Name: Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do analizy defektów migracji neuronów w transgenicznych modelach mysich. Technika umożliwia precyzyjną manipulację genową w określonych populacjach komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Pierre'owi Mattarowi i Fredzie Miller za ich pomoc przy elektroporacji in utero oraz Noelowi Ghanemowi i Bensun Fongowi za tworzenie diagramów. Dziękujemy Lindzie Jui i Jasonowi G. MacLaurinowi za doskonałą pomoc techniczną. Sprzęt został wsparty przez Centrum Rehabilitacji po Udarze Mózgu.
Ta praca była wspierana przez stypendium od HSFO i OGS dla D.S.S. oraz grant CIHR dla R.S.S.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie i materiały przedoperacyjne
<ol>
	<li>Przygotowanie plazmidu:
	<ol>
		<li>Przygotuj plazmidy za pomocą Qiagen MegaPrep zgodnie z protokołem producenta. Zaintruj co najmniej 400 ml bulionu LB przekształconymi bakteriami, aby zapewnić wysoką wydajność DNA i inkubuj przez noc.</li>
		<li>Zawiesić plazmid w 100-200 μl TE do końcowego stężenia co najmniej 5 μg/μl. Podwielokrotność DNA i przechowywać w temperaturze -20 °C. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, nie wytrącaj i nie zawieszaj ponownie, ponieważ może to spowodować dodanie zanieczyszczeń. Zacznij od nowa z nowym preparatem.</li>
		<li>Przed zabiegiem należy rozcieńczyć pojedynczy plazmid (na przykład Cre-GFP) do 2 μg/μl w sterylnej wodzie z 1 μl 0,1% (w/v) barwnika Fast Green na 10 lub 20 μl rozcieńczonego roztworu plazmidu. Jeśli GFP i gen będący przedmiotem zainteresowania mają być elektroporowane na oddzielnych plazmidach, wstrzyknij plazmid GFP i plazmid przenoszący gen będący przedmiotem zainteresowania w stosunku 1:4, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że wszystkie komórki oznaczone GFP są koelektroporowane z obydwoma plazmidami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciągnąć szklane rurki mikrokapilarne (średnica zewnętrzna 1 mm - zwane dalej igłami) za pomocą standardowego ściągacza igłowego, używając jednostopniowego pociągnięcia w temperaturze 62 °C.</li>
	<li>Autoklaw zestaw chirurgiczny zawierający następujące elementy: uchwyty do igieł, zwijacz rany, kleszcze, nożyczki do operacji, nożyczki do igieł, zszywacz, zszywki, gaza, osłony ran, obłożenia chirurgiczne (ryc. 1A, B; Tabela materiałów).</li>
	<li>Zbierz inne potrzebne narzędzia: Elektroporator, Mikroiniektor Femtojet, Pęseta (5 lub 7 mm), sól fizjologiczna, szew, strzykawka 5 ml (Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Przygotuj mysz do operacji
<ol>
	<li>W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć myszom w ciąży w ciąży buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała) na godzinę przed zabiegiem. Zastosuj ten protokół do myszy, których czas trwał od 12,5 dnia embrionalnego (E12,5) do E17,5.</li>
	<li>Użyj końcówek do pipet z mikroładowarką, aby ponownie załadować ciągnięte igły roztworem plazmidu. Nie należy jeszcze napełniać igły do końca, ponieważ spowoduje to zatkanie igły.</li>
	<li>Znieczulić mysz za pomocą 2-5% gazu izofluranowego o stężeniu 1 l/minO2. Po unieruchomieniu umieść maskę na twarz i nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) podskórnie w plecy. 
	UWAGA: Podczas pracy z gazem izofluranowym należy użyć pochłaniacza gazu, aby wychwycić nadmiar gazu i zapobiec jego ucieczce do pomieszczenia.</li>
	<li>Ogolić brzuch. Umyj brzuch peelingiem chloroheksadynowym, spłucz wodą i nałóż końcowy roztwór przygotowawczy z chloroheksadyny i 70% etanolu. Przykryj mysz sterylną serwetą lub gazą, aby przykryć futro, ale pozostaw odsłonięty brzuch (ryc. 1C, D).</li>
</ol>
3. Elektroporacja in utero 
<ol>
	<li>Wykonaj nacięcie w skórze nad brzuchem między dolnymi strzykami. Odciągnij skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej, rozrywając tkankę łączną, a następnie przetnij otrzewną do jamy brzusznej wzdłuż kresy białej. Włóż zwijacz rany, aby rozsunąć krawędzie rany.</li>
	<li>Wyjmij macicę z jamy brzusznej i ułóż ją, jak pokazano (ryc. 1E).
	<ol>
		<li>Jeśli różne młode mają zostać wstrzyknięte z różnymi plazmidami (np. GFP vs. GFP z genem będącym przedmiotem zainteresowania), policz młode z każdej strony i zdecyduj, które z nich i ile wstrzyknąć z każdym plazmidem. Zamień jedną stronę macicy z powrotem do brzucha, aby zarodki były ciepłe i nasmarowane. Odsłoniętą macicę należy natychmiast zwilżyć solą fizjologiczną (najlepiej podgrzaną do temperatury ciała).</li>
		<li>W przypadku wstrzykiwania wszystkim szczeniętom tego samego plazmidu (np. podczas wstrzykiwania Cre-GFP do transgenicznych zarodków) należy usunąć tylko jeden róg macicy na raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić obciążoną igłę w uchwycie różdżki iniekcyjnej i ostrożnie odciąć końcówkę małymi nożyczkami chirurgicznymi lub cienkimi kleszkami. Przeciąć końcówkę tak, aby igła pozostała tak długa, jak to możliwe, jednocześnie umożliwiając przepływ płynu (Rysunek 1Ji-iv).
	<ol>
		<li>Dostosuj długość wstrzyknięcia (w sekundach) i ciśnienie wtrysku na mikrowtryskiwaczu tak, aby mała, ale łatwo widoczna kropla o stężeniu 0,1-0,2 μl pojawiła się na końcu igły po naciśnięciu podkładki stopy. Utrzymuj objętość tej kropli tak równomiernie, jak to możliwe między różnymi igłami. 
		UWAGA: ten etap ma kluczowe znaczenie dla przeżycia zarodka (patrz dyskusja).</li>
		<li>Dla Femtojet należy stosować następujące parametry wtrysku: ciśnienie wtrysku (pi) = 250-300 hPa; czas wtrysku (ti) = 0,8-1,2 sek; ciśnienie kompensacyjne = 10-50 hPa. W razie potrzeby dostosuj te parametry, aby uwzględnić różnice między igłami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz zarodek i delikatnie ułóż go na plecach, z głową pochyloną do góry (ryc. 1F). 
	UWAGA: Może to wymagać obrócenia lub przesunięcia zarodka; Należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku i unikać pęknięcia worka owodniowego podczas manipulowania zarodkiem.</li>
	<li>Gdy zarodek znajdzie się na miejscu, zlokalizuj komorę, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Przyłóż końcówkę igły do macicy nad komorą pod niewielkim kątem i przeprowadź igłę przez ścianę macicy. Wymagana siła nacisku zależy od ostrości igły. Wbić igłę przez korę do komory. 
	UWAGA: Chociaż rzadko występuje dodatkowy wykrywalny opór, głowa zarodka jest często lekko odsuwana, a następnie cofa się, gdy igła przechodzi przez korę do komory.</li>
	<li>Napompuj łopatkę nożną, aby wstrzyknąć roztwór plazmidu. Kontynuuj pompowanie, aż pojawi się zielony obszar, który dostosuje się do kształtu łuku komory (ryc. 1G). U młodych zarodków (E12,5 do E14,5) barwnik często dyfunduje do przeciwległej komory. 
	UWAGA: Liczba pompek zależy od średnicy końcówki igły, wieku zarodka (i wynikającej z niego wielkości komory) oraz pożądanej objętości wstrzyknięcia. Utrzymuj jak najbardziej stałą objętość wstrzykniętych zarodków.</li>
	<li>Wstrzyknąć trzy lub cztery zarodki. Utrzymuj wszystkie odsłonięte zarodki wilgotne solą fizjologiczną przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Wróć do pierwszych wstrzykniętych zarodków i umieść łopatki tak, aby elektroda dodatnia wciągnęła plazmid do pożądanego obszaru mózgu (ryc. 1H). Ustawić elektrodę ujemną pod takim kątem, aby najkrótsza droga między elektrodami przechodziła bezpośrednio przez strukturę przeznaczoną do elektroporacji (rysunek 2).</li>
	<li>Gdy łopatki znajdą się na miejscu, zastosuj amortyzator. W zależności od wieku i wielkości zarodków należy zastosować 5 impulsów o napięciu 35-50 V (patrz Tabela 1). Należy zastosować następujące parametry elektroporacji: długość impulsu 5 ms z interwałem impulsu 950 ms. Powtórzyć tę czynność ze wszystkimi wstrzykniętymi zarodkami.</li>
	<li>Odetnij końcówkę nowej, wstępnie załadowanej igły, jak w kroku 3.3, ponieważ ostatnia igła prawdopodobnie wyschła i zatkała się w kroku 3.9. Wstrzyknąć następny zestaw trzech lub czterech zarodków z tym samym lub innym plazmidem, a następnie zastosować wstrząs, jak w kroku 3.9. Kiedy wszystkie młode po jednej stronie macicy zostaną wstrzyknięte, usuń drugą stronę macicy z brzucha samicy, a następnie wymień gotową stronę, aby utrzymać ją w cieple.</li>
	<li>Zwróć obie strony macicy do samicy, uważając, aby powierzchnia była wilgotna solą fizjologiczną i nie wywierała zbyt dużego nacisku, aby zapobiec urażeniu worków owodniowych. Zszyj warstwę mięśniową zamkniętą za pomocą prostego ciągłego ściegu. Zszyj skórę zszywką. Jeśli zszywki nie są dostępne, zszyj skórę prostym przerywanym szwem. (Rysunek 1I)</li>
	<li>Podczas szycia stopniowo zmniejszaj dawkę izofluranu, aby znieczulenie ciężarnej kobiety uległo znieczuleniu. 
	UWAGA: Przyspieszy to pobudzenie matki po zakończeniu operacji; Utrzymywanie samicy w znieczuleniu przez jak najkrótszy czas poprawi przeżywalność zarodka. Całkowity czas operacji, licząc od momentu pierwszego znieczulenia kobiety, powinien wynosić około 30 minut.</li>
</ol>
4. Opieka po leczeniu
<ol>
	<li>Umieść zszytą samicę w inkubatorze lub na poduszce grzewczej, aby wyzdrowiała ze znieczulenia. Ułóż ją na czystej pościeli i umieść standardowy żel regeneracyjny w klatce, aby utrzymać nawodnienie. W celu leczenia bólu po zabiegu chirurgicznym należy podać kobiecie trzy dawki buprenorfiny (0,05 mg/kg masy ciała) w odstępach 8 godzin po operacji, a następnie cztery dodatkowe dawki w odstępach 12-godzinnych. </li>
</ol>
5. Zbieranie mózgów
UWAGA: Mózgi mogą być zbierane w każdym wieku, aż do dorosłości. Poniższe zasady dotyczą pobierania mózgów przed urodzeniem. Należy pamiętać, że po urodzeniu szczeniąt porządek w macicy zostaje utracony, więc albo każde szczenię w miocie musi zostać wstrzyknięte tym samym plazmidem, albo należy opracować inną metodę rozróżniania między zwierzętami kontrolnymi a doświadczalnymi.
<ol>
	<li>Przygotuj zimny (4 °C), przefiltrowany 4% paraformaldehyd (PFA) przed eutanazją samic.</li>
	<li>Poddać samicy eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu (100 mg/kg masy ciała) i rozciąć brzuch. Wyciągnij obie strony macicy i ułóż tak, jak wtedy, gdy młode zostały początkowo wstrzyknięte.
	<ol>
		<li>W przypadku, gdy wszystkie młode otrzymały ten sam plazmid, na przykład podczas wstrzykiwania Cre do transgenicznego miotu, kolejność zarodków nie jest ważna, dlatego wyciąć macicę z samicy i umieścić w PBS.</li>
		<li>Jeśli szczeniętom wstrzyknięto różne plazmidy, należy zlokalizować każde szczenię, zwracając uwagę na martwe szczenięta i określić, którym z nich wstrzyknięto plazmidy kontrolne i eksperymentalne przed usunięciem macicy od samicy. Uważaj, aby śledzić, które młode należy do której grupy po tym, jak macica znajduje się w PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń każde szczenię z osobna, odetnij głowę ostrymi nożyczkami lub żyletką i umieść głowę w PBS. W przypadku myszy transgenicznych należy pobrać próbki tkanek do genotypowania i trzymać każdą głowę oddzielnie, na przykład na płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną usuń mózg z czaszki, uważając, aby nie naciąć kory ani nie rozerwać linii środkowej. Używając mikroskopu fluorescencyjnego, sprawdź, czy mózgi mają plaster GFP+, wskazujący, że zostały pomyślnie elektroporowane.</li>
	<li>Napraw mózg przez zanurzenie w PFA w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Sprawdź mózgi pod kątem ekspresji GFP przed fiksacją, ponieważ PFA często gasi sygnał.</li>
	<li>Cryoprotect mózgi poprzez zanurzenie w 20% sacharozie na co najmniej trzy dni przed zamrożeniem. Użyj gradientu sacharozy 10%, 15% i 20% (24 godziny w każdym roztworze), aby zapobiec uszkodzeniom tkanek spowodowanym ciśnieniem osmotycznym. Zamrożone mózgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C i ciąć na kriostacie w odcinkach o grubości 10-14 μm.</li>
</ol>
6. Współbarwienie za pomocą anty-GFP
UWAGA: Jeśli konieczne jest pobranie antygenu w celu jednoczesnego barwienia z anty-GFP, ważne jest, aby użyć łagodnego protokołu odzyskiwania antygenu, który nie narusza sygnału GFP. Niektóre protokoły pobierania antygenu są zbyt surowe, aby można je było stosować w połączeniu z barwieniem GFP (nawet z przeciwciałem przeciwko GFP). Wstępna obróbka podstawowym kwasem cytrynowym przed zastosowaniem przeciwciała pierwszorzędowego jest skuteczna w przypadku większości epitopów 24.
<ol>
	<li>Przygotować 0,01 M roztwór kwasu cytrynowego w ddH2O. pH do 6 za pomocą skalibrowanego pH-metru.</li>
	<li>Podgrzej kwas cytrynowy w komorze barwienia w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej, aż kwas cytrynowy osiągnie temperaturę 75-80 °C. Umieść szkiełka w komorze barwienia na 10-15 minut. Utrzymuj temperaturę tak stabilną, jak to możliwe.</li>
	<li>Myć szkiełka w PBS 3x przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe i kontynuuj barwienie immunologiczne zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
	<li>Walidacja wycięcia za pośrednictwem Cre poprzez wspólne znakowanie GFP i genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu potwierdzenia knock down (ryc. 3A).</li>
</ol>

<ol><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li>
<li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li>
<li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+requirement+for+Rb%2FE2F3+in+neuronal+migration%3A+evidence+for+cell+cycle-independent+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li>
<li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li>
<li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li>
<li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li>
<li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li>
<li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li>
<li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li>
<li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.</li>
<li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).</li>
<li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((targeting+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li>
<li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein%2C+Rb%2C+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li>
<li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li>
<li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li>
<li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.</li>
<li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Dwa z głównych wyzwań związanych z wykonywaniem elektroporacji in utero to: 1) zapobieganie śmiertelności zarodków oraz 2) zmniejszanie zmienności między elektroporacjami. Jednym z najważniejszych czynników zapobiegających śmiertelności jest jakość igieł, ponieważ igły powodują większe uszkodzenia zarodka. Podczas nacinania igły należy trzymać końcówkę tak długo, jak to możliwe, jednocześnie pozwalając, aby po pompowaniu łopatki nożnej pojawiła się widoczna kropla 0,1-0,2 μl płynu (Rysunek 1J). ...

Migracja promieniowa jest centralnym procesem wczesnego rozwoju kory mózgowej. Zależy to od różnych czynników autonomicznych komórki, takich jak prawidłowe wyjście mitotyczne i różnicowanie neuronów, polaryzacja komórek, regulacja dynamiki cytoszkieletu i ekspresja receptorów transbłonowych, a także czynniki autonomiczne dla komórek, takie jak tworzenie promienistego rusztowania glejowego i wydzielanie migrujących cząsteczek naprowadzających1-3. Ponieważ zakłócenie któregokolwiek z tych mechanizmów może upośledzać migrację neuronów w transgenicznym modelumyszy 4-8, określenie podstawowej przyczyny defektu migracji może być złożonym i trudnym procesem. Elektroporacja in utero (IUE) może być wykorzystana do uzupełnienia i uproszczenia interpretacji fenotypu genetycznego modelu nokautu, a tym samym do wyjaśnienia ważnych mechanizmów wymaganych do migracji radialnej7,9-11.
Elektroporacja in utero (IUE) to proces, w którym plazmid przenoszący zarówno interesujący gen, jak i reporter jest wstrzykiwany do komory w mózgu zarodka myszy lub szczura, a następnie wciągany do komórek wyściełających komorę za pomocą prądu elektrycznego12-14. Dzięki temu badacz może przeanalizować wpływ regulacji w górę lub w dół interesującego genu na rozwój lub funkcję neuronów elektroporowanych. Po IUE mózgi mogą być przetwarzane pod kątem immunohistochemii 7,9-11, elektrofizjologii 15 lub hodowli komórkowej 16,17. Główną zaletą IUE jest to, że pozwala na wysoce specyficzną manipulację ekspresją genów. Co więcej, IUE może być używany do celowania w określony obszar rozwijającego się mózgu za pomocą ukierunkowanego prądu (ryc. 2). IUE może być również stosowany do celowania w określony typ komórek poprzez wstrzykiwanie plazmidów przenoszących geny pod kontrolą różnych promotorów lub systemów aktywacji plazmidów (przykładem jest ekspresja genów indukowana tetracykliną) 10,18-21.
IUE może być używane w połączeniu z systemem wycinania genów za pośrednictwem Cre-Lox 7-9,11,22. Plazmid zawierający gen kodujący wiadomość dla białka Cre może być elektroporowany do zarodka homozygotycznego pod względem floksowanego allelu (w którym gen lub specyficzne regiony DNA są otoczone dwoma miejscami loxP dla rekombinacji DNA za pośrednictwem Cre). Cre następnie indukuje rekombinację genu będącego przedmiotem zainteresowania, szczególnie w elektroporowanych prekursorach neuronalnych, generując nokaut floksowanego allelu. Następnie można badać wpływ knockdownu białek na migrację i rozwój neuronów w obrębie poszczególnych neuronów. Elektroporacja Cre indukuje rekombinację tylko w niewielkiej populacji dotkniętych komórek, pozostawiając nienaruszone środowisko nośne. W przeciwieństwie do tego, specyficzna tkankowo ekspresja Cre pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki zachodzi w całej tkance, tak że może to mieć wpływ zarówno na migrujące neuroblasty, jak i otaczające środowisko. Tak więc zestawienie tych dwóch podejść może określić, czy dana wada migracyjna jest spowodowana mechanizmami autonomicznymi komórkami, czy nieautonomicznymi komórkami. Wadliwa migracja w obu systemach eksperymentalnych sugeruje, że obserwowany fenotyp wynika z autonomicznego mechanizmu komórki; normalna migracja po elektroporacji Cre z wadliwą migracją w specyficznym dla tkanki modelu Cre wskazuje, że gen będący przedmiotem zainteresowania działa poprzez autonomiczny mechanizm niekomórkowy.
IUE może być również używane do przeprowadzania eksperymentów ratunkowych poprzez elektroporację potencjalnie oddziałujących genów na nokautujących zwierzętach 7,9,10. Na przykład, badacz może próbować uratować fenotyp migracji w modelu transgenicznym poprzez elektroporację celu i określenie, czy defekt migracji jest korygowany w neuronach poddanych elektropostacji. Ma to dodatkową zaletę, że udana akcja ratunkowa wskazuje, że normalna migracja może zostać przywrócona poprzez manipulowanie ekspresją białka w określonym neuronie, nawet jeśli otaczające środowisko jest nadal niewystarczające dla docelowego genu. Ponownie, podejście to jest bardziej efektywne czasowo i kosztowo niż krzyżowanie lub generowanie linii transgenicznych, z dodatkową korzyścią w postaci określenia, czy wadliwy mechanizm jest autonomiczny dla komórek.
IUE może być używane do śledzenia migrujących neuronów poprzez elektroporację plazmidu reporterowego do wybijanych zarodków (Rysunek 4C). Ponieważ tylko neurony wyściełające komorę w czasie operacji są elektroporowane 17, IUE może być używany do śledzenia neuronów urodzonych w określonym czasie z korzyścią wizualizacji ich morfologii in vivo.
Wreszcie, możliwe jest użycie IUE do celowania w obszary mózgu, takie jak kresomózgowie przyśrodkowe lub grzbietowe, hipokamp lub wyniosłość zwojowa (Rysunek 2). Daje to naukowcom możliwość badania funkcji genów w określonym obszarze niezależnie od powikłań wynikających z knockdownu białek w sąsiednich strukturach.
Białko siatkówczaka (pRb), p107 i p130 stanowią rodzinę białek kieszonkowych i są dobrze znanymi regulatorami wyjścia z cyklu komórkowego. Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że białka te regulują również niezależne od cyklu komórkowego aspekty rozwoju neuronalnego. Jak wykazaliśmy wcześniej, pRb i p107 odgrywają kluczową rolę zarówno w migracji stycznej 4,23, jak i radialnej 6. W tym miejscu pokazujemy rolę członków rodziny białek kieszonkowych pRb i p107 w migracji neuronalnej 6, aby zilustrować zastosowanie elektroporacji Cre w macicy w modelu transgenicznym. Podsumowując, IUE zapewnia potężny sposób analizy autonomicznych efektów delecji genów (lub nadekspresji) komórek. W połączeniu z modelami nokautu specyficznymi dla tkanki, IUE może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmów kontrolujących migrację neuronów.

<table><tbody><tr><td>Elektroporator prostokątny ECM 830</td><td>Aparat BTX Harvard</td><td>45-0052</td><td>Tylko elektroporator &ndash; kup osobno (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Przełącznik nożny do ECM 830</td><td>BTX Aparat Harvard</td><td>45-0211</td><td>Łopatka nożna jest niezbędna do elektroporacji bez użycia rąk</td></tr><tr><td>Pęsety</td><td>BTX Aparat</td> <td>Harvard45-0489 (5mm)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>Platynowe elektrody kleszczowe</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Chwytak do mikroiniektorów</td></tr><tr><td>0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Trzyma ciągniętą igłę</td></tr><tr><td>Uniwersalny uchwyt kapilarny</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Łączy chwytak z</td></tr><tr><td>rurką Rurka iniekcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Łączy uchwyt kapilarny z Femtojet</td></tr><tr><td>Sterownik nożny</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Łopatka nożna do wstrzykiwania bez użycia rąk</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Końcówki do ładowania ciągniętych rurek kapilarnych</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, odczynniki,</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Nietoksyczny barwnik</td></tr><tr><td>Extra Fine Nożyczki Bonn</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>Do przycinania igieł</td></tr><tr><td>Bonn Zez Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Proste</td></tr><tr><td>zwijacze Colibri</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Zszywacz</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>Do klipsów</td></tr> <tr><td>7mmCastroviejo Uchwyt igły</td><td>Narzędzia medyczne</td><td>SNH-6737</td><td>Prosty, z blokadą</td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Do wyciągania mikrokapilar</td></tr><tr><td>Mikrokapilary</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0,4 mm szklane rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej</td></tr></tbody></table>

indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Delecjonowanie genetyczne za pomocą systemu Cre-Lox w transgenicznych liniach myszy jest potężnym narzędziem używanym do badania funkcji białek. Jednakże, z wyjątkiem bardzo specyficznych modeli Cre, delecja białka w całej populacji tkanek lub komórek często prowadzi do złożonych fenotypów wynikających z wielu oddziałujących mechanizmów. Ustalenie, czy fenotyp wynika z zakłócenia autonomicznego mechanizmu komórki, który jest nieodłączny od danej komórki, czy też z nieautonomicznego mechanizmu niekomórkowego, który wynikałby z upośledzenia środowiska tej komórki, może być trudne do rozpoznania. Aby uzyskać wgląd w funkcję białka w kontekście in vivo, elektroporacja in utero (IUE) umożliwia delecję genów w niewielkim podzbiorze komórek w rozwijającej się korze mózgowej lub innym wybranym regionie mózgu. IUE może być używany do celowania w określone obszary mózgu, w tym kresomózgowie grzbietowe, kresomózgowie przyśrodkowe, hipokamp lub wyniosłość zwojową. Ułatwia to obserwację konsekwencji autonomicznej delecji genów w kontekście zdrowego środowiska. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób IUE może być wykorzystany do analizy defektu migracji radialnej w transgenicznej linii myszy floksowej, z naciskiem na rozróżnienie między autonomicznymi i nieautonomicznymi komórkami efektów delecji białka. Porównując fenotyp wynikający z delecji genu w całej korze z delecją genu za pośrednictwem IUE w ograniczonej populacji komórek, można uzyskać lepszy wgląd w funkcję białka w rozwoju mózgu niż przy użyciu którejkolwiek z tych technik w izolacji.

Różne obszary mózgu można poddać elektroporacji poprzez zmianę orientacji elektrod płatowych nad głową zarodka (Rysunek 2). W przypadku wszystkich części przedmózgowia plazmid wstrzykuje się do komory bocznej (do tylnomózgowia można dotrzeć, wstrzykując go do komory czwartej). Generalnie należy umieścić elektrody tak, aby linia prosta między nimi przechodziła przez obszar zainteresowania, przy czym DNA jest przyciągane w stronę elektrody dodatniej. Aby skierować działanie na korę boczną (Rysunek ...

Migracja neuronów jest regulowana przez liczne czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórki. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać elektroporację in utero do określenia, czy fenotyp u myszy transgenicznej jest spowodowany zakłóceniem wewnętrznego mechanizmu komórki lub upośledzeniem interakcji między neuronem a jego środowiskiem.

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza defektów w rozwoju i migracji neuronów w transgenicznych modelach myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero różnych obszarów embrionalnej przodomózgowia. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie plazmidu przenoszącego geny Cree i białka reporterowego, takiego jak GFP, do komory embrionalnego mózgu i przyłożenie prądu elektrycznego do głowy, aby wciągnąć ten plazmid do wyściółki komórkowej komory. W drugim etapie zarodki są zwracane do jamy brzusznej matki, aby umożliwić zarodkom dalszy rozwój, podczas gdy fałda ulega ekspresji i pośredniczy w wycięciu genu specyficznie w neuronach poddanych elektropostacji.Następnie pobiera się zarodki, a mózgi są przygotowywane do analizy w celu określenia efektu wycięcia genu za pośrednictwem CRE i późniejszego knockdownu białka w neuronach poddanych elektroporacji; uzyskuje się wyniki, które pokazują, w jaki sposób wycięcie interesującego genu reguluje rozwój i migrację neuronów w sposób specyficzny dla komórki przy użyciu chemii immunohistologicznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak specyficzne tkankowo transgeniczne linie CRE, jest to, że elektroporacja Cree wycina interesujący nas gen tylko z niewielkiej populacji neuronów w regionie mózgu wybranym przez badacza, co znacznie upraszcza wyniki i ułatwia analizę fenotypu. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki chirurgiczne mogą być bardzo trudne do nauczenia, a zarodki na tym etapie są bardzo delikatne i łatwe do nieumyślnego uszkodzenia.Przed zabiegiem należy rozcieńczyć pojedynczy plazmid do dwóch mikrogramów na mikrolitr w sterylnej wodzie z jednym mikrolitrem 0,1% wag na objętość szybkiego zielonego barwnika na 10 lub 20 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu plazmidu. Następnie pociągnij szklane rurki mikrokapilarne na standardowej mikropipecie biegunowej w jednym kroku o temperaturze 62 stopni Celsjusza. Następnie użyj końcówek pipet do mikropodajnika, aby ponownie załadować wyciągnięte igły roztworem plazmidu.Nie należy napełniać igły do końca, ponieważ spowoduje to zatkanie igły. W tej procedurze wykonaj nacięcie w skórze nad brzuchem między dolnymi kępkami znieczulonej ciężarnej myszy. Odciągnij skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej, rozrywając tkankę łączną.Następnie przeciąć otrzewną do jamy brzusznej wzdłuż liniowego łokcia. Włóż zwijacz rany, aby rozsunąć krawędzie. Następnie wyjmij macicę z jamy brzusznej i ułóż ją zgodnie z ilustracją.Jeśli różne szczenięta mają zostać wstrzyknięte z różnymi plazmidami, policz młode z każdej strony i zdecyduj, które z nich i ile wstrzyknąć z każdym plazmidem, wróć jedną stroną macicy z powrotem do jamy brzusznej, aby zarodki były ciepłe i nasmarowane, natychmiast zwilż odsłoniętą macicę ciepłym solą fizjologiczną. Następnie umieścić załadowaną igłę w głowicy uchwytu różdżki iniekcyjnej. Ostrożnie odetnij końcówkę małymi nożyczkami chirurgicznymi lub cienkimi kleszczami w taki sposób, aby igła pozostała jak najdłużej, jednocześnie umożliwiając przepływ płynu.Następnie wyreguluj długość iniekcji i ciśnienie wtrysku na mikrowtryskiwaczu tak, aby na końcu igły pojawiła się mała, ale łatwo widoczna kropla o wielkości od 0,1 do 0,2 mikrolitra. Po naciśnięciu łopatki pod stopę utrzymuj objętość tej kropli tak spójną, jak to możliwe między różnymi igłami. Teraz wybierz zarodek i delikatnie ułóż go na plecach z głową pochyloną do góry.Gdy zarodek znajdzie się na miejscu, zlokalizuj komorę, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Dotknąć macicy nad komorą pod niewielkim kątem końcówką igły i przeprowadzić igłę przez ścianę macicy. Następnie wepchnij igłę przez korę do komory.Następnie pompuj łopatkę nożną, aby wstrzyknąć roztwór plazmidu. Kontynuuj pompowanie, aż pojawi się zielony obszar, który dostosuje się do kształtu łuku komory. U młodych zarodków barwnik często dyfunduje do przeciwległej komory.Wstrzyknij łącznie około trzech lub czterech zarodków i utrzymuj wszystkie odsłonięte zarodki w wilgoci soli fizjologicznej przez cały zabieg. Zaczynając od pierwszego wstrzykniętego zarodka, umieść łopatki tak, aby elektroda dodatnia wciągnęła plazmid do pożądanego obszaru mózgu. Ustawić elektrodę ujemną pod takim kątem, aby najkrótsza droga między elektrodami przechodziła bezpośrednio przez strukturę przeznaczoną do elektroporacji.Gdy łopatki znajdą się na miejscu, zastosuj amortyzator. W zależności od wieku i wielkości zarodków użyj pięciu impulsów o napięciu od 35 do 50 woltów, pięciomilisekundowej długości impulsu i 950-milisekundowego interwału impulsów. W przypadku elektroporacji powtórz tę czynność ze wszystkimi wstrzykniętymi zarodkami.Następnie zwróć obie strony macicy myszy. Uważaj, aby powierzchnia była wilgotna solą fizjologiczną i nie wywierała zbyt dużego nacisku, aby zapobiec urazowi saksofonu owodniowego. Następnie zszyj warstwę mięśniową za pomocą prostego ciągłego ściegu.Następnie zszyj skórę pod kątem. Teraz przygotuj cztery stopnie Celsjusza przefiltrowane 4% PFA. Po eutanazji zwierzęcia za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu, należy rozciąć brzuch.Następnie wyciągnij obie strony macicy i ułóż je tak, jak wtedy, gdy młode zostały początkowo wstrzyknięte. Jeśli szczeniętom wstrzyknięto różne plazmidy, pamiętaj, aby zlokalizować każde szczenię, zauważając martwe szczenięta i określić, którym z nich wstrzyknięto plazmidy kontrolne i eksperymentalne. Przed usunięciem macicy od samicy, wyjmij każde młode z macicy i worka owodniowego z osobna.Odetnij głowę ostrymi nożyczkami lub żyletką i umieść głowę w PBS. W przypadku myszy transgenicznych należy pobrać próbki tkanek do genotypowania i trzymać każdą głowę oddzielnie, na przykład na 12-dołkowej płytce pod lunetą sekcyjną, usunąć mózg z czaszki, uważając, aby nie naciąć kory ani nie rozerwać linii środkowej. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprawdź, czy mózgi mają dodatnią plamę GFP wskazującą, że zostały pomyślnie elektroporowane.Następnie utrwal mózgi w PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Teraz podgrzej kwas cytrynowy w miejscu, w którym pH było wcześniej ustawione na sześć, w komorze barwienia w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej, aż osiągnie temperaturę od 75 do 80 stopni Celsjusza. Następnie umieść szkiełka w komorze barwienia na 10 do 15 minut.Następnie umyj szkiełka w PB S3 razy przez trzy minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej. Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe i przystąp do barwienia immunologicznego zgodnie ze standardowym protokołem. Następnie zweryfikuj wycięcie, w którym pośredniczy CRE, poprzez wspólne znakowanie GFP i genu będącego przedmiotem zainteresowania, aby potwierdzić knockdown.Rysunek ten pokazuje potwierdzenie wycięcia za pośrednictwem CRE przez barwienie cos dla dalszego celu usuniętego genu. RB Flokowane, nokaut P 1 0 7 P jeden 30 zarodki flokowane poddano elektropostacji pustym dwuplazmidowym PCI lub dwóm plazmidom Cree PCI i wybarwiono pod kątem GFP i KI 67. Marker proliferacji komórek.Podwójnie barwione komórki zaobserwowano w neuronach, elektroporowanych za pomocą Cree, ale nie w neuronach. Elektroporowane psig. Tylko we dwoje.Wycięcie RB potwierdzono również poprzez wykonanie PCR ze starterami genotypowania na DNA wyekstrahowanym z wycinków tkanek usuniętych ze szkiełek. Górny prążek reprezentuje allel flox F, a dolny prążek reprezentuje allel typu dzikiego. Strzałka wskazuje wycięty allel w elektroporowanej stronie mózgu.Tylko wycięcie za pośrednictwem CRE można również potwierdzić in vitro przy użyciu plazmidów z flokowanymi kodonami stop. Poprzedzające RFP, takie jak NL DS Red RFP, ulega ekspresji w komórkach EK tylko wtedy, gdy COT transfekuje Cree GFP w komórkach HEK 2 93, co wskazuje, że wycięcie powiodło się zgodnie z tą techniką. Inne metody, takie jak hodowla komórkowa, immunohistochemia lub elektrofizjologia, mogą być wykorzystane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące rozwoju i funkcji poszczególnych neuronów po wycięciu genu za pośrednictwem c.Po obejrzeniu tej techniki można zobaczyć, jak elektroporacja in utero może być wykorzystana do celowania w różne obszary mózgu, a to może naprawdę pomóc w zrozumieniu niektórych z tych złożonych fenotypów, które mamy u różnych zwierząt transgenicznych.

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Poznaj metodę elektroporacji in utero do analizy defektów migracji neuronów w transgenicznych modelach mysich. Technika umożliwia precyzyjną manipulację genową w określonych populacjach komórek nerwowych.

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Przeglądaj więcej filmów