektowaniu mieszaniny monomerów. W celu łatwego wytworzenia kombinatorycznej biblioteki polimerów, setki kopolimerów tworzy się poprzez mieszanie kilku monomerów w różnych proporcjach. Zazwyczaj przygotowuje się biblioteki składające się z 576 elementów, ponieważ tworzą one macierz 24 x 24, która jest dopasowana do geometrii szkiełka przedmiotowego. Aby stworzyć bibliotekę kombinatoryczną eksplorującą największą przestrzeń kombinatoryczną, najprostszą metodą jest parowe mieszanie 24 monomerów w stosunku 2:1. Alternatywnie, wprowadzenie gradientów składu w obrębie macierzy jest przydatne do obserwacji trendów, co pozwala na wyznaczenie optymalnych składów monomerów. Jako przykład, 22 monomery mogą zostać użyte jako pierwszy składnik mieszaniny ko-monomerów, która jest sekwencyjnie rozcieńczana jednym z 6 drugich składników. Jeśli zastosuje się 5 rozcieńczeń, na przykład mieszając pierwszy i drugi składnik w stosunkach 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 i 10:90, zaowocuje to 488 unikalnych roztworów kopolimerów. Aby zwiększyć łączną liczbę do 576, można wprowadzić powtórzenia homopolimerów z użytych monomerów, co często stanowi istotną próbkę referencyjną. 576 roztworów monomerów należy rozdzielić do dwóch płytek 384-dołkowych. W celu zaprogramowania robota łatwiej jest zastosować dwie identyczne płytki pod względem rozmieszczenia monomerów, zatem roztwory monomerów powinny zostać rozdzielone równomiernie pomiędzy obie płytki.
Znaczną ilość czasu podczas przygotowywania płytek źródłowych można zaoszczędzić dzięki zastosowaniu pipet wielokanałowych, dlatego układ płytek źródłowych powinien zostać zaplanowany w sposób umożliwiający wykorzystanie tych pipet.
Aby przeprowadzić zautomatyzowaną analizę HTSC macierzy, pozycja plamki musi zostać prawidłowo zsynchronizowana z aparaturą charakteryzującą. Zazwyczaj rozstaw macierzy akrylowej wynosi 500-1000 μm, a średnica polimerowej plamki to 300 μm. Większość stołów X-Y posiada rozdzielczość poniżej 10 μm, zatem istnieje odpowiednia tolerancja, aby aparatura do charakteryzacji powierzchni mogła niezawodnie uzyskać dostęp do pozycji w macierzy po wprowadzeniu prawidłowych wymiarów do oprogramowania pozycjonującego próbkę. Ograniczeniem w automatycznym pozycjonowaniu jest w rzeczywistości precyzyjny druk macierzy. Aby zapewnić dokładność druku, ważne jest zapobieganie przesuwaniu się podłoża na stole drukującym, stosując ssanie próżniowe lub zaciski sprężynowe wraz z odpowiednimi wymiarami szkiełka (należy pamiętać, że istnieją standardowe rozmiary szkiełek według normy amerykańskiej i europejskiej). 
ToF-SIMS jest techniką niezwykle czułą powierzchniowo, która pozwala wykryć wszelkie zanieczyszczenia na próbkach. W związku z tym należy zachować najwyższą ostrożność, aby uniknąć kontaktu z powierzchnią. Próbki należy przenosić w czystych rękawiczkach (najlepiej polietylenowych) i za pomocą świeżo oczyszczonych pincet, unikając jednak dotykania badanej powierzchni. Zazwyczaj przemywamy narzędzia chloroformem i heksanem. Przechowywanie próbek przed pomiarami najlepiej realizować w uchwycie, który oddziela od siebie szkiełka, na przykład w uchwycie na 5 lub 20 szkiełek.
Macierze zostały zaprojektowane specjalnie tak, aby były kompatybilne z wieloma formatami analiz biologicznymi i metodami odczytu; zastosowanym podłożem jest zatem szkiełko przedmiotowe, idealnie dostosowane do skanerów fluorescencyjnych i mikroskopów świetlnych. Oznacza to, że format ten doskonale nadaje się do badania wielu oddziaływań materiałowo-biologicznych. Ponadto format ten umożliwia równoległe przesiewanie setek materiałów. Pozwala to na przeanalizowanie znacznie większej liczby materiałów niż w przypadku metod konwencjonalnych, w których każdy nowy skład chemiczny materiału jest badany indywidualnie. Rozszerzony zakres oddziaływań biologiczno-materiałowych pozwala na wyjaśnienie mechanizmów interakcji powierzchniowych z układami biologicznymi, a także na znalezienie optymalnego materiału dla danej aplikacji.

<table><tbody><tr><td>Lamelki epoksydowe</td><td>Genetix</td><td>K2652</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka kontaktowa</td><td>Biodot</td><td>XYZ3060 Platform</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa igła</td><td>ArrayIt</td><td>946MP6B</td><td></td></tr><tr><td>Instrument ToF-SIMS</td><td>ION-TOF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument XPS</td><td>Kratos Analytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat WCA</td><td>Kr&amp;#252;ss</td><td>DSA 100</td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Bruker Corporation</td><td>Dimension Icon</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>SYTO17</td><td>Invitrogen</td><td>S-7579</td><td></td></tr></tbody></table>

polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Odkrywanie nowych biomateriałów zoptymalizowanych pod kątem konkretnych zastosowań biologicznych jest łatwo osiągalne dzięki zastosowaniu polimerowych mikrotablic, które umożliwiają przesiewanie kombinatorycznej biblioteki materiałów w równoległym formacie wysokoprzepustowym1. W niniejszym opracowaniu opisano tworzenie i charakterystykę polimerowej mikrotablicy z wykorzystaniem techniki fotopolimeryzacji na płytce (on-chip)2. Proces ten polega na mieszaniu monomerów w różnych proporcjach w celu wytworzenia biblioteki roztworów monomerowych, przenoszeniu roztworów na szkiełko przedmiotowe za pomocą robotycznego urządzenia drukującego oraz utwardzaniu poprzez naświetlanie promieniami UV. Format ten jest łatwo dostosowany do wielu testów biologicznych, w tym badania adhezji i proliferacji komórek macierzystych, sortowania komórek oraz niskiej adhezji bakteryjnej, co pozwala na szybką identyfikację materiałów typu „hit”, które spełniają określone kryterium biologiczne3-5. Ponadto zastosowanie wysokoprzepustowej charakterystyki powierzchni (HTSC) pozwala powiązać wyniki biologiczne z właściwościami fizykochemicznymi, co wyjaśnia mechanizm oddziaływania biologiczno-materiałowego6. HTSC wykorzystuje pomiary kąta zwilżania wodą (WCA), mikroskopię sił atomowych (AFM), spektroskopię fotoelektronów emitowanych rentgenowsko (XPS) oraz spektrometrię mas jonów wtórnych w czasie przelotu (ToF-SIMS). W szczególności ToF-SIMS zapewnia bogatą chemicznie analizę próbki, która może być wykorzystana do powiązania reakcji komórkowej z konkretną grupą molekularną. W niektórych przypadkach wydajność biologiczna może być przewidziana na podstawie widm ToF-SIMS, co wykazuje zależność chemiczną oddziaływania biologiczno-materiałowego i dostarcza informacji niezbędnych do opracowywania materiałów typu hit5,3.

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Odkrycie nowych biomateriałów zoptymalizowanych pod kątem konkretnego zastosowania biologicznego jest łatwo osiągalne dzięki zastosowaniu mikromacierzy polimerowych, co pozwala na...

Ten film opisuje metodę tworzenia i wykorzystywania polimerowej mikromacierzy z zastosowaniem techniki fotopolimeryzacji na chipie. Najpierw szkiełka przedmiotowe są pokrywane metodą dip-coatingu polihydroksyetylometakrylanem (HEMA), aby uzyskać podłoże o niskiej adhezji. Monomery są mieszane w różnych proporcjach w celu przygotowania biblioteki roztworów monomerów.Roztwory są przenoszone na szkiełka przedmiotowe za pomocą urządzenia do drukowania robotycznego, a następnie utwardzane poprzez naświetlanie promieniowaniem UV. Monomer ulega polimeryzacji, a rozpuszczalnik jest usuwany w próżni. Po wysokoprzepustowej charakterystyce powierzchni mikromacierze mogą być wykorzystane do badań właściwości materiałów, takich jak testy adhezji bakterii.Analiza danych dotyczących adhezji jest krokiem w stronę odkrywania nowych biomateriałów, podkreślającym użyteczność formatu polimerowych mikrotablic. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, w których odpowiedź biologiczną różnych materiałów bada się pojedynczo, jest równoległy screening setek materiałów, którymi można łatwo manipulować na jednym szkiełku. Technikę tę można łatwo zaadaptować do różnych testów biologicznych, takich jak screening materiałów odpornych na przywieranie bakterii lub wspierających ekspansję komórek macierzystych.Technika ta pomogła w odkryciu materiałów o potencjalnych zastosowaniach w wspieraniu ekspansji pluripotencjalnych komórek macierzystych dla medycyny regeneracyjnej. Jesteśmy również bardzo entuzjastycznie nastawieni do niedawnego odkrycia materiałów zapobiegających przyleganiu bakterii, które mogą ograniczyć występowanie zakażeń związanych z urządzeniami medycznymi. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą miały trudności z optymalizacją warunków niezbędnych do wydrukowania macierzy mikrowzorów, ponieważ trudno jest przewidzieć optymalne parametry.Błędy nawet w niewielkich szczegółach mogą doprowadzić do powstania nieużytkowych macierzy. Niezbędne jest również rozważenie, który szczep bakterii i jakie warunki hodowlane zostaną zastosowane, ponieważ adhezja i morfologia biofilmu są specyficzne dla gatunku oraz użytego medium, a zatem mogą się znacznie różnić. W niniejszej procedurze jako organizm modelowy wykorzystujemy aerogen oraz chemicznie zdefiniowane podłoże, aby zapewnić dobrze kontrolowany test adhezji.Nasi współpracownicy z MIT po raz pierwszy wpadli na pomysł zastosowania tej metody poprzez porównanie jej z mikromacierzyami DNA i białek. Są one dobrze ugruntowane w badaniu odpowiednich biologicznych przestrzeni kombinatorycznych. Dan i Bob zauważyli, że istnieje podobna chemiczna przestrzeń kombinatoryczna, która wymaga eksploracji w zakresie materiałów. Procedurę tę zaprezentują Andrew Hook i Chen Chang, stypendyści postdoktoranccy w naszym projekcie finansowanym przez Welcome Trust. Rozpocznij procedurę od przygotowania podłoża o niskim stopniu adhezji.Jest to powierzchnia odporna na przyleganie biomolekuł, takich jak białka i komórki. Odważ dwa gramy poli(metakrylanu hydroksyetylu) lub pHEMA do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie uzupełnij objętość do 50 ml za pomocą 95% etanolu w wodzie.Następnie umieścić probówkę w rotatorze przez około 24 godziny lub do całkowitego rozpuszczenia FEMA, przytrzymując szklaną płytkę pęsetą. Zanurzyć szklaną płytkę funkcjonalizowaną epoksydami. Wsunąć ją do roztworu FEMA tak, aby pokrył on całą powierzchnię z wyjątkiem pięciu milimetrów.Grupy epoksydowe tworzą wiązania kowalencyjne z powłoką FEMA. Niepowlekana część może służyć jako kontrola dodatnia w okresie jednej sekundy. Wyjąć preparat z roztworu FEMA, następnie odwrócić go i umieścić w pozycji niemal poziomej do wyschnięcia.Po wyschnięciu preparatu umieść go w uchwycie do szkiełek. Pozostaw szkiełka powlekane FEMA w warunkach atmosferycznych przez jeden tydzień, aby umożliwić całkowite odparowanie rozpuszczalnika. Następnie, aby przygotować roztwory monomerów, nanieś pipetą 5 µL roztworu fotoinicjatora oraz 15 µL rozpuszczalnych w dimetyloformamidzie monomerów akrylowych i metakrylowych do płytki źródłowej z 384 studzienkami.Objętość całkowita 20 µL jest optymalna do tworzenia plamek. Po przygotowaniu roztworów, do wytworzenia mikroarray wykorzystuje się robota do druku kontaktowego z przesuwem w osiach X, Y i Z. Robot wykorzystuje wpłuki o średnicy 220 µm, które posiadają szczeliny pełniące funkcję zbiorników do przenoszenia roztworu.Zacznij od umieszczenia pinów oraz uchwytu na piny w naczyniu zawierającym dichlorometan na 10 minut. Następnie, po wysuszeniu pinów, ponownie zamocuj uchwyt do głowicy drukującej. W kolejnym kroku włóż piny do uchwytu.Następnie wprowadź do robota 10 szkiełek przedmiotowych do blotingu oraz szkiełek powlekanych FEMA. Zazwyczaj na każdym szkiełku nanosi się trzy powtórne macierze. Następnie za pomocą wężyków podłącz stację myjącą robota do butelki zawierającej 2,5 litra świeżego dimetyloformamidu.Włóż płytkę zawierającą roztwór monomeru do robota. Wypełnij całą komorę robota argonem, aby obniżyć poziom tlenu poniżej 2000 PPM. Przy tak niskim stężeniu rodniki polimeryzacyjne nie powinny być wygaszane przez tlen.Za pomocą urządzenia regulującego wilgotność ustaw wartość wilgotności w komorze robota w przedziale od 30 do 40%; taka wilgotność umożliwia pęcznienie FEMA, co pozwala uformowanemu polimerowi przeniknąć przez warstwę FEMA i zostać fizycznie uwięzionym na powierzchni. Aby rozpocząć proces drukowania, kliknij przycisk start w oprogramowaniu na powiązanym komputerze. Następnie piny zostaną opuszczone do roztworów monomerów z prędkością 25 millimeters per second.Następnie zostaną one utrzymane w roztworze przez 2,5 sekundy i wycofane z prędkością 25 milimetrów na sekundę. W dalszej kolejności koniec pinu zostaje doprowadzony do kontaktu z preparatami FEMA, dozując około 2,4 nanolitrów roztworu z części quilt pinu. Całkowity czas każdego kontaktu wynosi 10 milisekund, a prędkość zbliżania i wycofywania wynosi 175 milimetrów na sekundę.Następnie piny są osuszane poprzez wielokrotne przykładanie do szkiełek osuszających w celu usunięcia roztworu monomeru z ich zewnętrznych powierzchni. Zastosowana procedura osuszania polega na 33 kontaktach z czystym szkiełkiem. W pierwszych czterech pozycjach wykonuje się odpowiednio 10, 5, 4 i 3 kontakty.Kolejne cztery pozycje utworzą dwa kontakty, a ostatnie trzy pozycje utworzą jeden kontakt po zakończeniu drukowania. Piny są płukane w kąpieli przepływowej z DMF przy mieszaniu przez 30 sekund. Równocześnie nadrukowane slajdy są naświetlane krótkofalowym źródłem UV o długości fali 365 nanometrów z gęstością 30 millivolts per centimeter squared.Po zakończeniu płukania i naświetlania drukowane jest kolejne szkiełko. Jeśli wydruk wydaje się prawidłowy, należy dodatkowo naświetlić matryce promieniowaniem UV o długości fali 365 nanometrów przez kolejne 10 minut. Świeżo wydrukowane matryce umieszcza się w piecu próżniowym przy ciśnieniu poniżej 50 mili tours przez jeden tydzień, aby usunąć nie spolimeryzowany monomer i rozpuszczalnik po drukowaniu i ekstrakcji próżniowej.Sukces polimeryzacji plamek polimerowych można ocenić za pomocą zwykłej mikroskopii świetlnej w celu zidentyfikowania wszelkich anomalii w morfologii plamek; zazwyczaj powinny one być okrągłe i jednorodne, jak pokazano na tej figurze po lewej stronie. Prawdopodobną przyczyną zmiany geometrii jest uszkodzona lub zanieczyszczona igła bądź obecność zanieczyszczeń w postaci kurzu w roztworach monomerów. W takim przypadku proces będzie musiał zostać powtórzony dla niewielkiej liczby kombinacji monomerów.Można zaobserwować plamy o nieprawidłowym kształcie, na przykład plamę centralną z satelitami małych plamek widocznymi po prawej stronie lub kształt „smażonego jajka”, w którym plama centralna znajduje się na wierzchu większej, bardziej płaskiej plamy. Może to być spowodowane rozwarstwzeniem faz przed drukowaniem, wynikającym z różnic w lepkości, hydrofilowości, lotności lub napięciu powierzchniowym monomerów, co sugeruje, że kombinacja monomerów nie jest kompatybilna z tym formatem. Dodatkowe mapowanie chemiczne plam polimerowych jest również ważnym, a niekiedy niezbędnym etapem kontroli jakości w celu określenia rozkładu składu chemicznego materiałów w obrębie plam oraz wysokoprzepustowej charakterystyki powierzchni (HTSC) wygenerowanych mikrotablic.Zastosowanie tej techniki pozwala również na korelację właściwości biologicznych z właściwościami fizykochemicznymi. Umożliwia to badanie oddziaływań materiałów biologicznych. HTSC wykorzystuje pomiary kąta zwilżania, spektrometrię czasu przelotu, wtórną spektrometrię mas jonowych, mikroskopię sił atomowych oraz rentgenowską spektroskopię fotoelektronów.W szczególności metoda TOF-SIMS zapewnia bogatą chemicznie analizę próbki, która może zostać wykorzystana do skorelowania odpowiedzi komórkowej z konkretną grupą molekularną. W niektórych przypadkach możliwe jest przewidzenie parametrów biologicznych. Widma TOF-SIM wykazują zależność chemiczną interakcji materiału biologicznego i dostarczają informacji pomocnych w opracowywaniu materiałów HI.Po zcharakteryzowaniu powierzchni polimerowej mikromacierzy można ją wykorzystać do badania oddziaływań biologicznych. W niniejszej części demonstrujemy zastosowanie mikromacierzy w teście adhezji bakterii. Pracę należy rozpocząć od zaszczepienia 10 mililitrów pożywki LB pojedynczą kolonią pseudomonas znakowanych białkiem GFP.Hodowlę Aerogen inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM przez noc. Zmierzyć OD 600 nocnej hodowli bakteryjnej i rozcieńczyć ją do wartości OD 600 równej 0,01 w 15 ml pożywki RPMI 1640. W międzyczasie przemyć szkiełka z macierzami i sterylizować wodę destylowaną przez 10 minut, aby usunąć z macierzy wszelkie rozpuszczalne komponenty, takie jak niepolimeryzowany monomer, ligandy i rozpuszczalnik.Następnie wysuszyć preparaty na powietrzu w komorze z wymuszonym przepływem powietrza. Kolejnie umieścić umyte szkiełka z macierzą w czystym naczyniu Petri i sterylizować je promieniami UV przez 10 minut. Po przygotowaniu kultury bakteryjnej przenieść szkiełko z macierzą do naczynia Petri i dodać 15 milliliters zaszczepionej pożywki RPMI 1640.Umieść kolejny slajd z matrycą w drugiej płytce Petriego i dodaj 15 ml sterylnego medium RPMI 1640 w celu uzyskania kontroli. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, a następnie wstrząsaj z prędkością 60 RPM po zakończeniu inkubacji. Przemyj slajdy trzykrotnie, używając 15 ml sterylnego PBS, przez pięć minut przy 100 RPM.Następnie wypłukać preparaty dwukrotnie 15 mililitrami sterylnej wody destylowanej, aby usunąć sól fosforanową. Po płukaniu pozostawić preparaty do wyschnięcia na powietrzu w komorze z przepływem powietrza.Po wyschnięciu preparatów należy je jak najszybciej odczytać za pomocą skanera fluorescencyjnego, stosując odpowiednią technologię obrazowania i oprogramowanie, aby uniknąć zaniku GFP. Fluorescencję wynikającą z przylegania bakterii oblicza się poprzez odjęcie wartości fluorescencji kontroli zawierającej tylko medium od wartości próbki inokulowanej, w celu zidentyfikowania materiałów odpornych na adhezję bakteryjną.Macierze mikroprzypadków zostały przygotowane, a testy adhezji bakteryjnej przeprowadzono zgodnie z metodami opisanymi w tym filmie. Jak widać tutaj, polimerowa macierz mikroprzypadków zawiera materiały o zarówno niskiej adhezji bakteryjnej, które wykazują niską fluorescencję, jak i wysokiej adhezji bakteryjnej, które wykazują wysoką fluorescencję. Trzy przedstawione tutaj macierze są powtórzeniami; wartości fluorescencji z trzech powtórzeń zostają uśrednione i przedstawione w formie reprezentacji 3D.Jak pokazano tutaj, ilościowa interpretacja wizualna została uproszczona. Skala intensywności po prawej stronie reprezentuje wartości danych fluorescencyjnych. Na podstawowym poziomie identyfikacja materiałów o niskiej fluorescencji pozwala na szybkie wyłonienie materiałów spełniających określone zastosowanie biologiczne, takie jak odporność na przywieranie bakterii.Wyniki te można jednak połączyć z HTSC w celu zbadania korelacji między konkretnymi właściwościami materiałów a ich wydajnością biologiczną. Analiza ta pozwala wyjaśnić zależności między strukturą a funkcją, co umożliwia zidentyfikowanie mechanizmów leżących u podstaw biologicznych interakcji z materiałami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania i drukowania polimerowych mikrotablic, a także zrozumieć sposób wykorzystania tych mikrotablic do badania odpowiedzi bakterii na materiały.Po opanowaniu techniki, polimerowy mikroarray może zostać wydrukowany w ciągu dwóch dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Przygotowanie monomerów zajmuje około jednego dnia, a drukowanie arrayy około sześciu godzin. Test przylegania bakterii trwa pięć dni, co obejmuje czas wzrostu kultury nakładkowej jako inokulum, inkubację mikroarray w kulturze bakteryjnej przez 72 godziny oraz detekcję sygnału fluorescencyjnego przy użyciu skanera mikroarray. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymywanie w czystości pinów oraz uchwytów do pinów.Sytuacja, w której w połowie pomiaru pin blokuje się w pozycji pionowej i nie może nawiązać kontaktu z powierzchnią z powodu niewystarczającego oczyszczenia pinu lub jego uchwytu, jest bardzo frustrująca. Należy pamiętać, że praca z DMF i toksycznymi monomerami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego w procedurze zawsze powinny być uwzględnione środki ostrożności, takie jak systemy wyciągowe.

polymer-microarrays-for-high-throughput-discovery-of-biomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikromacierze polimerowe do wykrywania materiałów biologicznych o dużej wydajności

Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Źródło: Venkateswaran, S., et al. Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę identyfikacji polimerów odstraszających bakterie za pomocą szkiełka mikromacierzowego wystawionego na działanie mieszanych kultur bakteryjnych. Wiązanie bakteryjne ocenia się za pomocą fluorescencji DAPI, gdzie zmniejszony sygnał wskazuje na polimery o minimalnym przyczepieniu powierzchniowym.

Wysokoprzepustowa identyfikacja polimerów odpychających bakterie za pomocą badań przesiewowych mikromacierzy

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Opisano wysokoprzepustową metodę mikromatrycową do identyfikacji polimerów, które redukują wiązanie powierzchni bakteryjnej na urządzeniach medycznych.

Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Poznaj metodę generowania mikromacierzy polimerowych przy użyciu fotopolimeryzacji na chipie. Technika umożliwia równoległe badanie setek materiałów pod kątem przyczepności bakterii i wsparcia ekspansji komórek macierzystych.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Przeglądaj więcej filmów