Monitorowanie autonomicznych rytmów zegara okołodobowego ekspresji genów za pomocą reporterów bioluminescencji lucyferazy

Protokół ten szczegółowo opisuje generowanie linii komórkowych reporterowych lucyferazy i późniejsze monitorowanie autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji bioluminescencji komórek. Najpierw konstruuje reportery ekspresji lucyferazy lentiwirusowej i wytwarza cząsteczki lentiwirusa, a następnie infekuje interesujące komórki i amplifikuje wybrane kultury. Następnie monitoruj ekspresję bioluminescencji w zsynchronizowanych komórkach reporterowych za pomocą odpowiedniego urządzenia rejestrującego.

Ostatecznie zapis bioluminescencji służy do demonstracji autonomicznych rytmów okołodobowych komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja przejściowa i ochrona linii zarodkowej, jest to, że VIR jest pośredniczy. Gene zapewnia stabilną integrację z genomem komórkowym, a także większą wydajność i wszechstronność.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad zegarami cytowymi. Na przykład, czy istnieją specyficzne dla tkanek zegary okołodobowe? Jeśli tak, to jakie są właściwości zegarów okołodobowych specyficznych dla tkanek?

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w mechanizmy zegara. Może być również stosowany do innych układów, takich jak dynamika cyklu komórkowego, nowotwory i tak dalej. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdecydowaliśmy się zbadać zegary zabezpieczające specyficzne dla tkanek lub komórek.

Procedurę zademonstrują dr Chita Norm Napkin, stażysta podoktorski, oraz Sandra, doktorantka z mojego laboratorium Atory. Zazwyczaj konstrukt reportera okołodobowego ssaków zawiera kasetę ekspresji, w której promotor okołodobowy jest połączony z genem lucyferazy. W tym reporterze lentiwirusowym zdestabilizowana lucyferazy jest pod kontrolą myszy na dwa promotory.

Szczegółowe instrukcje dotyczące konstruowania wektorów reporterowych w reakcji rekombinacji można znaleźć w dołączonym manuskrypcie w celu uzyskania informacji na temat skutecznej transfekcji. Zacznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek nerkowych o niskiej liczbie pasażów, które są w 90 do 100% zlewne. Teraz pokryj sześć, dobrze płytki hodowlane.

Do transfekcji dodaj jeden mililitr 0,001% poli litra lycyny do każdego, dobrze inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut i spłucz raz PBS. Następnie zbierz komórki za pomocą trypsyny i zasiej komórki w każdym dołku wstępnie pokrytych płytek. Zakręć płytki, aby uzyskać równomierny rozkład komórek.

Sprawdź, czy wysiane komórki osiągnęły zbieg od 80 do 90% w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Przygotować mieszaninę transfekcji plazmidu składającą się z plazmidu reporterowego lentiwirusa, DNA i trzech wektorów pakowania jako kontrolę zarówno transfekcji, jak i późniejszej infekcji. Dołącz dodatkową studzienkę dla lentiwirusowego wektora ekspresyjnego GFP, który zawiera wzmocnione białko zielonej fluorescencji pod kontrolą promotora CMV.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,25 molowego chlorku wapnia do plazmidów i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów dwóch roztworów XBBS i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Inkubować mieszaninę DNA w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Czekając, zastąp pożywkę z 2 9 3 komórek T dwoma mililitrami świeżej pożywki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na co najmniej 10 minut, aby zrównoważyć pH medium. Następnie kroplami dodaj mieszankę transfekcyjną do komórek, delikatnie zakręć płytką, obserwuj tworzenie się cząstek pod mikroskopem, a następnie umieść komórki na noc w inkubatorze.

Około 16 godzin po transfekcji uzupełnij pożywkę dwoma mililitrami świeżego DMEM i kulturą przez noc. Następnie, aby ocenić skuteczność transfekcji, oceń ekspresję EGFP w komórkach kontrolnych transfekcji. Skuteczność transfekcji od 90 do 100% przy wysokiej ekspresji EGFP jest wiarygodnym predyktorem dobrego przygotowania wirusa.

Zebrać pożywkę zawierającą wydzielane zakaźne cząstki wirusa, odwirować w celu usunięcia pozostałości 2, 9, 3 limfocytów T i zebrać wirusa zawierającego supernat. W trzecim dniu wysiewaj około 12 003 T trzech komórek na 12-dołkowej kulturze płytkowej przez noc do 20 do 30% płynności co i obserwuj komórki w czwartym dniu. Jeszcze czwartego dnia dodaj poli brain do zebranej pożywki zawierającej cząsteczki wirusa i dobrze wymieszaj przez pipetowanie.

Teraz odessać pożywkę z trzech komórek T trzy i dodać jeden mililitr mieszaniny wirusowej na studzienkę. Inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc po jednokrotnym umyciu komórek PBS, uzupełnij pożywkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w celu odzyskania i wzrostu. Po zlewaniu się podziel komórki i hodowlę przez noc następnego dnia.

Aby rozpocząć selekcję zainfekowanych komórek, dodaj świeżą pożywkę zawierającą 10 mikrogramów na mililitr. Pomijając blastyczność, kwas wybuchowy w samochodzie do zabijania musi być empirycznie określony dla każdej linii komórkowej. Uzupełniaj pożywkę zawierającą blastinę co dwa do trzech dni w celu ciągłej selekcji komórek opornych na antybiotyki.

Wyrażanie reporterów zegara. Po rozmnożeniu kultury komórek reporterowych odpornych na blastynę w 35-milimetrowych szalkach hodowlanych aż do zlewania się, zwykle przygotowujemy trzy lub więcej naczyń dla każdej linii komórek reporterowych w każdych warunkach dla fenotypu sarcy. Po jednym przemyciu PBS dodać DMEM zawierający 10 mikromolowych forlin lub 200 nanomolowych deksametazonów inkubowanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę w celu synchronizacji komórek.

Teraz umieść komórki na świeżo przygotowanym nośniku do nagrywania. Przykryj naczynia hodowlane sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o grubości 40 milimetrów i uszczelnij smarem próżniowym, aby zapobiec parowaniu. Załaduj naczynia do luminometru cyklu lumous i rozpocznij bioluminescencję w czasie rzeczywistym.

Nagranie Do nagrywania 96 starej płyty. Z dwoma urządzeniami rejestrującymi GSR patrz załączony manuskrypt. Z łatwością rejestrujemy rytm przez pięć do siedmiu dni w programie do analizy cyklu lum.

Pierwszy plan bazowy pasuje do nieprzetworzonych danych. Następnie użyj odjętych danych od linii bazowej, aby dopasować je do fali sinusoidalnej i określić wymagane parametry dla próbek, które wykazują trwałe rytmy. Dobroć danych stóp w górę niż 90% jest łatwo osiągana dzięki wysokiemu przejściowemu Luminate.

Wyczuwaj w górę i zmieniaj środek. Zazwyczaj wykluczamy pierwszy cykl danych z naszej analizy na potrzeby prezentacji danych. W razie potrzeby wykreślaj surowe dane w czasie.

Wykreśl odjęte dane wyjściowe, aby porównać amplitudę i fazę zarówno w przejściowej transfekcji 2 9 3 limfocytów T, jak i w infekcji linii komórkowych. Obrazy fluorescencyjne transfekowanych i transdukowanych komórek wykazujących ekspresję GFP wskazują, że system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa jest bardzo wydajny. Podstawowa pętla sprzężenia zwrotnego zegara okołodobowego składa się z czynników transkrypcyjnych, które działają na elementy wzmacniające okołodobowość w celu wytworzenia rytmicznej ekspresji genów.

W tym przypadku cztery różne konstrukty reporterowe w trzech komórkach T trzy wytwarzają odrębne fazy ekspresji reporterowej. Nowatorskie fazy pośrednie mogą być generowane z kombinatoryczną regulacją przez wiele elementów okołodobowych przy użyciu knockdownu genów za pośrednictwem RNAi i farmakologicznie aktywnych związków. W eksperymencie tym wykorzystano luminometr cyklu lum do rejestracji bioluminescencji komórek w 35-milimetrowych szalkach w komórkach U2 OS.

Irna została użyta do wyjaśnienia efektów nokautujących genów płaczu pierwszego i płaczu dwóch. W tym przypadku do rejestracji bioluminescencji komórek wykorzystano luminometr synergiczny. W 96-dołkowej płytce w trzech T, trzech komórkach reporterowych.

RNA wykorzystano do oceny wpływu trójjedynego knockdownu na rytmy komórkowe. W tym przykładzie system UX i luminometr tekan zostały wykorzystane do rejestracji bioluminescencji komórek w 3 84. Podczas gdy płytki, jak wskazano, wybrane, małe cząsteczki mogą farmakologicznie celować i zaburzać funkcję białka w rytmach komórkowych komórek reporterowych U2 OS.

Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie biologii okołodobowej w celu zbadania mechanizmów zegarowych i fizjologii w różnych typach komórek i tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinien dobrze zrozumieć, jak generować Lucyfera, raportować linie komórkowe i monitorować woluminy.

I nie zapominaj, że praca z VIR może być bardzo ryzykowna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki zapobiegawcze, takie jak środki ochrony osobistej i dekontaminacja wirusowa.