Przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego i testy nadwrażliwości na ból u szczurów
March 13th, 2012
Ze względu na prostotę operacji i solidny wynik behawioralny, przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego jest jednym z najwybitniejszych zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego. W ciągu 24 godzin po zabiegu ustalana jest nadwrażliwość na ból, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) i miernika analgezji podeszwowej (test termiczny).
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie przewlekłego zwężenia, uszkodzenia nerwu kulszowego, powszechnie stosowanego modelu bólu neuropatycznego u gryzoni oraz ilościowe zmierzenie wynikających z tego zachowań bólowych. Osiąga się to poprzez umieszczenie najpierw czterech chromowych ligatur jelitowych wokół odsłoniętego nerwu kulszowego na poziomie połowy uda, aby spowodować zwężenie nerwu kulszowego. Następnie monitoruj zachowania bólowe w tylnej łapie w pożądanych punktach czasowych, ilościowo mierząc próg wycofania łapy do bodźca mechanicznego za pomocą von fray anthes i opóźnienie wycofania łapy do bodźca termicznego za pomocą miernika przeciwbólowego podeszwy.
Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na występowanie bólu mechanicznego i termicznego, nadwrażliwości uszkodzonej tylnej łapy poprzez pomiar wywołanych reakcji wycofania zarówno na bodźce mechaniczne, jak i termiczne. Ta metoda uszkodzenia nerwów obwodowych, opracowana po raz pierwszy przez bene i Z, może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bólu przewlekłego, takie jak to, jakie są obwodowe i ośrodkowe mechanizmy, za pomocą których generowany jest ból neuropatyczny. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię bólu neuropatycznego, ponieważ model ten stanowi podstawę do zbadania nowych strategii zmniejszania nadwrażliwości na ból.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ umieszczenie szwów jelitowych cmic wokół nerwu statycznego i odpowiednie napięcie, aby spowodować wystarczające, ale nie nadmierne uszkodzenie nerwu, jest szczególnie trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zdezynfekować powierzchnię roboczą zabiegu 70% etanolem i przygotować sterylne narzędzia, zszywki z gazy i waciki, które zostały wcześniej autoklawowane. Następnie znieczulij szczura w komorze indukcyjnej za pomocą 5% fluoru ISO.
Dostarcz do niego 2% fluoru ISO przez specjalnie wykonaną maskę na twarz podczas operacji. Następnie ogol lewą tylną nogę szczura, a następnie umieść zwierzę na macie grzewczej z regulacją termiczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nałóż nawilżającą maść okulistyczną na oczy.
Następnie przygotuj chromowy szew jelitowy, krojąc go na małe kawałki o długości około trzech centymetrów, zanurz je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Następnie wysterylizuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi aplikacjami roztworu alkoholu i jodu. Gdy zwierzę leży na klatce piersiowej, podnieś lewą tylną nogę i przytrzymaj kość udową pod kątem 90 stopni do kręgosłupa za pomocą taśmy maskującej na stopie.
Następnie wykonaj nacięcie skóry około trzech do czterech milimetrów poniżej kości udowej. Oddziel skórę od mięśnia otaczającego nacięcie, przecinając tkankę łączną. Użyj nożyczek, aby przeciąć tkankę łączną między mięśniami pośladkowymi powierzchownymi a mięśniami bicepsa.
Następnie użyj retraktora, aby poszerzyć szczelinę między dwoma mięśniami, aby umożliwić wyraźną wizualizację nerwu kulszowego, a następnie użyj kleszczy i mikronożyczek, aby delikatnie uwolnić około 10 milimetrów nerwu kulszowego z otaczającej tkanki łącznej. Przywiąż pierwszą ligaturę proksymalnie do trifurkacji nerwu kulszowego dla każdej ligatury. Zacznij od pojedynczej luźnej pętli.
Następnie chwyć dwa końce blisko pętli i ciągnij, aż pętla będzie ledwo przylegająca, a ligatura nie przesuwa się wzdłuż nerwu. Następnie przytrzymaj pętlę we właściwej pozycji i umieść drugą pętlę na pierwszej pętli, aby zakończyć węzeł. Następnie odetnij luźne końce ligatury do okrągłego milimetrowego zwężenia nerwu powinno być minimalne.
Powtórz kroki dla pozostałych trzech ligatur, wiążąc każdą dodatkową ligaturę o jeden milimetr bardziej proksymalnie niż poprzednia. Również przy minimalnym zwężeniu pod koniec operacji użyj szwów, aby zamknąć warstwę mięśniową i zszywek, aby zapiąć skórę. Następnie użyj roztworu jodu, aby wysterylizować ranę.
Uważnie obserwuj zwierzę w okresie rekonwalescencji po znieczuleniu i pozwól mu dojść do siebie w oddzielnej klatce z płaską papierową ściółką. Przed rozpoczęciem eksperymentu. Ze zwierzęciem należy obchodzić się codziennie przez kilka dni.
Następnie przed testami behawioralnymi przyzwyczaj szczura do wybiegu. Środowisko testowe powinno być ciche i dobrze kontrolowane ze stałym poziomem temperatury i wilgotności, a każda sesja testowa powinna być przeprowadzana o podobnej porze dnia. Aby zbadać mechaniczny próg wycofania w dniu testu, umieść szczura w klatce testowej z podwyższoną siatką na 15 do 30 minut przed eksperymentem, używając dynamicznego antera podeszwowego von fray, ustaw stymulator dotykowy z włóknem bezpośrednio pod środkową powierzchnią sadzarki tylnej łapy i naciśnij start.
To podnosi włókno, aby mechanicznie stymulować powierzchnię sadzarki tylnej łapy z rosnącą siłą. Następnie zapisz mechaniczny próg wycofania zarówno z uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap. To urządzenie automatycznie rejestruje i wyświetla maksimum dla dostarczonej reakcji po odstawieniu.
Powtórz stymulację mechaniczną trzy razy w odstępie około pięciu minut między badaniem bodźców a nieuszkodzonymi tylnymi łapami w przeciwwadze, a następnie oblicz średnią progów wycofania łapy. Aby zbadać opóźnienie wycofania termicznego w dniu testu, umieść szczura w szklanej podłodze. Testowanie klatki 15 do 30 minut przed eksperymentem za pomocą termicznego przyrządu do zwalczania analgezji sadzarki, umieść źródło podczerwieni bezpośrednio pod środkową powierzchnią sadzarki tylnej łapy i naciśnij start.
To wystawia powierzchnię donicy tylnej łapy na wiązkę promieniowania cieplnego przez przezroczystą szklaną powierzchnię. Następnie zapisz opóźnienie wycofania zarówno z uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap. To urządzenie automatycznie rejestruje czas od wystąpienia bodźca termicznego do wycofania łapy ze źródła ciepła.
Powtórz stymulację cieplną co najmniej trzy razy w odstępie około pięciu minut między bodźcami testującymi uszkodzone i nieuszkodzone tylne łapy w przeciwwadze w przeciwwadze, a następnie oblicz średnią wycofania łapy Opóźnienia pokazują tutaj mechaniczny próg wycofania zarówno w uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych łapach szczurów wistar przed i do 12 dni po przewlekłym zwężeniu nerwu kulszowego. W uszkodzonej ipsilateralnej tylnej łapie występuje znaczne obniżenie progu wycofania łapy na bodźce mechaniczne w porównaniu z nieuszkodzoną przeciwległą tylną łapą. Pokazano tutaj opóźnienie wycofania termicznego zarówno w uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych łapach przed i do 12 dni po przewlekłym zwężeniu nerwu kulszowego.
Podobnie, opóźnienie wycofania termicznego jest znacznie zmniejszone w uszkodzonej ipsilateralnej tylnej łapie w porównaniu z nieuszkodzoną tylną łapą przeciwległą. Po opanowaniu operacji CCI można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu zaledwie 20 minut na zwierzę, co skutkuje długotrwałą nadwrażliwością bólową tylnej łapy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o luźnym związaniu ligatur, ponieważ jest to samouduszenie pod ligaturami po obrzęku, co powoduje zwężenie po jego rozwinięciu.
Ta technika uszkodzenia nerwów obwodowych w połączeniu z testowaniem nadwrażliwości na ból załamek P dla naukowców zajmujących się bólem neuropatycznym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw przewlekłego bólu spowodowanego uszkodzeniem nerwów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje przewlekłe ściśnięcie nerwu kulszowego, szeroko stosowany model u gryzoni do badania bólu neuropatycznego. Procedura ta pozwala na ilościowe pomiaru zachowań związanych z bólem w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowań
- Badania nad przewlekłym bólem
Tło
- Przewlekłe ściśnięcie nerwu kulszowego jest wybitnym modelem bólu neuropatycznego.
- Model charakteryzuje się wystąpieniem nadwrażliwości na ból w ciągu 24 godzin po operacji.
- Techniki pomiarowe obejmują testy von Frey i plantarnej analgezji.
- Ten model pomaga w zrozumieniu mechanizmów bólu neuropatycznego.
Cel badania
- Wykonanie przewlekłego ściśnięcia nerwu kulszowego u gryzoni.
- Ilościowa ocena zachowań związanych z bólem wynikających z urazu.
- Zbadanie obwodowych i centralnych mechanizmów bólu neuropatycznego.
Zastosowane metody
- Umieszczenie czterech chromowych ściągaczy wokół nerwu kulszowego.
- Monitorowanie zachowań związanych z bólem w tylnej łapce w określonych punktach czasowych.
- Pomiar progu wycofania łapki w odpowiedzi na bodźce mechaniczne za pomocą estezjometru von Frey.
- Pomiar opóźnienia wycofania łapki w odpowiedzi na bodźce termiczne za pomocą plantarnego miernika analgezji.
Główne wyniki
- Ustanowienie nadwrażliwości na ból mechaniczny i termiczny w zranionej tylnej łapce.
- Ilościowe dane wykazujące wywołane reakcje wycofania się w odpowiedzi na bodźce.
- Wgląd w mechanizmy bólu neuropatycznego.
- Podwaliny pod badaniem nowych strategii zarządzania bólem.
Wnioski
- Model przewlekłego ściśnięcia jest skuteczny w badaniu bólu neuropatycznego.
- Wyniki mogą wskazywać na potencjalne podejścia terapeutyczne do zmniejszenia nadwrażliwości na ból.
- Ten model zapewnia podstawę do dalszych badań nad mechanizmami przewlekłego bólu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The chronic constriction injury (CCI) model enables mechanistic de-risking of neuropathic pain targets by establishing reproducible pain hypersensitivity phenotypes. Quantitative measurement of mechanical and thermal withdrawal thresholds provides predictive confidence for target validation in analgesic discovery. This disease-relevant system supports translational biomarker alignment and preclinical model continuity for go/no-go decisions in pain therapeutics pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by establishing causal links between sciatic nerve injury and pain hypersensitivity phenotypes.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized induction of neuropathic pain states in rodents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying target engagement via reversal of hypersensitivity in injured versus uninjured paws.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using von Frey and plantar analgesia metrics.
- Quantitative Outputs: Delivers reproducible withdrawal threshold and latency measurements for dose-response characterization.
- Screening Scalability: Facilitates platform reuse through counterbalanced testing of injured and uninjured hind paws across time points.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral neuropathic pain mechanisms aligned with human chronic pain symptomatology.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical efficacy testing via hypersensitivity endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by demonstrating target-mediated attenuation of mechanical and thermal pain responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CCI model integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative refinement of analgesic candidates based on pain phenotype modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking peripheral nerve injury to quantifiable hypersensitivity phenotypes.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized mechanical and thermal stimulus application protocols.
- Analytics: Provides withdrawal threshold and latency readouts that enable inter-group comparison and effect size calculation.
- Translational Research: Connects mechanism elucidation to preclinical validation through consistent pain hypersensitivity metrics.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple analgesic targets across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuropathic pain pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined ligation parameters and blinded testing procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets unlikely to modulate hypersensitivity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by quantifying target effects on established pain phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent microsurgery and behavioral neuroscience for consistent nerve ligation and habituation.
- Dependent on calibrated von Frey aesthesiometers and plantar analgesia meters for accurate threshold and latency measurements.
- Necessitates cross-team standardization of surgery timing, testing environment controls, and counterbalanced paw assessment.
- Involves adaptation considerations when translating rat CCI protocols to other species or pain models.
- Includes practical limitations such as variability in ligation tightness affecting injury severity and hypersensitivity magnitude.
