zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty
31 maja 2016
Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja zwapnienia naczyń aorty ex vivo oraz modelowanie zwapnienia naczyń in vivo z wykorzystaniem hodowlanych pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty mysiej. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chorób naczyniowych, dostarczając modelu in vitro do badania mechanizmów molekularnych zwapnienia naczyń oraz umożliwiając ocenę zwapnienia naczyń i stanu zapalnego wywołanego przez makrofagi in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na czułą kwantyfikację i kolokalizację aktywności makrofagów z złogami wapnia w zmianach miażdżycowych, nawet we wczesnych stadiach choroby.
Oprócz Caitlin i mnie, tę procedurę będzie demonstrował Robert Tainsh, technik w naszym laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, zdezynfekuj ogon za pomocą wacika z alkoholem i zlokalizuj bocznie żyły ogonowe. Następnie, wywierając lekki nacisk do przodu na strzykawkę, wprowadź igłę o rozmiarze 30G do ogona, aż zostanie ona wprowadzona bez oporu.
Następnie wstrzyknij 100 µL kalcjum NIR i/lub 100 µL katepsyny NIR ze stałą prędkością. Wyjmij igłę po pięciu sekundach, a aort poszukaj od trzech do 24 godzin po wstrzyknięciu. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń otrzewną, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
Następnie usunąć narządy przewodu pokarmowego, uważając, aby nie przeciąć aorty. Po tym wykonać nacięcie boczne w przedniej części przepony i kontynuować nacięcie przez brzuch. Za pomocą nożyczek chirurgicznych uwolnić klatkę piersiową, przecinając boki żeber i usuwając tkankę miękką przylegającą do górnej części mostka.
Następnie usuń klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. Ostrożnie wyjmij płuca. Następnie z uwagą usuń tchawicę i przełyk, upewniając się, że aorta pozostała nienaruszona.
Następnie usuń tkankę miękką otaczającą aortę, od rozwidlenia tętnic biodrowych do łuku aorty. Zachowaj ostrożność podczas usuwania tłuszczu okołaortycznego. Po tym kroku usuń pozostały tłuszcz i tkankę miękką otaczającą aortę piersiową oraz główne odgałęzienia łuku aorty.
Następnie usuń grasicę. Teraz wyjmij serce z jam ciała klatki piersiowej, ostrożnie oddzielając je od aorty proksymalnej. Następnie przetnij aortę dystalną na wysokości rozwidlenia biodrowego.
Za pomocą igły insulinowej wstrzyknij sól fizjologiczną do aorty, zaczynając od łuku aorty, aby wypłukać pozostałe komórki krwi. Oddziel aortę wraz z naczyniami łuku aorty i całkowicie usuń ją z organizmu. Umieść aortę w roztworze soli fizjologicznej na lodzie do momentu rozpoczęcia obrazowania.
Na tym etapie należy umieścić aorty w schłodzonym HBSS do czasu zakończenia sekcji. W sterylnej komorze do hodowli tkanek przenieść aorty do roztworu do trawienia aorty w naczyniach hodowlanych o wymiarach 35 X 10 milimetrów. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut, stosując delikatne, przerywane kołysanie.
Po trawieniu aortą powinny mieć rozciągnięty lub postrzępiony wygląd. Pod mikroskopem sekcyjnym usuń zewnętrzną warstwę zewnętrzną aorty, pozostawiając nienaruszoną warstwę środkową. W tym celu odwarstw zewnętrzną warstwę aorty na jednym z końców i zdejmij ją z leżącej poniżej warstwy środkowej, podobnie jak skarpetkę.
Po usunięciu błony treściwej inkubuj pozostałą aortę w nowej naczyniu hodowlanym z pożywką do hodowli komórek w temperaturze 37 °C przez dwie do czterech godzin. Następnie przetnij aortę na pierścienie o szerokości od jednego do dwóch milimetrów. Przenieś pierścienie do nowego naczynia do hodowli tkanek z roztworem do trawienia aorty i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 120 minut, stosując delikatne, przerywane kołysanie.
Podczas inkubacji kilkakrotnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby resuspenderaj komórki. Następnie dodaj pięć mililitrów podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych do roztworu trawiennego i przenieś go do stożkowatej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wiruj probówkę przez pięć minut przy 200 G. Następnie odessij pożywkę i resuspenderaj komórki w pożądanej objętości pożywki do hodowli komórkowych.
Aby wywołać zwapnienie w komórkach mięśni gładkich naczyń, przenieś komórki na płytkę hodowlaną z sześcioma dołkami i pozwól im przywrósć. Następnie uzupełnij pożywkę do medium indukującego zwapnienie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej siedem dni.
Następnie odessaj pożywkę z płytki hodowli komórkowej. Przepłucz komórki raz w wodzie zjonizowanej. Utrwal komórki, umieszczając je w 1 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut.
Następnie usunąć formalinę i płukać utrwalone komórki wodą destylowaną przez pięć minut. Kolejnie inkubować komórki w jednym mililitrze 5% roztworu azotanu srebra pod żarówką o mocy od 60 do 100 watów przez jedną do dwóch godzin. Po tym czasie odessać roztwór azotanu srebra i płukać wodą destylowaną przez pięć minut.
Po pięciu minutach usuń niezwiązane srebro, umieszczając komórki w jednym mililitrze 5% roztworu tiosiarczanu sodu w wodzie destylowanej na pięć minut. Następnie płucz komórki wodą destylowaną przez pięć minut. Komórki barwione metodą von Kossa są teraz gotowe do obrazowania przy użyciu standardowego odwróconego mikroskopu optycznego.
Na tej rycinie przedstawiono myszy typu dzikiego, myszy z nokautem genu MGP oraz myszy z nokautem genu LDLR, którym podano wewnątrzżylnie przez ogon wapń NIR oraz katepsynę NIR; aorty pobrano po 24 godzinach i oceniono za pomocą obrazowania fluorescencyjnego NIR. Myszy typu dzikiego praktycznie nie wykazują zwapnień aorty ani obecności makrofagów. Aorty myszy z nokautem genu LDLR wykazują rozległe zwapnienia, które współwystępują z akumulacją makrofagów.
W przeciwieństwie do nich, myszy z nokautem genu MGP wykazują zwapnienie aorty, które występuje przy braku infiltracji makrofagów. W tym eksperymencie hodowane VSMC aorty wyizolowano z myszy z nokautem MGP i zainfekowano adenowirusem wykazującym ekspresję GFP lub MGP. VSMC aorty wyizolowane z myszy typu dzikiego przetransfekowano za pomocą kontrolnego, losowego siRNA lub siRNA celującego w MGP.
Komórki hodowano w medium do kalcyfikacji A przez siedem dni, a następnie utrwalono i zabarwiono metodą von Kossa. Barwienie wapnia ilościowo oceniono za pomocą oprogramowania ImageJ po odjęciu tła. Po opracowaniu tych technik naukowcy mogli obrazować miażdżycę oraz kalcyfikację naczyniową ex vivo.
Oraz do modelowania zwapnienia naczyń krwionośnych in vitro. Otwiera to możliwość testowania efektów nowych terapii lekowych w chorobach naczyniowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować aorty w celu uzyskania pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń aorty myszy, wizualizować blaszki miażdżycowe za pomocą sond obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni oraz zwapniałe mięśnie gładkie naczyń in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody wizualizacji i kwantyfikacji zwapnienia naczyń w hodowlanym pierwotnych komórkach mięśni gładkich aorty myszy oraz w aortach zwierząt. Ma on na celu pogłębienie zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Obrazowanie komórkowe
Wstęp
- Wapnienie naczyń jest istotnym czynnikiem w chorobach układu sercowo-naczyniowego.
- Zrozumienie mechanizmów wapnienia może pomóc w leczeniu tych schorzeń.
- Aktywność makrofagów jest powiązana ze stanem zapalnym naczyń i ich wapnieniem.
- Modele in vitro są niezbędne do badania tych procesów.
Cel badania
- Wizualizacja wapnienia naczyń aorty ex vivo.
- Modelowanie wapnienia naczyń in vivo z wykorzystaniem hodowlanych komórek.
- Ocena stanu zapalnego makrofagów w związku z wapnieniem.
Zastosowane metody
- Indukcja zwapnienia w hodowlach pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
- Ilościowe oznaczenie zwapnienia w aortach zwierząt.
- Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni w celu czułego wykrywania.
- Kolokalizacja aktywności makrofagów z złogami wapnia.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja zwapnienia naczyń w hodowlach komórkowych.
- Ilościowa ocena zwapnienia oraz obciążenia makrofagami.
- Demonstracja procesów chorobowych we wczesnym stadium.
- Wgląd w zależność między stanem zapalnym a zwapnieniem.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania chorób naczyniowych.
- Umożliwia ona badanie molekularnych mechanizmów zwapnienia.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu opracowania strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednostkom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego modelowanie zwapnienia naczyń i stanu zapalnego w miażdżycy z wykorzystaniem komórek mięśni gładkich naczyń pochodzenia mysiego i ludzkiego, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Podejście oparte na obrazowaniu w bliskiej podczerwieni z użyciem podwójnej sondy pozwala na ilościową ko-lokalizację zwapnień i aktywności makrofagów, zapewniając pewność prognostyczną w odniesieniu do wczesnych etapów procesów chorobowych. Możliwości te stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac (go/no-go) w rozwoju terapii sercowo-naczyniowych poprzez powiązanie ścieżek molekularnych z wynikami fenotypowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez modelowanie szlaków sygnalizacyjnych zwapnienia w komórkach mięśni gładkich naczyń.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez indukcję zwapnienia i barwienie metodą von Kossa w komórkach pierwotnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację molekularnych czynników zwapnienia niezależnych od stanu zapalnego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewania związków z wykorzystaniem pożywek kalcyfikujących i protokołów hodowli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje gotowość do testów poprzez powtarzalną izolację komórek mięśni gładkich naczyń aorty z Źródeł mysich i ludzkich.
- Wartość skalowalności: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki spójnym procesom adhezji komórek, indukcji kalcyfikacji i barwienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez obrazowanie aorty ex vivo oraz modelowanie zwapnienia in vitro.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia związek między zapaleniem a zwapnieniem z wykorzystaniem modeli knockout LDLR oraz MGP.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji poprzez wykazanie, że zwapnienie może wystąpić bez infiltracji makrofagów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkryć – od identyfikacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjne badanie mechanizmów zwapnienia naczyń.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków kalcyfikacji z wykorzystaniem modulacji siRNA i adenowirusów w komórkach mięśni gładkich naczyń.
- Przesiewanie: Opisuje przygotowanie testu poprzez standaryzowaną hodowlę komórek, indukcję kalcyfikacji oraz barwienie metodą von Kossa.
- Analityka: Podkreśla ilościową analizę barwienia wapniem w programie ImageJ po odjęciu tła w celu porównania poszczególnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z ciągłością przedkliniczną poprzez obrazowanie ex vivo kalcyfikacji aorty i kolokalizacji makrofagów w modelach miażdżycowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia protokół izolacji komórek i indukcji kalcyfikacji jako zdolność wielokrotnego wykorzystania w projektach ukierunkowanych na układ sercowo-naczyniowy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznych w relacjach między zwapnieniem a stanem zapalnym.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność izolacji oraz hodowli komórek mięśni gładkich naczyń aorty w modelach mysich i ludzkich.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki umożliwieniu wczesnej oceny fenotypów zwapnienia w odpowiedzi na modulację genetyczną lub farmakologiczną.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich rolę w szlakach zwapnienia zwalidowanych in vitro i ex vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek naczyniowych, sekcji oraz obrazowaniu fluorescencyjnym w bliskiej podczerwieni.
- Zależne od odczynników o stopniu czystości histologicznej, w tym formaliny, azotanu srebra i tiosiarczanu sodu do barwienia metodą von Kossa.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy zespołami histologii, obrazowania i biologii komórki w celu zapewnienia spójnej kwantyfikacji zwapnień.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują różnice gatunkowe w kinetyce zwapnień aorty pomiędzy mysimi a ludzkimi komórkami pochodzącymi z tętnic wieńcowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czasochłonny charakter sekcji aorty oraz wymóg posiadania specjalistycznego sprzętu obrazującego do detekcji w bliskiej podczerwieni.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Tail Vein Injection
1:35
Mouse Dissection
3:39
Isolation of Primary Murine Aortic VSMCs
5:21
Assessing VSMC Calcification Using the Von Kossa Staining Method
6:43
Results: MGP Deficiency Results in Vascular Calcification in the Absence of Vascular Inflammation and MGP Protects Cultured VSMCs from Calcification
8:03
Conclusion
