Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Protokół demonstruje, jak efektywnie generować ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z czterech mililitrów krwi obwodowej. W dniu zerowym należy wyizolować i namnożyć komórki mononuklearne z próbki krwi obwodowej. Następnie przeprowadza się transdukcję pierwotnych komórek za pomocą wektora do reprogramowania.

Dziewiątego dnia należy wysiać przetransdukowane komórki na nieaktywne zarodkowe fibroblasty mysie i hodować przez około trzy tygodnie. Wybrać kolonie przypominające hESC w celu ich ekspansji i charakterystyki. Wyniki barwienia immunofluorescencyjnego na ekspresję markerów pluripotencji, takich jak SSEA-4, TRA-1-60 i TRA-1-81.

Zaprezentowano wydajną generację indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Zastosowanie antywirusowego wektora komórek macierzystych do generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi istniejącymi metodami. Najbardziej atrakcyjna jest prawdopodobnie ogólna prostota tego podejścia, ponieważ wymaga ono łatwego dostępu do tkanki dawcy, co w tym przypadku oznacza łatwo dostępne próbki krwi obwodowej.

Najważniejszymi atrybutami tej metody są wydajność programowania oraz jakość uzyskanych klonów komórek iPS. Procedurę zademonstrują Andrea January Summer, pracownik podoktorski w moim laboratorium, oraz Sarah Rozelle, doktorantka z laboratorium George'a Murphy'ego. Wszystko w dniu zerowym.

Pobierz cztery mililitry krwi obwodowej do probówki vacutainer do przygotowania komórek z cytrynianem sodu. Odwróć probówkę od 8 do 10 razy w ciągu dwóch godzin od pobrania. Wirować próbkę przy 1 800 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyizolowania komórek mononuklearnych.

Odssać osocze i za pomocą pipety pobrać warstwę białkową (buffy coat) – warstwę komórek znajdującą się między barierą żelową a osoczem. Przenieść warstwę białkową do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i uzupełnić objętość do 10 ml sterylnym roztworem PBS. Kilkukrotnie odwrócić probówki i wirować z prędkością 300 G przez 15 minut.

PrzesuspendTime pellet komórkowy w 10 ml sterylnego PBS, wykonaj zliczanie komórek, a następnie przenieś od 1 do 2 × 10⁶ komórek do sterylnej rurki wirówkowej typu conical o pojemności 15 ml. Odzyskaj komórki poprzez wirowanie i przesuspendTime pellet w 2 ml medium ekspansyjnego. Następnie wysiej wyizolowane komórki mononuklearne do jednej studzienki płytki 12-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.

Pozostałe komórki zebrać za pomocą wirowania i zamrozić zapasy w ilości około dwóch razy 10⁶ komórek na fiolkę w FBS zawierającym 10% DMSO w trzecim i szóstym dniu. Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i raz wypłukać studzienkę za pomocą 1 ml pożywki dla komórek macierzystych QBSF 60. W celu zebrania komórek adherentnych.

Zebrać komórki poprzez wirowanie, a osad komórkowy resuspender w dwóch mililitrach em. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do jednego dołka płytki 12-dołkowej i zwrócić hodowlę do inkubatora w dziewiątym dniu. Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i wypłukać dołek raz jednym mililitrem pożywki dla komórek macierzystych QB SF 60; aby zebrać komórki przylegające, wirować hodowlę przy 300 G przez 10 minut.

Następnie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze świeżego EM zawierającego pięć mikrogramów na mililitr polybrain i lentiwirusa STEM dla MOI od 1 do 10. Następnie przenieść zawiesinę do jednej studni płytki 12-dołkowej i wirować przy 2 250 RPM przez 90 minut w temperaturze 25 °C. Dodać dodatkowy jeden mililitr świeżego EM zawierającego pięć mikrogramów na mililitr polybrain, aby uzyskać łącznie dwa mililitry EM, i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórek w 10. dniu.

Po zebraniu komórek zgodnie z wcześniejszym opisem, ponownie zawiesić pellet komórkowy w dwóch mililitrach pożywki EM. Przetransformowane komórki w jednej studzience płytki 12-dołkowej w 11. dniu; pokryć studzienki płytki 6-dołkowej 0,1% żelatyną, a następnie wysiać inaktywowane blastocyty zarodkowe myszy w zagęszczeniu 2 × 10⁵ komórek na studzienkę w pożywce meth. Przygotować trzy studzienki na każdą infekcję.

Następnego dnia zebrać przetransdukowane komórki mononuklearne zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Po wirowaniu zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach medium BFGF zawierającego kwas askorbinowy i czynniki wzrostu.

Następnie odessaj pożywkę z płytki MES, pozostawiając 1 mL OFM z MC na każdą studzienkę. Następnie dodaj 1,5 mL kompletnej pożywki meth i wiruj płytkę z prędkością 500 RPM w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez dwa dni, począwszy od 14. dnia.

Uzupełniać pożywkę co drugi dzień, dodając 2,5 ml pożywki meth zawierającej 10 ng/ml BFGF i 50 µg/ml kwasu askorbinowego, ale bez czynników wzrostu. Około 20. dnia, po pojawieniu się małych kolonii, dokarmiać komórki codziennie 2 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w okresie między 30. a 40. dniem. Wybrać każdą kolonię i przenieść do oddzielnych studni płytki 12-dołkowej, uprzednio przygotowanych z inaktywowanym matrigelem zawierającym 1 ml pożywki HESC oraz inhibitorem ROCK; dokarmiać komórki codziennie.

Następnie, po dodaniu jednego mililitra pożywki HESC bez inhibitora ROCK, ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z monocytów są gotowe do barwienia immunofluorescencyjnego markerów pluripotencji, a także do wycięcia zintegrowanej kasety reprogramującej. W trakcie tego protokołu komórki przechodzą szereg zmian morfologicznych, od P BMCs do generowania ludzkich I PSCs. W dniu zerowym wyizolowane mononuklearne komórki z krwi obwodowej są hodowane w pożywce ekspansyjnej po dziewięciu dniach.

Obserwuje się obecność skupisk komórek przypominających grona winogron, co sugeruje, że komórki są zdrowe i proliferują przed transdukcją. Około 21. dnia po wysianiu komórek na MAs tworzą się kolonie. W 30. dniu kolonie iPSC wykazują typową morfologię charakterystyczną dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Ta analiza immunofluorescencyjna iPSC wygenerowanych z PBMC wykazuje ekspresję markerów pluripotencji SSEA-4, TRA-1-60 oraz TRA-1-81. iPSC wykazują również pozytywne barwienie na fosfatazę alkaliczną. Obrazy te przedstawiają etapy generowania iPSC wolnych od transgenu poprzez transfekcję plazmidem CoEx wykazującym ekspresję rekombinazy CRE oraz genu oporności na purymycynę, zgodnie z opisem w pracy Summers et al. 2010; w porównaniu z iPSC przed transfekcją obserwuje się śmierć komórek.

Po dwóch dniach selekcji puromycyną, nowe kolonie wyłaniają się z komórek opornych około 10 dni po transfekcji. Analizy metodą Southern blot wybranych kolonii potwierdzają wycięcie transgenu. Ścieżki 1, 3, 5 i 7 wykazują obecność transgenu w klonach iPSC przed wycięciem. Prążki te są nieobecne na ścieżkach 2, 4, 6 i 8 po wycięciu transgenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie w sposób powtarzalny i niezawodny generować wysokiej jakości ludzkie komórki iPSC, prawidłowe lub specyficzne dla danej choroby, z niewielkich ilości krwi obwodowej dowolnej osoby.

Podejście to upraszcza proces programowania rep, aby uczynić go szeroko dostępnym dla środowiska badaczy komórek macierzystych. Jednocześnie stanowi ono punkt wyjścia do generowania bardziej homogenicznych populacji linii komórek macierzystych.