Name: Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj metodę izolacji osteoklastów ze szpiku kostnego myszy w dużych ilościach. Protokół obejmuje rozdrabnianie kości, separację gradientową i hodowlę in vitro. Technika umożliwia badanie biologii komórek kostnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie NIH przyznaje R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation i The Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine.

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania z udziałem kręgowców zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Pozwolić, aby 10 ml dostępnej w handlu pożywki do separacji komórek z gradientem gęstości (zawierającej polisacharozę i ditrizoinian sodu, dostosowanych do gęstości 1,077 g/ml) znalazło się w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przygotować bufor do cytometrii przepływowej (FACS) z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 2% płodową surowicą cielęcą (FCS). Pobrać podwielokrotność o objętości 50 ml i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej do użycia podczas etapu separacji komórek w gradieniu gęstości.</li>
	<li>Przygotuj wiadro z lodem do przechowywania izolowanych tkanek i komórek podczas procedury izolacji.</li>
</ol>
2. Przygotuj pożywkę hodowlaną
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże podstawowe: MEM (Minimal Essential Medium), bez czerwieni fenolowej (500 ml), glutaminianu (1x), FCS (10x), 10 000 jednostek/ml penicyliny (1x).</li>
	<li>Przefiltruj media podstawowe za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do indukcji makrofagów szpiku kostnego:
	<ol>
		<li>Pobrać 50 ml podłoża podstawowego przygotowanego w kroku 2.1.</li>
		<li>Dodać prostaglandynę E2 (PGE2, Mr 352,465 g/mol) w stężeniu końcowym 10-7 M.</li>
		<li>Dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w stężeniu 10 ng/ml.</li>
		<li>Nie filtrować końcowego roztworu pożywki stymulującej makrofagi szpiku kostnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów:
	<ol>
		<li>Pobrać 50 ml podłoża podstawowego przygotowanego w kroku 2.1.</li>
		<li>Dodać prostaglandynę E2 (PGE2, Mr 352,465 g/mol) w stężeniu końcowym 10-7 M</li>
		<li>Dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w stężeniu 10 ng/ml.</li>
		<li>Dodać RANKL w stężeniu 10 ng/ml.</li>
		<li>Nie filtrować końcowego roztworu pożywki indukcyjnej osteoklastów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja szpiku kostnego
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji jedną mysz C57BL/6 metodą inhalacji dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięciu szyjki macicy. 
	UWAGA: Gryzonie muszą być poddawane eutanazji przez przeszkolony personel przy użyciu odpowiedniej techniki, sprzętu i środków.</li>
	<li>Ustaw i zabezpiecz mysz na desce preparacyjnej i spryskaj 70% alkoholem.</li>
	<li>Wypreparuj kości udowe, piszczelowe, ramienne i kręgosłup.
	<ol>
		<li>Zacznij od myszy w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie pionowo wzdłuż kończyny dolnej i zacznij od wycięcia wzdłuż kości udowej i piszczelowej, dzieląc przyczepy tkanek miękkich. Na koniec zwichnij kości z kolana i stawu biodrowego, aby całkowicie uwolnić kości od szkieletu.</li>
		<li>Przystąp do wykonania nacięcia wzdłuż kończyny górnej, aby odizolować kość ramienną. Zwichnąć kość ramienną w stawach barkowych i łokciowych, rozcinając przyczep torebki tkanek miękkich.</li>
		<li>Na koniec odwróć mysz tak, aby mysz leżała na brzuchu. Wykonaj nacięcie skóry wzdłuż kręgosłupa, w linii środkowej. Obserwuj tkankę miękką przykręgosłupa po obu stronach kręgosłupa i naciąć wzdłuż kostnej krawędzi kręgosłupa, przecinając masę tkanek miękkich przykręgosłupa. Za pomocą nożyczek wykonaj poziome cięcie w poprzek kręgosłupa u podstawy szyi i na końcu kręgosłupa, tuż proksymalnie do przyczepu ogona, uwalniając kręgosłup od przyczepu tkanek miękkich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zebraniu kości przechowuj je w buforze FACS na lodzie.</li>
	<li>Użyj bibuły, aby oczyścić mięśnie i tkanki miękkie z kości.</li>
	<li>Oczyszczone kości umieścić w tłuczku i moździerzu z 3 ml buforu FACS.</li>
	<li>Delikatnie zmiażdż kości w tłuczku i moździerzu.</li>
	<li>Odessać płyn zabarwiony krwią i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przepuszczając roztwór przez sitko o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu FACS do zmiażdżonej kości i dalej rozdrabniać. Ponownie usunąć płyn za pomocą pipety i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Zazwyczaj miażdży się kości dwa do trzech razy w świeżym buforze FACS, używając moździerza i tłuczka, za każdym razem dodając kolejne 5 ml świeżego buforu FACS, aż płyn nie zabarwi się na czerwono.</li>
	<li>Odwirować roztwór szpiku kostnego o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
</ol>
4. Gradientowa separacja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml buforu FACS (utrzymywanego w temperaturze pokojowej stężenia).</li>
	<li>Pobrać stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 10 ml dostępnych w handlu pożywek do separacji komórek z gradientem gęstości (RT).</li>
	<li>Nałożyć roztwór szpiku kostnego na pożywkę do separacji komórek o gradiencie gęstości. Zrób to powoli za pomocą pipety elektrycznej. Ustawić końcówkę pipety pod kątem względem wewnętrznej powierzchni w pobliżu górnej części stożkowej rurki i przechylić stożkową rurkę pod kątem około 30°. Używając niskiej prędkości na pipecie, delikatnie usunąć roztwór szpiku kostnego, aby nie naruszyć gradientu gęstości pożywki do separacji komórek. 
	UWAGA: Ostatecznie będzie jasna definicja między tymi dwoma roztworami (roztwór komórkowy i roztwór pożywki do separacji komórek z gradientem gęstości).</li>
	<li>Za pomocą wirówki RT odwirować pożywkę do separacji komórek w gradiencie gęstości i roztwór komórkowy w zbalansowanej wirówce o sile 200 x g przez 15 minut. Ponadto należy usunąć przyspieszanie i zwalnianie wirówki, aby zapewnić odpowiednią separację faz za pomocą gradientu mediów do separacji komórek w gradiencie gęstości.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać mętną warstwę środkową, która zawiera interesujące komórki szpiku kostnego.</li>
	<li>Przenieś te komórki do nowej stożkowej rurki. Dodać 20 ml dodatkowego buforu FACS (trzymanego na lodzie) w celu przemycia komórek.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w 1 ml pożywki stymulującej makrofagi, aby umożliwić zliczenie komórek za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
5. Liczenie komórek
<ol>
	<li>Pobrać 10 μl roztworu komórkowego i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego. Załadować 10 μl powstałej mieszaniny do hemocytometru i uzyskać liczbę komórek na ml roztworu.</li>
</ol>
6. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Umieścić 2 ml pożywki stymulującej makrofagi w każdym dołku 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodaj 200 000 komórek do każdej studzienki. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że gęstość posiewu komórkowego jest jednym z najważniejszych wymagań dla odpowiedniej hodowli in vitro osteoklastów.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać płytkę i umieścić w zwykłym inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Nie zmieniaj nośnika przez 3 dni.</li>
	<li>Po 3 dniach w pożywce stymulującej makrofagi zmień pożywkę na pożywkę osteoklastową.</li>
	<li>Następnie należy zmieniać pożywkę codziennie przez 5–7 dni, po czym na płytce hodowlanej powinny być widoczne duże, wielojądrowe osteoklasty.</li>
</ol>
7. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP)
<ol>
	<li>Po 5–7 dniach hodowli in vitro dobrze odessać pożywkę z kultury.</li>
	<li>Delikatnie umyj studzienki 1x PBS trzy razy.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 4% roztwór paraformaldehydu i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W tym czasie należy przygotować bejcę TRAP (dostępną w handlu) poprzez wstępne podgrzanie do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Po 1 godzinie w paraformaldehydzie odessać paraformaldehyd i delikatnie zmyć 3 razy 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej bejcy TRAP do każdego dołka płytki, która ma być zabarwiona.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, w osłonie przed światłem.</li>
	<li>Po 1 godzinie odessać plamę TRAP.</li>
	<li>Umyj studzienki 3 razy podgrzaną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Przeciwbarwić studzienkę hematoksyliną Gilla (UWAGA) przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Obrazowanie osteoklastów za pomocą mikroskopii jasnego pola.</li>
	<li>Myj studzienki wodą dejonizowaną, aż do uzyskania odpowiedniej intensywności koloru plamy, zwykle gdy jądra wydają się niebieskie.</li>
</ol>
8. Test resorpcji osteoklastów
<ol>
	<li>Użyć dostępnego w handlu 24-dołkowego naczynia do hodowli polistyrenu, które jest wstępnie pokryte substratem kostnym lub nieorganiczną krystaliczną powłoką z fosforanu wapnia.</li>
	<li>Umieścić 2 ml pożywki stymulującej makrofagi w każdym dołku.</li>
	<li>Dodać 200 000 świeżo wyizolowanych komórek szpiku kostnego uzyskanych pod koniec kroku 2 do każdej studzienki.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać płytkę przed umieszczeniem jej w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3 dni.</li>
	<li>W dniu 3 zmień pożywkę na pożywkę różnicującą osteoklasty.</li>
	<li>Wykonuj codzienne zmiany podłoża za pomocą pożywki różnicującej osteoklasty przez 5–7 dni.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja aktywności resorpcji osteoklastów
<ol>
	<li>Po 5–7 dniach hodowli in vitro w pożywkach różnicujących osteoklasty na zmineralizowanym podłożu należy przeanalizować zmineralizowaną powierzchnię, jak opisano poniżej, aby ocenić zdolność osteoklastów do tworzenia dołów resorpcyjnych, wskaźnika aktywności osteoklastów.</li>
	<li>Odessać pożywkę z płytki do testu resorpcyjnego i dodać 100 μl 10% roztworu wybielacza do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować komórki z 10% roztworem wybielacza przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj studzienki 3 razy wodą destylowaną.</li>
	<li>Odessać pozostałą wodę, strząsnąć nadmiar wody z płytki i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu na 3–5 godzin.</li>
	<li>Przeciwbarwić płytkę dostępnym w handlu zestawem do barwienia Von Kossa, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację nieresorbowanego podłoża.</li>
	<li>Użyj mikroskopii jasnego pola, aby wykonać zdjęcia reprezentatywnych części resorpowanej powierzchni.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, oblicz procent resorbowanej powierzchni, aby umożliwić ilościowe określenie aktywności resorpcyjnej osteoklastów.</li>
</ol>

<ol><li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption%3A+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+reports%22%5BJournal%5D)">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li>
<li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li>
<li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bench+to+bedside%3A+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li>
<li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li>
<li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+the+OPG%2FRANKL%2FRANK+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li>
<li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li>
<li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget%27s+Disease+of+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li>
<li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li>
<li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD%2FSCID+IL-2Rgamma%28null%29+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li>
<li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li>
<li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li>
<li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li>
<li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interleukin-6%2C+osteoclastogenesis%2C+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li>
<li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+among+cells+of+bone%2C+immune+system%2C+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+developmental+immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).</li>
<li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+advances+in+hematolog.%2C+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).</li>
<li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania ujawnienia ani konfliktu interesów.

Zdolność do łatwego izolowania i hodowli dużej liczby osteoklastów in vitro przyczyniła się do pogłębienia wiedzy na temat biologii kości i chorób wywoływanych przez osteoklasty. Doprowadziło do tego zidentyfikowanie RANKL, który został niedawno zidentyfikowany jako główny regulator powstawania, różnicowania i przeżycia osteoklastów16-18.
Z naszego doświadczenia wynika, że hodowla in vitro osteoklastów ze szpiku kostnego jest w dużej mierze zależna od gęstości wysi...

Przebudowa kości jest dynamiczna i polega na sprzężeniu procesu tworzenia kości z resorpcją kości1. Ten ściśle regulowany proces jest odpowiedzialny za utrzymanie szkieletu podczas normalnej homeostazy oraz w odpowiedzi na urazy i choroby.
Osteoklasty to unikalne, wielojądrowe komórki, które są zdolne do resorpcji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych matryc kości. Osteoklasty pochodzą z linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego2-5. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu lub tworzeniu osteoklastów mogą powodować różne patologie kliniczne, w tym powszechne schorzenia, takie jak osteoporoza.
Zdolność do generowania osteoklastów in vitro pozwoliła na znaczący postęp w naszym zrozumieniu biologii kości6. W rezultacie pojawiają się nowe środki terapeutyczne do leczenia chorób związanych z osteoklastami, które są odpowiedzialne za znaczną zachorowalność i śmiertelność7. Homeostatyczne utrzymanie masy i siły kostnej wymaga skoordynowanego działania osteoblastów tworzących kości i osteoklastów resorpcyjnychkości 8,9. Homeostaza kości jest zmieniona w wielu chorobach, w tym w osteoporozie pomenopauzalnej, w której zwiększona aktywność osteoklastów prowadzi do patogennej utraty masy i gęstości kości10. Wraz z rosnącą dostępnością transgenicznych mysich modeli chorób u ludzi, istnieje więcej możliwości rozszyfrowania roli osteoklastów w chorobach kościu ludzi 11-13.
W literaturze pojawiają się liczne protokoły technik hodowli osteoklastów, z wieloma wariantami opisanymi9,12,14. Xing i współpracownicy opisują podobną metodologię do protokołu opisanego poniżej, w swoim opisie testów osteoklastogennych z mysich komórek szpiku kostnego. Jednakże, aby uwolnić komórki szpiku kostnego po długim pobraniu kości, Xing i wsp. przepłukują jamę szpiku za pomocą kompletnego podłoża α-MEM14. Catalfamo bada wpływ hiperglikemii na funkcję osteoklastów i opisuje metodę, w której wszystkie komórki zmobilizowane przez płukanie szpiku kostnego są hodowane przez 24 godziny, po czym nieprzylegające komórki są odrzucane12, technika stosowana również przez Boyle'a i wsp.9 Te wcześniej opublikowane protokoły wymagają praktyki płukania szpiku kostnego, co jest żmudną praktyką, która również wiąże się z ryzykiem zranienia igłą i utraty cennego szpiku kostnego, ponieważ należy przeciąć oba końce kości. Protokół, który opisujemy, implementuje użycie moździerza i tłuczka do izolacji osteoklastów, co jest podobne do metody izolacji makrofagów opisanej przez Weischenfeldta i wsp.15 
Nasze doświadczenie jest jednak takie, że izolacja osteoklastów i hodowla in vitro przy użyciu wcześniej opublikowanych technik skutkuje zmiennymi wynikami w zakresie produkcji osteoklastów, często skutkując niemożnością uprawy osteoklastów. Dlatego opracowaliśmy protokół, który pozwala na konsekwentną izolację szpiku kostnego myszy w celu wytworzenia dużej liczby wielojądrowych osteoklastów in vitro, z przybliżoną wydajnością 70-80% komórek początkowo posianych, tworząc makrofagi, a następnie osteoklasty, w obecności pożywki indukującej osteoklasty.

<table><tbody><tr><td>MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, rekombinowana mysz</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli wyrażona)</td><td>R& D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandyna E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do resorpcji kości do testu kostnego, płytki 24-dołkowe</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklasty to wysoce wyspecjalizowane komórki, które wywodzą się z linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego. Ich wyjątkowa zdolność do resorpcji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych matryc kości oznacza, że odgrywają kluczową rolę w regulacji przebudowy szkieletu. Razem osteoblasty i osteoklasty są odpowiedzialne za dynamiczny proces sprzężenia, który obejmuje zarówno resorpcję kości, jak i tworzenie kości, działając razem w celu utrzymania normalnego szkieletu podczas zdrowia i choroby.
Jako główna komórka resorbująca kości w ciele, zmiany w różnicowaniu lub funkcji osteoklastów mogą powodować głębokie skutki w organizmie. Choroby związane ze zmienioną funkcją osteoklastów mogą mieć różne nasilenie, od śmiertelnej choroby noworodka spowodowanej niemożnością wytworzenia przestrzeni szpikowej dla hematopoezy, po częściej obserwowane patologie, takie jak osteoporoza, w której nadmierna osteoklastyczna resorpcja kości predysponuje do powstawania złamań.
Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach in vitro pozwoliła na znaczący postęp w zrozumieniu cyklu przebudowy kości i utorowała drogę do odkrycia nowych strategii terapeutycznych, które zwalczają te choroby. 
Tutaj opisujemy protokół izolowania i hodowli osteoklastów ze szpiku kostnego myszy, który daje dużą liczbę osteoklastów.

Celem tej metody była łatwa izolacja dużej liczby osteoklastów in vitro, zazwyczaj w ciągu jednego tygodnia. Poprawność izolacji znacznej liczby osteoklastów potwierdzono za pomocą barwienia na fosfatazę kwaśną odporną na tatranian (Ryc. 1A). Duże osteoklasty są widoczne jako duże fioletowe komórki z wieloma jądrami (zazwyczaj ≥ 3 jądra). Stosując ten protokół, często izoluje się osteoklasty posiadające nawet 30 jąder w jednej komórce (Ryc. 1B).
Wykor...

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie osteoklastów ze szpiku kostnego myszy w dużej liczbie. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie kości od myszy poddanych eutanazji. Następnie komórki są uwalniane ze szpiku kostnego za pomocą moździerza i tłuczka do miażdżenia kości w buforze faktów.Następnie roztwór szpiku kostnego nakłada się warstwami na podłoże do separacji komórek gradientu gęstości i przeprowadza się separację komórek w gradiencie gęstości. Na koniec warstwa zawierająca interesujące komórki jest odsysana, a komórki umieszcza się w pożywce indukcyjnej mikrofagów szpiku kostnego. Ostatecznie barwienie pułapkowe służy do wykazania obecności dużej liczby osteoklastów.Implikacje tej techniki rozciągają się na choroby związane ze zmienioną funkcją osteoklastów, które mogą mieć różne nasilenie, od śmiertelnej choroby noworodka z powodu niemożności utworzenia przestrzeni szpikowej dla hematopoezy do częstszych patologii, takich jak osteoporoza, ponieważ daje niezawodną metodę izolowania dużej liczby osteoklastów ze szpiku kostnego myszy. Na początek przynieś 10 mililitrów dostępnej na rynku separacji komórek z gradientem gęstości, od medium do temperatury pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Umieścić 50-mililitrową porcję bufora faksu w temperaturze pokojowej, która ma być użyta z podłożem do separacji komórek z gradientem gęstości.Po przygotowaniu dodatkowych pożywek i poddaniu eutanazji myszy C 57 black six, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść mysz na desce sekcyjnej i użyj 70% etanolu. Aby go spryskać, zbierz oko i kręgosłup fera piszczelowe. Następnie umieść kości w buforze faktów na lodzie.Następnie za pomocą czystej bibuły usuń mięśnie i tkanki miękkie z kości. Umieść kości w moździerzu i tłuczku z trzema mililitrami buforu faktów i delikatnie je zmiażdż. Następnie odessaj zabarwiony krwią płyn i przepuść go przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj dodatkowe pięć mililitrów buforu efektów do zmiażdżonej kości i zmiażdż dalej przed przeniesieniem płynu przez sitko do 50-mililitrowej probówki. Kontynuuj ten proces, aż płyn przestanie zabarwiać się na czerwono, a następnie granuluj szpik kostny w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić separację gradientową, odessać supernatanty z osadu komórkowego i użyć 10 mililitrów bufora faksu do reanimacji.Zawiesić osad, przechylić stożkową rurkę z medium do separacji komórek w gradiacji gęstości w temperaturze pokojowej do około 30 stopni i za pomocą pipety elektrycznej z końcówką pipety dociśnij wewnętrzną górną powierzchnię probówki. Powoli nakładać roztwór szpiku kostnego na podłoże za pomocą wirówki o temperaturze pokojowej, bez przyspieszania lub zwalniania. Obracaj gradient z prędkością 200 G przez 15 minut.Następnie odessaj mętną warstwę środkową, która zawiera interesujące nas komórki i przenieś je do nowej stożkowej rurki. Dodaj 20 mililitrów lodowatego buforu faksu, aby umyć komórki. Następnie użyj jednego mililitra pożywki stymulującej mikrofagi szpiku kostnego, aby ponownie zawiesić końcowe osady komórkowe po zliczeniu komórek.Umieszczono dwa mililitry pożywki stymulującej mikrofagi w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Następnie dodaj 200 000 komórek do każdej studzienki, gęstość komórek, która zapewni odpowiednią hodowlę osteoklastów in vitro. Delikatnie wymieszaj płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zmiany podłoża przez trzy dni.Po trzecim dniu zmień pożywkę na pożywkę do indukcji osteoklastów szpiku kostnego i zacznij zmieniać ją codziennie przez pięć do siedmiu dni. W tym momencie powinny być widoczne duże wielojądrowe osteoklasty. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać informacje na temat barwienia i testu resorpcji, jak pokazano tutaj.Dużą liczbę osteoklastów można potwierdzić za pomocą testu oporności na winiany. Osteoklasty barwiące fosforyny są wizualizowane jako duże fioletowe komórki z wieloma jądrami przy użyciu protokołu pokazanego w tym filmie. Często izoluje się osteoklasty z nawet 30 jądrami na komórkę.Użycie zmineralizowanej powierzchni jest uważane za złoty standard metody oceny aktywności resorpcyjnej osteoklastów in vitro. Na tym rysunku mikroskopia jasnego pola przy 10-krotnym powiększeniu pokazuje procent zmineralizowanej powierzchni lub wgłębień resorpcyjnych, które są uformowane zgodnie z czarnym kolorem, co pozwala na określenie zdolności resorpcyjnej osteoklastów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak niezawodnie wyizolować dużą liczbę osteoklastów ze szpiku kostnego myszy.

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy izolację i hodowlę komórek zrębu szpiku kostnego z długich kości myszy. Izolowane przylegające BMSC mogą być wykorzystane do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla komórek zrębu szpiku kostnego z kości piszczelowej myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj metodę izolacji osteoklastów ze szpiku kostnego myszy w dużych ilościach. Protokół obejmuje rozdrabnianie kości, separację gradientową i hodowlę in vitro. Technika umożliwia badanie biologii komórek kostnych.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Przeglądaj więcej filmów