Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie braku reakcji suceptywnych na nacisk mechaniczny w tylnej łapie myszy. Osiąga się to, umieszczając najpierw zwierzęta na podłodze z siatki drucianej i pozwalając im się przyzwyczaić, gdy będą gotowe. Polipropylenową końcówkę nakłada się na spód tylnej łapy, a nacisk jest stopniowo zwiększany.

Po odnotowaniu odpowiedniej reakcji behawioralnej bodziec zostaje wycofany. Po zebraniu wartości wyjściowych zwierzęta są poddawane interwencji doświadczalnej przed dalszymi badaniami. Ostatecznie zmiany w progach wycofania tylnej łapy są porównywane w różnych grupach leczenia w celu określenia wpływu konkretnego leczenia na zmiany wrażliwości dotykowej na nacisk.

Ból jest głównym składnikiem stanu zapalnego. Ważne jest, aby mierzyć i charakteryzować ból w różnych kontekstach. Ta stosunkowo prosta metoda oceny bólu może być stosowana do wielu różnych modeli stanu zapalnego.

Procedurę zademonstruje Tiana i technik badawczy w moim laboratorium, Madison Mack, która była zaangażowana w tę pracę jako studentka, oraz Akila Sykes. Obecnie studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Zacznij od ustawienia aparatury testowej w celu łatwego dostępu do tylnych łap.

Umieść poszczególne komory na podłodze z siatki. Podłoga z siatki powinna znajdować się na wygodnej wysokości i na solidnej powierzchni. Następnie umieść elektroniczne urządzenie Von Freya na blacie stołu.

Upewnij się, że sonda i są prawidłowo podłączone do wyświetlacza i włącz przyrząd w trybie konfiguracji. Ustaw odczyt na zero i delikatnie umieść dostarczony wzorzec masy na stożku sondy Von Freya. Zapisz odczyt i powtórz tę procedurę ponownie po zakończeniu badania, jeśli występuje rozbieżność między tymi dwiema wartościami, może być konieczna ponowna kalibracja aparatu.

Wybierz końcówkę polipropylenową o rozmiarze odpowiednim do badanej tkanki. Sztywne końcówki dobrze sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwej, twardszej tkanki tylnej łapy. Delikatnie zamontuj końcówkę na stożku sondy.

Następnie przełącz się z trybu konfiguracji na tryb pracy. Spowoduje to wyświetlenie maksymalnego nacisku zastosowanego, gdy sonda jest schowana. Potrzeba dwóch badaczy, aby zmierzyć progi wycofania tylnej łapy.

Jeden, do obsługi aparatury i przeprowadzania pomiarów, a drugi do rejestrowania tych pomiarów w celu zmniejszenia odchylenia. Badacz obsługujący anestezjolog powinien być ślepy na zabiegi, jak również na zarejestrowane wartości progowe wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna rejestrować wszystkie wartości podstawowe i progowe wycofania.

Na 48 godzin przed podaniem rejestrowany jest pierwszy zestaw pomiarów wyjściowych. Umieść materiał chłonny pod stojakiem, aby zebrać wydalane odpady. Po zamontowaniu końcówki i wyzerowaniu sondy, eksperymentator rejestrujący pomiary powinien umieścić myszy w poszczególnych komorach.

Przykryj komory perforowanymi pokrywkami i połóż na nich ciężki przedmiot. Aby zapobiec ucieczce myszy, pozwól myszom zaaklimatyzować się w komorze przez 15 minut przed kontynuowaniem. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej technice, będą miały trudności ze stopniowym stosowaniem zwiększonego nacisku, a dzięki ustaleniu wewnętrznej spójności z własnymi pomiarami, praktyka jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników.

Gdy będziesz gotowy, użyj dwóch rąk, aby powoli podnieść sondę i stymulować opuszkę lewej lub prawej tylnej łapy. Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż do zaobserwowania zachowania nocyceptywnego. Są one identyfikowane przez chowanie tylnej łapy, lizanie tylnej łapy lub skakanie łapą.

Poinstruuj drugiego badacza, aby zarejestrował ciśnienie, które wywołało zaobserwowane zachowanie. Podczas pomiaru warto zachęcić mysz do pozostania w bezruchu, umieszczając podniebienie pokarmowe tuż na zewnątrz komory lub wydając lekki dźwięk, taki jak delikatne stuknięcie przed wykonaniem pomiaru. Kontynuuj do następnej myszy, aż każda z nich zostanie przetestowana raz i powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.

Po zebraniu pięciu wartości linii bazowej uzyskaj średnią dla każdej myszy. Powtórz pomiary podstawowe 24 godziny później i użyj tych wartości do obliczenia kolejnej średniej. Aby upewnić się, że wszystkie myszy mają spójne odpowiedzi wyjściowe, należy wykluczyć zwierzęta, u których średni wyjściowy próg wycofania wynosi poniżej 3,5 grama lub gdy progi wyjściowe różnią się o dwa gramy lub więcej.

Na koniec przypisz myszy do oddzielnych grup leczenia, tak aby średnia wartość wyjściowa odstawienia każdej z nich była jak najbardziej podobna Tutaj mierzono progi wycofania po tylnej łapie, podaniu jadu, ROS raca. Kontrola leczona solą fizjologiczną. Myszy wykazywały niewielkie zmiany w porównaniu z wartością wyjściową przez cały czas.

Testowane punkty odpowiedzi nocyceptywne u leczonych myszy wyraźnie utrzymywały się do sześciu godzin. Ponadto obrzęk tkanek, charakterystyczny dla stanu zapalnego, był widoczny w jadzie, ale nie w tylnych łapach leczonych solą fizjologiczną. Wywołanym jadem zmianom wrażliwości dotykowej towarzyszył prawie 1000-krotny napływ neutrofili

W porównaniu z tylnymi łapami leczonymi solą fizjologiczną w łapach poddanych działaniu soli fizjologicznej, komórki tuczne podeszwy w tkance tylnej łapy były w dużej mierze nienaruszone lub wykazywały łagodną degranulację. Natomiast u krytych łań wykazywała od 15 do 20% umiarkowaną i rozległą degranulację komórek tucznych. Technikę tę można dostosować do oceny wrażliwości mechanicznej lub dotykowej w szerokim zakresie tkanek innych niż tylna łapa.

Dlatego technikę tę można włączyć do wielu różnych modeli zapalenia i bólu u gryzoni.