Name: In vivo (in vivo) Systemy obrazowania (IVIS) wykrywające neuroinwazyjnego wirusa encefalitycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metodę wykrywania zakażeń OUN przez wirusa alfa przy użyciu bioluminescencji i systemu obrazowania IVIS. Technika ta umożliwia wizualizację inwazji wirusa w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności szczepionek i leków przeciwwirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Instytut Nauk Translacyjnych UTMB-NIH w ramach grantu 1UL1RR029876-01 oraz Alishie Prather za pomoc w montażu wideo do niniejszego opracowania.

1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
 <li>Przybycie zwierząt: Po przybyciu do obiektów poziomu biosafety 2 dla zwierząt (ABSL2), należy pozwolić zwierzętom na aklimatyzację w nowym środowisku przez minimum 2 dni. Po tym okresie odpoczynku należy zbadać zwierzęta, aby ocenić ich stan zdrowia i ogólną kondycję fizyczną.
 <ol>
 <li>W przypadku stosowania reporterów fluorescencyjnych ważne jest wprowadzenie wszystkich zwierząt na dietę bez lucerny, aby ograniczyć autofluorescencję przewodu pokarmowego i sygnał tła. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Golenie zwierząt: Aby poprawić sygnał bioluminescencyjny wykrywany z obszaru czaszki podczas obrazowania, należy ogolić głowy wszystkich zwierząt. Zwierzęta należy poddać znieczuleniu mieszanką tlenu i odparowanego izofluranu. Po pełnym znieczuleniu zwierząt należy użyć maszynki elektrycznej do ogolenia ich głów. Po zakończeniu golenia należy przenieść zwierzęta do klatek i obserwować je do czasu pełnego wybudzenia z narkozy. </li>
 <li>Wprowadzenie transpondera Bio Medic Data Systems (BMDS) (wykonywane po ogoleniu myszy, podczas pełnego znieczulenia): W celu zastosowania mniej inwazyjnej metody monitorowania temperatury, należy wszczepić zaprogramowany bezprzewodowy transponder BMDS podskórnie w obszarze grzbietowym każdej myszy. Transpondery te umożliwiają bezprzewodową identyfikację i rejestrację temperatury. Po implantacji transpondera należy nałożyć na ranę weterynaryjny klej tkankowy. </li>
 <li>Pomiary wyjściowe: Przed zakażeniem należy zapisać temperaturę wyjściową i masę ciała wszystkich zwierząt. Należy pobrać krew do analizy testem neutralizacji redukcji plaków (PRNT) poprzez upust z splotu zatwarczowego (RO), gdy myszy znajdują się pod wpływem znieczulenia. Po pobraniu krwi należy zastosować weterynaryjną antybiotykową maść do oczu, aby zredukować ryzyko wtórnego zakażenia bakteryjnego. Pomiary wyjściowe powinny być przeprowadzane z uwzględnieniem liczby podań znieczulenia ze względu na stres zwierząt. Kolejne pobrania metodą RO powinny być wykonywane po obrazowaniu, gdy mysz nadal znajduje się pod wpływem środka znieczulającego. Maksymalna ilość krwi pobranej metodą RO powinna wynosić około 200 μl. </li>
 <li>Zakażenie: Myszy należy poddać znieczuleniu zgodnie z wcześniejszym opisem. Inokulację wykonuje się drogą donosową, stosując dawkę od 5x106 do 5x107 pfu TC83-Luciferase w całkowitej objętości 40 μl rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Po zakażeniu należy umieścić myszy w klatkach i obserwować proces rekonwalescencji. </li>
</ol>
2. Obrazowanie zwierząt
Zastrzeżenie: Myszy należy przez cały czas utrzymywać w ich klatkach, w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) lub w pudełku ograniczającym XIC. Do tego protokołu zatwierdzone komory BSC to klasy II typu B1 lub B2.
<ol>
 <li>Wstrzyknąć wszystkim zwierzętom dożylnie w obszarze otrzewnej (IP) lucyferynę w stężeniu 15 mg/ml w dawce 10 μl na gram masy ciała.
 <ol>
 <li>Myszy otrzymujące Ampligen należy poddać wstrzyknięciu IP w dawce 12,5 mg/kg masy ciała w czasie -4 h po infekcji lub +48 h po infekcji, zależnie od przypisanej grupy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przed wstrzyknięciem lucyferyny podzielić myszy na grupy po trzy sztuki, aby zapewnić ich odpowiednie rozmieszczenie wewnątrz komory izolacyjnej XIC-3.
 <ol>
 <li>Podczas wszystkich badań obrazowych należy stosować maść lub lubrykant do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki w trakcie procedury.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Uruchomić oprogramowanie LivingImage i nacisnąć Initialize, aby przygotować komorę obrazującą; ustawić automatyczne zapisywanie, czas ekspozycji na auto (automatyczny czas ekspozycji jest nową funkcją oprogramowania LivingImage w wersji 3.2 i nowszych), pole widzenia na C oraz filtr na otwarty (open); pole widzenia zależy od liczby obrazowanych myszy, a filtr może być optymalizowany w zależności od potrzeb innych projektów obrazowania.</li>
 <li>Upewnić się, że filtry węglowe powietrza nie utraciły ważności, butla z tlenem jest pełna, a zbiornik z izofluranem jest napełniony. W komorze izolacyjnej XIC-3 umieścić małe paski taśmy izolacyjnej, co pomoże ograniczyć ruchy zwierząt podczas obrazowania.</li>
 <li>Wstrzyknąć myszom lucyferynę IP zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i umieścić je w komorze indukcyjnej z izofluranem (z otwartą pokrywą) na 3-5 min.</li>
 <li>Po 5 min zamknąć pokrywę komory indukcyjnej i rozpocząć przepływ izofluranu. Środek znieczulający podać w stężeniu około 3-5% przy przepływie tlenu ustawionym na około 2,0 L/min. Po całkowitej utracie przytomności odczekać dodatkowe 30 s i przenieść myszy do komory izolacyjnej XIC-3. Upewnić się, że wykorzystywana komora z laminarnym przepływem powietrza umożliwia bezpieczne odprowadzanie oparów izofluranu, ponieważ procedura ta wiąże się z ucieczką izofluranu z komory indukcyjnej (urządzenie IVIS posiada własne kanistry Passive Fair, a komora XIC-3 łączy się bezpośrednio z gniazdami wlotowymi/wylotowymi, co zapewnia zamknięty przepływ środka znieczulającego).
 <ol>
 <li>Przenieść myszy do komory izolacyjnej XIC-3 zgodnie z numerem chipa/grupy, z podłączonym i otwartym złączem do izofluranu. Ułożyć myszy w pozycji brzusznej (sternal recumbency), tak aby głowy lekko spoczywały na paskach taśmy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przetrzeć komorę XIC etanolem, spryskać dłonie oraz dno komory XIC-3 preparatem Cavicide i przenieść całość do komory obrazowania IVIS. Po umieszczeniu wewnątrz urządzenia obrazującego ponownie podłączyć znieczulenie do komory.</li>
 <li>Po 10 min od wstrzyknięcia lucyferyny wykonać obrazowanie myszy za pomocą oprogramowania LivingImage.</li>
 <li>Po wstępnym obrazowaniu z otwartym filtrem rozpocząć trójwymiarowe obrazowanie DLIT, korzystając z ustawień Sequence analysis oraz Image Wizard dla bioluminescencyjnej lucyferazy świetlika. Proces ten potrwa 4-5 min i powinien zostać wykonany przy polu widzenia dostosowanym do pożądanej liczby myszy.
 <ol>
 <li>Analiza ex-vivo jest możliwa po sekcji i pobraniu mózgu. Umieścić mózg na sterylnym naczyniu Petriego, nanieść kroplą 50-100 μl roztworu lucyferyny i umieścić w komorze obrazującej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wykonać drugi obraz z otwartym filtrem w 15-17 min po infekcji, po zakończeniu obrazowania DLIT. Upewnić się, że analiza sekwencyjna (sequence analysis) jest wyłączona, a pole widzenia i ustawienia filtra zostały przywrócone do poprzednich wartości.</li>
</ol>
3. Powrót myszy i analiza danych
<ol>
 <li>Wyłącz parownik izofluranu i przenieś pojemnik zabezpieczający XIC z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
 <li>Umieść myszy z powrotem w ich klatce, zamknij górną pokrywę, spryskaj zewnętrzną stronę odpowiednim środkiem dezynfekującym i umieść klatkę z powrotem na regale.
 <ol>
 <li>Upewnij się, że myszy całkowicie wybudziły się z narkozy. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Powtarzaj powyższą procedurę zgodnie z wymaganiami eksperymentu aż do zakończenia obrazowania. </li>
 <li>Zdezynfekuj BSC, wyłącz sprzęt i przenieś wszystkie dane do zewnętrznej lokalizacji laboratoryjnej w celu dalszej analizy. </li>
 <li>Przeanalizuj dane i wygeneruj obrazy 3D na podstawie wyników IVIS, korzystając z oprogramowania LivingImage.
 <ol>
 <li>Upewnij się, że obraz jest odpowiednio zorientowany, a oświetlenie i balans kolorów zostały ustawione. W palecie narzędzi (Tool Palette) dostępne są opcje: Image Adjust, Corrections, Image Information oraz ROI Tools.</li>
 <li>Wykorzystaj kształty ROI, aby zidentyfikować konkretne natężenia sygnału w zależności od lokalizacji.</li>
 <li>Zrekonstruuj topografię powierzchni, aby wyróżnić ciało myszy, zainicjuj rekonstrukcję 3D DLIT i użyj dopasowania liniowego (linear fit), aby przypisać mapę organów do rekonstrukcji topograficznej. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dalsza analiza miana wirusa może zostać przeprowadzona poprzez pobranie krwi i organów. Miareczkowanie w niniejszym badaniu wykonano poprzez homogenizację tkanki mózgowej w zmodyfikowanym medium Orła (MEM). Homogenizat poddano rozcieńczeniom seryjnym, a następnie zainfekowano płytkę 6-dołkową z komórkami Vero przez 1 hr. Komórki przykryto warstwą 1,5% agarozy/2xMEM i inkubowano przez 2 dni w 37 °C. Komórki utrwalono 10% formaliną przez 30 min i zabarwiono fioletem krystalicznym.</li>
</ol>

<ol><li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H%2FHeN+and+BALB%2Fc+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology+Online%22%5BJournal%5D)">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li>
<li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li>
<li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li>
<li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection%3A+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li>
<li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592(2009).</li>
<li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds%3A+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li>
<li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Choć niniejszy protokół obejmuje aspekty obrazowania dla analiz in vivo, ważne jest uznanie wektora bioluminescencyjnego za kluczowy czynnik dla przyszłych badań. Wykorzystanie przez nas TC83, atenuowanego szczepu szczepionkowego VEEV, jako wektora do ekspresji lucyferazy zapewnia produkcję dużych ilości enzymu ze względu na wysoką szybkość replikacji wirusa w OUN, jak opisano wcześniej1-4. Chociaż dodanie drugiego promotora subgenomowego i genu lucyferazy skutkuje dalszą atenuacją wirusa rekombinowan...

<table><tbody><tr><td>D-lucyferyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Xenogen IVIS (Spectrum)</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny XGI-8-gas</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora izolacyjna XIC-3</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LivingImage 4.0</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chiptelemetria/identyfikacyjne</td><td>Bio Medic Data Systems</td><td>IPTT-300</td><td>Identyfikacja zwierząt i temperatura</td></tr><tr><td>Strzykawka BD Integra 1ml TB z igłą 26 g x 3/8&amp;#8221;</td><td>Fisher Scientific</td><td>305279</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vet Bond</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9259532</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Vetropolycin</td><td>Webster Veterinary Products</td><td>78444656</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik chipów BMDS</td><td>Bio Medic Data Systems</td><td>DAS-7007S</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie DAS-HOST</td><td>Bio Medic Data Systems</td><td></td><td>Służy do pobierania informacji z sond</td></tr></tbody></table>

wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania in vivo (ivis)

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Nowoczesne postępy w technologiach obrazowania sprzyjają dalszemu rozwojowi i udoskonalaniu sposobów prowadzenia badań nad wirusami. Zgodnie z koncepcją 3R (zastąpienie, ograniczenie, udoskonalenie) zaproponowaną pierwotnie przez Russella i Burcha, wykorzystywanie modeli zwierzęcych w badaniach naukowych podlega ciągłej presji w celu identyfikacji nowych metodologii pozwalających na ograniczenie liczby zwierząt przy jednoczesnej poprawie dokładności i szybkości badań. Głównym wyzwaniem dla zasad 3R jest jednak zapewnienie statystycznej dokładności badań przy jednoczesnym zmniejszeniu zachorowalności zwierząt i ich całkowitej liczby. Badania nad skutecznością szczepionek wymagają obecnie dużej liczby zwierząt, aby wyniki uznano za istotne statystycznie, co często prowadzi do wysokiej zachorowalności i śmiertelności jako punktów końcowych służących do identyfikacji ochrony odpornościowej. Wykorzystaliśmy systemy obrazowania in vivo (IVIS) w połączeniu z bioluminescencyjnym enzymem świetlika, aby progresywnie śledzić inwazję ośrodkowego układu nerwowego (CNS) przez wirus zapalenia mózgu w modelu mysim. Zazwyczaj choroba postępuje stosunkowo powoli, jednak replikacja wirusa jest szybka, zwłaszcza w obrębie CNS, co często prowadzi do śmiertelnego wyniku. Po infekcji donosowej myszy szczepem TC83-Luc, czyli atenuowanym szczepem wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni zmodyfikowanym tak, aby ekspresował gen lucyferazy, jesteśmy w stanie zwizualizować replikację wirusa w mózgu co najmniej na trzy dni przed wystąpieniem klinicznych objawów choroby. Wykorzystując inwazję CNS jako kluczowy punkt końcowy rozwoju choroby zapalnej mózgu, możemy szybko zidentyfikować terapeutyczną i szczepionkową ochronę przeciwko infekcji TC83-Luc przed wystąpieniem objawów klinicznych. Dzięki technologii IVIS jesteśmy w stanie zademonstrować szybkie i dokładne testowanie leków terapeutycznych oraz szczepionek przy jednoczesnym ograniczeniu liczby zwierząt i ich zachorowalności.

Przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego wirusa, TC83-Luciferase, zaobserwowaliśmy wzrost natężenia sygnału bioluminescencyjnego w miarę przemieszczania się replikacji wirusa z obszaru nosa do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) (Rysunek 1). Ze względu na wysoką szybkość replikacji wirusa spodziewamy się wysokiego poziomu sygnału bioluminescencyjnego (Rysunek 2A), zależnego od wektora oraz odpowiedzi immunologicznej zwierzęcia na ten wektor. Przewidujemy, że wzrost sygnału będzie trwał aż ...

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli zwierzęcych. Możliwość obserwacji poszczególnych zwierząt w wielu punktach czasowych zapewnia zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt, redukcję kosztów oraz ogólnej zachorowalności badanych osobników, co gwarantuje bardziej humanitarny i naukowy sposób badania chorób.

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Współczesne osiągnięcia w technologii obrazowania sprzyjają dalszemu rozwojowi i udoskonalaniu metod prowadzenia badań nad wirusami. Początkowo zaproponowane przez ...

W dzisiejszym materiale przedstawiamy metodę wykrywania infekcji ośrodkowego układu nerwowego wywołanej przez alfawirus w gatunku Aurine z wykorzystaniem technologii bioluminescencyjnej. Metoda ta wykorzystuje TC 83, szczep żywej atenuowanej szczepionki przeciwko wenezuelskiemu zapaleniu mózgu koni z wprowadzonym genem lucyferazy świetlika, który pozwala nam śledzić replikację wirusa w miarę jego rozprzestrzeniania się w organizmie gospodarza. W niedawno opublikowanej pracy dotyczącej szczepionek wykazaliśmy zdolność do wizualizacji inwazji OUN i wykorzystaliśmy ją jako punkt końcowy badania do testowania skuteczności szczepionek oraz leków przeciwwirusowych, zanim w grupie kontrolnej wystąpiły objawy kliniczne choroby.Witajcie, nazywam się Allison Ard i jestem technologiem zwierząt w laboratoriach o wysokim stopniu zabezpieczenia na University of Texas Medical Branch. Prace, które zobaczycie w tym filmie, zostały wykonane przeze mnie, Michaela Pattersona, doktoranta na UTMB, oraz Katie Taylor, starszej doktorantki w naszym laboratorium. Wszystkie przedstawione działania zostały przeprowadzone w Galveston National Laboratory z pełną zgodą IACUC, zgodnie z przepisami dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego, z wykorzystaniem systemów obrazowania in vivo.IVUS pozwala nam zmniejszyć liczbę zwierząt wymaganych w naszych badaniach dzięki możliwości codziennego generowania obrazów dla każdego osobnika. Dzisiejszy przegląd zaprezentuje przygotowanie zwierzęcia, w tym golenie czoła, BMDS, chipowanie, infekcję donosową TC 80 D, trzy zastrzyki doszpikowe Lucifer w celu obrazowania, a także obsługę i przenoszenie zwierzęcia z szafki zabezpieczającej Biocon do pudełka do obrazowania. Z pudełka do obrazowania przeniesiemy zwierzę do jednostki obrazującej caliper, zaprezentujemy właściwy proces obrazowania, obrazowanie dwu- i trójwymiarowe oraz przeniesienie zwierząt po obrazowaniu z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.Nasze laboratorium zoologiczne posiada jedną komorę z laminarnym przepływem powietrza klasy drugiej, w której odbywają się wszystkie procedury in vitro i in vivo. Obok komory znajduje się urządzenie Cali ivu spectrum z podłączonym parownikiem izofluranu oraz interfejsem komputerowym. Parownik izofluranu umożliwia precyzyjne podawanie anestetyku inhalacyjnego i stanowi szybszą oraz bezpieczniejszą metodę znieczulania myszy w porównaniu do anestetyków wstrzykiwalnych.Kamera obrazująca XI C3 jest jednostką szczelną, wyposażoną w filtrację HEPA, co pozwala na bezpieczny transport zwierząt w obrębie laboratorium. W poprzednich badaniach ustaliliśmy, że morskie gatunki o ciemniejszym owłosieniu wykazują zahamowany sygnał bioluminescencyjny bezpośrednio związany z ich futrem. Zalecamy zgolenie obszaru czoła i pyska w celu poprawy detekcji sygnału w trakcie całego badania.W naszych badaniach wykorzystujemy chipy transponderowe BMDS, które umożliwiają bezprzewodowe zbieranie informacji o temperaturze oraz identyfikacji zwierząt. Ta metoda gromadzenia danych pozwala na ograniczenie manipulacji zwierzętami i redukcję stresu. Sierść jest matowiona za pomocą gazika nasączonego etanolem, a chip jest wprowadzany podskórnie.Podczas gdy mysz znajduje się pod wpływem znieczulenia. Zwierzęta znieczulamy w celu przeprowadzenia infekcji donosowej. Po utracie przytomności delikatnie trzymamy każde zwierzę za kark, kierując pysk ku górze.Do każdej nozdrzy pipetuje się 20 µL. Przy całkowitej objętości 40 µL na mysz, zwierzęta oddychają pomiędzy kolejnymi kroplami, aby inokulum nie gromadziło się w tylnej części gardła. W celu podania lucyferazy drogą IP, zwierzęta są delikatnie unieruchamiane poprzez chwycenie za kark i umieszczenie ogona pod małym oraz serdecznym palcem.Następnie do brzucha każdego zwierzęcia wstrzykuje się Luciferian, aby zapewnić maksymalną dyfuzję lucyferyny w krwiobiegu. Przed znieczuleniem myszy w celu wykonania obrazowania odczekujemy od 5 do 10 minut po iniekcji. Po znieczuleniu zwierzęta można przenieść do komory obrazowania XI C3.Ich głowy są delikatnie umieszczane na paskach czarnej taśmy izolacyjnej, co ogranicza przemieszczanie się czaszki. Ze względu na ruchy oddechowe, które zakłócałyby proces obrazowania w przypadku wszystkich technik, w tym obrazowania trójwymiarowego, pełna protrakcja kończyn oraz pozycja na brzuchu wewnątrz jednostki XI C3 zapewniają optymalne mapowanie topograficzne. Po prawidłowym umieszczeniu wszystkich zwierząt należy zamknąć szczelnie pudełko XI C3 i przetrzeć zewnętrzną część urządzenia etanolem oraz zdezynfekować ręce przed wyjęciem pudełka z komory bezpieczeństwa biologicznego.Podczas umieszczania komory XI C3 w urządzeniu obrazującym ivus należy upewnić się, że wloty i wyloty gazu anestetycznego są prawidłowo podłączone do filtrów HEPA zamocowanych w komorze XI C3. Należy również upewnić się, że siatka obrazująca całkowicie obejmuje myszy przed zamknięciem urządzenia i uruchomieniem przepływu anestetyku. Po uruchomieniu oprogramowania Living Image należy zalogować się przy użyciu swojej nazwy użytkownika.Następnie inicjujemy urządzenie IVUS. Gdy urządzenie IVUS będzie gotowe, wskaźnik temperatury zmieni kolor na zielony, co następuje przy temperaturze około -90 °C. Używamy automatycznego wykrywania czasu ekspozycji, a wszystkie pozostałe ustawienia pozostawiamy w wartościach domyślnych.Po zarejestrowaniu obrazu zostanie on wyświetlony na głównym ekranie. Można wybrać obszary zainteresowania, co pozwoli na automatyczne wykrycie konkretnych stref o silnej intensywności sygnału. Możliwe jest również ręczne wprowadzenie obszarów o wysokiej intensywności, które chcą Państwo zwizualizować, a których system nie identyfikuje automatycznie w obrazowaniu trójwymiarowym.Wybierz opcję konfiguracji sekwencji, wybierz kreator obrazowania, a następnie wybierz bioluminescencję. Po wybraniu bioluminescencji kliknij DLIT i kliknij Dalej. W sekcji DLIT upewnij się, że wybrano odpowiedni reporter dla US Firefly i kliknij Dalej.Upewnij się, że wszystkie wprowadzone informacje są poprawne. Naszym obiektem obrazowania jest mysz z polem widzenia w rozmiarze C. Następnie klikamy przycisk „dalej”, co generuje zestaw pięciu obrazów o różnych długościach fali, od 560 nm do 640 nm.W ramach naszego pierwszego obrazu mamy również obraz topograficzny, wykonany w celu umożliwienia obrazowania trójwymiarowego. Następnie klikamy „acquire sequence”. Po pozyskaniu wszystkich pięciu obrazów możemy zamknąć ustawienia sekwencji obrazowania i przejść do obróbki obrazu.Aby stworzyć rekonstrukcję trójwymiarową, musimy najpierw upewnić się, że dysponujemy dokładną mapą topograficzną. Jako obiekt wybieramy mysz domową w orientacji grzbietowej i przeprowadzamy rekonstrukcję. Zaznaczamy samą mysz, unikając zaznaczania obszarów tła wewnątrz skrzynki.Klikamy „dalej”; ten etap może zająć pewną ilość czasu, w zależności od obrazu oraz wykorzystywanego systemu komputerowego. Po zakończeniu otrzymamy mapę topograficzną ciała myszy. Następnie przechodzimy do rekonstrukcji 3D DLIT.Upewnij się, że ustawienia progu oraz właściwości tkanki zostały poprawnie skonfigurowane. Wybierz start dla tkanki mózgowej, a następnie wybierz rekonstruuj. Jest to kolejny punkt czasowy, którego przetworzenie może zająć trochę czasu, w zależności od Twojego systemu obliczeniowego.Po zakończeniu na mapie topograficznej pojawi się sygnał. Następnie należy kliknąć narzędzia 3D, wybrać rejestrację, atlas organów, a następnie orientację grzbietową dla samicy. Możemy wtedy zmienić przezroczystość organów, aby lepiej widzieć, a następnie kliknąć dopasowanie liniowe, aby dopasować mapę topograficzną do cyfrowego zestawu organów.Możemy usunąć wszystkie organy z wyjątkiem tych, które chcemy faktycznie zidentyfikować za pomocą sygnału US dla mózgu. Dzięki tej technologii jesteśmy również w stanie stworzyć trójwymiarowe wideo, które pozwala nam na obracanie, zmianę przezroczystości, zmianę widoku, powiększanie, usuwanie organów, a na koniec oddalanie obrazu. Po zakończeniu obrazowania należy wyłączyć parowar izofluranu i odłączyć pojemnik zabezpieczający XI C3.Wróć z zamkniętym pudełkiem do komory bezpieczeństwa biologicznego i delikatnie odczep myszy od taśmy izolacyjnej. W przypadku dłuższego czasu obrazowania, myszy wewnątrz ABS L two można ogrzać poprzez odpowiednią manipulację w rękawiczkach.Zwierzęta są pod ścisłą obserwacją do czasu pełnego wybudzenia z narkozy. Chcielibyśmy podziękować dr. Pesslerowi oraz wszystkim osobom w laboratorium, które przyczyniły się do realizacji tego projektu. Dziękujemy również Galveston National Laboratory za udostępnienie zaplecza i sprzętu, a także Institute for Translational Sciences za sfinansowanie tych badań.

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In Vivo Systemy do obrazowania (IVIS) Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia immunokompetentnego mysiego modelu infekcji ośrodkowego układu nerwowego ICR (Institute of Cancer Research), aby pokazać rozwój neuropatii. Monitorowanie ostrych wirusowych zaburzeń encefalitycznych za pomocą identycznych wyników choroby można przeprowadzić w celu wykazania neuropatii wywołanej wirusem dengi in vivo.

Mysi model ostrej choroby podobnej do wirusowego zapalenia mózgu wywołanej wirusem dengi

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Poznaj metodę wykrywania zakażeń OUN przez wirusa alfa przy użyciu bioluminescencji i systemu obrazowania IVIS. Technika ta umożliwia wizualizację inwazji wirusa w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności szczepionek i leków przeciwwirusowych.

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Przeglądaj więcej filmów