Name: Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metody manipulacji środowiskowej i wlewu do mózgu u dorosłych myszy w celu badania plastyczności neuronów dopaminowych śródmózgowia. Technika ta pozwala analizować zmiany behawioralne i neuronalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) grant grantowy 1022839. AJH jest członkiem Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). Florey Institute of Neuroscience and Mental Health dziękuje za wsparcie z Grantu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu Wiktorii.

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Neuronauki i Zdrowia Psychicznego Florey i są zgodne z opublikowanym przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych kodeksem postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (7edycja, 2004).
1. Manipulacje środowiskowe
<ol>
	<li>Parowanie płci
	<ol>
		<li>Używaj dojrzałych płciowo (>8 tygodni), dopasowanych do wieku samców i samic myszy. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy myszy C57BL/6, ale uzyskaliśmy te same wyniki przy użyciu myszy szwajcarskich w tym protokole. Zazwyczaj używamy n = 8 mężczyzn i n = 8 kobiet dla każdego eksperymentu, podzielonych na n = 2 pary mężczyzna-mężczyzna (n = 4 samce), n = 2 pary żeńsko-żeńskie (n = 4 samice) i n = 4 pary męsko-żeńskie (n = 4 samce i n = 4 samice).</li>
		<li>Po przybyciu do gospodarstwa hodowlanego, myszy należy trzymać w grupie według płci przez >3 dni w celu aklimatyzacji. Tutaj i przez cały okres parowania płci utrzymuj zewnętrzne bodźce środowiskowe (np. temperaturę otoczenia, cykl światło-ciemność, jedzenie, woda, obchodzenie się i czyszczenie) na stałym poziomie lub rozprowadź równomiernie na wszystkie myszy.</li>
		<li>Losowo przypisz każdą mysz do pary mężczyzna-mężczyzna, para żeńsko-żeńska lub para męsko-żeńska. Umieść każdą parę w czystej klatce w izolacji (2 myszy / klatka) z dostępem ad libitum do jedzenia i wody i po prostu trzymaj je w ten sposób nieprzerwanie przez 7 dni. 
		UWAGA: Rutynowa hodowla zwierząt jest w tym okresie w porządku, ale musi być równomiernie rozłożona na wszystkie myszy. Uważaj, aby nie łączyć się w pary między samcami i samicami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie środowiska
	<ol>
		<li>Używaj dojrzałych płciowo (>8 tygodni), dopasowanych do wieku samców lub samic myszy. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy n = 18 myszy do każdego eksperymentu, podzielonych na n = 6 / grupę leczoną.</li>
		<li>Po przybyciu do obiektu przetrzymywania zwierząt należy je trzymać w grupach w identycznych standardowych warunkach (SH) (np. patrz poniżej) na tym etapie przez >3 dni w celu aklimatyzacji. Tutaj i przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj zewnętrzne bodźce środowiskowe (np. temperaturę otoczenia, cykl światło-ciemność, jedzenie, woda, obsługa i czyszczenie) na stałym poziomie lub rozprowadź równomiernie na wszystkie myszy.</li>
		<li>Aby rozpocząć wzbogacanie środowiska, losowo przypisz każdą mysz do jednej z 3 grup: SH; koło do biegania (RW) lub wzbogacone środowisko (EE) i umieść każdą grupę myszy razem w identycznej czystej klatce z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. 
		UWAGA: Tutaj zastosowano większe klatki dla szczurów dla wszystkich grup, mierzące 27 cm szerokości, 42 cm długości i 16 cm głębokości.
		<ol>
			<li>Ponadto każdej grupie należy zapewnić następujące warunki środowiskowe: SH składający się wyłącznie ze ściółki (granulki papieru lub trociny) na podłodze; RW składający się z SH i 2 kół jezdnych; EE składa się z RW oraz zabawek (liny, drabiny, tunele i przedmioty, takie jak puste rolki ręczników papierowych i kawałki bibuły), z którymi można eksplorować, bawić się, wspinać, chować i gniazdować.</li>
			<li>Przechowuj je w ten sposób nieprzerwanie przez 14 dni. 
			UWAGA: Rutynowa hodowla zwierząt jest w tym okresie w porządku, ale musi być równomiernie rozłożona na wszystkie myszy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Poddaj myszy EE dodatkowemu "super-wzbogaceniu" (SE) poprzez umieszczenie ich razem w większej klatce zawierającej nowe zabawki na 1 godzinę dziennie (ta sama godzina każdego dnia), 5 dni / tydzień><.
		UWAGA: W tym przypadku użyto plastikowej wanny o szerokości 46 cm, długości 69 cm i głębokości 40 cm.
		<ol>
			<li>Utrzymuj świeżość, prezentując inny zestaw zabawek podczas każdej sesji. Wyczyść zabawki, które mają być ponownie zaprezentowane myszom, wodą z mydłem i 80% etanolem, aby usunąć zapachy.</li>
			<li>Po każdej sesji SE wróć myszy do klatki EE. Z myszami SH i RW należy obchodzić się tak samo jak z myszami SE (z wyjątkiem samego SE) przez cały ten okres (np. wyjmować i wkładać każdą mysz SH i RW z i do klatki).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. Implanty kaniuli pompy osmotycznej i infuzji mózgu do infuzji leków
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Używaj sterylnych pomp osmotycznych i zestawów do infuzji mózgu, które są dostępne na rynku. Dzień przed implantacją, stosując technikę aseptyczną, należy zagruntować implanty, napełniając każdą pompę, rurkę łączącą i kaniulę sterylnym roztworem leku lub nośnika (zgodnie z opisem w instrukcji dołączonej do pomp). Połączyć je ze sobą i inkubować w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez noc w temperaturze 37 °C. Implanty wypełnione lekiem i nośnikiem należy inkubować oddzielnie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgia. 
	UWAGA: W zależności od kraju przeprowadzającego eksperyment, do przeprowadzenia tego rodzaju operacji i eksperymentów pooperacyjnych wymagane są specjalne zezwolenia lub zezwolenia na eksperymenty na zwierzętach.
	<ol>
		<li>Sterylizuj cały sprzęt chirurgiczny i stosuj technikę aseptyczną przez cały czas. Znieczulij mysz (np. za pomocą 1-2% izofluoranu w powietrzu) i umieść ją w stereotaktycznej ramie czołowej. Sprawdź głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu i w razie potrzeby podaj dalsze środki znieczulające (np. brak wycofania kończyny z powodu szkodliwego uszczypnięcia łapy wskazuje na odpowiednie znieczulenie). Upewnij się, że oczy są chronione przed wysuszeniem przez nawilżającą maść do oczu, a temperatura ciała myszy pozostaje normalna przez cały czas trwania zabiegu.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę, zaczynając od spomiędzy oczu i kończąc 2 cm z tyłu do tylnej krawędzi czaszki. krokiem odetnij skórę od leżącej poniżej powięzi w dół grzbietu myszy, aby utworzyć podskórną "kieszeń" wystarczająco dużą, aby wygodnie zmieścić pompę i rurkę łączącą po wszczepieniu kaniuli (rurka łącząca nie powinna być zginana po zakończeniu). Zeskrob powięź znad grzbietowej części czaszki.</li>
		<li>Za pomocą wiertła dentystycznego o średnicy około 1,5 mm wwierc się w czaszkę w odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych, aż pozostanie cienka, elastyczna warstwa kości. Oderwij tę warstwę za pomocą cienkich kleszczy (pozwala to uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem opony twardej i mózgu za pomocą zadzioru dentystycznego). Upewnij się, że czaszka jest oczyszczona z krwi i fragmentów kości oraz że nie ma dalszego krwawienia.</li>
		<li>Trzymając kaniulę w uchwycie kaniuli, umieść pompę i rurkę łączącą w podskórnej "kieszeni" leżącej na grzbiecie myszy. Następnie umieść końcówkę kaniuli w odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych i na powierzchni mózgu. Ostrożnie opuść kaniulę do mózgu, ale zatrzymaj się około 1 mm przed wymaganą głębokością. 
		UWAGA: Pozostała głębokość zostanie uzgodniona po nałożeniu pierwszej warstwy akrylu dentystycznego.</li>
		<li>Upewnij się, że powierzchnia czaszki jest czysta i sucha, a następnie przygotuj niewielką objętość akrylu dentystycznego i użyj wykałaczki, aby wygładzić go na całym odsłoniętym obszarze czaszki, w tym w otworze zadziorowym przez czaszkę wokół kaniuli. Zanim akryl stwardnieje, opuść końcówkę kaniuli na pozostałą głębokość w cel.</li>
		<li>Przygotuj kolejną niewielką objętość akrylu dentystycznego i nałóż ją na pierwszą, a także na białą plastikową podporę kaniuli, aby zamocować kaniulę na miejscu. W razie potrzeby powtórz z dodatkowymi warstwami akrylu.</li>
		<li>Gdy akryl stwardnieje, ostrożnie wyjmij uchwyt kaniuli i odetnij białą plastikową zdejmowaną zakładkę kaniuli za pomocą ostrza skalpela podgrzanego płomieniem butanu. Na koniec zszyj skórę zamkniętą na całym implancie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie pooperacyjne zwierząt
	<ol>
		<li>Na brzegi skóry nałożyć maść antyseptyczną, a myszy podać środek przeciwzapalny (np. Meloksykam, 3 mg/kg s.c.). Zdejmij mysz z ramy, umieść ją pod lampą grzewczą i obserwuj, aż odzyska przytomność. Nie należy zwracać myszy, która przeszła operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. 
		UWAGA: Eksperymentalne manipulacje, takie jak parowanie płci i wzbogacanie środowiska, można rozpocząć lub wznowić najwcześniej następnego dnia po operacji.</li>
		<li>Codziennie monitoruj ich masę ciała, ogólne zachowanie i wygląd. Objawy infekcji (np. obrzęk, zaczerwienienie, ropa) wokół nacięć chirurgicznych należy leczyć miejscową maścią antyseptyczną. Wszelkie objawy choroby, ból, stres lub dyskomfort (np. utrata >10% masy ciała, wycofanie społeczne, brak pielęgnacji, "puchanie", zaburzenia ruchowe, drgawki) za pomocą ogólnoustrojowych leków przeciwbólowych i/lub antybiotyków, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Eutanazja myszy, jeśli utrata masy ciała >15% lub objawy choroby, bólu, stresu lub dyskomfortu są nieodwracalne w ciągu 1 tygodnia od leczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanki mózgowej, przetwarzanie immunohistochemiczne i stereologia
<ol>
	<li>Perfuzji
	<ol>
		<li>Bezpośrednio po manipulacjach środowiskiem/narkotykami przygotuj mózg do badania. 
		UWAGA: W przedstawionych tutaj eksperymentach liczba neuronów SNc TH+ została zmierzona i porównana w każdej z różnych grup leczenia.</li>
		<li>Najpierw należy podać nadmierną dawkę środka znieczulającego, aby zabić myszy (np. 100 mg/kg i.p. pentobarbitonu sodu). Po znieczuleniu, ale zanim serce przestanie bić, połóż mysz na plecach i zwiąż lub przygwoźdź obie przednie kończyny.</li>
		<li>Za pomocą skalpela odetnij skórę pokrywającą klatkę piersiową, a następnie naciąć mięsień tuż pod klatką piersiową do jamy brzusznej. Umieść zacisk na wyrostku mieczykowatym klatki piersiowej i podnieś klatkę piersiową do góry i odsuń ją od wątroby, odsłaniając przeponę.</li>
		<li>Przeciąć przeponę i żebra bocznie po obu stronach za pomocą dużych nożyczek, aż klatkę piersiową będzie można złożyć z powrotem nad głową, aby odsłonić płuca i serce. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku jako punkt wyjścia dla krwi i roztworów perfuzji, a następnie przetnij podstawę lewej komory i umieść kaniulę w górę przez lewą komorę, lewy przedsionek i do aorty.</li>
		<li>Zacisnąć kaniulę na miejscu, a następnie pompować ciepłą (37 °C) heparynizowaną i 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez naczynia krwionośne, aż roztwór wychodzący z prawego przedsionka będzie całkowicie wolny od krwi. Następnie przepompuj zimny (4 °C) roztwór utrwalający (taki jak 4% paraformaldehydu w PBS) przez układ krwionośny, aż cała mysz będzie dobrze utrwalona. Usuń mózg i umieść w PBS z 30% sacharozą na 2-3 dni, aż mózg zatonie. 
		UWAGA: W zależności od wiedzy specjalistycznej w danym laboratorium można zastosować inne rodzaje preparatyki tkankowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kriosekcji swobodnie pływających
	<ol>
		<li>Wytnij sekcje szeregowe przez interesujące Cię obszary mózgu i zbierz je w PBS. 
		UWAGA: Odcinki o grubości 40 μm tniemy za pomocą kriostatu. Inne rodzaje sekcji tkanek mogą być stosowane w zależności od wiedzy specjalistycznej w odpowiednim laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia
	<ol>
		<li>Wykonaj standardową immunohistochemię dla interesujących Cię białek. Inkubować skrawki w 5% normalnej surowicy koziej i 0,3% trytonie X-100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut, następnie reagować immunologicznie z poliklonalnym króliczym anty-TH (1:400) w temperaturze 4 °C przez 48 godzin, a następnie poliklonalnym biotynylowanym kozim anty-króliczym (1:1 000) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Następnie inkubować w peroksydazie awidyny (1:500) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie w diaminobenzydynie o intensywności kobaltu i niklu (0,5 mg/ml) w temperaturze pokojowej przez 18-20 minut; przez ostatnie 3-5 minut inkubacji diaminobenzydyny dodawać nadtlenek wodoru (0,01%) w celu katalizowania wytrącania chromagenu. Umyj sekcje trzy razy po 10 minut w PBS przed, po i między każdym z powyższych kroków.</li>
		<li>Zamontuj skrawki na żelatynizowanych szkiełkach mikroskopowych, wysusz je na powietrzu, następnie zabarwić Nissl (neutralny czerwony), odwodnić w alkoholu, bezbarwnym (X-3B) i nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stereologia
	<ol>
		<li>Oszacuj całkowitą liczbę neuronów TH+ i TH-SNc (oraz VTA i LC) przy użyciu bezstronnych metod stereologicznych. Upewnij się, że stereolog jest ślepy na otrzymane leczenie. Wyklucz glej na podstawie średnicy somy <5 μm i policz tylko te komórki, które mają widoczne jądro.</li>
		<li>Zidentyfikuj SNc (oraz VTA i LC) na podstawie lokalizacji przestrzennej komórek TH + i anatomicznych punktów orientacyjnych/granic zgodnie z atlasem mózgu Paxinosa i Watsona7. Zliczać komórki TH+ w ramce zliczającej (55 x 55 μm = 3025 μm2) w regularnych, z góry określonych odstępach czasu (x = 140 μm, y = 140 μm dla SNc; x = 100 μm, y = 100 μm dla VTA i LC) w każdym jądrze w co czwartej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Aumann, T., Horne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+the+dopamine+phenotype+in+substantia+nigra+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons.</a> Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).</li>
<li>Sauer, H., Oertel, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+degeneration+of+nigrostriatal+dopamine+neurons+following+intrastriatal+terminal+lesions+with+6-hydroxydopamine%3A+a+combined+retrograde+tracing+and+immunocytochemical+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat.</a> Neuroscience. 59, 401-415 (1994).</li>
<li>Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timecourse+of+striatal+re-innervation+following+lesions+of+dopaminergic+SNpc+neurons+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat.</a> The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).</li>
<li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+expression+of+tyrosine+hydroxylase+in+adult+mouse+substantia+nigra+pars+compacta+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons.</a> Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).</li>
<li>Aumann, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK+channel+function+regulates+the+dopamine+phenotype+of+neurons+in+the+substantia+nigra+pars+compacta%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta.</a> Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).</li>
<li>Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+behavioral+modulation+of+the+number+of+substantia+nigra+dopamine+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice.</a> Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd, Academic Press. (2001).</li>
<li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+dopamine+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Behavioral dopamine signals.</a> Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).</li>
<li>Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+bonds+in+male+prairie+vole%3A+long-term+effects+on+emotional+and+social+behavior%2C+physiology%2C+and+neurochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry.</a> Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).</li>
<li>Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+progenitor+cell+proliferation+and+astrogenesis+in+the+partial+progressive+6-hydroxydopamine+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).</li>
<li>Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+new+dopaminergic+neurons+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).</li>
<li>Lie, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+substantia+nigra+contains+progenitor+cells+with+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).</li>
<li>Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+proliferation+in+the+adult+hippocampus+and+substantia+nigra+induced+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).</li>
<li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibility+for+neurogenesis+in+substantia+nigra+of+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain.</a> Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).</li>
<li>Shan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+de+novo+neurogenesis+and+dopaminergic+neurogenesis+in+the+substantia+nigra+of+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine-induced+Parkinson%27s+disease-like+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice.</a> Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+neurogenesis+in+the+adult+mammalian+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).</li>
<li>Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+regulation+of+tyrosine+hydroxylase+expression+in+olfactory+bulb+of+mouse+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).</li>
<li>Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-synaptic+increase+in+RNA+coding+for+tyrosine+hydroxylase+in+a+rat+sympathetic+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion.</a> Brain research. 339, 151-153 (1985).</li>
<li>Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preganglionic+nerve+stimulation+increases+the+amount+of+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).</li>
<li>Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preganglionic+nerve+stimulation+increases+mRNA+levels+for+tyrosine+hydroxylase+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion.</a> Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).</li>
<li>Richard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+tyrosine+hydroxylase+gene+expression+in+rat+brain+and+adrenals+by+exposure+to+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold.</a> Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).</li>
<li>Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+increase+in+enzyme+and+peptide+mRNA+in+sympathetic+ganglia+after+electrical+stimulation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).</li>
<li>Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+tyrosine+hydroxylase+mRNA+levels+in+A1%2C+A2+and+locus+ceruleus+neurons+following+electrical+stimulation+of+A1+noradrenergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Molecular+brain+research%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons.</a> Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).</li>
<li>Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+mapping+of+direct+inputs+to+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 74, 858-873 (2012).</li>
<li>Tepper, J. M., Lee, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).</li>
<li>Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+and+brain+repair%3A+harnessing+the+therapeutic+effects+of+cognitive+stimulation+and+physical+activity+to+enhance+experience-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+applied+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).</li>
<li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environments%2C+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li>
<li>Chmiel, D. J., Noonan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+of+laboratory+rats+for+potentially+enriching+stimulus+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects.</a> Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).</li>
<li>Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+runway+paradigm+to+assess+the+relative+strength+of+rats%27+motivations+for+enrichment+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Behavior+research+methods%22%5BJournal%5D)">Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects.</a> Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).</li>
<li>Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions+and+construct+validity+in+preclinical+models+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neuro-psychopharmacology+%26+biological+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders.</a> Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).</li>
<li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Animal+Behaviour+Science%22%5BJournal%5D)">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li>
<li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+on+gene+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).</li>
<li>Eckert, M. J., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+behavioral+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li>
<li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmental+enrichment+model+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li>
<li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+and+brain+plasticity%3A+towards+an+endogenous+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Manipulacje środowiskowe
Motywacją stojącą za zaprojektowaniem tych manipulacji środowiskowych (parowanie płci i wzbogacanie środowiska) było ustalenie, czy środowisko i/lub zachowanie wywołane przez środowisko jest związane ze zmianami w liczbie neuronów DA w śródmózgowiu. W związku z tym skupiono się na zapewnieniu środowiska i stymulowaniu zachowań, które prawdopodobnie angażują sygnalizację DA w śródmózgowiu. Obejmowały one łączenie się w pary z płcią przeciwną i wzbogacanie środo...

DArgiczny sygnał przez neurony w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) i istocie czarnej pars compacta (SNc) śródmózgowia jest uważany za ważny dla motywowanych nagrodą zachowań poznawczych, emocjonalnych i motorycznych. Jednak zbyt duża lub zbyt mała sygnalizacja DA śródmózgowia powoduje wiele objawów powodujących niepełnosprawność w różnych zaburzeniach neurologicznych (np. Choroba Parkinsona, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, schizofrenia i uzależnienie od narkotyków). Leki, które zwiększają lub zmniejszają sygnalizację DA, łagodzą te objawy, jednak wywołują również skutki uboczne związane z rozregulowaną sygnalizacją i efektami niedocelowymi. Skuteczność leku również spada z czasem z powodu kompensacyjnych reakcji mózgu. Wyzwaniem jest zatem przywrócenie normalnej sygnalizacji DA śródmózgowia w bardziej ukierunkowany i fizjologiczny sposób, a preferowanym podejściem jest zwiększenie lub zmniejszenie liczby neuronów DA w śródmózgowiu.
Przez kilka dziesięcioleci gromadzono dowody na to, że ekspresja genów i białek biorących udział w metabolizowaniu i transporcie DA i innych katecholamin w dojrzałych dorosłych komórkach jest modyfikowalna (omówione w1). W śródmózgowiu liczba neuronów immunododatnich hydroksylazy tyrozynowej (TH+, enzym ograniczający szybkość syntezy DA) zmniejsza się, a następnie wzrasta po podaniu neurotoksyny2,3, podczas gdy liczba neuronów immunoujemnych TH (TH-) wykazuje odwrotny wzorzec (tj. wzrasta, a następnie maleje3). Jest to zgodne z utratą, a następnie zyskiem "fenotypu DA" przez niektóre komórki. Wykazano również, że liczba neuronów TH+ i TH-SNc zmienia się w równych, ale przeciwnych kierunkach po różnych zabiegach, które zmieniają aktywność elektryczną tych komórek4,5. Na przykład infuzja apasziny, antagonisty kanału potasowego (SK) o małym przewodnictwie, aktywowanego wapniem, do śródmózgowia przez 2 tygodnie zmniejsza liczbę TH+ i zwiększa (o tę samą ilość) liczbę neuronów TH-SNc4,5. Natomiast infuzja agonisty kanału SK 1-EBIO zwiększa liczbę TH+ i zmniejsza (o tę samą ilość) liczbę neuronów TH-SNc4,5. Podobne zmiany zaobserwowano po różnych terapiach ukierunkowanych na aktywność neuronalną SNc, w tym niektórych, które były ukierunkowane na doprowadzające4. Ta pozorna regulacja liczby neuronów SNc DArgic przez aktywność neuronalną i dane wejściowe aferentne zwiększa prawdopodobieństwo, że środowisko lub zachowanie może wpływać na liczbę neuronów SNc. Rzeczywiście, dorosłe myszy wystawione na działanie różnych środowisk mają mniej więcej neurony TH + w śródmózgowiu (SNc i VTA), a przynajmniej niektóre z tych zmian wywołanych przez środowisko są znoszone przez jednoczesną blokadę wejścia synaptycznego wśródmózgowiu 6. Cele niniejszego komunikatu są następujące: (1) dostarczenie dalszych szczegółów na temat tego, w jaki sposób wdrażać nasze manipulacje środowiskowe i wlewy leków; oraz (2) dostarczyć dalszych danych potwierdzających nasze twierdzenie, że środowisko reguluje liczbę neuronów DA w śródmózgowiu poprzez aferentne dane wejściowe.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>Pompa osmotyczna ALZET 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Zestaw do infuzji mózgu 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na kaniulę ALZET 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0008860</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Samoutwardzalny (dentystyczny rozpuszczalnik akrylowy)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holandia</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (dentystyczny proszek akrylowy)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Holandia</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, Smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbiton sodu</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, Nowa Południowa Walia, Australia</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-litrowy</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Siedziba główna Merck Millipore&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalna hydroksylaza antytyrozynowa królika Siedziba</td><td>główna Merck Millipore&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalna biotynylowana koza anty-królik</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza awidyny</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzydyna</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Długotrwałe zmiany w mózgu lub 'plastyczność mózgu' leżą u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu po chorobie lub urazie. Co więcej, interakcje z naszym środowiskiem mogą indukować plastyczność mózgu. Coraz częściej badania starają się określić, które środowiska stymulują plastyczność mózgu, co jest korzystne w leczeniu zaburzeń mózgu i zachowania. Opisano dwie manipulacje środowiskowe, które zwiększają lub zmniejszają liczbę immunododatnich neuronów hydroksylazy tyrozynowej (TH+, enzym ograniczający szybkość syntezy dopaminy (DA)) w śródmózgowiu dorosłej myszy. Pierwsza polega na parowaniu samców i samic myszy w sposób ciągły przez 1 tydzień, co zwiększa neurony TH + w śródmózgowiu o około 12% u samców, ale zmniejsza neurony TH + w śródmózgowiu o około 12% u samic. Drugi obejmuje trzymanie myszy w sposób ciągły przez 2 tygodnie w "wzbogaconym środowisku" (EE) zawierającym koła do biegania, zabawki, liny, materiał do gniazdowania itp., co zwiększa neurony TH + w śródmózgowiu o około 14% u samców. Ponadto opisano protokół jednoczesnego podawania leków bezpośrednio do śródmózgowia podczas tych manipulacji środowiskowych, aby pomóc zidentyfikować mechanizmy leżące u podstaw plastyczności mózgu wywołanej przez środowisko. Na przykład, indukcja EE większej liczby neuronów TH + w śródmózgowiu jest zniesiona przez jednoczesną blokadę wejścia synaptycznego do neuronów śródmózgowia. Łącznie dane te wskazują, że informacje o środowisku są przekazywane za pośrednictwem sygnałów synaptycznych do neuronów śródmózgowia w celu włączenia lub wyłączenia ekspresji genów "DA". Tak więc odpowiednia stymulacja środowiskowa lub ukierunkowanie leków na mechanizmy leżące u podstaw może być pomocne w leczeniu zaburzeń mózgu i zachowania związanych z brakiem równowagi w DA śródmózgowia (np. choroba Parkinsona, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, schizofrenia i uzależnienie od narkotyków).

U dorosłych myszy poddanych tym manipulacjom środowiskowym stwierdzono zmianę liczby neuronów TH+ w śródmózgowiu (SNc i VTA), lecz nie w LC, a EE wraz z jednoczesną infuzją do śródmózgowia piktotoksyny lub bikukulin (antagonistów receptora GABAA) znosi indukcję większej liczby neuronów TH+ w SNc przez EE. Dane te zostały opublikowane wcześniej6. Niniejsze dane zostały zestawione z powtórzonych eksperymentów przeprowadzonych w ramach wspomnianego badania, lecz nie były publikowane w innych miejscach....

Ten protokół opisuje dwie różne manipulacje środowiskowe oraz równoległy protokół infuzji mózgu do badania wywołanych przez środowisko zmian w mózgu, leżących u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu u dorosłych myszy.

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie kontrolowanych sytuacji środowiskowych, które stymulują plastyczność mózgu i zmiany behawioralne u myszy. Osiąga się to poprzez kwaterowanie myszy w parach samiec-samica w przeciwieństwie do kontrolnych par samiec-samiec oraz samica-samica, aby zbadać wpływ długotrwałego dobierania płci na mózg; alternatywnie myszy mogą być kwaterowane razem w klatkach wypełnionych różnymi przedmiotami do eksploracji i zabawy w przeciwieństwie do standardowych klatek laboratoryjnych, aby zbadać wpływ wzbogacenia środowiskowego na mózg. Do tych stymulacji środowiskowych można dodać inne zabiegi, takie jak podawanie leków, aby pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za obserwowanymi zmianami w mózgu i zachowaniu.Wyniki pokazują, że wspomniane wzbogacenia środowiskowe i zabiegi indukują zmiany w liczbie dopaminergicznych neuronów śródmózgowia, które są zależne od GABAergicznej transmisji synaptycznej w śródmózgowiu. Wzbogacenie środowiskowe jest paradygmatem zwiększającym somatosensoryczną stymulację motoryczną i poznawczą u myszy. Zastosowanie tego podejścia w badaniach wykazało zwiększoną neuroplastyczność, a także poprawę uczenia się i pamięci w wielu modelach chorób.Implikacje tej techniki rozszerzają się na zrozumienie mechanizmów plastyczności mózgu dorosłych wywołanej wpływami środowiskowymi. Ma to znaczenie dla leczenia wielu chorób mózgu i psychiki. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że liczba dopaminergicznych neuronów śródmózgowia zmienia się w odpowiedzi na zaburzenie aktywności neuronalnej śródmózgowia napędzanej przez wejścia synaptyczne.Wizualna demonstracja pompy osmotycznej i kaniuli do infuzji do mózgu może mieć kluczowe znaczenie, ponieważ procedury te mogą być trudne do opanowania na podstawie samych opisów. Opisy pisemne dotyczące parowania według płci. Pogrupuj seksualnie dojrzałe myszy samce i samice w tym samym wieku według płci, unikając parowania osobników z jednego miotu. Losowo umieść każdą mysz w parze samiec-samiec, samica-samica lub samiec-samica w czystej klatce w izolacji, z dostępem ad libitum do pożywienia i wody w trakcie parowania według płci oraz w dalszej części procesu.Utrzymaj wszystkie zbędne bodźce środowiskowe na stałym poziomie lub rozdziel je równomiernie pomiędzy wszystkie myszy i utrzymuj zwierzęta w tych warunkach nieprzerwanie przez siedem dni. W celu wzbogacenia środowiskowego, losowo przydziel dojrzałe płciowo myszy samce lub samice w tym samym wieku do jednej z trzech grup: standardowych warunków utrzymania, dostępu do kołowrotka lub środowiska wzbogaconego, na co najmniej trzy dni. Utrzymuj je w ten sposób.Z wolnym dostępem do pokarmu i wody przez 14 dni. W przypadku wzbogacenia środowiskowego, klatka standardowa powinna zawierać jedynie ściółkę. Klatka z kołowrotkiem powinna zawierać ściółkę oraz dwa kołowrotki, a klatka ze wzbogaconym środowiskiem powinna zawierać ściółkę, dwa kołowrotki i zabawki.Myszy w warunkach wzbogaconego środowiska poddano dodatkowemu superwzbogaceniu, umieszczając je razem w większej klatce z nowymi zabawkami na jedną godzinę dziennie. Pięć dni w tygodniu, o tej samej porze, myszy wracano do ich klatki ze wzbogaconym środowiskiem. Po każdej sesji utrzymywano czynnik nowości, prezentując w każdej kolejnej sesji inny zestaw zabawek.Wyczyścić wodą z mydłem i 80% ethanol każdą zabawkę, która ma zostać udostępniona myszom. Aby usunąć wszelkie zapachy, należy w ten sam sposób i przez podobny czas każdego dnia traktować również grupy przebywające w standardowych klatkach oraz grupy z kołowrotkami, jednak bez dodawania materiałów do superwzbogacenia w dniu poprzedzającym implantację. Stosując technikę aseptyczną, napełnić każdą sterylną pompę osmotyczną, rurkę łączącą i kaniulę sterylnym roztworem leku lub nośnika zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie połącz wszystkie elementy i inkubuj je przez noc w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C w dniu operacji. Po potwierdzeniu sedacji poprzez test uszczypnięcia palca, nałóż maść do oczu zwierzęciu i ułóż je na plecach na podgrzewaczu. Następnie, stosując technikę aseptyczną, wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej skóry, zaczynając dwa centymetry za tylną krawędzią czaszki i kończąc między oczami; za pomocą rozwieracza oddziel skórę od leżącej pod nią powięzi wzdłuż grzbietu myszy, tworząc kieszeń podskórną wystarczająco dużą, aby swobodnie pomieścić pompę i rurkę łączącą.Następnie należy oczyścić powięź z grzbietowej powierzchni czaszki i za pomocą wiertła stomatologicznego o średnicy około 1,5 mm wywiercić otwór w czaszce w odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych, aż do momentu pozostania cienkiej, elastycznej warstwy kości, którą następnie należy usunąć za pomocą precyzyjnej pęsety. Po oczyszczeniu czaszki z krwi i odłamków kostnych oraz ustąpieniu krwawienia, należy użyć uchwytu do kaniuli, aby umieścić pompę i rurkę łączącą w utworzonej właśnie kiesonce. Teraz należy ustawić końcówkę kaniuli w odpowiednich współrzędnych stereotaktycznych na powierzchni mózgu, a następnie ostrożnie wprowadzić rurkę do mózgu, zatrzymując się 1 mm przed wymaganą głębokością.Należy ponownie upewnić się, że powierzchnia czaszki jest czysta i sucha, a następnie za pomocą wykałaczki wygładzić świeżo przygotowany akryl dentystyczny na całej odsłoniętej powierzchni czaszki, w tym w otworze wiertniczym wokół kaniuli, zanim akryl stwardnieje. Końcówkę kaniuli należy obniżyć na pozostałą głębokość do celu. Gdy kaniula znajdzie się na miejscu, należy ostrożnie nałożyć drugą warstwę świeżo przygotowanego akrylu dentystycznego na czaszkę oraz na biały plastikowy wspornik kaniuli, aby unieruchomić kaniulę w tej pozycji.Po utwardzeniu akrylu ostrożnie usuń uchwyt kaniuli i za pomocą podgrzanego ostrza skalpela przetop plastikową zakładkę kaniuli. Następnie zaszyj skórę nad całym implantem. Na brzegi rany nanieś maść antyseptyczną i podaj zwierzęciu lek przeciwzapalny.Na koniec wyjmij mysz z ramki. Umieść ją pod lampą grzewczą i monitoruj zwierzę do czasu pełnego wybudzenia. Dorosłe samce myszy, które przebywały w parach z dorosłymi samicami przez siedem dni, wykazują o około 12% więcej neuronów w obszarze dodatniego SNC w śródmózgowiu niż samce przebywające w parach z samcami.W przeciwieństwie do nich, samice sparowane z samcami mają o około 12% mniej neuronów SNC wykazujących pozytywną reakcję na TH niż samice sparowane z samicami. Liczba neuronów SNC i neuronów obszaru brzusznego pola nakrywki pozytywnych na TH jest również zwiększona u dorosłych samców myszy poddanych wzbogaceniu środowiskowemu poprzez parowanie oraz super-wzbogaceniu przez 14 dni. W przypadku zwierząt poddanych wzbogaceniu środowiskowemu oraz super-wzbogaceniu z infuzją nośnika, odnotowano o około 14% więcej neuronów SNC pozytywnych na TH.Z kolei zwierzęta utrzymywane w standardowych warunkach, którym podawano nośnik, a także zwierzęta poddane wzbogaceniu środowiskowemu oraz super-wzbogaceniu wraz z infuzją antagonisty receptora gabaa, nie wykazują tego wzrostu. Podczas wprowadzania manipulacji środowiskowych należy pamiętać o ograniczeniu wszelkich zakłóceń dla zwierząt do minimum, na przykład poprzez maksymalne zredukowanie hałasu i unikanie zmian klatek. Przy tworzeniu wzbogaconego środowiska kluczowe jest zapewnienie zróżnicowanego materiału do budowy gniazd oraz utrzymanie stałego miejsca gniazdowania, aby zminimalizować stres u zwierząt.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak manipulować środowiskiem dorosłych myszy w celu wywołania zmian w mózgu i zachowaniu. Prosimy pamiętać, że substancje chemiczne mogą być niezwykle niebezpieczne, dlatego podczas przygotowywania pomp osmotycznych należy zawsze nosić odzież ochronną.

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Modulacje środowiskowe liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Opisano metody manipulacji i analizy neurogenezy hipokampa zależnej od NF-κB u dorosłych. Przedstawiono szczegółowy protokół testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (określanego jako separacja wzorca przestrzennego - labirynt Barnesa) w celu zbadania wyników poznawczych u myszy. Technika ta powinna również pomóc w umożliwieniu badań w innych warunkach eksperymentalnych.

Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

Opracowaliśmy model przyspieszonego stresu związanego z porażką społeczną dla dorastających myszy C57BL/6, który działa zarówno u samców, jak i samic i umożliwia ekspozycję podczas dyskretnych okresów dojrzewania. Ekspozycja na ten model indukuje unikanie społeczne, ale tylko w podgrupie pokonanych samców i samic myszy.

Model stresu porażki społecznej dla dorastających samców i samic myszy C57BL/6

Poznaj metody manipulacji środowiskowej i wlewu do mózgu u dorosłych myszy w celu badania plastyczności neuronów dopaminowych śródmózgowia. Technika ta pozwala analizować zmiany behawioralne i neuronalne.

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów