Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy
November 6th, 2014
Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie osteoklastów ze szpiku kostnego myszy w dużej liczbie. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie kości od myszy poddanych eutanazji. Następnie komórki są uwalniane ze szpiku kostnego za pomocą moździerza i tłuczka do miażdżenia kości w buforze faktów.
Następnie roztwór szpiku kostnego nakłada się warstwami na podłoże do separacji komórek gradientu gęstości i przeprowadza się separację komórek w gradiencie gęstości. Na koniec warstwa zawierająca interesujące komórki jest odsysana, a komórki umieszcza się w pożywce indukcyjnej mikrofagów szpiku kostnego. Ostatecznie barwienie pułapkowe służy do wykazania obecności dużej liczby osteoklastów.
Implikacje tej techniki rozciągają się na choroby związane ze zmienioną funkcją osteoklastów, które mogą mieć różne nasilenie, od śmiertelnej choroby noworodka z powodu niemożności utworzenia przestrzeni szpikowej dla hematopoezy do częstszych patologii, takich jak osteoporoza, ponieważ daje niezawodną metodę izolowania dużej liczby osteoklastów ze szpiku kostnego myszy. Na początek przynieś 10 mililitrów dostępnej na rynku separacji komórek z gradientem gęstości, od medium do temperatury pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Umieścić 50-mililitrową porcję bufora faksu w temperaturze pokojowej, która ma być użyta z podłożem do separacji komórek z gradientem gęstości.
Po przygotowaniu dodatkowych pożywek i poddaniu eutanazji myszy C 57 black six, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść mysz na desce sekcyjnej i użyj 70% etanolu. Aby go spryskać, zbierz oko i kręgosłup fera piszczelowe. Następnie umieść kości w buforze faktów na lodzie.
Następnie za pomocą czystej bibuły usuń mięśnie i tkanki miękkie z kości. Umieść kości w moździerzu i tłuczku z trzema mililitrami buforu faktów i delikatnie je zmiażdż. Następnie odessaj zabarwiony krwią płyn i przepuść go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.
Dodaj dodatkowe pięć mililitrów buforu efektów do zmiażdżonej kości i zmiażdż dalej przed przeniesieniem płynu przez sitko do 50-mililitrowej probówki. Kontynuuj ten proces, aż płyn przestanie zabarwiać się na czerwono, a następnie granuluj szpik kostny w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić separację gradientową, odessać supernatanty z osadu komórkowego i użyć 10 mililitrów bufora faksu do reanimacji.
Zawiesić osad, przechylić stożkową rurkę z medium do separacji komórek w gradiacji gęstości w temperaturze pokojowej do około 30 stopni i za pomocą pipety elektrycznej z końcówką pipety dociśnij wewnętrzną górną powierzchnię probówki. Powoli nakładać roztwór szpiku kostnego na podłoże za pomocą wirówki o temperaturze pokojowej, bez przyspieszania lub zwalniania. Obracaj gradient z prędkością 200 G przez 15 minut.
Następnie odessaj mętną warstwę środkową, która zawiera interesujące nas komórki i przenieś je do nowej stożkowej rurki. Dodaj 20 mililitrów lodowatego buforu faksu, aby umyć komórki. Następnie użyj jednego mililitra pożywki stymulującej mikrofagi szpiku kostnego, aby ponownie zawiesić końcowe osady komórkowe po zliczeniu komórek.
Umieszczono dwa mililitry pożywki stymulującej mikrofagi w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Następnie dodaj 200 000 komórek do każdej studzienki, gęstość komórek, która zapewni odpowiednią hodowlę osteoklastów in vitro. Delikatnie wymieszaj płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zmiany podłoża przez trzy dni.
Po trzecim dniu zmień pożywkę na pożywkę do indukcji osteoklastów szpiku kostnego i zacznij zmieniać ją codziennie przez pięć do siedmiu dni. W tym momencie powinny być widoczne duże wielojądrowe osteoklasty. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać informacje na temat barwienia i testu resorpcji, jak pokazano tutaj.
Dużą liczbę osteoklastów można potwierdzić za pomocą testu oporności na winiany. Osteoklasty barwiące fosforyny są wizualizowane jako duże fioletowe komórki z wieloma jądrami przy użyciu protokołu pokazanego w tym filmie. Często izoluje się osteoklasty z nawet 30 jądrami na komórkę.
Użycie zmineralizowanej powierzchni jest uważane za złoty standard metody oceny aktywności resorpcyjnej osteoklastów in vitro. Na tym rysunku mikroskopia jasnego pola przy 10-krotnym powiększeniu pokazuje procent zmineralizowanej powierzchni lub wgłębień resorpcyjnych, które są uformowane zgodnie z czarnym kolorem, co pozwala na określenie zdolności resorpcyjnej osteoklastów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak niezawodnie wyizolować dużą liczbę osteoklastów ze szpiku kostnego myszy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę izolacji osteoklastów z szpiku kostnego myszy w dużych ilościach. Proces obejmuje pozyskiwanie kości, uwalnianie komórek i stosowanie separacji gradientu gęstości w celu uzyskania osteoklastów do dalszych badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia kości
- Techniki izolowywania komórek
- Ilościowa ocena aktywności osteoklastów
Tło
- Osteoklasty są niezbędne do resorpcji kości.
- Zrozumienie biologii osteoklastów jest kluczowe dla poznania chorób kości.
- Techniki izolacji posunęły naprzód badania nad tymi komórkami.
- Ten protokół ma na celu zwiększenie wydajności izolowywania osteoklastów do badań.
Cel badania
- Izolować osteoklasty ze szpiku kostnego myszy.
- Hodowla osteoklastów in vitro do analizy eksperymentalnej.
- Ilościowa ocena aktywności osteoklastów za pomocą specyficznych metod barwienia.
Stosowane metody
- Pozbyskiwanie kości od eutanayzowanych myszy.
- Młócenie kości w buforze fakts, aby uwolnić komórki.
- Przeprowadzanie separacji komórek gradientem gęstości.
- Wykorzystanie mikrofagowego medium hodowli szpiku kostnego dla kultury komórkowej.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja osteoklastów w dużych liczbach.
- Skuteczna hodowla osteoklastów in vitro.
- Wykazanie obecności osteoklastów za pomocą barwienia trap.
- Osiągnięta ilościowa ocena aktywności osteoklastów.
Konkluzje
- Protokół zapewnia niezawodną metodę izolacji osteoklastów.
- Ułatwia dalsze badania nad biologią osteoklastów.
- Możliwe zastosowania w badaniach nad chorobami związanymi z kośćmi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable in vitro derivation of osteoclasts from mouse bone marrow enables high-confidence interrogation of bone resorption mechanisms and disease-relevant cellular phenotypes. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in early-stage bone disease drug discovery. The method supports portfolio decisions by providing scalable access to functional osteoclasts for quantitative assessment of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of bone resorption hypotheses in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating osteoclast-specific effects.
- Facilitates functional target validation for bone disease pathways.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Generates validated osteoclast populations for downstream resorption assays.
- Enables standardization of quantitative TRAP staining and resorption pit assays.
- Supports reproducible, scalable workflows for compound screening.
- Allows for robust evaluation of osteoclast-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone remodeling endpoints.
- Provides continuity from cellular mechanism to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted therapeutic candidates.
- Supports translational biomarker development for bone resorption activity.
Pipeline & Workflow Integration
This osteoclast derivation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational studies in bone biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast-mediated bone resorption mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of multinucleation, TRAP positivity, and resorptive capacity for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo bone remodeling and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for osteoclast isolation across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bone resorption target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible osteoclast cultures at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for bone disease programs by reducing biological ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of osteoclast-targeted therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and bone marrow handling.
- Needs access to density gradient separation and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of TRAP staining and resorption assays.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Dependent on careful quantification and validation of osteoclast identity and function.
