Name: Wytwarzanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę generowania ludzkich komórek iPSC z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA. Protokół umożliwia efektywną reprogramację komórek dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały częściowo sfinansowane z grantu NIH UO1HL107443-01 przyznanego GJM i GM.

1. Izolacja i namnażanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs)
DZIEŃ 0
<ol>
 <li>Pobrać 4 ml krwi obwodowej do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z cytrynianem sodu. Odwrócić probówkę od 8 do 10 razy i wirować przy 1,800 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej. Optymalnie ten etap należy przeprowadzić w ciągu 2 h od pobrania krwi.</li>
 <li>Zebrać komórki mononuklearne (MCs), pipetując warstwę leukocytarną (warstwa komórek między barierą żelową a osoczem) do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Uzupełnić całkowitą objętość do 10 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), kilkukrotnie odwrócić i wirować przy 300 x g przez 15 min.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 10 ml sterylnego PBS i przeprowadzić zliczenie komórek. Przenieść od 1 do 2x106 komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 10 min.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 2 ml pożywki do ekspansji (EM) (pożywka QBSF-60 Stem Cell Medium zawierająca 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 2 U/ml EPO, 40 ng/ml IGF-1, 1 μM deksametazonu oraz 100 μg/ml primociny lub 1% Pen/Strep) i przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
 <li>Wirować pozostałe komórki przy 300 x g przez 10 min i zamrozić ok. 2x106 komórek/fiolkę w FBS zawierającym 10% DMSO.</li>
 <li>Aby rozpocząć protokół z użyciem zamrożonych PBMC, rozmrozić 1 fiolkę komórek w 10 ml pożywki QBSF i wirować przy 300 x g przez 10 min. Resuspendować komórki w 2 ml EM i przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
DZIEŃ 3 i DZIEŃ 6
<ol start="17">
 <li>Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wypłukać studzienkę raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium w celu zebrania komórek adherentnych.</li>
 <li>Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 10 min.</li>
 <li>Resuspender komórki w 2 ml EM i przenieść do jednej studzienki płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
2. Transdukcja PBMC lentiwirusem STEMCCA
DZIEŃ 9
<ol>
 <li>Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wypłukać dołek raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium w celu zebrania komórek adherentnych.</li>
 <li>Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 10 min.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 1 ml świeżego EM zawierającego 5 μg/ml polybrene oraz lentiwirus STEMCCA (MOI=1 do 10), a następnie przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. (Protokół opisujący produkcję cząstek lentiwirusowych znajduje się pod adresem <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a>)</li>
 <li>Wirować płytkę z prędkością 2 250 rpm w temperaturze 25 °C przez 90 min.</li>
 <li>Po wirowaniu dodać kolejny 1 ml świeżego EM zawierającego 5 μg/ml polybrene, tak aby całkowita objętość pożywki wynosiła 2 ml, i inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
DZIEŃ 10
<ol start="16">
 <li>Przenieś komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przepłucz studzienkę raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium, aby zebrać komórki adherentne.</li>
 <li>Odwiruj komórki przy 300 x g przez 10 min.</li>
 <li>Resuspenduj komórki w 2 ml EM i przenieś do jednej studzienki płytki 12-dołkowej. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Wysiewanie transdukowanych komórek na MEFs
DZIEŃ 11
<ol>
 <li>Do studzienek płytki 6-dołkowej nanieść 0,1% żelatynę, a następnie wysiać inaktywowaną linię embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) w zagęszczeniu 2x105 komórek/studzienkę w pożywce MEF (IMDM zawierającej 10% FBS, 1% nieessentialnych aminokwasów, 100 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml primocyny lub 1% penicyliny/streptomycyny). Przygotować 3 studzienki na każdą infekcję.</li>
</ol>
DZIEŃ 12
<ol start="2">
 <li>Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przemyć dołek raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium, aby zebrać komórki adherentne.</li>
 <li>Resuspendować komórki w 3 ml pożywki MEF zawierającej 10 ng/ml bFGF, kwas askorbinowy oraz czynniki wzrostu w tych samych stężeniach, co w pożywce EM (50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 2 U/ml EPO, 40 ng/ml IGF-1, 1 μM dekzametazonu).</li>
 <li>Wysiać 1 ml komórek na każdy dołek płytki 6-dołkowej zawierającej MEF. Dodać 1,5 ml pożywki MEF z bFGF, kwasem askorbinowym i czynnikami wzrostu, tak aby całkowita objętość pożywki wynosiła 2,5 ml na dołek.</li>
 <li>Wirować płytkę z prędkością 500 rpm w temperaturze 25 °C przez 30 min. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
DZIEŃ 14
<ol start="6">
 <li>Dokarmiać komórki co drugi dzień 2,5 ml pożywki MEF zawierającej 10 ng/ml bFGF i 50 μg/ml kwasu askorbinowego (bez czynników wzrostu). Przy każdym dokarmianiu odessać i usunąć komórki pływające.</li>
 <li>Dodawać kolejne MEF w razie potrzeby (zazwyczaj raz w tygodniu).</li>
</ol>
~ DZIEŃ 20
<ol start="8">
 <li>Po pojawieniu się małych kolonii, codziennie dokarmiać komórki 2 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) (DMEM/F12 zawierającej 20% Knockout Serum Replacement, 1% nieessentialnych aminokwasów, 100 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml primocyny lub 1% Pen/Strep oraz 10 ng/ml bFGF).</li>
</ol>
4. Wybieranie i ekspansja klonów iPSC
~ DZIEŃ 30 - 40
<ol>
 <li>Przenieś każdą kolonię do oddzielnych studzienek płytki 12-dołkowej, uprzednio zasianej nieaktywnymi MEF w 1 ml/studzienka pożywki do hESC z dodatkiem 10 μM Stemolecule Y27632 (inhibitor ROCK).</li>
 <li>Następnie codziennie dostarczaj komórkom 1 ml samej pożywki do hESC (bez inhibitora ROCK).</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne markerów pluripotencji
<ol>
 <li>Barwienie przeprowadzono przy użyciu zestawu „ES Cell Marker Sample Kit” firmy Millipore, zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Wycięcie zintegrowanego wektora STEMCCA
<ol>
 <li>Wycięcie kasety reprogramującej przeprowadza się przy użyciu wektora wykazującego ekspresję Cre-IRES-Puro po transfekcji i krótkiej selekcji puromycyną, zgodnie z opisem6.</li>
</ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym pracy opisujemy zastosowanie wektora lentiwirusowego STEMCCA do generowania ludzkich iPSC z komórek mononuklearnych wyizolowanych z kilku mililitrów świeżo pobranej krwi obwodowej. Protokół ten może być również wykorzystany do reprogramowania zamrożonych PBMC (uzyskanych bezpośrednio z warstwy leukocytarnej), co ma istotne znaczenie praktyczne w przypadku wykorzystania komórek donora pozyskanych z odległej lokalizacji. Przed indukcją reprogramowania wyizolowane PBMC muszą przejść krytyczny etap ekspansji, dz...

<table><tbody><tr><td>Probówka do przygotowania komórek BD Vacutainer CPT z cytrynianem sodu</td><td>BD Biosciences</td><td>362760</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do komórek macierzystych QBSF-60</td><td>Quality Biological</td><td>160-204-101</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td> zamiennik surowicy Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nieessentialne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>MP Biomedicals</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>286-EP</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw próbek markerów komórek ES</td><td>Millipore</td><td>SCR002</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego stemcca

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych: Oct4, Klf4, Sox2 i cMyc, ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przekształcone w stan pluripotencji, co prowadzi do powstania tzw. indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs)1-4. Specyficzne dla pacjenta iPSCs nie budzą zastrzeżeń etycznych towarzyszących embrionalnym komórkom macierzystym (ESCs) i pozwoliłyby uniknąć ewentualnego odrzucenia immunologicznego. W związku z tym iPSCs przyciągnęły znaczną uwagę w badaniach nad modelowaniem chorób, przesiewaniu związków farmakologicznych oraz w terapiach regeneracyjnych5.
Wykazaliśmy możliwość generowania wolnych od transgenów ludzkich iPSC od pacjentów z różnymi chorobami płuc przy użyciu pojedynczej, wycinanej policistronicznej lentiwirusowej kasety komórek macierzystych (STEMCCA) kodującej czynniki Yamanaki6. Linie iPSC te zostały wygenerowane z fibroblastów skóry, najczęściej stosowanego typu komórek w procesie reprogramowania. Zazwyczaj pozyskanie fibroblastów wymaga biopsji skóry wycięciem cylindrycznym, a następnie namnożenia komórek w hodowli przez kilka pasaży. Co ważne, szereg grup badawczych zgłosiło reprogramowanie ludzkich komórek krwi obwodowej do iPSC7-9. W jednym z badań zastosowano indukowalną Tet wersję wektora STEMCCA9, co wymagało jednoczesnego zainfekowania komórek krwi konstytutywnie aktywnym lentiwirusem kodującym odwrotny transaktywator tetracykliny. W przeciwieństwie do fibroblastów, komórki krwi obwodowej można pobrać za pomocą procedur małoinwazyjnych, co znacznie zmniejsza dyskomfort i stres pacjenta. Prosty i skuteczny protokół reprogramowania komórek krwi z użyciem pojedynczego, konstytutywnego, wycinanego wektora może przyspieszyć zastosowanie technologii iPSC, czyniąc ją dostępną dla szerszej społeczności badawczej. Co więcej, reprogramowanie komórek krwi obwodowej umożliwia generowanie iPSC od osób, u których należy unikać biopsji skóry (tj. w przypadku nieprawidłowego bliznowacenia) lub ze względu na istniejące stany chorobowe uniemożliwiające wykonanie biopsji wycięciem cylindrycznym.
W niniejszej pracy prezentujemy protokół generowania ludzkich iPSC z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z wykorzystaniem pojedynczego, floksowanego, wycinanego wektora lentiwirusowego konstytutywnie ekspresującego 4 czynniki. Świeżo pobrane lub rozmrożone PBMC są namnażane przez 9 dni zgodnie z opisem10,11 w medium zawierającym kwas askorbinowy, SCF, IGF-1, IL-3 i EPO przed transdukcją lentiwirusem STEMCCA. Następnie komórki są wysiewane na MEF, a kolonie przypominające ESC można zaobserwować dwa tygodnie po infekcji. Na koniec wybrane klony są namnażane i testowane pod kątem ekspresji markerów pluripotencji SSEA-4, Tra-1-60 i Tra-1-81. Protokół ten jest prosty, odporny i wysoce powtarzalny, stanowiąc niezawodną metodologię generowania ludzkich iPSC z łatwo dostępnej ilości 4 ml krwi.

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z PBMC z wykorzystaniem pojedynczego wektora lentiwirusowego. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg protokołu. Krew pobiera się do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z cytrynianem sodu, a po wirowaniu komórki mononuklearne można zebrać z warstwy między żelem poliestrowym a osoczem (warstwa leukocytowa) (Rysunek 1B). Wyizolowane PBMC są następnie namnażane w hodowli przez 9 dni. Rysunek 2</stro...

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych: Oct4, Klf4, Sox2 i cMyc, ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przekształcone w stan pluripotencyjny, ...

Protokół demonstruje, jak efektywnie generować ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z czterech mililitrów krwi obwodowej. W dniu zerowym należy wyizolować i namnożyć komórki mononuklearne z próbki krwi obwodowej. Następnie przeprowadza się transdukcję pierwotnych komórek za pomocą wektora do reprogramowania.Dziewiątego dnia należy wysiać przetransdukowane komórki na nieaktywne zarodkowe fibroblasty mysie i hodować przez około trzy tygodnie. Wybrać kolonie przypominające hESC w celu ich ekspansji i charakterystyki. Wyniki barwienia immunofluorescencyjnego na ekspresję markerów pluripotencji, takich jak SSEA-4, TRA-1-60 i TRA-1-81.Zaprezentowano wydajną generację indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Zastosowanie antywirusowego wektora komórek macierzystych do generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi istniejącymi metodami. Najbardziej atrakcyjna jest prawdopodobnie ogólna prostota tego podejścia, ponieważ wymaga ono łatwego dostępu do tkanki dawcy, co w tym przypadku oznacza łatwo dostępne próbki krwi obwodowej.Najważniejszymi atrybutami tej metody są wydajność programowania oraz jakość uzyskanych klonów komórek iPS. Procedurę zademonstrują Andrea January Summer, pracownik podoktorski w moim laboratorium, oraz Sarah Rozelle, doktorantka z laboratorium George'a Murphy'ego. Wszystko w dniu zerowym.Pobierz cztery mililitry krwi obwodowej do probówki vacutainer do przygotowania komórek z cytrynianem sodu. Odwróć probówkę od 8 do 10 razy w ciągu dwóch godzin od pobrania. Wirować próbkę przy 1 800 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyizolowania komórek mononuklearnych.Odssać osocze i za pomocą pipety pobrać warstwę białkową (buffy coat) – warstwę komórek znajdującą się między barierą żelową a osoczem. Przenieść warstwę białkową do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i uzupełnić objętość do 10 ml sterylnym roztworem PBS. Kilkukrotnie odwrócić probówki i wirować z prędkością 300 G przez 15 minut.PrzesuspendTime pellet komórkowy w 10 ml sterylnego PBS, wykonaj zliczanie komórek, a następnie przenieś od 1 do 2 × 10⁶ komórek do sterylnej rurki wirówkowej typu conical o pojemności 15 ml. Odzyskaj komórki poprzez wirowanie i przesuspendTime pellet w 2 ml medium ekspansyjnego. Następnie wysiej wyizolowane komórki mononuklearne do jednej studzienki płytki 12-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.Pozostałe komórki zebrać za pomocą wirowania i zamrozić zapasy w ilości około dwóch razy 10⁶ komórek na fiolkę w FBS zawierającym 10% DMSO w trzecim i szóstym dniu. Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i raz wypłukać studzienkę za pomocą 1 ml pożywki dla komórek macierzystych QBSF 60. W celu zebrania komórek adherentnych.Zebrać komórki poprzez wirowanie, a osad komórkowy resuspender w dwóch mililitrach em. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do jednego dołka płytki 12-dołkowej i zwrócić hodowlę do inkubatora w dziewiątym dniu. Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i wypłukać dołek raz jednym mililitrem pożywki dla komórek macierzystych QB SF 60; aby zebrać komórki przylegające, wirować hodowlę przy 300 G przez 10 minut.Następnie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze świeżego EM zawierającego pięć mikrogramów na mililitr polybrain i lentiwirusa STEM dla MOI od 1 do 10. Następnie przenieść zawiesinę do jednej studni płytki 12-dołkowej i wirować przy 2 250 RPM przez 90 minut w temperaturze 25 °C. Dodać dodatkowy jeden mililitr świeżego EM zawierającego pięć mikrogramów na mililitr polybrain, aby uzyskać łącznie dwa mililitry EM, i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórek w 10. dniu.Po zebraniu komórek zgodnie z wcześniejszym opisem, ponownie zawiesić pellet komórkowy w dwóch mililitrach pożywki EM. Przetransformowane komórki w jednej studzience płytki 12-dołkowej w 11. dniu; pokryć studzienki płytki 6-dołkowej 0,1% żelatyną, a następnie wysiać inaktywowane blastocyty zarodkowe myszy w zagęszczeniu 2 × 10⁵ komórek na studzienkę w pożywce meth. Przygotować trzy studzienki na każdą infekcję.Następnego dnia zebrać przetransdukowane komórki mononuklearne zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Po wirowaniu zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach medium BFGF zawierającego kwas askorbinowy i czynniki wzrostu.Następnie odessaj pożywkę z płytki MES, pozostawiając 1 mL OFM z MC na każdą studzienkę. Następnie dodaj 1,5 mL kompletnej pożywki meth i wiruj płytkę z prędkością 500 RPM w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez dwa dni, począwszy od 14. dnia.Uzupełniać pożywkę co drugi dzień, dodając 2,5 ml pożywki meth zawierającej 10 ng/ml BFGF i 50 µg/ml kwasu askorbinowego, ale bez czynników wzrostu. Około 20. dnia, po pojawieniu się małych kolonii, dokarmiać komórki codziennie 2 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w okresie między 30. a 40. dniem. Wybrać każdą kolonię i przenieść do oddzielnych studni płytki 12-dołkowej, uprzednio przygotowanych z inaktywowanym matrigelem zawierającym 1 ml pożywki HESC oraz inhibitorem ROCK; dokarmiać komórki codziennie.Następnie, po dodaniu jednego mililitra pożywki HESC bez inhibitora ROCK, ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z monocytów są gotowe do barwienia immunofluorescencyjnego markerów pluripotencji, a także do wycięcia zintegrowanej kasety reprogramującej. W trakcie tego protokołu komórki przechodzą szereg zmian morfologicznych, od P BMCs do generowania ludzkich I PSCs. W dniu zerowym wyizolowane mononuklearne komórki z krwi obwodowej są hodowane w pożywce ekspansyjnej po dziewięciu dniach.Obserwuje się obecność skupisk komórek przypominających grona winogron, co sugeruje, że komórki są zdrowe i proliferują przed transdukcją. Około 21. dnia po wysianiu komórek na MAs tworzą się kolonie. W 30. dniu kolonie iPSC wykazują typową morfologię charakterystyczną dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.Ta analiza immunofluorescencyjna iPSC wygenerowanych z PBMC wykazuje ekspresję markerów pluripotencji SSEA-4, TRA-1-60 oraz TRA-1-81. iPSC wykazują również pozytywne barwienie na fosfatazę alkaliczną. Obrazy te przedstawiają etapy generowania iPSC wolnych od transgenu poprzez transfekcję plazmidem CoEx wykazującym ekspresję rekombinazy CRE oraz genu oporności na purymycynę, zgodnie z opisem w pracy Summers et al. 2010; w porównaniu z iPSC przed transfekcją obserwuje się śmierć komórek.Po dwóch dniach selekcji puromycyną, nowe kolonie wyłaniają się z komórek opornych około 10 dni po transfekcji. Analizy metodą Southern blot wybranych kolonii potwierdzają wycięcie transgenu. Ścieżki 1, 3, 5 i 7 wykazują obecność transgenu w klonach iPSC przed wycięciem. Prążki te są nieobecne na ścieżkach 2, 4, 6 i 8 po wycięciu transgenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie w sposób powtarzalny i niezawodny generować wysokiej jakości ludzkie komórki iPSC, prawidłowe lub specyficzne dla danej choroby, z niewielkich ilości krwi obwodowej dowolnej osoby.Podejście to upraszcza proces programowania rep, aby uczynić go szeroko dostępnym dla środowiska badaczy komórek macierzystych. Jednocześnie stanowi ono punkt wyjścia do generowania bardziej homogenicznych populacji linii komórek macierzystych.

generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie ludzkich komórek pluripotentnych z krwi obwodowej przy użyciu wirusowego wektora STEMCCA

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Poznaj metodę generowania ludzkich komórek iPSC z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA. Protokół umożliwia efektywną reprogramację komórek dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Wytwarzanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Przeglądaj więcej filmów