Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów
13 marca 2012
Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie przewlekłego uciśnięcia (chronic constriction injury) nerwu kulszowego, będącego powszechnie stosowanym modelem bólu neuropatycznego u gryzoni, oraz ilościowy pomiar wynikających z tego zachowań bólowych. Jest to realizowane poprzez najpierw nałożenie czterech ligatur z nici jelitowej chromowej wokół odsłoniętego nerwu kulszowego na poziomie połowy uda, aby wywołać uraz uciskowy nerwu kulszowego. Następnie monitoruje się zachowania bólowe w tylnej łapie w wybranych punktach czasowych, ilościowo mierząc próg wycofania łapy w odpowiedzi na bodziec mechaniczny przy użyciu włókien von Frey oraz latencję wycofania łapy w odpowiedzi na bodziec termiczny przy użyciu plantarnego miernika analgesji.
W rezultacie można uzyskać dane wykazujące istnienie bólu mechanicznego i termicznego oraz nadwrażliwość uszkodzonej tylnej łapy poprzez pomiar wywołanych reakcji wycofania w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne. Ta metoda uszkodzenia nerwów obwodowych, opracowana pierwotnie przez bene i Z, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłego bólu, takie jak obwodowe i centralne mechanizmy generowania bólu neuropatycznego. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię bólu neuropatycznego, ponieważ model ten stanowi podstawę do badania nowych strategii redukcji nadwrażliwości bólowej.
Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ założenie szwów jelitowych cmic wokół nieruchomego nerwu oraz uzyskanie odpowiedniego stopnia zaciśnięcia, aby wywołać wystarczający, lecz nie nadmierny uraz nerwu, jest szczególnie wymagające. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zdezynfekować powierzchnię roboczą 70% ethanol i przygotować sterylne narzędzia, gazę, zszywki oraz tampony, które zostały wcześniej wysterylizowane w autoklawie. Następnie należy znieczulić szczura w komorze indukcyjnej, stosując 5% ISO fluorine.
Podczas operacji podawaj zwierzęciu 2% ISO fluoranu za pomocą specjalnie wykonanej maski twarzowej. Następnie zgol skórę na lewej tylnej kończynie szczura, a potem umieść zwierzę na matach grzewczych z termoregulacją w temperaturze 37 °C. Na oczy nanieś smarującą maść oftalmiczną.
Następnie przygotuj chromową nić jelitową, tnąc ją na małe kawałki o długości około trzech centymetrów i zanurzając je w sterylnej soli fizjologicznej. Dalej, zdezynfekuj ogoloną okolicę, stosując naprzemiennie trzy aplikacje alkoholu i roztworu jodu. Układając zwierzę na klatce piersiowej, unieś jego lewą tylną kończynę i utrzymaj kość udową pod kątem 90 stopni względem kręgosłupa, mocując stopę za pomocą taśmy maskującej.
Następnie wykonaj nacięcie skóry około trzech do czterech milimetrów poniżej kości udowej. Oddziel skórę od mięśni otaczających nacięcie, przecinając tkankę łączną. Używając tępych nożyczek, przetnij tkankę łączną pomiędzy mięśniem pośladkowym powierzchownym (gluteus superficialis) a mięśniem dwugłowym uda (biceps fems).
Następnie za pomocą retraktora poszerzyć szczelinę między dwoma mięśniami, aby umożliwić wyraźną wizualizację nerwu kulszowego, a następnie użyć pęsety i mikronożyczek, aby delikatnie uwolnić około 10 milimetrów nerwu kulszowego z otaczającej go tkanki łącznej. Związać pierwszą ligaturę proksymalnie względem trifurkacji nerwu kulszowego dla każdej ligatury. Rozpocząć od pojedynczej luźnej pętli.
Następnie chwyć oba końce blisko pętli i pociągnij, aż pętla będzie przylegać ściśle, a więzadło przestanie przesuwać się wzdłuż nerwu. Następnie przytrzymaj pętlę w odpowiedniej pozycji i nałóż drugą pętlę na pierwszą, aby dokończyć węzeł. Następnie odetnij wolne końce więzadła tak, aby okrągłe zwężenie nerwu o szerokości jednego milimetra było minimalne.
Powtórz kroki dla pozostałych trzech podwiązań, zawiązując każde kolejne podwiązanie o jeden milimetr bardziej proksymalnie niż poprzednie. Po zakończeniu operacji, przy minimalnym ucisku, użyj szwów do zamknięcia warstwy mięśniowej oraz zszywek do zamknięcia skóry. Następnie użyj roztworu jodu, aby wysterylizować ranę.
W okresie wybudzania z narkozy należy uważnie obserwować zwierzę i pozwolić mu na regenerację w osobnej klatce z płaską ściółką papierową. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przez kilka dni codziennie utrzymywać kontakt z zwierzęciem.
Następnie, przed testami behawioralnymi, poddaj szczura habituacji w klatce. Środowisko testowe powinno być ciche i dobrze kontrolowane pod kątem stałej temperatury i wilgotności, a każda sesja testowa powinna być przeprowadzana o podobnej porze dnia. Aby zbadać próg wycofania mechanicznego w dniu testu, umieść szczura w klatce testowej z podwyższoną siatkowaną podłogą od 15 do 30 minut przed eksperymentem; używając dynamicznego urządzenia von Frey do badania odruchu plantarnego, ustaw stymulator dotyku z włóknem bezpośrednio pod środkową powierzchnią podeszczową tylnej łapy i naciśnij klawisz start.
Operacja ta unosi filament, aby mechanicznie stymulować powierzchnię podeszczową tylnej łapy z rosnącą siłą. Następnie należy zarejestrować próg wycofania mechanicznego dla obu tylnych łap – uszkodzonej i nieuszkodzonej. Urządzenie to automatycznie rejestruje i wyświetla maksymalną siłę przyłożoną w momencie wystąpienia reakcji wycofania.
Powtórz stymulację mechaniczną trzykrotnie w odstępach około pięciu minut między próbami, badając nieuszkodzone tylne łapy w kolejności zrównoważonej, a następnie oblicz średnią wartości progów wycofania łapy. Aby zbadać czas utajenia odruchów cieplnych w dniu testu, umieść szczura w klatce testowej z szklaną podłogą na 15 do 30 minut przed eksperymentem. Korzystając z urządzenia do badania analgezji podeszwowej w teście termicznym, ustaw źródło podczerwieni bezpośrednio pod środkową częścią podeszwy tylnej łapy i naciśnij przycisk start.
Pozwala to na wystawienie powierzchni podeszwowej tylnej łapy na działanie wiązki ciepła promieniującego przez przezroczystą szklaną powierzchnię. Następnie należy zarejestrować czas utajenia wycofania obu tylnych łap, zarówno tych uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych. Urządzenie to automatycznie rejestruje czas od momentu rozpoczęcia bodźca termicznego do wycofania łapy ze źródła ciepła.
Powtórz stymulację cieplną co najmniej trzy razy w odstępach około pięciu minut między bodźcami, badając uszkodzone i nieuszkodzone tylne łapy w kolejności zrównoważonej, a następnie oblicz średnią czasu latencji wycofania łapy. Przedstawiono tutaj mechaniczny próg wycofania w obu łapach, uszkodzonej i nieuszkodzonej, u szczurów szczepu Wistar przed oraz do 12 dni po chronicznej konstrikcji nerwu kulszowego. Obserwuje się istotne obniżenie progu wycofania łapy w odpowiedzi na bodźce mechaniczne w uszkodzonej tylnej łapie po stronie ipsilateralnej w porównaniu z nieuszkodzoną tylną łapą po stronie kontralateralnej. Przedstawiono tutaj czas latencji wycofania termicznego w obu łapach, uszkodzonej i nieuszkodzonej, przed oraz do 12 dni po chronicznej konstrikcji nerwu kulszowego.
Podobnie, czas utajenia odruchu wycofania termicznego jest znacznie skrócony w uszkodzonej kończynie tylnej po stronie ipsilateralnej w porównaniu z nieuszkodzoną kończyną tylną po stronie kontralateralnej. Po opanowaniu techniki operacja CCI może być prawidłowo wykonana w czasie zaledwie 20 minut na zwierzę, co prowadzi do długotrwałej nadwrażliwości bólowej kończyny tylnej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o luźnym wiązaniu ligaturek, ponieważ to samo zaciskanie się pod wiązaniami w wyniku obrzęku powoduje późniejszą konstrikcję.
Ta technika uszkodzenia nerwu obwodowego w połączeniu z badaniem fali P nadwrażliwości bólowej pozwala badaczom z dziedziny bólu neuropatycznego na eksplorację mechanizmów leżących u podstaw chronicznego bólu spowodowanego uszkodzeniem nerwu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metodę przewlekłego ucisku nerwu kulszowego (chronic constriction injury), będącą szeroko stosowanym modelem gryzoni w badaniach nad bólem neuropatycznym. Procedura ta umożliwia ilościowy pomiar zachowań bólowych w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i termiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Badania nad przewlekłym bólem
Wstęp
- Przewlekłe uciśnięcie nerwu kulszowego jest istotnym modelem bólu neuropatycznego.
- Model ten charakteryzuje się wystąpieniem nadwrażliwości bólowej w ciągu 24 godzin po zabiegu chirurgicznym.
- Techniki pomiarowe obejmują testy von Frey oraz testy analgezji podeszwowej.
- Model ten pomaga w zrozumieniu mechanizmów bólu neuropatycznego.
Cel badania
- W celu wykonania przewlekłego uszkodzenia uciskowego nerwu kulszowego u gryzoni.
- W celu ilościowej oceny zachowań bólowych wynikających z uszkodzenia.
- W celu zbadania obwodowych i ośrodkowych mechanizmów bólu neuropatycznego.
Zastosowane metody
- Założenie czterech podwiązań z chromowanego jelita wokół nerwu kulszowego.
- Monitorowanie zachowań bólowych tylnej łapy w określonych punktach czasowych.
- Pomiar progu wycofania łapy w odpowiedzi na bodźce mechaniczne przy użyciu estezjometru von Frey.
- Pomiar czasu utajenia wycofania łapy w odpowiedzi na bodźce termiczne przy użyciu analizatora analgezji podeszwowej.
Główne wyniki
- Ustanowienie mechanicznej i termicznej nadwrażliwości na ból w uszkodzonej tylnej łapie.
- Ilościowe dane wykazujące wywołane reakcje wycofania w odpowiedzi na bodźce.
- Wgląd w mechanizmy bólu neuropatycznego.
- Podstawa do badania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu bólu.
Wnioski
- Model przewlekłego uszkodzenia uciskowego (chronic constriction injury) jest skuteczny w badaniu bólu neuropatycznego.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji na temat potencjalnych podejść terapeutycznych w celu zmniejszenia nadwrażliwości bólowej.
- Model ten stanowi podstawę do dalszych badań nad mechanizmami przewlekłego bólu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model przewlekłego uszkodzenia uciskowego (CCI) umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka celów terapeutycznych w bólu neuropatycznym poprzez ustanowienie powtarzalnych fenotypów nadwrażliwości bólowej. Ilościowy pomiar progów wycofania mechanicznego i termicznego zapewnia pewność predykcyjną niezbędną do walidacji celów w procesie odkrywania leków przeciwbólowych. Ten system istotny z punktu widzenia choroby wspiera dostrojenie translacyjnych biomarkerów oraz ciągłość modelu przedklinicznego dla decyzji go/no-go w potokach rozwoju terapii przeciwbólowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ustalenie związków przyczynowych między uszkodzeniem nerwu kulszowego a fenotypami nadwrażliwości bólowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki standaryzowanej indukcji stanów bólu neuropatycznego u gryzoni.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określenie zaangażowania celu za pomocą odwrócenia nadwrażliwości w łapach uszkodzonych w porównaniu do nieuszkodzonych.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do oceny związków chemicznych z wykorzystaniem pomiarów von Frey oraz analgezji podeszwowej.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza powtarzalne pomiary progu wycofania i czasu latencji w celu charakterystyki zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność przesiewania: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dzięki zrównoważonemu testowaniu uszkodzonych i nieuszkodzonych tylnych łap w różnych punktach czasowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje mechanizmy obwodowego bólu neuropatycznego zgodne z symptomatologią przewlekłego bólu u ludzi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację celu w fazie odkryć z przedklinicznymi badaniami skuteczności poprzez punkty końcowe nadwrażliwości.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go poprzez wykazanie zależnej od celu atenuacji mechanicznych i termicznych reakcji bólowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model CCI wpisuje się w kontinuum odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjne udoskonalanie kandydatów na leki przeciwbólowe w oparciu o modulację fenotypu bólu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie uszkodzenia nerwów obwodowych z mierzalnymi fenotypami nadwrażliwości.
- Przesiew: Zapewnia gotowość testów dzięki ustandaryzowanym protokołom stosowania bodźców mechanicznych i termicznych.
- Analityka: Dostarcza odczyty progu wycofania i czasu latencji, które umożliwiają porównania międzygrupowe i obliczenie wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy wyjaśnianie mechanizmów z walidacją przedkliniczną poprzez spójne wskaźniki nadwrażliwości bólowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny wielu celów przeciwbólowych w ramach kampanii odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach bólu neuropatycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym parametrom ligacji oraz procedurom testowania w ślepej próbie.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku celów, które prawdopodobnie nie będą modulować nadwrażliwości.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację efektów celu na ustalonych fenotypach bólu.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii gryzoni oraz neurobiologii behawioralnej w celu zapewnienia spójności ligacji nerwu i habituacji.
- Zależność od skalibrowanych estezjometrów von Frey oraz mierników analgezji podeszwowej w celu dokładnego pomiaru progu i latencji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie czasu przeprowadzania operacji, kontroli środowiska testowego oraz zrównoważonej oceny łap.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy przenoszeniu protokołów CCI u szczurów na inne gatunki lub modele bólu.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność siły ligacji wpływająca na stopień uszkodzenia i nasilenie nadwrażliwości.
