Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya
19 grudnia 2013
Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.
Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie braku reakcji suceptywnych na nacisk mechaniczny w tylnej łapie myszy. Osiąga się to, umieszczając najpierw zwierzęta na podłodze z siatki drucianej i pozwalając im się przyzwyczaić, gdy będą gotowe. Polipropylenową końcówkę nakłada się na spód tylnej łapy, a nacisk jest stopniowo zwiększany.
Po odnotowaniu odpowiedniej reakcji behawioralnej bodziec zostaje wycofany. Po zebraniu wartości wyjściowych zwierzęta są poddawane interwencji doświadczalnej przed dalszymi badaniami. Ostatecznie zmiany w progach wycofania tylnej łapy są porównywane w różnych grupach leczenia w celu określenia wpływu konkretnego leczenia na zmiany wrażliwości dotykowej na nacisk.
Ból jest głównym składnikiem stanu zapalnego. Ważne jest, aby mierzyć i charakteryzować ból w różnych kontekstach. Ta stosunkowo prosta metoda oceny bólu może być stosowana do wielu różnych modeli stanu zapalnego.
Procedurę zademonstruje Tiana i technik badawczy w moim laboratorium, Madison Mack, która była zaangażowana w tę pracę jako studentka, oraz Akila Sykes. Obecnie studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Zacznij od ustawienia aparatury testowej w celu łatwego dostępu do tylnych łap.
Umieść poszczególne komory na podłodze z siatki. Podłoga z siatki powinna znajdować się na wygodnej wysokości i na solidnej powierzchni. Następnie umieść elektroniczne urządzenie Von Freya na blacie stołu.
Upewnij się, że sonda i są prawidłowo podłączone do wyświetlacza i włącz przyrząd w trybie konfiguracji. Ustaw odczyt na zero i delikatnie umieść dostarczony wzorzec masy na stożku sondy Von Freya. Zapisz odczyt i powtórz tę procedurę ponownie po zakończeniu badania, jeśli występuje rozbieżność między tymi dwiema wartościami, może być konieczna ponowna kalibracja aparatu.
Wybierz końcówkę polipropylenową o rozmiarze odpowiednim do badanej tkanki. Sztywne końcówki dobrze sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwej, twardszej tkanki tylnej łapy. Delikatnie zamontuj końcówkę na stożku sondy.
Następnie przełącz się z trybu konfiguracji na tryb pracy. Spowoduje to wyświetlenie maksymalnego nacisku zastosowanego, gdy sonda jest schowana. Potrzeba dwóch badaczy, aby zmierzyć progi wycofania tylnej łapy.
Jeden, do obsługi aparatury i przeprowadzania pomiarów, a drugi do rejestrowania tych pomiarów w celu zmniejszenia odchylenia. Badacz obsługujący anestezjolog powinien być ślepy na zabiegi, jak również na zarejestrowane wartości progowe wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna rejestrować wszystkie wartości podstawowe i progowe wycofania.
Na 48 godzin przed podaniem rejestrowany jest pierwszy zestaw pomiarów wyjściowych. Umieść materiał chłonny pod stojakiem, aby zebrać wydalane odpady. Po zamontowaniu końcówki i wyzerowaniu sondy, eksperymentator rejestrujący pomiary powinien umieścić myszy w poszczególnych komorach.
Przykryj komory perforowanymi pokrywkami i połóż na nich ciężki przedmiot. Aby zapobiec ucieczce myszy, pozwól myszom zaaklimatyzować się w komorze przez 15 minut przed kontynuowaniem. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej technice, będą miały trudności ze stopniowym stosowaniem zwiększonego nacisku, a dzięki ustaleniu wewnętrznej spójności z własnymi pomiarami, praktyka jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników.
Gdy będziesz gotowy, użyj dwóch rąk, aby powoli podnieść sondę i stymulować opuszkę lewej lub prawej tylnej łapy. Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż do zaobserwowania zachowania nocyceptywnego. Są one identyfikowane przez chowanie tylnej łapy, lizanie tylnej łapy lub skakanie łapą.
Poinstruuj drugiego badacza, aby zarejestrował ciśnienie, które wywołało zaobserwowane zachowanie. Podczas pomiaru warto zachęcić mysz do pozostania w bezruchu, umieszczając podniebienie pokarmowe tuż na zewnątrz komory lub wydając lekki dźwięk, taki jak delikatne stuknięcie przed wykonaniem pomiaru. Kontynuuj do następnej myszy, aż każda z nich zostanie przetestowana raz i powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.
Po zebraniu pięciu wartości linii bazowej uzyskaj średnią dla każdej myszy. Powtórz pomiary podstawowe 24 godziny później i użyj tych wartości do obliczenia kolejnej średniej. Aby upewnić się, że wszystkie myszy mają spójne odpowiedzi wyjściowe, należy wykluczyć zwierzęta, u których średni wyjściowy próg wycofania wynosi poniżej 3,5 grama lub gdy progi wyjściowe różnią się o dwa gramy lub więcej.
Na koniec przypisz myszy do oddzielnych grup leczenia, tak aby średnia wartość wyjściowa odstawienia każdej z nich była jak najbardziej podobna Tutaj mierzono progi wycofania po tylnej łapie, podaniu jadu, ROS raca. Kontrola leczona solą fizjologiczną. Myszy wykazywały niewielkie zmiany w porównaniu z wartością wyjściową przez cały czas.
Testowane punkty odpowiedzi nocyceptywne u leczonych myszy wyraźnie utrzymywały się do sześciu godzin. Ponadto obrzęk tkanek, charakterystyczny dla stanu zapalnego, był widoczny w jadzie, ale nie w tylnych łapach leczonych solą fizjologiczną. Wywołanym jadem zmianom wrażliwości dotykowej towarzyszył prawie 1000-krotny napływ neutrofili
.W porównaniu z tylnymi łapami leczonymi solą fizjologiczną w łapach poddanych działaniu soli fizjologicznej, komórki tuczne podeszwy w tkance tylnej łapy były w dużej mierze nienaruszone lub wykazywały łagodną degranulację. Natomiast u krytych łań wykazywała od 15 do 20% umiarkowaną i rozległą degranulację komórek tucznych. Technikę tę można dostosować do oceny wrażliwości mechanicznej lub dotykowej w szerokim zakresie tkanek innych niż tylna łapa.
Dlatego technikę tę można włączyć do wielu różnych modeli zapalenia i bólu u gryzoni.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę pomiaru reakcji nocyceptywnych na mechaniczne ciśnienie w tylnej łapce myszy za pomocą elektronicznych pomiarów von Frey. Ta technika pozwala na szybkie i precyzyjne ocena zmian w progach wycofania mechanicznego przed i po interwencjach zapalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Ocena zachowania
- Modele zapalne
Tło
- Pomiar bólu jest kluczowy dla zrozumienia zapalenia.
- Elektroniczny aparat von Frey oferuje zalety w porównaniu z klasycznymi metodami.
- Dokładne pomiary progów wycofania są niezbędne dla reprodykowalności.
- Ta metoda może być dostosowana do różnych modeli gryzoni.
Cel badania
- Ocenić mechaniczną wrażliwość w odpowiedzi na bodźce ciśnieniowe.
- Ocenić wpływ terapii na zachowanie nocyceptywne.
- Ustalić niezawodną metodę oceny bólu w badaniach.
Stosowane metody
- Przyzwyczajanie myszy do podłogi z siatki drucianej.
- Stopniowe stosowanie ciśnienia za pomocą końcówki z polipropylenu.
- Rejestrowanie progów wycofania przez dwóch zlekceważonych badaczy.
- Porównanie pomiarów w linii bazowej i po leczeniu.
Główne wyniki
- Znaczne zmiany w progach wycofania obserwowano po leczeniu.
- Zapalenie charakteryzowało się obrzękiem tkankowym i napływem neutrofili.
- Degranulacja komórek tucznych różniła się między grupami leczonymi.
- Metoda wykazała się przystosowaniem do różnych tkanek.
Wnioski
- Elektroniczna metoda von Frey jest skuteczna w ocenie bólu u gryzoni.
- Ta technika może poprawić zrozumienie mechanizmów bólu zapalnego.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań nad bolem i skutecznością leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Assessing tactile sensitivity changes in rodent models provides critical early-phase data for analgesic target validation and mechanistic de-risking in pain therapeutics development. The electronic von Frey method enables rapid, quantitative measurement of mechanical withdrawal thresholds, supporting reproducible preclinical evaluation of inflammatory and neuropathic pain models. This approach enhances predictive confidence in target engagement and treatment efficacy before advancing compounds into later-stage studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to nociceptive pathways and pain modulation mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing quantifiable, internally controlled tactile sensitivity readouts across treatment groups.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage through objective comparison of baseline and post-intervention withdrawal thresholds to assess target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized baseline tactile sensitivity measurements.
- Reproducibility: Enables consistent, repeated measurements within short time periods, supporting assay standardization and cross-group comparability.
- Scalability: Allows multiple measurements per subject, increasing throughput and reliability for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models inflammation-induced mechanical allodynia, aligning with clinical pain phenotypes in inflammatory and neuropathic conditions.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing mechanistically relevant, quantifiable pain sensitivity outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on reproducible changes in withdrawal thresholds following experimental interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The electronic von Frey method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for pain-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring nociceptive responses to mechanical pressure as a functional readout of target engagement.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs essential for reliable compound evaluation in pain models.
- Analytics: Provides precise withdrawal threshold measurements and statistical comparability across baseline and treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through disease-relevant mechanical sensitivity outcomes in inflammation models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across multiple inflammatory and neuropathic pain models, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pain pathway modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible tactile sensitivity measurements with minimal technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhancing capital efficiency and reducing late-stage attrition due to lack of target-mediated efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on quantifiable effects on mechanical withdrawal thresholds.
Implementation Considerations
- Requires training in behavioral observation and nociceptive response identification to ensure measurement consistency.
- Dependent on calibrated electronic von Frey apparatus and appropriate polypropylene tip selection for hind paw tissue.
- Necessitates blinding of operators and recorders to treatment conditions to minimize bias in threshold recording.
- Involves exclusion criteria based on baseline threshold variability to ensure group homogeneity and data integrity.
- Limited to measurable behavioral responses; requires clear nociceptive endpoints such as paw withdrawal, licking, or jumping.
