Name: Barwienie immunohistochemiczne witaminy B7-H1 (PD-L1) na zatopionych w parafinie szkiełkach tkanki gruczolakoraka trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj technikę barwienia immunohistochemicznego B7-H1 (PD-L1) w tkankach gruczolakoraka trzustki zatopionych w parafinie. Metoda ta umożliwia wizualizację ekspresji białka w mikrośrodowisku nowotworowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.B., K.M.B i H.X. wniosą równy wkład. Niniejsze badanie było wspierane przez NCI SPORE in Gastrointestinal Cancers P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, grant szkoleniowy NIH 5T32 CA0090701-28, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center oraz National Pancreas Foundation.

B7-H1/PD-L1, należący do rodziny B7 białek powierzchniowych komórek regulujących odporność, odgrywa istotną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi immunologicznej komórkowej poprzez oddziaływanie z receptorem programmed death-1 (PD-1) 1,2. Nadekspresja B7-H1 przez komórki nowotworowe została odnotowana w wielu nowotworach u ludzi, w tym w czerniaku, glejaku wielopostaciowym oraz w rakach płuc, piersi, jelita grubego, jajnika i komórek nerkowych, i wykazano, że upośledza ona przeciwnowotworową odporność limfocytów T3-8.
Niedawno wykazano, że ekspresja B7-H1 w tkankach gruczolakoraka trzustki może służyć jako potencjalny marker prognostyczny9,10. Ponadto wykazano, że blokada B7-H1 w mysim modelu raka trzustki wywołuje odpowiedź przeciwnowotworową11. Dane te wskazują na znaczenie B7-H1 jako potencjalnego celu terapeutycznego. W związku z tym przeciwciała blokujące B7-H1 są testowane w badaniach klinicznych w leczeniu wielu guzów litych u ludzi, w tym czerniaka oraz nowotworów płuc, jelita grubego, nerek, żołądka i trzustki12.
Aby w przyszłości móc zidentyfikować pacjentów, którzy odniosą korzyść z terapii celujących w B7-H1, kluczowe jest zbadanie korelacji między ekspresją i lokalizacją B7-H1 a odpowiedzią pacjentów na leczenie przeciwciałami blokującymi B7-H1. Analiza ekspresji B7-H1 w tkankach ludzkiego gruczolakoraka trzustki za pomocą immunohistochemii pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ta ko-inhibicyjna cząsteczka sygnałowa przyczynia się do supresji odporności przeciwnowotworowej w mikrośrodowisku guza. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne anty-B7-H1 (klon 5H1) opracowane przez Chena i współpracowników daje wiarygodne wyniki barwienia w kriosnittach wielu typów ludzkich tkanek nowotworowych4,8, jednak barwienie preparatów zalanych w parafinie stanowiło do niedawna wyzwanie13-18. Opracowaliśmy protokół barwienia B7-H1 dla preparatów z tkankami gruczolakoraka trzustki zalanych w parafinie. Opisany tutaj protokół barwienia B7-H1 zapewnia spójne barwienie błonowe i cytoplazmatyczne B7-H1 przy minimalnym tle.
1. Deparafinizacja
<ol>
 <li>Wypiekać preparaty w temperaturze 55 °C przez 20 min.</li>
 <li>W dygestorium zanurzyć preparaty w ksylenie na 10 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w świeżym ksylenie na 10 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 5 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w świeżym 100% etanolu na 5 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 95% etanolu na 5 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 80% etanolu na 5 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w wodzie dejonizowanej na 5 min.</li>
</ol>
2. Odmaskowanie antygenów
<ol>
 <li>Zanurzyć preparaty w buforze Tris-EDTA (pH 9.0) i podgrzać w autoklawie do 125 °C przez 30 sec, a następnie do 90 °C przez 10 sec. </li>
 <li>Pozostawić preparaty do ochłonięcia na 60 min. </li>
 <li>Zanurzyć preparaty w buforze TBST na 5 min; powtórzyć dwukrotnie. </li>
</ol>
3. Barwienie
<ol>
 <li>Usunąć nadmiar roztworów wokół tkanki na szkiełkach. Obrysować obszar tkanki okręgiem za pomocą pisaka hydrofobowego.</li>
 <li>Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysychaniu tkanki na szkiełku przez cały proces barwienia. Nanieść jedną kroplę (około 200 μl lub więcej, aby całkowicie pokryć obszar tkanki) blokera peroksydazy wewnątrz okręgu hydrofobowego na szkiełku i inkubować szkiełka w blokerze peroksydazy przez 5 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. </li>
 <li>Nanieść jedną kroplę buforu blokującego BLOCK ACE na każde szkiełko i inkubować przez 15 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min.</li>
 <li>Nanieść jedną kroplę roztworu awidyny na każde szkiełko i inkubować przez 15 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. </li>
 <li>Nanieść jedną kroplę roztworu biotyny na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.</li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. </li>
 <li>Inkubować szkiełka z przeciwciałem monoklonalnym mysim anty-B7-H1 (klon 5H1) lub kontrolą izotypową mysiego IgG1 κ w rozcieńczeniu 1:1 000 w 200 μl TBST w temperaturze 4 °C przez noc (22 hr+/- 1 hr). Końcowe stężenie przeciwciał w TBST wynosi 2,57 μg/ml. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie. </li>
 <li>Inkubować szkiełka z koniugowanym z biotyną szczurzym przeciwciałem wtórnym anty-mysie IgG1 w stężeniu 1:500 (w 200 μl roztworu 2% surowicy koziej) przez 30 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.</li>
 <li>Nanieść jedną kroplę kompleksu streptawidyna-biotyna (musi zostać przygotowany co najmniej 30 min przed użyciem) na każde szkiełko i inkubować przez 15 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie. </li>
 <li>Nanieść jedną kroplę odczynnika wzmacniającego (rozcieńczonego 2:1 w TBST) na każde szkiełko i inkubować przez 4 min.</li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie. </li>
 <li>Nanieść jedną kroplę streptawidyny-HRP na każde szkiełko i inkubować przez 15 min. </li>
 <li>Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie. </li>
 <li>Nanieść jedną kroplę substratu i chromogenu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) na każde szkiełko i rozwijać barwę przez 2 min. </li>
 <li>Bezzwłocznie po wywołaniu barwy przemyć szkiełka wodą ddH2O przez 1-2 min. </li>
 <li>Inkubować szkiełka z jedną kroplą hematoksyliny przez 90 sec. </li>
 <li>Przemyć wodą ddH2O przez 1-2 min. </li>
 <li>Przemyć wodą z kranu z dodatkiem mydła przez 1-2 min. </li>
 <li>Przemyć wodą ddH2O przez 1-2 min. </li>
</ol>
4. Odwadnianie i montowanie
<ol>
 <li>Zanurzyć preparaty w 80% etanolu na 3 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 95% etanolu na 3 min.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 5 min. Powtórzyć czynność.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w ksylenie na 5 min. Powtórzyć czynność.</li>
 <li>Nanieść jedną kroplę Cytoseal 60 na preparat i nałożyć szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
Tabela 1 zawiera listę odczynników wykorzystanych w opisanych powyżej procedurach.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 na skrawkach mrożonych było raportowane w poprzednich badaniach dla wielu rodzajów nowotworów3,4. Jednak kliniczne próbki guzów są zazwyczaj dostępne jedynie w formie bloków zatopionych w parafinie. Przeciwciało monoklonalne 5H1 zostało niedawno z sukcesem zastosowane do barwienia tkanek nowotworowych zatopionych w parafinie, w tym raka jasnokomórkowego nerki, raka szyjki macicy, raka pęcherza moczowego oraz czerniaka13-18. Raportowano również barwienie B7-H1 na ...

<table><tbody><tr><td>System CSA</td><td>Dako</td><td>K1500</td><td>Zawiera następujące odczynniki wymienione w protokole: blokery peroksydazy, kompleks streptawidyna-biotyna, odczynnik wzmacniający, streptawidynę-HRP oraz substrat i chromogen DAB</td></tr><tr><td>Zestaw blokujący awidyna/biotyna</td><td>Vector</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Block ACE</td><td>Serotec</td><td>BUF029</td><td></td></tr><tr><td>Biotynowana anty-mysia IgG1</td><td>BD</td><td>553441</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypowa mysiej IgG1 K</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-85</td><td></td></tr><tr><td>TBS (bufor solny z Tris), 10X</td><td>Cellgro</td><td>46-012-CM</td><td>10x TBS zawiera 80 g/L NaCl i 24,2 g/L Tris;&lt;br/&gt; rozcieńczany do 1X wodą ddH2O do płukania;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>1 ml dodany do 1 L 1X TBS w celu przygotowania TBST</td></tr><tr><td>Target Retrieval, 20x</td><td>Celerus Wave</td><td>014-3000-000</td><td>Rozcieńczany do 1x wodą ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 190 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof</td><td>Pharmo-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR</td><td>95057-827</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>72804</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapturki</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

barwienie immunohistochemiczne b7-h1 (pd-l1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, członek rodziny B7 białek powierzchniowych komórek o działaniu regulacyjnym w układzie odpornościowym, odgrywa istotną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi immunologicznej zależnej od komórek poprzez oddziaływanie z jego receptorem, PD-1 (programmed death-1) 1,2. Nadmierna ekspresja B7-H1 przez komórki nowotworowe została odnotowana w wielu rodzajach nowotworów u ludzi, w tym w czerniaku, glejakach oraz rakach płuca, piersi, jelita grubego, jajnika i komórek nerek, i wykazano, że upośledza ona przeciwnowotworową odporność limfocytów T3-8.
Niedawno stwierdzono, że ekspresja B7-H1 w tkankach gruczolakoraka trzustki może służyć jako potencjalny marker prognostyczny9,10. Ponadto wykazano, że blokada B7-H1 w mysim modelu raka trzustki wywołuje odpowiedź przeciwnowotworową11. Dane te sugerują, że B7-H1 jest istotnym, potencjalnym celem terapeutycznym. W związku z tym przeciwciała blokujące B7-H1 są testowane w badaniach klinicznych nad wieloma litymi guzami u ludzi, w tym czerniakiem oraz rakami płuc, jelita grubego, nerki, żołądka i trzustki12.
Aby w przyszłości móc zidentyfikować pacjentów, którzy odniosą korzyść z terapii celowanych w B7-H1, kluczowe jest zbadanie korelacji między ekspresją i lokalizacją B7-H1 a odpowiedzią pacjentów na leczenie przeciwciałami blokującymi B7-H1. Analiza ekspresji B7-H1 w tkankach ludzkiego gruczolakoraka trzustki za pomocą immunohistochemii pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób ta ko-inhibicyjna cząsteczka sygnałowa przyczynia się do supresji odporności przeciwnowotworowej w mikrośrodowisku guza. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne anty-B7-H1 (klon 5H1) opracowane przez Chena i współpracowników daje wiarygodne wyniki barwienia w kriosiekcjach wielu rodzajów ludzkich tkanek nowotworowych4,8, jednak barwienie preparatów zatopionych w parafinie stanowiło do niedawna wyzwanie13-18. Opracowaliśmy protokół barwienia B7-H1 dla preparatów tkanek gruczolakoraka trzustki zatopionych w parafinie. Opisany tutaj protokół barwienia B7-H1 zapewnia spójne barwienie błonowe i cytoplazmatyczne B7-H1 przy niewielkim poziomie tła.

Prawidłowe barwienie immunohistochemiczne B7-H1 wykaże heterogenną ekspresję B7-H1 (brązowe sygnały po utlenianiu DAB) w gruczolakoraku trzustki. Niektóre komórki gruczolakoraka trzustki wykazują przeważnie błonową ekspresję B7-H1 (Rysunek 1A), podczas gdy inne wykazują albo przeważnie cytoplazmatyczną ekspresję B7-H1, albo niewielką ekspresję B7-H1 (Rysunki 2 i 3). Normalne nabłonek przewodowy trzustki wykazuje niewielką ekspresję B7-H1 (Rysunek 4). Barwienie z użyciem ...

B7-H1 (PD-L1) oraz jego wiązanie z PD-1 stanowią główny indukowany przez nowotwór sygnał immunosupresyjny w mikrośrodowisku guza. W niniejszym materiale opisano technikę barwienia immunohistochemicznego służącą do charakterystyki ekspresji i lokalizacji B7-H1 w gruczolakoraku trzustki.

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 (PD-L1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie

B7-H1/PD-L1, członek rodziny B7 białek powierzchni komórkowych regulujących odpowiedź immunologiczną, odgrywa istotną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi komórkowej...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie technik barwienia immunohistochemicznego do oceny ekspresji B seven H one PD L one w skrawkach tkanek gruczolakoraka trzustki człowieka zatopionych w parafinie. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie usunięcie parafiny i rehydratację pociętych skrawków tkankowych. Drugim etapem procedury jest odsłanianie antygenu, które polega na wykorzystaniu szybkowaru do barwienia tkanki.Procedurze barwienia przeciwciałami towarzyszą etapy wzmocnienia sygnału oraz rozwoju barwy za pomocą DAB. Ostatnie kroki polegają na odwodnieniu i montowaniu tkanki. Po ich zakończeniu.Mikroskopia i analiza obrazu mogą zostać wykorzystane do wizualizacji błonowej i cytoplazmatycznej B7-H1. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad gruczolakorakiem trzustki, zapewniając lepsze zrozumienie tego, w jaki sposób B7-H1 (BTL1) przyczynia się do supresji odporności przeciwnowotworowej w mikrośrodowisku guza. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie skrawków mrożonych, jest jej optymalizacja pod kątem zastosowania w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie, które są często łatwiej dostępne i prostsze w przechowywaniu.Niezawodne barwienie przeciwciałami na szkiełkach nie jest możliwe bez uprzedniego usunięcia parafiny. Aby zatem przygotować szkiełka z tkankami zatopionymi w parafinie, należy najpierw wygrzewać szkiełka w temperaturze 55 °C przez 20 minut. Następnie, w dygestorium, stosuje się serię siedmiu kąpieli chemicznych w celu usunięcia parafiny; w pierwszej kolejności zanurz szkiełka w ksylenie na 10 minut.Następnie zanurzcie slajdy w drugiej świeżej kąpieli z ksylenem na 10 minut. Po trzecie, zanurzcie slajdy w 100% etanolu przez pięć minut. Po czwarte, ponownie zanurzcie slajdy w świeżym, 100% etanolu przez pięć minut.Po piąte, zanurz preparaty w 95% etanolu na pięć minut. Po szóste, zanurz preparaty w 80% etanolu na pięć minut. Na koniec przemyj preparaty wodą dejonizowaną przez pięć minut.Po usunięciu parafiny konieczne jest odsłonięcie antygenu. Najpierw zanurz preparaty w buforze Tris EDTA. Następnie podgrzej preparaty w szybkowarze, stosując program dwuetapowy.W pierwszej kolejności należy podgrzać je do 125 °C przez 30 sekund. Następnie do 90 °C przez 10 sekund. Potem odstawić preparaty do ostygnięcia do temperatury pokojowej.Po pozostawieniu slajdów do ochłodzenia przez godzinę, przemyj je dwukrotnie roztworem TBST, przez pięć minut w każdej kąpieli. Teraz można przystąpić do barwienia każdego slajdu. Rozpocznij od osuszenia roztworu TBST wokół tkanki za pomocą bibuły, a następnie obrysuj obszar wokół tkanki za pomocą pisaka hydrofobowego.W trakcie całej procedury należy zapobiegać wysychaniu tkanki, przechowując preparaty w komorze wilgotnościowej. W czasie, gdy preparaty nie są zanurzone w roztworze, należy nanieść jedną kroplę blokera peroksydazy wewnątrz hydrofobowego okręgu na szkiełku. Po pięciu minutach należy spłukać bloker peroksydazy roztworem TBST.Następnie należy kąpać preparaty w TBST przez pięć minut. Wyjąć preparaty z roztworu i delikatnie strząsnąć nadmiar TBST. Teraz nanieść jedną kroplę buforu blokującego CE na każdy preparat i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Oczyść preparaty, płucząc je i mocząc przez pięć minut w TBST. Następnie nanieś jedną kroplę roztworu Vidan na każdy preparat i odczekaj 15 minut. Usuń AVADON, stosując ten sam schemat płukania i moczenia w TBST.Następnie należy nanieść biotynę. Po pięciu minutach oczekiwania szkiełka ponownie przemyć roztworem TBST. Następnie szkiełka inkubować z rozcieńczeniem mysiego przeciwciała monoklonalnego lub przeciwciałem kontrolnym.W buforze TBST pozostaw oba przeciwciała do koniugacji w temperaturze czterech stopni Celsiusiusza przez 22 godziny. Następnego dnia przemyj preparaty TBST trzykrotnie, analogicznie jak poprzednio. Każde przemywanie obejmuje płukanie w TBST oraz pięciominutową kąpiel.Ten schemat potrójnego przemywania jest powtarzany kilkakrotnie w celu usunięcia przeciwciała pierwszorzędowego. Przygotuj roztwór kompleksu STR titin Bio ITIN. Powinien on zostać przygotowany co najmniej 30 minut przed użyciem.Następnie inkubuj preparaty z przeciwciałem wtórnym kozim anty-US sprzężonym z biotyną w roztworze surowicy koziej przez 30 minut. Podczas tej inkubacji przygotuj roztwór CHROMOGEN substratu DAB zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu DACO. Roztwór można przechowywać w temperaturze czterech stopni w ciemności do ośmiu godzin.Po inkubacji przeprowadź potrójne przemywanie w TBST. Następnie nanieś jedną kroplę kompleksu strippingowego do biotyny. Inkubuj preparaty na każdym szkiełku przez 15 minut, a następnie przemyj szkiełka trzy razy w TBST.Następnie nanieś kroplę odczynnika amplifikującego na każdy preparas. Odczekaj cztery minuty i przemyj preparaty trzykrotnie buforem TBST. Po wypłukaniu odczynnika amplifikującego nanieś kroplę streptawidyny HRP na każdy preparat i inkubuj je przez 15 minut.Przed kontynuacją przeprowadź kolejne trzykrotne przemycie w buforze TBST. Teraz następuje najwrażliwszy etap procedury. Nanieś jedną kroplę substratu CHROMOGEN DAB z nadtlenkiem wodoru na szkiełko i zacznij obserwować rozwój barwy. Substrat DAB.Czas wywoływania CHROMOGENU wynosi zazwyczaj dwie minuty, jednak rutynowo monitorujemy proces pod mikroskopem, aby zapewnić optymalne barwienie. Aby zminimalizować tło w każdej serii barwień, dołączamy jeden preparat z poprzedniej partii oraz jeden preparat z migdałka jako nasze kontrole dodatnie. Po zakończeniu procesu natychmiast przemyj preparat wodą, a nie buforem TBST.Inkubować preparat z jedną kroplą hematyny przez 90 sekund. Niezwłocznie przemyć preparat destylowaną wodą dejonizowaną, następnie wodą z kranu z mydłem, a na koniec ponownie wodą DD. To kończy procedurę barwienia.Po zabarwieniu wszystkich preparatów, należy przeprowadzić ich dehydratację przy użyciu serii stężeń etanolu przed ich zamontowaniem. Po pierwsze, zanurz preparaty w 80% etanolu na trzy minuty. Po drugie, zanurz preparaty w 95% etanolu na trzy minuty.W przypadku trzeciej i czwartej kąpieli zanurz preparaty w 100% etanolu na pięć minut. W piątej i szóstej kąpieli zanurz preparaty w ksylenie na pięć minut. Na koniec nanieś jedną kroplę odpowiedniej ilości na każdy preparat i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe.Preparaty są teraz gotowe do immunohistochemicznego barwienia mikroskopowego z użyciem B7-H1, co wykazało heterogenną ekspresję B7-H1 w gruczolakoraku trzustki. Są one widoczne jako brązowe po wywołaniu kolorem DAB. Niektóre komórki gruczolakoraka trzustki wykazują przeważnie ekspresję błonową B7-H1, podczas gdy inne wykazują albo przeważnie ekspresję cytoplazmatyczną B7-H1, albo niską ekspresję B7-H1. Normalny nabłonek przewodów trzustkowych wykazywał niskie barwienie na B7-H1. Zastosowanie przeciwciała kontrolnego z izotypem mysiego IgG1 kappa zamiast przeciwciała anty-B7-H1 spowodowało bardzo niskie barwienie tła. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w siedem godzin, rozłożone na dwa dni z 22-godzinną inkubacją nocną, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo po tym etapie wywoływania.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny onkologii do zgłębienia sygnalizacji B7H1/PD-L1 w innych nowotworach złośliwych.

immunohistochemical-staining-b7-h1-pd-l1-on-paraffin-embedded-slides

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Immunuhistochemiczne barwienie B7-H1 (PD-L1) na osadzonej w parafinie tkankach miąższu gruczolakoraka trzustki

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&amp;E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&amp;E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku...

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.

Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Aby odkryć najwcześniejsze mechanizmy molekularne leżące u podstaw inicjacji raka prostaty, desperacko potrzebne są nowatorskie i innowacyjne systemy i podejścia do modelowania ludzi.  Potencjał mezenchymy zatok układu moczowo-płciowego przed gruczołem krokowym (UGSM) do indukowania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych do tworzenia ludzkiego nabłonka prostaty jest potężnym narzędziem eksperymentalnym w badaniach nad prostatą.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Poznaj technikę barwienia immunohistochemicznego B7-H1 (PD-L1) w tkankach gruczolakoraka trzustki zatopionych w parafinie. Metoda ta umożliwia wizualizację ekspresji białka w mikrośrodowisku nowotworowym.

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 (PD-L1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie

Przeglądaj więcej filmów