Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya
19 grudnia 2013
Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar braku reakcji nadwrażliwości na ucisk mechaniczny w tylnej łapie myszy. Osiąga się to poprzez umieszczenie zwierząt na podłodze z drucianej siatki i pozwolenie im na habituację w odpowiednim czasie. Do spodu tylnej łapy przykładana jest końcówka z polipropylenu, a następnie stopniowo zwiększa się nacisk.
Po odnotowaniu odpowiedniej reakcji behawioralnej bodziec jest wycofywany. Po zebraniu wartości bazowych zwierzęta zostają poddane interwencji eksperymentalnej przed kolejnymi testami. Ostatecznie porównuje się zmiany progów wycofania tylnej łapy pomiędzy grupami badawczymi, aby określić wpływ danej terapii na zmiany wrażliwości dotykowej na nacisk.
Ból jest głównym komponentem stanu zapalnego. Ważne jest mierzenie i charakteryzowanie bólu w różnych kontekstach. Tę stosunkowo prostą metodę oceny bólu można zastosować w wielu różnych modelach stanu zapalnego.
Procedurę zademonstrują Tiana, technik badawczy w moim laboratorium, Madison Mack, która uczestniczyła w tych badaniach jako studentka studiów licencjackich, oraz Akila Sykes, obecnie studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Zaczynamy od przygotowania aparatury testowej, aby zapewnić łatwy dostęp do tylnych łap.
Umieść poszczególne komory na siatkowym dnie. Siatkowe dno powinno znajdować się na wygodnej wysokości i spoczywać na stabilnej powierzchni. Następnie ustaw elektroniczny aparat Von Frey na blacie laboratoryjnym.
Upewnij się, że sonda i kabel są prawidłowo podłączone do jednostki wyświetlającej, a następnie włącz urządzenie w trybie konfiguracji. Wyzeruj odczyt i delikatnie umieść dostarczony ciężarek testowy na stożku sondy Von Frey. Zapisz odczyt i powtórz tę procedurę ponownie po zakończeniu testów; w przypadku rozbieżności między obiema wartościami aparat może wymagać ponownej kalibracji.
Wybierz polipropylenowy końcówkę o rozmiarze odpowiednim dla badanej tkanki. Sztywne końcówki sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwej, twardszej tkanki tylnej łapy. Delikatnie zamocuj końcówkę na stożku sondy.
Następnie przełącz z trybu konfiguracji na tryb pracy. Wyświetli to maksymalne przyłożone ciśnienie w momencie wycofania sondy. Do pomiaru progów wycofania tylnej łapy wymagane są dwóch badaczy.
Jedna osoba obsługuje aparat i wykonuje pomiary, a druga zapisuje te pomiary w celu zmniejszenia błędu systematycznego. Badacz obsługujący anestezymetr powinien być zaślepiony względem zastosowanych terapii, jak również zapisanych wartości progu wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna zapisywać wszystkie wartości bazowe oraz wartości progu wycofania.
Na 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia rejestruje się pierwszy zestaw pomiarów bazowych. Pod statywem należy umieścić materiał chłonny w celu zbierania wydalin. Po zamontowaniu końcówki i wyzerowaniu sondy, osoba wykonująca pomiary powinna umieścić myszy w oddzielnych komorach.
Przykryj komory perforowanymi pokrywami i połóż na nich ciężki przedmiot. Aby zapobiec ucieczce myszy, pozwól im na aklimatyzację w komorze przez 15 minut przed kontynuowaniem procedury. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mają trudności z stopniowym zwiększaniem nacisku oraz z zachowaniem wewnętrznej spójności własnych pomiarów, dlatego praktyka jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników.
Po przygotowaniu, używając obu rąk, powoli unieś sondę i stymuluj poduszkę stopy lewej lub prawej tylnej łapy. Stopniowo zwiększaj nacisk, aż do zaobserwowania zachowania nocyceptywnego. Objawia się ono cofnięciem tylnej łapy, lizaniem tylnej łapy lub podskakiwaniem łapą.
Poproś drugiego badacza o zapisanie wartości ciśnienia, które wywołało zaobserwowane zachowanie. Podczas pomiaru warto zachęcić mysz do pozostania w bezruchu, umieszczając pokarm tuż poza komorą lub wydając lekki dźwięk, np. delikatnie stukając przed wykonaniem pomiaru. Przejdź do kolejnej myszy, aż każda zostanie przebadana raz, a następnie powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.
Po zebraniu pięciu wartości bazowych oblicz średnią dla każdej myszy. Powtórz pomiary bazowe po 24 godzinach i wykorzystaj te wartości do obliczenia kolejnej średniej. Aby upewnić się, że wszystkie myszy wykazują spójne reakcje bazowe, wyklucz zwierzęta, u których średni bazowy próg wycofania jest niższy niż 3,5 grams lub u których progi bazowe różnią się o dwa grams lub więcej.
Na koniec przydziel myszy do oddzielnych grup badawczych w taki sposób, aby średni poziom bazowy progu wycofania w każdej z nich był możliwie zbliżony. W tym przypadku progi wycofania mierzono po podaniu jadu do tylnej łapy, ROS raca. Myszy z grupy kontrolnej traktowane solą fizjologiczną wykazały niewielkie zmiany w porównaniu z poziomem bazowym we wszystkich punktach czasowych.
Badania wykazały, że odpowiedzi nocyceptywne u myszy poddanych leczeniu utrzymywały się wyraźnie do sześciu godzin. Ponadto obrzęk tkanki, charakterystyczny dla stanu zapalnego, był widoczny w tylnych łapach traktowanych jadem, ale nie w tych traktowanych solą fizjologiczną. Zmiany w wrażliwości dotykowej wywołane przez jad współistniały z niemal 1000-krotnym napływem neutrofili.
W porównaniu do tylnych łap traktowanych solą fizjologiczną, komórki tuczne w tkance podeszwy łapy były w dużej mierze nienaruszone lub wykazywały łagodną degranulację. W przeciwieństwie do nich, w tylnych łapach zwierząt kopulowanych stwierdzono umiarkowaną i rozległą degranulację komórek tucznych u 15 do 20% badanych. Technikę tę można dostosować do oceny wrażliwości mechanicznej lub dotykowej w szerokim zakresie tkanek innych niż tylna łapa.
W związku z tym technikę tę można zastosować w wielu różnych modelach zapalenia i bólu u gryzoni.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę pomiaru odpowiedzi nocycepcyjnych na nacisk mechaniczny w tylnej łapie myszy z wykorzystaniem elektronicznych pomiarów von Freya. Technika ta umożliwia szybką i precyzyjną ocenę zmian w progach wycofywania mechanicznego przed i po interwencjach zapalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ocena behawioralna
- Modele stanu zapalnego
Wstęp
- Pomiar bólu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia stanu zapalnego.
- Elektroniczny aparat von Frey oferuje liczne zalety w porównaniu z metodami klasycznymi.
- Precyzyjny pomiar progów wycofania jest niezbędny dla zapewnienia powtarzalności wyników.
- Metoda ta może zostać dostosowana do różnych modeli gryzoni.
Cel badania
- Ocena wrażliwości mechanicznej w odpowiedzi na bodźce uciskowe.
- Ocena wpływu zastosowanych terapii na zachowania nocyceptywne.
- Opracowanie wiarygodnej metody oceny bólu w badaniach.
Zastosowane metody
- Habituacja myszy na siatkowanej podłodze.
- Stopniowe przykładanie nacisku przy użyciu końcówki z polipropylenu.
- Rejestracja progów wycofania przez dwóch badaczy pracujących w ślepej próbie.
- Porównanie pomiarów wyjściowych i pomiarów po zastosowaniu leczenia.
Główne wyniki
- Po zastosowaniu leczenia zaobserwowano istotne zmiany w progach wycofywania.
- Stan zapalny charakteryzował się obrzękiem tkanek oraz napływem neutrofili.
- Degranulacja komórek tucznych różniła się pomiędzy grupami badawczymi.
- Metoda ta wykazała możliwość zastosowania w odniesieniu do różnych tkanek.
Wnioski
- Elektroniczna metoda von Frey jest skuteczna w ocenie bólu u gryzoni.
- Technika ta może pogłębić zrozumienie mechanizmów bólu zapalnego.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań nad bólem i skutecznością leczenia.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena zmian czułości dotykowej w modelach gryzoni dostarcza kluczowych danych we wczesnej fazie badań, niezbędnych do walidacji celów przeciwbólowych oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesie opracowywania leków terapeutycznych w leczeniu bólu. Metoda elektronicznego von Freya umożliwia szybki, ilościowy pomiar progów wycofania mechanicznego, co wspiera powtarzalną przedkliniczną ewaluację modeli bólu zapalnego i neuropatycznego. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel i skuteczności leczenia przed wprowadzeniem związków do badań w późniejszych etapach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych ze szlakami nocyceptywnymi i mechanizmami modulacji bólu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczanie mierzalnych, kontrolowanych wewnętrznie odczytów czułości dotykowej w grupach badawczych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfelu badań poprzez obiektywne porównanie bazowych i pointerwencyjnych progów wycofania w celu oceny modulacji celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie standaryzowanych pomiarów bazowych czułości dotykowej.
- Powtarzalność: Umożliwia spójne i powtarzalne pomiary w krótkich odstępach czasu, co wspiera standaryzację analizy oraz porównywalność między grupami.
- Skalowalność: Pozwala na wykonanie wielu pomiarów u jednego osobnika, zwiększając przepustowość i wiarygodność kampanii przesiewowych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje indukowaną stanem zapalnym allodynię mechaniczną, co odpowiada klinicznym fenotypom bólu w stanach zapalnych i neuropatycznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkryć z procesami przedklinicznymi, dostarczając mierzalnych wyników nadwrażliwości bólowej o istotnym znaczeniu mechanistycznym.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o powtarzalne zmiany progów wycofania po interwencjach eksperymentalnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Elektroniczna metoda von Frey wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, szczególnie w przypadku związków modulujących ból.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar odpowiedzi nocyceptywnych na nacisk mechaniczny jako funkcjonalny odczyt zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych wyników ilościowych, niezbędnych do wiarygodnej oceny związków w modelach bólu.
- Analityka: Zapewnia precyzyjne pomiary progu wycofania oraz porównywalność statystyczną między warunkami bazowymi a warunkami po zastosowaniu leku.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną poprzez wyniki wrażliwości mechanicznej istotne dla choroby w modelach zapalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma w wielu modelach bólu zapalnego i neuropatycznego, ograniczając konieczność redundantnego opracowywania testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji szlaków bólowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne pomiary czułości dotykowej przy minimalnej zmienności technicznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go, zwiększając efektywność kapitałową i zmniejszając odsetek niepowodzeń w późnych fazach z powodu braku skuteczności zapośredniczonej przez cel.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków w oparciu o ryzyko, bazując na mierzalnych efektach wpływających na progi wycofania mechanicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga przeszkolenia w zakresie obserwacji behawioralnych i identyfikacji reakcji nocyceptywnych w celu zapewnienia spójności pomiarów.
- Zależne od skalibrowanego elektronicznego aparatu von Frey oraz odpowiedniego doboru końcówek polipropylenowych dla tkanek tylnej łapy.
- Konieczne jest zaślepienie operatorów i osób rejestrujących dane w odniesieniu do warunków traktowania, aby zminimalizować błąd w zapisie progów reagowania.
- Obejmuje kryteria wykluczenia oparte na zmienności progu bazowego w celu zapewnienia homogeniczności grup i integralności danych.
- Ograniczone do mierzalnych reakcji behawioralnych; wymaga jasnych punktów końcowych nocycepcji, takich jak cofnięcie łapy, lizanie lub skakanie.
