Name: Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę progów wycofania w modelach zapalenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R15 NS067536-01A1 (do DC) i Macalester College Wallace Research Fund (do DC) wspierały te badania. Biblioteka Macalester College wsparła publikację tego artykułu w otwartym dostępie. Ponadto dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium Chatterjea za ich wsparcie.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Macalester College's zatwierdził wszystkie protokoły. Do tych eksperymentów użyto 8-12 tygodniowych samców szwajcarskich myszy ND4.
1. Preparat i wstrzyknięcie jadu Bothrops jararaca
<ol>
	<li>UWAGA: Jad B. jararaca jest toksyczny. Nosić rękawice, maskę i okulary ochronne podczas obchodzenia się z proszkiem i przygotowywania roztworów.</li>
	<li>Podawać 45 μg/kg jadu B. jararaca (schemat określony na podstawie wcześniejszych doświadczeń dawka-odpowiedź) lub 0,9% nośnika soli fizjologicznej (10 μl) przez wstrzyknięcie dopodeszwowe do obu tylnych łap za pomocą strzykawek insulinowych 3/10 ml z igłami 29 G x 1/2. Uwaga: W zależności od projektu eksperymentalnego, roztwory lecznicze i kontrolne mogą być wstrzykiwane oddzielnie odpowiednio do każdej tylnej łapy, aby zapewnić wewnętrzną kontrolę u każdego pacjenta.</li>
</ol>
2. Konfiguracja i obsługa elektronicznego aparatu von Freya
<ol>
	<li>Umieść elektroniczną jednostkę von Freya na stojaku sondy. Upewnij się, że sonda i są prawidłowo podłączone do wyświetlacza i włącz instrument. Ustaw odczyt na zero (0.00 g) w trybie konfiguracji i delikatnie umieść dostarczony wzorzec masy (5.00 g) na stożku sondy von Freya.</li>
	<li>Zapisz odczyt w notatniku laboratoryjnym i powtórz tę procedurę po zakończeniu sesji testowej. Jeśli występuje rozbieżność większa niż 0,20 g między odczytami wzorca masy przed i po sesji testowej lub jeśli odczyt zmienia się po nałożeniu wzorca masy, może być konieczna ponowna kalibracja przyrządu (przez producenta).</li>
	<li>Aby ocenić próg wycofania tylnej łapy myszy, należy użyć odpowiedniej końcówki polipropylenowej spośród dostarczonych z sondą. Wybór końcówki zależy od badanej tkanki. Sztywne końcówki dobrze sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwych, twardszych tkanek tylnej łapy, podczas gdy półelastyczne końcówki mogą być lepszym wyborem dla bardziej wrażliwego obszaru, takiego jak grzbiet odbytu i narządów płciowych (Chatterjea, niepublikowane). Delikatnie zamontuj sztywną końcówkę na stożku sondy.</li>
	<li>Aby zarejestrować maksymalne zastosowane ciśnienie, przełącz tryb pracy z konfiguracji na pracę tak, aby maksymalne zastosowane ciśnienie zostało zarejestrowane na wyświetlaczu. W tym trybie odczyt maksymalnego zastosowanego ciśnienia zostanie zapisany na ekranie wyświetlacza po wsunięciu sondy.</li>
</ol>
3. Ogólne uwagi dotyczące oceny progu wycofania tylnej łapy
<ol>
	<li>Idealnie byłoby, gdyby do pomiaru progu wycofania tylnej łapy (czułości mechanicznej) za pomocą aparatu EvF potrzebnych było dwóch badaczy - jeden do obsługi aparatury i wykonywania pomiarów, a drugi do transkrypcji zarejestrowanych pomiarów i obchodzenia się z myszami.</li>
	<li>W celu zmniejszenia błędu systematycznego, badacz obsługujący aparaturę powinien być ślepy na leczenie i zarejestrowane wartości progowe wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna ocenić wszystkie podstawowe i eksperymentalne progi wycofania.</li>
	<li>Wszystkie pomiary wykonuj w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i o tej samej porzednia 14.</li>
	<li>Eksperymentator rejestrujący pomiary powinien umieścić każdą mysz w indywidualnych komorach wielojednostkowej obudowy z polimetakrylanu metylu (PMMA) ustawionej na siatkowym stojaku podłogowym. Przykryj komory perforowanymi pokrywami z PMMA, a na wierzchu połóż ciężki przedmiot, aby zapobiec ucieczce myszy. Umieść materiał chłonny pod stojakiem, aby wchłonąć/zebrać wydalane odpady. Pozwolić myszom zaaklimatyzować się przez 15 minut w komorach przed oceną wyjściową lub eksperymentalną oceną progu wycofania 6,7,10.</li>
	<li>Tylne łapy myszy muszą być łatwo dostępne przez otwory w siatkowej podłodze, dlatego należy umieścić siatkowy stojak podłogowy na wygodnej wysokości na wózku z hamulcami lub na stabilnym blacie, który jest dostępny ze wszystkich stron.</li>
	<li>Podczas pomiarów myszy mogą wymagać odwrócenia uwagi za pomocą granulki żywności15 umieszczonej tuż na zewnątrz komory pomiarowej lub bardzo niewielkiego hałasu wytwarzanego przez stukanie lub przesuwanie długopisem po siatce drucianej podłogi komory przed, ale nie w trakcie pomiaru. To skłania mysz do pozostawania w bezruchu, umożliwiając eksperymentatorowi łatwiejsze rozpoczęcie wykonywania pomiarów.</li>
</ol>
4. Podstawowa ocena progu wycofania tylnej łapy
<ol>
	<li>Pierwszy zestaw pomiarów wyjściowych należy wykonać 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia. Wyzeruj sondę po zamontowaniu sztywnej końcówki. Używając dwóch rąk, powoli podnieś sondę, aby stymulować środek (obszar opuszki stopy) lewej lub prawej tylnej łapy (jeśli obie łapy otrzymały takie samo leczenie).</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż zaobserwuje się zdefiniowane zachowania reakcji nocyceptywnej, takie jak cofanie tylnej łapy, lizanie tylnej łapy lub skakanie na czterech łapach6,10. Poinstruuj drugiego badacza, aby dokonał transkrypcji nacisku, który wywołał zaobserwowane zachowanie.</li>
	<li>Zmierz próg wycofania myszy znajdującej się w sąsiedniej komorze. Kontynuuj, aż raz ocenisz progi wycofania każdej myszy. Powtórz kolejne cztery razy, tak aby każda mysz była mierzona 5 razy, jak opisanowcześniej 10.</li>
	<li>Dla każdej myszy oblicz wartość mediany 5 pomiarów, a następnie oblicz, jak bardzo każda wartość odbiega od mediany. Wybierz 3 wartości, które najmniej się różnią, i uśrednij je, aby uzyskać podstawowy próg wycofania, jak opisano wcześniej10. W tej demonstracji pomiar został ustandaryzowany przy użyciu 3 z 5 wartości; Chociaż konkretna liczba pomiarów może się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie myszy są szturchnięte taką samą liczbę razy w celu oceny linii wyjściowych.</li>
	<li>Powtórz pomiary podstawowe 24 godziny później. Wykonaj 5 pomiarów na mysz i uśrednij 3, które są najbliższe medianie, aby uzyskać wyjściowy próg wycofania.</li>
	<li>Aby obliczyć średni wyjściowy próg wycofania myszy, należy uśrednić jej wyjściowe progi wycofania przyjęte po 48 i 24 godzinach przed leczeniem. Jeśli średni wyjściowy próg wycofania jest niższy niż 3,50 g lub jeśli dwa podstawowe progi różnią się o 2,00 g lub więcej, należy wykluczyć mysz z eksperymentu. Kryteria te zapewniają, że wszystkie myszy w eksperymencie mają spójne odpowiedzi wyjściowe i wystarczająco wysokie wyjściowe progi wycofania, które pozwalają na zaobserwowanie niższych progów po leczeniu.</li>
	<li>Uwaga: Próg wykluczenia będzie zależał od badanej tkanki, szczepu badanych zwierząt i rodzaju użytej końcówki. Na przykład odkryliśmy, że 3,5 g jest użytecznym punktem odniesienia dla tkanki tylnej łapy ND4, ale bardziej wrażliwe obszary, takie jak grzbiet odbytu i narządów płciowych, wymagają niższego progu wykluczenia (Chatterjea, niepublikowane).</li>
	<li>Przypisz myszy do grup leczonych tak, aby średnia wartość wyjściowa odstawienia grup eksperymentalnych była jak najbardziej podobna przed podaniem leczenia.</li>
</ol>
Uwaga: Pomiary bazowe mogą być wykonane przed upływem 48 godzin przed eksperymentem. Należy jednak wykonać co najmniej 2 zestawy pomiarów wyjściowych w regularnych odstępach czasu przed rozpoczęciem leczenia.
5. Eksperymentalna ocena progu wycofania tylnej łapy
<ol>
	<li>Oceń próg wycofania tylnej łapy (wrażliwość mechaniczną) po leczeniu w odpowiednich punktach czasowych określonych przez projekt eksperymentu. Wróć myszy do ich klatek z dostępem do jedzenia i wody natychmiast po zakończeniu pomiarów.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami opisanymi powyżej; wykonaj 3 zamiast 5 pomiarów, aby zmniejszyć możliwość nadmiernej stymulacji (leczonej) tkanki tylnej łapy, zwłaszcza jeśli wrażliwość ma być oceniana w wielu punktach czasowych. Jeśli dowolne dwa z trzech wykonanych pomiarów różnią się o więcej niż 2,00 g, wykonaj czwarty pomiar.</li>
	<li>Oblicz średnią z 3 pomiarów, aby uzyskać eksperymentalny próg wycofania dla każdej myszy. Dla dowolnych myszy, dla których wykonano 4 pomiary, należy obliczyć średnią z trzech, które najmniej odbiegają od mediany, w celu uzyskania eksperymentalnego progu wycofania.</li>
	<li>Aby uzyskać próg wycofania delta dla każdej myszy w określonym punkcie czasowym, odejmij linię bazową od eksperymentalnego progu wycofania. Powtórz dla wszystkich myszy i wszystkich eksperymentalnych punktów czasowych9.</li>
	<li>Wykonaj odpowiednią analizę statystyczną na zebranych danych. W tym przypadku użyliśmy JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) do przeprowadzenia jednokierunkowej analizy ANOVA i Tukey HSD post hoc.</li>
</ol>

<ol><li>Meetoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diseases%3A+the+silent+global+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nurs%22%5BJournal%5D)">Chronic diseases: the silent global epidemic.</a> Br J Nurs. (21), 17-21 (2008).</li>
<li>Goldberg, D. S., McGee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+as+a+global+public+health+priority%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pain as a global public health priority.</a> BMC Public Health. 11, 770 (2011).</li>
<li>Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+this+thing+called+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">What is this thing called pain.</a> J. Clin. Invest. 120 (11), 3742-3744 (2010).</li>
<li>Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol. Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Ren, K., Dubner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+immune+and+nervous+systems+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interactions between the immune and nervous systems in pain.</a> Nat. Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).</li>
<li>Cunha, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electronic+pressure-meter+nociception+paw+test+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">An electronic pressure-meter nociception paw test for mice.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 37 (3), 401-407 (2004).</li>
<li>Rudick, C. N., Bryce, P. J., Guichelaar, L. A., Berry, R. E., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cell-Derived+Histamine+Mediates+Cystitis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mast Cell-Derived Histamine Mediates Cystitis Pain.</a> PLoS ONE. 3, (2008).</li>
<li>Farmer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+vulvovaginal+fungal+infections+cause+persistent+pain+in+a+mouse+model+of+vulvodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Repeated vulvovaginal fungal infections cause persistent pain in a mouse model of vulvodynia.</a> Sci. Transl. Med. 3 (101), (2011).</li>
<li>Parada, C. A., Tambeli, C. H., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+role+of+peripheral+release+of+histamine+and+5-hydroxytryptamine+in+formalin-induced+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major role of peripheral release of histamine and 5-hydroxytryptamine in formalin-induced nociception.</a> Neuroscience. 102 (4), 937-944 (2001).</li>
<li>Chatterjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+degranulation+mediates+compound+48%2F80-induced+hyperalgesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mast cell degranulation mediates compound 48/80-induced hyperalgesia in mice.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 425, 237-243 (2012).</li>
<li>Oliveira, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mast+cells+in+a+mouse+model+of+postoperative+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Involvement of mast cells in a mouse model of postoperative pain.</a> Eur. J. Pharmacol. 672 (1-3), 88-95 (2011).</li>
<li>Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+constriction+of+the+sciatic+nerve+and+pain+hypersensitivity+testing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats.</a> J. Vis. Exp. (61), (2012).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J. Neurosci. Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Akunne, H. C., Soliman, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulation+of+pain+responsiveness+in+the+aged+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulation of pain responsiveness in the aged rat.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 48 (2), 411-416 (1994).</li>
<li>Detloff, M. R., Fisher, L. C., Deibert, R. J., Basso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+tactile+sensory+testing+after+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic tactile sensory testing after spinal cord injury in rats.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Cunha, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+neutrophils+in+the+development+of+mechanical+inflammatory+hypernociception%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crucial role of neutrophils in the development of mechanical inflammatory hypernociception.</a> J Leukoc. Biol. 83 (4), 824-832 (2008).</li>
<li>Lavich, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+infiltration+is+implicated+in+the+sustained+thermal+hyperalgesic+response+evoked+by+allergen+provocation+in+actively+sensitized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Neutrophil infiltration is implicated in the sustained thermal hyperalgesic response evoked by allergen provocation in actively sensitized rats.</a> Pain. (1-2), 125-121 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%26%2334%3Btunable%26%2334%3B+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as &#34;tunable&#34; effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+degranulation+activates+a+pain+pathway+underlying+migraine+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache.</a> Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).</li>
<li>Bonavita, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+and+snake+venom+metalloproteinases+to+the+hyperalgesia+induced+by+Bothrops+jararaca+venom+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells and snake venom metalloproteinases to the hyperalgesia induced by Bothrops jararaca venom in rats.</a> Toxicon. 147 (8), 885-893 (2006).</li>
<li>Zychar, B. C., Dale, C. S., Demarchi, D. S., Gonçalves, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+metalloproteases%2C+serine+proteases+and+phospholipases+A2+to+the+inflammatory+reaction+induced+by+Bothrops+jararaca+crude+venom+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Contribution of metalloproteases, serine proteases and phospholipases A2 to the inflammatory reaction induced by Bothrops jararaca crude venom in mice.</a> Toxicon. 55 (2-3), 227-234 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Pomiar zmian w reakcjach odstawienia jest ważnym narzędziem wykorzystywanym do oceny zmian wrażliwości dotykowej w modelach bólu i stanu zapalnego gryzoni. Tutaj pokazujemy użyteczność elektronicznego aparatu von Freya do przeprowadzenia tej oceny. Technika ta ma kilka zalet: i) możemy szybko ocenić reakcje odstawienia na zastosowany nacisk dla wielu myszy w wielu punktach czasowych, które są dość blisko siebie, ii) możemy użyć jednej końcówki do zastosowania ciągłego i specyficznego nacisku na mały obszar tkanki, iii) możemy dokładnie zmierzyć dokładny nacisk zastosowany w celu uzyskania reakcji odstawienia, oraz iv) możemy łatwo wdrożyć solidne punkty odcięcia, kryteria wykluczenia i kontrole wewnętrzne, aby zapewnić, że oceny zachowań są tak precyzyjne i obiektywne, jak to tylko możliwe.
Kluczowymi krokami zapewniającymi najlepsze wyniki testu EvF są wcześniejsza kalibracja przyrządu i spójne praktyki pomiarowe. Jak wyszczególniono w sekcji protokołu, z przyrządem należy obchodzić się ostrożnie, a przed i w trakcie użytkowania należy zapewnić odpowiednią kalibrację. Przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów należy potwierdzić odczyty wzorca masy testowej, aby zapewnić optymalne działanie maszyny. Jeśli odczyty ulegają znacznym wahaniom lub jeśli odczyty wzorca masy nie są dokładne, należy niezwłocznie skontaktować się z producentem w celu kalibracji urządzenia. Mając to na uwadze, zaleca się, jeśli to możliwe, posiadanie zapasowego elektronicznego aparatu von Freya, aby nie narażać na szwank eksperymentów wrażliwych na czas z powodu nieoczekiwanej potrzeby kalibracji instrumentu. Co więcej, pojedynczy, dobrze wyszkolony badacz powinien wykonać wszystkie pomiary podstawowe i eksperymentalne dla danego badania lub serii eksperymentów, pozostając ślepym na grupy leczone. Myszy powinny być oceniane w cichym pomieszczeniu, utrzymywane w stałej temperaturze, aklimatyzowane w komorach EvF przez co najmniej 15 minut, ale nie krępowane w komorze dłużej niż to konieczne (zwłaszcza jeśli wykonuje się wiele pomiarów w ciągu jednego dnia), aby zminimalizować zmiany w zachowaniu wywołane stresem i dyskomfortem.
Pomiary EvF oferują znaczące ulepszenia w stosunku do istniejących technik CvF. Badacze mogą stosować ciągły nacisk i nie muszą przełączać się między końcówkami o różnej wadze, jak ma to miejsce w eksperymentach z filamentami CvF6. Prowadzi to do mniejszej liczby ukłuć tkanki, co jest szczególnie istotne w przypadku tkanki objętej stanem zapalnym lub uszkodzonej. Dokładne ciśnienie, przy którym następuje wycofanie, może być zmierzone w porównaniu z pomiarami 50% wycofania, które są również ograniczone dostępnymi masami filamentów używanymi w pomiarach CvF13. Ponieważ można wdrożyć racjonalne i jednolite kryteria wykluczenia (jak omówiono powyżej), myszy można przypisać do grup eksperymentalnych w taki sposób, aby wszystkie grupy miały podobne średnie wartości wyjściowe na początku eksperymentu. Pomiary EvF oceniają zmiany w reakcji behawioralnej na dany bodziec, a nie same reakcje bezwzględne. W związku z tym zmiana odpowiedzi nocyceptywnej każdej myszy jest mierzona jako różnica między jej indywidualnym wycofaniem eksperymentalnym a wyjściowym, zapewniając w ten sposób wewnętrzną kontrolę dla każdego wykonanego pomiaru.
Być może najbardziej znaczącym ograniczeniem EvF jest to, że podobnie jak w przypadku jego ręcznego odpowiednika, ten sam badacz musi wykonać wszystkie pomiary dla określonej serii pomiarów podstawowych i eksperymentalnych. To sprawia, że skalowanie techniki jest wyzwaniem z punktu widzenia czasu, personelu i sprzętu. Okazuje się, że ~20 myszy na raz (w zależności od konfiguracji komór testowych) można zmierzyć w ciągu 30-45 minut lub mniej w wielu punktach czasowych, pod warunkiem, że między pomiarami jest co najmniej 45 minut. Pokrewną kwestią w tym względzie jest krzywa uczenia się poszczególnych eksperymentatorów. Wewnętrzna spójność musi zostać ustalona, zanim pojedynczy badacz będzie mógł rozpocząć eksperyment na pełną skalę, a to wymaga wielu godzin poświęconej praktyki, obejmującej powtarzające się pomiary odpowiedzi wyjściowej, aż do osiągnięcia pożądanej spójności. Ponadto użycie wartości odcięcia linii bazowej oznacza, że nie wszystkie myszy z bazą do eksperymentu mogą zostać uwzględnione; Okazuje się, że 25-30% myszy z wartością bazową na eksperyment jest zwykle wykluczonych.
Jeśli chodzi o modyfikacje i przyszłe zastosowania, pomiary behawioralne EvF dodają potężny wymiar do szerokiej gamy modeli stanu zapalnego w celu analizy współistniejącego ostrego i/lub przewlekłego bólu, który może leżeć u podstaw patologii zapalnych. W przypadku jadu stwierdziliśmy, że wyraźne, szybkie zmiany wrażliwości dotykowej towarzyszyły oczekiwanym wynikom obrzęku tkanek, rekrutacji leukocytów i degranulacji komórek tucznych w tylnych łapach samców myszy ND4. Odkrycia te potwierdzają wcześniejsze obserwacje dotyczące udziału mediatorów komórek tucznych we wrażliwości termicznej u szczurów20 i wrażliwości mechanicznej indukowanej przez jad B. jararaca u szwajcarskich myszy ND4 mierzonych za pomocą CvF21. Protokół EvF można łatwo zmodyfikować do stosowania na tkankach innych niż tylna łapa , np. brzuch7 i grzbiet odbytu i narządów płciowych8 , gdzie obecnie stosuje się CvF. Modele alergii, gojenia się ran, neuropatii i innych patologii u gryzoni można łatwo dostosować do pomiarów wrażliwości mechanicznej w tkankach, w tym i poza tylną łapą.
Podsumowując, EvF jest użyteczną i skuteczną techniką, która aktualizuje klasyczne podejście do pomiaru nocycepcji u gryzoni i jest ważnym nowym narzędziem w badaniu złożonych mechanizmów leżących u podstaw bólu w szerokim zakresie modeli chorób.

Przewlekłe choroby niezakaźne są odpowiedzialne za nieproporcjonalną część obciążeń ludzkich związanych ze śmiertelnością i zachorowalnością1. Przewlekły ból jest coraz częściej uznawany za ważny składnik globalnego obciążenia chorobą2. Dało to ogromny impuls do innowacji w zapobieganiu, leczeniu i leczeniu bólu. Jednocześnie istnieje wiele dowodów na to, że biologia leżąca u podstaw bólu jestzłożona3. Mechanizmy leżące u podstaw bólu ochronnego, a także nieprzystosowawczego i przewlekłego wskazują na skomplikowane wzajemne oddziaływanie między układem odpornościowym i nerwowym3,4. Wyjaśnienie tych mechanizmów wymaga rygorystycznych ilościowych, powtarzalnych podejść eksperymentalnych, od analizy molekularnej po analizę behawioralną.
Modele gryzoni były nieocenione w charakterystyce molekularnych czynników bólu zapalnego i neuropatycznego5. Skrócenie czasu i intensywności wcześniej określonych reakcji na szkodliwe bodźce służy do pomiaru stanów bólowych u tych zwierząt, ponieważ gryzonie nie są w stanie w inny sposób zgłosić uczucia bólu6. Zmienione reakcje na temperaturę i ciśnienie są powszechnie stosowane jako wskaźniki wrażliwości tkanek w modelach nocycepcji zapalnej gryzoni, która może być spowodowana infekcją7,8, ekspozycją chemiczną6, 9,10, nacięciem chirurgicznym11, a także bólem neuropatycznym spowodowanym podwiązaniem nerwów12.
Czułość mechaniczna, czyli reakcja na bodźce naciskowe, jest często mierzona za pomocą klasycznych włókien von Freya (CvF) - serii (np. 0,4-15 g13) ważonych końcówek ręcznie nakładanych na badaną tkankę w przyrostach seryjnych, aż do wywołania zachowań bólowych u osób kontrolnych i eksperymentalnych. Istnieją różne metody wykorzystania tych końcówek lub włosów do oceny wrażliwości mechanicznej6,13; Najczęściej stosowana metoda jest następująca. Końcówka o określonym ciśnieniu (w obrębie serii; Np. 2 g13) jest wybierany jako punkt wyjścia, a 50% próg wycofania szczura lub myszy (intensywność bodźca wymagana do wywołania odpowiedzi w 50% przypadków, gdy końcówka jest przykładana do tkanki) jest określany przez przesuwanie się w górę i w dół wagi końcówki w oparciu o wyświetlanie wcześniej określonych zachowań odpowiedzi13. Bezwzględne 50% progi wycofania dla grup leczonych są następnie porównywane między punktami czasowymi wyjściowymi i po leczeniu. Ta ręczna technika jest dość czasochłonna. Oprócz wydłużenia czasu spędzonego przez każdego badanego zamkniętego w komorze von Freya, zwiększa to również liczbę nakładanych końcówek testowych o różnej wadze na tkankę objętą stanem zapalnym, powodując większy dyskomfort u gryzoni w badaniu. Ponadto oblicza się 50% progi wycofania i porównuje je między grupami gryzoni; Indywidualne reakcje osób eksperymentalnych zazwyczaj nie są znormalizowane w stosunku do ich indywidualnych nieleczonych odpowiedzi wyjściowych, z, o ile nam wiadomo, jednym wyjątkiem6. W związku z tym gryzonie nie są zwykle zgłaszane jako przypisane do grup leczonych na podstawie spójnych odpowiedzi wyjściowych w wcześniej ustalonym zakresie, ani też poszczególne osoby nie są oceniane na podstawie konsekwentnie stosowanego zestawu kryteriów wykluczenia, które pozwalają na standaryzację odpowiedzi wyjściowych dla dowolnego konkretnego zestawu badań i testów.
Tutaj prezentujemy alternatywną metodę pomiaru wrażliwości dotykowej tylnej łapy myszy po ekspozycji na jad Bothrops jararaca za pomocą elektronicznego aparatu von Freya (EvF). Cunha i współpracownicybyli pionierami w stosowaniu technik EvF u gryzoni i systematycznie porównywali skuteczność CvF i EvF, aby wykazać, że EvF zapewnia "bardziej czułą, obiektywną i ilościową" miarę wrażliwości dotykowej w modelach bólu zapalnego gryzoni. Krótko mówiąc, w pomiarach EvF, niehigroskopijna polipropylenowa końcówka von Freya o jednolitej średnicy (0,8 mm) o odpowiedniej sztywności dla badanej tkanki jest przymocowana do sondy elektronicznej i odczytu, który pokazuje siłę/wagę, przy której gryzoń chowa się z końcówki. Istnieje kilka istotnych różnic między pomiarami CvF i EvF. Po pierwsze, proces pomiaru zarówno odpowiedzi wyjściowych, jak i eksperymentalnych za pomocą EvF jest znacznie usprawniony, ponieważ nacisk na tylną łapę może być wywierany z rosnącą siłą, aż do wystąpienia odpowiedzi i nie ma potrzeby zmiany końcówek, jak w CvF; Zwierzęta spędzają mniej czasu zamknięte w komorach testowych, dzięki czemu są mniej zestresowane i czują się bardziej komfortowo podczas eksperymentu. Po drugie, EvF pozwala na relatywną łatwość implementacji kryteriów racjonalnego wykluczenia badanych osób w postaci zakresów akceptowalnych progów wyjściowych. Pozwala to na standaryzację wyjściowych odpowiedzi w obrębie grup leczenia i między nimi. Po trzecie, odpowiedź pacjenta po eksperymentalnym leczeniu jest zawsze porównywana z jego indywidualną reakcją wyjściową, tworząc ważne wewnętrzne kontrole pomiarów. Po czwarte, dokładność progów wycofania jest rejestrowana na wyższym poziomie rozdzielczości, ponieważ ciśnienie może być stosowane w sposób ciągły, a nie w przyrostach dostępnych w postaci mas włókien ręcznych. Podobnie jak w przypadku dobrze zaprojektowanych testów CvF, eksperymenty oparte na EvF są również przeprowadzane z tym samym badaczem (ślepym na leczenie) przykładającym siłę i rejestrującym zachowania reakcji. Ważne jest, aby zauważyć, że technika ta wymaga czasu i wysiłku ze strony badaczy w celu ustalenia wewnętrznej spójności pomiarów i wymaga planowania eksperymentów w taki sposób, aby uwzględnić odpowiednie uwzględnienia dla myszy, które mogą być wykluczone z powodu niespójnych odpowiedzi wyjściowych.
Łatwa do wdrożenia, skuteczna, dobrze kontrolowana ocena wrażliwości mechanicznej ułatwia dodanie oceny behawioralnej do modeli zdarzeń zapalnych, takich jak zatrucie - przykład, którego użyliśmy tutaj, aby zilustrować możliwości i moc pomiarów EvF w pomiarze zmian wrażliwości dotykowej. Odkryliśmy, że samce szwajcarskich myszy ND4 wykazywały zwiększoną wrażliwość mechaniczną po wstrzyknięciu jadu pochodzącego z południowoamerykańskiej żmii Bothrops jararaca w tylną łapę. Reakcjom behawioralnym towarzyszył obrzęk, napływ neutrofili i degranulacja komórek tucznych w dotkniętej tkance.

<table><tbody><tr><td>ND4 Szwajcarskie samce myszy</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>Użyte tutaj myszy miały 8-12 tygodni i były trzymane i używane zgodnie z wytycznymi IACUC Macaleter College.</td></tr><tr><td>3 ml/100 Strzykawka insulinowa z igłą 29 G 1/2 in</td><td>BD</td><td>BD309301</td><td>Po każdym użyciu przelać do odpowiedniego pojemnika.</td></tr><tr><td>B. jararaca jad</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>UWAGA: Substancja toksyczna. Nosić ochronę oczu i skóry. Rozpuścić w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>Elektroniczny aparat von Freya; sonda = zakres 90 g</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>Poruszaj się delikatnie i upewnij się, że zawsze jest poziomy. Aby wyzerować sondę, naciśnij "Program" i "Wyczyść". Aby przełączyć się z trybu konfiguracji do trybu pracy, naciśnij "Funkcja" (dla odczytu "MH") lub "MAX".</td></tr><tr><td>Stojak siatkowy + komory PMMA</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Umieść na stabilnym blacie lub wózku z czterema kołami, aby uzyskać dostęp ze wszystkich stron.</td></tr><tr><td>Tylko sztywne końcówki elektroniczne von Frey, zakres 90 g</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von freya

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Pomiar wywołanych stanem zapalnym zmian w progach wycofania tylnej łapy pod wpływem nacisku mechanicznego jest użyteczną techniką oceny zmian w odczuwaniu bólu u gryzoni. Progi wycofania można zmierzyć najpierw na początku badania, a następnie po zastosowaniu leku, jadu, urazu, alergenu lub w inny sposób wywołanego stanu zapalnego, poprzez przyłożenie dokładnej siły do bardzo określonych obszarów skóry. Elektroniczny aparat von Freya umożliwia precyzyjną ocenę progów wycofania tylnej łapy myszy, które nie są ograniczone dostępnymi rozmiarami włókien, w przeciwieństwie do klasycznych pomiarów von Freya. Łatwość i szybkość pomiarów pozwala na włączenie oceny wyników wrażliwości dotykowej do różnych modeli bólu zapalnego i neuropatycznego o szybkim początku, ponieważ można wykonać wiele pomiarów w krótkim czasie. Pomiary eksperymentalne dla poszczególnych gryzoni mogą być wewnętrznie kontrolowane w odniesieniu do indywidualnych odpowiedzi wyjściowych i kryteriów wykluczenia łatwo ustalonych w celu standaryzacji odpowiedzi wyjściowych w obrębie grup eksperymentalnych i między nimi. W związku z tym pomiary za pomocą elektronicznego aparatu von Freya stanowią użyteczną modyfikację dobrze znanych klasycznych testów opartych na włóknach von Freya dla mechanicznej allodynii gryzoni, które mogą być również stosowane do innych modeli ssaków innych niż ludzie.

Miejscowe podanie jadu B. jararaca powoduje zmiany w czułości dotykowej tylnej łapy oraz obrzęk tkanek u samców myszy szwajcarskich ND4.
1,5 h po podaniu 45 µg/kg jadu B. jararaca, samce myszy szwajcarskich ND4 cofały tylne łapy przy nacisku o 3,0 g niższym niż wartość wyjściowa (Rysunek 1A). Wartość wyjściowa cofania łap dla wszystkich grup wynosiła ~4,5 g przyłożonego nacisku; po podaniu jadu myszy eksperymentalne cofały tylne łapy przy nacisku 1-1,5 g (dane nie zostały przedstawione). Myszy kontrolne traktowane solą fizjologiczną wykazały niewielki lub żaden spadek reakcji na nacisk w porównaniu z wartością wyjściową we wszystkich badanych punktach czasowych. Obniżone progi reakcji u myszy traktowanych były wyraźnie utrzymywane w 3. i 6. godzinie po enwenomacji (Rysunek 1A) i stały się nierozróżnialne od grupy kontrolnej do 24. godziny (dane nie zostały przedstawione). Tylne łapy myszy po enwenomacji wykazywały obrzęk tkanek charakterystyczny dla stanu zapalnego. W 1,5 h po podaniu jadu tylne łapy myszy traktowanych, mierzone zgodnie z wcześniejszym opisem10, były o 1,5 mm grubsze niż w wartości wyjściowej; obrzęk utrzymywał się przez 3. i 6. godzinę (Rysunek 1B). W przeciwieństwie do nich, łapy traktowane solą fizjologiczną nie wykazały opuchlizny ani zmiany grubości w okresie eksperymentalnym. W reprezentatywnym eksperymencie przedstawionym tutaj, do pomiarów wyjściowych wykorzystano łącznie 21 myszy, z czego 14 wybrano do udziału w eksperymencie. Zostały one przypisane do grup terapeutycznych w taki sposób, aby średnie reakcje cofania w wartości wyjściowej wynosiły około 4,5 g dla każdej grupy jako całości.
B. jararaca wywołane jadem zmiany w wrażliwości dotykowej towarzyszą degranulacji komórek tucznych i napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy szwajcarskich ND4.
Oprócz zwiększonej wrażliwości dotykowej i obrzęku tkanek, oceniliśmy również napływ neutrofili (Rysunki 2A-B) oraz degranulację komórek tucznych (Rysunki 2C-D) w tylnych łapach myszy po wstrzyknięciu jadu w porównaniu z myszami traktowanymi solą fizjologiczną. Neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi rekrutowanymi z krążenia do miejsca uszkodzenia i wiadomo, że pośredniczą one w zapalnych odpowiedziach nocyceptywnych10,16,17. Komórki tuczne są tkankowymi komórkami wartowniczymi18, a ich degranulacja była wiązana z odpowiedziami nocyceptywnymi w tylnych łapach myszy10 oraz w oponie twardej szczurów19.
Stwierdzono tutaj, że napływ neutrofili do tylnych łap po wstrzyknięciu jadu zwiększył się niemal 1000-krotnie w porównaniu z tylnymi łapami traktowanymi solą fizjologiczną (Rycina 3A), co oceniono poprzez zliczenie neutrofili w barwionych hematoksyliną i eozyną 4 µm przekrojach strzałkowych tkanki podeszwy zatopionych w parafinie10, pobranych od uśpionych myszy 1,5 h po podaniu jadu.
W łapach traktowanych solą fizjologiczną komórki tuczne podeszwy w tkance tylnej łapy pozostały w dużej mierze nienaruszone lub wykazały łagodne degranulowanie (Rysunek 3B). W przeciwieństwie do nich, w tylnych łapach poddanych działaniu jadu stwierdzono 20-15% umiarkowanego i rozległego degranulowania komórek tucznych (Rysunek 3B). Opisane powyżej przekroje tkankowe zabarwiono błękitem toluidyny, a liczbę widocznych ziarn policzono w każdej zaobserwowanej komórce tucznej, aby ustalić stopień degranulowania zgodnie z wcześniejszym opisem10.
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1. Lokalny B. jararaca podanie jadu powoduje zmiany w mechanicznej wrażliwości tylnej łapy oraz obrzęk tkankowy u samców myszy szwajcarskich szczepu ND4. Wyjściowe progi wycofania oraz wyjściowa szerokość łapy były oceniane 48 i 24 godziny przed podaniem wewnątrzpodeszwowym B. jararaca jad (Bjv; 45 µg/kg) lub podanie nośnika (soli fizjologicznej) (10 µl). Progi wycofywania oceniano w 1,5, 3 i 6 godzinie po zastosowaniu leczenia (A). Aśrednia szerokość łapy (średnia szerokość lewej i prawej łapy myszy) w środkowej części podeszwy oceniono za pomocą suwmiarki cyfrowej w punkcie wyjściowym, a następnie po 1,5, 3 i 6 godzinach od zastosowania leczenia, aby określić obrzęk tkanek zgodnie z wcześniejszym opisem10 (B). Istotność statystyczną porównano z myszami traktowanymi solą fizjologiczną (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; odpowiednio 0,001). n = 10–11 myszy na grupę terapeutyczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Porównanie histologiczne efektów soli fizjologicznej i B. jararaca, przy powiększeniu 400x i 1000x." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Nadwrażliwość mechaniczna wywołana jadem B. jararaca towarzyszy degranulacji komórek tucznych i napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy szwajcarskich ND4. U 3 myszy na grupę zabiegową wykonano eutanazję za pomocą CO2 1,5 hr po zabiegu , a następnie wycięto tylne łapy, które przechowywano w 10% formalinie przez 24 hr, przeniesiono do 70% etanolu, odwapniono przez 1-2 tygodnie w 15% EDTA i zatopiono w parafinie. Przekroje strzałkowe o grubości 4 µm barwiono hematoksyliną i eozyną (A-B) oraz błękitem toluidyny (C-D) w celu wizualizacji odpowiednio neutrofili (A-B) i komórek tucznych (C-D). Obrazy pozyskano przy powiększeniu 400X i 1 000X zgodnie z opisem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>. 
<img alt="Neutrofile i degranulacja wywołana jadem B. jararaca; wykres słupkowy; analiza wpływu jadu." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Nadwrażliwość mechaniczna wywołana jadem B. jararaca towarzyszy znacznemu wzrostowi poziomu degranulacji komórek tucznych oraz napływowi neutrofili do tylnych łap samców myszy ND4 Swiss. Neutrofile i komórki tuczne na barwionych przekrojach tkanek zliczano przy użyciu mikroskopu Olympus CX21LED. Neutrofile zliczano w 3 tylnych łapach na każdą grupę zabiegową, od pięty do palców, w sąsiadujących polach widzenia przy powiększeniu 400X (A). Komórki tuczne zliczano w 3 poduszkach stopy na każdą grupę zabiegową, a ich stopień degranulacji oceniano na podstawie liczby widocznych ziarnistek poza granicą komórki: nienaruszone (0), łagodna (0-10), umiarkowana (10-20), rozległa (21+), zgodnie z wcześniejszym opisem10 (B).  Aby uniknąć podwójnego liczenia tych samych komórek, badacze oceniający liczbę neutrofili i poziom degranulacji komórek tucznych w przekrojach tylnych łap stosowali siatkę wpisaną w siatkę okularową. Badacze nie znali przydziału grup zabiegowychs. Istotność statystyczną określano w porównaniu do myszy traktowanych roztworem soli fizjologicznej (odpowiednio * = p &lt; 0.05, ** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; 0.001). n = 3 myszy na grupę zabiegową.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar braku reakcji nadwrażliwości na ucisk mechaniczny w tylnej łapie myszy. Osiąga się to poprzez umieszczenie zwierząt na podłodze z drucianej siatki i pozwolenie im na habituację w odpowiednim czasie. Do spodu tylnej łapy przykładana jest końcówka z polipropylenu, a następnie stopniowo zwiększa się nacisk.Po odnotowaniu odpowiedniej reakcji behawioralnej bodziec jest wycofywany. Po zebraniu wartości bazowych zwierzęta zostają poddane interwencji eksperymentalnej przed kolejnymi testami. Ostatecznie porównuje się zmiany progów wycofania tylnej łapy pomiędzy grupami badawczymi, aby określić wpływ danej terapii na zmiany wrażliwości dotykowej na nacisk.Ból jest głównym komponentem stanu zapalnego. Ważne jest mierzenie i charakteryzowanie bólu w różnych kontekstach. Tę stosunkowo prostą metodę oceny bólu można zastosować w wielu różnych modelach stanu zapalnego.Procedurę zademonstrują Tiana, technik badawczy w moim laboratorium, Madison Mack, która uczestniczyła w tych badaniach jako studentka studiów licencjackich, oraz Akila Sykes, obecnie studentka studiów licencjackich w moim laboratorium. Zaczynamy od przygotowania aparatury testowej, aby zapewnić łatwy dostęp do tylnych łap.Umieść poszczególne komory na siatkowym dnie. Siatkowe dno powinno znajdować się na wygodnej wysokości i spoczywać na stabilnej powierzchni. Następnie ustaw elektroniczny aparat Von Frey na blacie laboratoryjnym.Upewnij się, że sonda i kabel są prawidłowo podłączone do jednostki wyświetlającej, a następnie włącz urządzenie w trybie konfiguracji. Wyzeruj odczyt i delikatnie umieść dostarczony ciężarek testowy na stożku sondy Von Frey. Zapisz odczyt i powtórz tę procedurę ponownie po zakończeniu testów; w przypadku rozbieżności między obiema wartościami aparat może wymagać ponownej kalibracji.Wybierz polipropylenowy końcówkę o rozmiarze odpowiednim dla badanej tkanki. Sztywne końcówki sprawdzają się w przypadku mniej wrażliwej, twardszej tkanki tylnej łapy. Delikatnie zamocuj końcówkę na stożku sondy.Następnie przełącz z trybu konfiguracji na tryb pracy. Wyświetli to maksymalne przyłożone ciśnienie w momencie wycofania sondy. Do pomiaru progów wycofania tylnej łapy wymagane są dwóch badaczy.Jedna osoba obsługuje aparat i wykonuje pomiary, a druga zapisuje te pomiary w celu zmniejszenia błędu systematycznego. Badacz obsługujący anestezymetr powinien być zaślepiony względem zastosowanych terapii, jak również zapisanych wartości progu wycofania. Ponadto, aby zapewnić spójność między pomiarami, ta sama osoba powinna zapisywać wszystkie wartości bazowe oraz wartości progu wycofania.Na 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia rejestruje się pierwszy zestaw pomiarów bazowych. Pod statywem należy umieścić materiał chłonny w celu zbierania wydalin. Po zamontowaniu końcówki i wyzerowaniu sondy, osoba wykonująca pomiary powinna umieścić myszy w oddzielnych komorach.Przykryj komory perforowanymi pokrywami i połóż na nich ciężki przedmiot. Aby zapobiec ucieczce myszy, pozwól im na aklimatyzację w komorze przez 15 minut przed kontynuowaniem procedury. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mają trudności z stopniowym zwiększaniem nacisku oraz z zachowaniem wewnętrznej spójności własnych pomiarów, dlatego praktyka jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników.Po przygotowaniu, używając obu rąk, powoli unieś sondę i stymuluj poduszkę stopy lewej lub prawej tylnej łapy. Stopniowo zwiększaj nacisk, aż do zaobserwowania zachowania nocyceptywnego. Objawia się ono cofnięciem tylnej łapy, lizaniem tylnej łapy lub podskakiwaniem łapą.Poproś drugiego badacza o zapisanie wartości ciśnienia, które wywołało zaobserwowane zachowanie. Podczas pomiaru warto zachęcić mysz do pozostania w bezruchu, umieszczając pokarm tuż poza komorą lub wydając lekki dźwięk, np. delikatnie stukając przed wykonaniem pomiaru. Przejdź do kolejnej myszy, aż każda zostanie przebadana raz, a następnie powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.Po zebraniu pięciu wartości bazowych oblicz średnią dla każdej myszy. Powtórz pomiary bazowe po 24 godzinach i wykorzystaj te wartości do obliczenia kolejnej średniej. Aby upewnić się, że wszystkie myszy wykazują spójne reakcje bazowe, wyklucz zwierzęta, u których średni bazowy próg wycofania jest niższy niż 3,5 grams lub u których progi bazowe różnią się o dwa grams lub więcej.Na koniec przydziel myszy do oddzielnych grup badawczych w taki sposób, aby średni poziom bazowy progu wycofania w każdej z nich był możliwie zbliżony. W tym przypadku progi wycofania mierzono po podaniu jadu do tylnej łapy, ROS raca. Myszy z grupy kontrolnej traktowane solą fizjologiczną wykazały niewielkie zmiany w porównaniu z poziomem bazowym we wszystkich punktach czasowych.Badania wykazały, że odpowiedzi nocyceptywne u myszy poddanych leczeniu utrzymywały się wyraźnie do sześciu godzin. Ponadto obrzęk tkanki, charakterystyczny dla stanu zapalnego, był widoczny w tylnych łapach traktowanych jadem, ale nie w tych traktowanych solą fizjologiczną. Zmiany w wrażliwości dotykowej wywołane przez jad współistniały z niemal 1000-krotnym napływem neutrofili.W porównaniu do tylnych łap traktowanych solą fizjologiczną, komórki tuczne w tkance podeszwy łapy były w dużej mierze nienaruszone lub wykazywały łagodną degranulację. W przeciwieństwie do nich, w tylnych łapach zwierząt kopulowanych stwierdzono umiarkowaną i rozległą degranulację komórek tucznych u 15 do 20% badanych. Technikę tę można dostosować do oceny wrażliwości mechanicznej lub dotykowej w szerokim zakresie tkanek innych niż tylna łapa.W związku z tym technikę tę można zastosować w wielu różnych modelach zapalenia i bólu u gryzoni.

measuring-changes-tactile-sensitivity-hind-paw-mice-using-an

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pomiar zmian w wrażliwości dotyku w tylnej łapce myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Frey

Opisujemy dwie metody testowania czucia dotykowego w ostrych lub przewlekłych okresach po urazie rdzenia kręgowego u szczurów. Te zwalidowane procedury pozwalają wykryć rozwój i utrzymywanie się doznań typu allodynii.

Ostre i przewlekłe badanie czucia dotykowego po uszkodzeniu rdzenia kręgowego u szczurów

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

Ból neuropatyczny jest konsekwencją uszkodzenia lub choroby wpływającej na układ somatosensoryczny. "Model mankietowy" bólu neuropatycznego u myszy polega na wszczepieniu mankietu polietylenowego wokół głównej gałęzi nerwu kulszowego. Mechaniczna allodynia jest testowana przy użyciu filamentów von Freya.

Model kajdanki nerwu kulszowego bólu neuropatycznego u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do określania progów wykrywania drgań i ostrości dotyku za pomocą metod psychofizycznych u człowieka.

Pomiar progu detekcji drgań i ostrości przestrzennej dotyku u ludzi

Precyzyjna ocena reakcji na ból w neuropatycznym modelu zwierzęcym jest kluczowa dla zbadania patofizjologii chorób bólowych i opracowania nowych leków przeciwbólowych. Przedstawiamy czułą i obiektywną metodę określania funkcji sensorycznej tylnej łapy gryzonia za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy chodu.

Zautomatyzowana analiza chodu u myszy z przewlekłym urazem zwężenia

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

W tym artykule podajemy szczegóły dotyczące metod produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10. Pokazujemy również, jak przetestować skuteczność tego białka w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu bólu zapalnego.

Opracowanie białek rekombinowanych w leczeniu bólu przewlekłego

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.

Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego wywołuje długotrwały przewlekły ból neuropatyczny, charakteryzujący się przesadnymi reakcjami na bodźce termiczne i mechaniczne. Ten mysi model bólu neuropatycznego jest powszechnie stosowany do badania innowacyjnych terapii leczenia bólu. W tym artykule szczegółowo opisano procedurę chirurgiczną w celu poprawy standaryzacji i odtwarzalności.

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego: mysi model przewlekłego bólu neuropatycznego w celu zbadania antynocyceptywnego działania nowych terapii

Tutaj prezentujemy protokół oceny nocycepcji u myszy zakażonych Trypanosoma evansi, używając elektronicznego aparatu von Freya jako narzędzia, mierzącego mechaniczne progi tylnej łapy i wnętrzności.

Elektroniczny von Frey związany ze skalą grymasu myszy do oceny allodynii i bólu u myszy zakażonych Trypanosoma evansi

Poznaj metodę pomiaru zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę progów wycofania w modelach zapalenia.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Przeglądaj więcej filmów