zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty
31 maja 2016
Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja zwapnienia naczyń aorty ex vivo oraz modelowanie zwapnienia naczyń in vivo przy użyciu hodowanych pierwotnych mysich komórek mięśni gładkich aorty. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chorób naczyniowych, dostarczając model in vitro do badania molekularnych mechanizmów zwapnienia naczyń krwionośnych i umożliwiając ocenę zwapnienia naczyń i zapalenia makrofagów in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na czułą kwantyfikację i kolokalizację aktywności makrofagów ze złogami wapnia w zmianach miażdżycowych nawet we wczesnych stanach choroby.
Tę procedurę zademonstruje oprócz Caitlin i mnie Robert Tainsh, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym alkoholem i zlokalizuj żyły ogonowe z boku. Następnie lekko naciskaj strzykawkę do przodu, gdy igła o rozmiarze 30 jest wsunięta w ogon bez oporu.
Następnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów wapnia NIR i/lub 100 mikrolitrów katepsy NIR ze stałą szybkością. Wyjmij igłę po pięciu sekundach i pobierz aortę od trzech do 24 godzin po wstrzyknięciu. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń otrzewną, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
Następnie usuń narządy żołądkowo-jelitowe, uważając, aby nie przeciąć aorty. Następnie wykonaj boczne nacięcie w przedniej przeponie i kontynuuj nacięcie w poprzek brzucha. Za pomocą nożyczek preparacyjnych zwolnij klatkę piersiową, przecinając boki żeber i usuwając tkankę miękką przylegającą do górnej części mostka.
Następnie zdejmij klatkę piersiową i odsłoń płuca. Ostrożnie usuń płuca. Następnie ostrożnie usuń tchawicę i przełyk, upewniając się, że aorta pozostaje nienaruszona.
Następnie usuń tkankę miękką otaczającą aortę od rozwidlenia biodrowego do łuku aorty. Zachowaj ostrożność podczas usuwania tłuszczu okołoaortalnego. Następnie usuń pozostały tłuszcz i tkankę miękką otaczającą aortę piersiową i duże gałęzie łuku aorty.
Następnie usuń grasicę. Teraz usuń serce z jamy klatki piersiowej, ostrożnie odłączając je od bliższej aorty. Następnie przeciąć dystalną aortę w rozwidleniu biodrowym.
Za pomocą igły insulinowej wstrzyknij zwykłą sól fizjologiczną do aorty z łuku aorty, aby wypłukać pozostałe krwinki. Odłącz aortę wraz z naczyniami łuku aorty i całkowicie usuń ją z ciała. Umieść aortę w normalnym roztworze soli fizjologicznej na lodzie, aż będzie gotowa do obrazowania.
Na tym etapie umieść aorty w zimnym HBSS, aż do zakończenia sekcji. W sterylnym kapturze do hodowli tkanek przenieś aorty do roztworu do trawienia aorty w szalkach do hodowli tkankowych o wymiarach 35 x 10 milimetrów. Następnie inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie przerywając kołysanie.
Po strawieniu aorty powinny wyglądać na rozciągnięte lub postrzępione. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń zewnętrzną warstwę przybyszową aorty, zachowując nienaruszoną warstwę przyśrodkową. Aby to zrobić, oderwij zewnętrzną warstwę aorty na jednym końcu i usuń ją z leżącej poniżej warstwy przyśrodkowej jak skarpetę.
Po usunięciu warstwy przybyszowej inkubuj pozostałą aortę w nowym naczyniu hodowlanym z pożywką do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Następnie przetnij aortę na pierścienie o szerokości od jednego do dwóch milimetrów. Przenieś pierścienie do nowego naczynia do hodowli tkankowej z roztworem do trawienia aorty i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym przerywanym kołysaniem przez 120 minut.
Podczas inkubacji należy kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki. Następnie dodaj pięć mililitrów ciepłej pożywki do hodowli komórek do roztworu wytrawiającego i przenieś ją do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 200 G. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości pożywki do hodowli komórkowych.
Aby wywołać zwapnienie w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych, przenieś komórki na sześciodołkową płytkę hodowlaną i pozwól im przylegać. Następnie ponownie nałóż komórki na pożywkę do zwapnienia. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej siedem dni.
Następnie odessać pożywkę z płytki do hodowli komórkowej. Umyj komórki raz w zjonizowanej wodzie. Napraw komórki, umieszczając je w jednym mililitrze 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut.
Następnie usuń formalinę i myj utrwalone komórki wodą destylowaną przez pięć minut. Następnie inkubuj komórki w jednym mililitrze 5% roztworu azotanu srebra pod żarówką o mocy od 60 do 100 watów przez jedną do dwóch godzin. Następnie odessać roztwór azotanu srebra i przemywać wodą destylowaną przez pięć minut.
Po pięciu minutach usuń nieprzereagowane srebro, umieszczając komórki w jednym mililitrze 5% roztworu tiosiarczanu sodu w wodzie destylowanej na pięć minut. Następnie płucz komórki wodą destylowaną przez pięć minut. Komórki wybarwione metodą von Kossa są teraz gotowe do obrazowania za pomocą standardowej mikroskopii w świetle odwróconym.
Na tym rysunku myszom z nokautem MGP typu dzikiego i myszom z nokautem LDLR wstrzyknięto NIR wapnia i katepsynę NIR poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, a aorty pobrano 24 godziny później i oceniono za pomocą obrazowania florescencji NIR. Myszy typu dzikiego praktycznie nie wykazują zwapnienia aorty ani obecności makrofagów. Aorty myszy z nokautem LDLR mają rozległe zwapnienie, które współlokalizuje się z akumulacją makrofagów.
W przeciwieństwie do tego, myszy z nokautem MGP mają zwapnienie aorty, które występuje przy braku infiltracji makrofagów. W tym eksperymencie hodowane VSMC aorty wyizolowano od myszy z nokautem MGP i zainfekowano adenowirusem wykazującym ekspresję GFP lub MGP. VSMC aorty wyizolowane od myszy typu dzikiego transfekowano albo kontrolnym zakodowanym siRNA, albo siRNA ukierunkowanym na MGP.
Komórki hodowano w pożywce do zwapnienia A przez siedem dni, a następnie utrwalano i barwiono za pomocą von Kossy. Barwienie wapniem określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ po odjęciu tła. Po jego opracowaniu techniki te umożliwiły naukowcom obrazowanie miażdżycy i zwapnienia naczyń krwionośnych ex vivo.
I do modelowania zwapnienia naczyń krwionośnych in vitro. Otwiera to możliwość testowania wpływu nowych terapii lekowych na choroby naczyniowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować aorty w pierwotnych mysich komórkach mięśni gładkich naczyń aortalnych, wizualizować blaszki miażdżycowe za pomocą sond fluorescencyjnych w bliskiej podczerwieni i zwapniałe mięśnie gładkie naczyń krwionośnych in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody wizualizacji i kwantyfikacji zwapnienia naczyń w hodowlanym pierwotnych komórkach mięśni gładkich aorty myszy oraz w aortach zwierząt. Ma on na celu pogłębienie zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Obrazowanie komórkowe
Wstęp
- Wapnienie naczyń jest istotnym czynnikiem w chorobach układu sercowo-naczyniowego.
- Zrozumienie mechanizmów wapnienia może pomóc w leczeniu tych schorzeń.
- Aktywność makrofagów jest powiązana ze stanem zapalnym naczyń i ich wapnieniem.
- Modele in vitro są niezbędne do badania tych procesów.
Cel badania
- Wizualizacja wapnienia naczyń aorty ex vivo.
- Modelowanie wapnienia naczyń in vivo z wykorzystaniem hodowlanych komórek.
- Ocena stanu zapalnego makrofagów w związku z wapnieniem.
Zastosowane metody
- Indukcja zwapnienia w hodowlach pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
- Ilościowe oznaczenie zwapnienia w aortach zwierząt.
- Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni w celu czułego wykrywania.
- Kolokalizacja aktywności makrofagów z złogami wapnia.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja zwapnienia naczyń w hodowlach komórkowych.
- Ilościowa ocena zwapnienia oraz obciążenia makrofagami.
- Demonstracja procesów chorobowych we wczesnym stadium.
- Wgląd w zależność między stanem zapalnym a zwapnieniem.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania chorób naczyniowych.
- Umożliwia ona badanie molekularnych mechanizmów zwapnienia.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu opracowania strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednostkom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego modelowanie zwapnienia naczyń i stanu zapalnego w miażdżycy z wykorzystaniem komórek mięśni gładkich naczyń pochodzenia mysiego i ludzkiego, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Podejście oparte na obrazowaniu w bliskiej podczerwieni z użyciem podwójnej sondy pozwala na ilościową ko-lokalizację zwapnień i aktywności makrofagów, zapewniając pewność prognostyczną w odniesieniu do wczesnych etapów procesów chorobowych. Możliwości te stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac (go/no-go) w rozwoju terapii sercowo-naczyniowych poprzez powiązanie ścieżek molekularnych z wynikami fenotypowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez modelowanie szlaków sygnalizacyjnych zwapnienia w komórkach mięśni gładkich naczyń.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez indukcję zwapnienia i barwienie metodą von Kossa w komórkach pierwotnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację molekularnych czynników zwapnienia niezależnych od stanu zapalnego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewania związków z wykorzystaniem pożywek kalcyfikujących i protokołów hodowli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje gotowość do testów poprzez powtarzalną izolację komórek mięśni gładkich naczyń aorty z Źródeł mysich i ludzkich.
- Wartość skalowalności: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki spójnym procesom adhezji komórek, indukcji kalcyfikacji i barwienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez obrazowanie aorty ex vivo oraz modelowanie zwapnienia in vitro.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia związek między zapaleniem a zwapnieniem z wykorzystaniem modeli knockout LDLR oraz MGP.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji poprzez wykazanie, że zwapnienie może wystąpić bez infiltracji makrofagów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkryć – od identyfikacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjne badanie mechanizmów zwapnienia naczyń.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków kalcyfikacji z wykorzystaniem modulacji siRNA i adenowirusów w komórkach mięśni gładkich naczyń.
- Przesiewanie: Opisuje przygotowanie testu poprzez standaryzowaną hodowlę komórek, indukcję kalcyfikacji oraz barwienie metodą von Kossa.
- Analityka: Podkreśla ilościową analizę barwienia wapniem w programie ImageJ po odjęciu tła w celu porównania poszczególnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z ciągłością przedkliniczną poprzez obrazowanie ex vivo kalcyfikacji aorty i kolokalizacji makrofagów w modelach miażdżycowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia protokół izolacji komórek i indukcji kalcyfikacji jako zdolność wielokrotnego wykorzystania w projektach ukierunkowanych na układ sercowo-naczyniowy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznych w relacjach między zwapnieniem a stanem zapalnym.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność izolacji oraz hodowli komórek mięśni gładkich naczyń aorty w modelach mysich i ludzkich.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki umożliwieniu wczesnej oceny fenotypów zwapnienia w odpowiedzi na modulację genetyczną lub farmakologiczną.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich rolę w szlakach zwapnienia zwalidowanych in vitro i ex vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek naczyniowych, sekcji oraz obrazowaniu fluorescencyjnym w bliskiej podczerwieni.
- Zależne od odczynników o stopniu czystości histologicznej, w tym formaliny, azotanu srebra i tiosiarczanu sodu do barwienia metodą von Kossa.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy zespołami histologii, obrazowania i biologii komórki w celu zapewnienia spójnej kwantyfikacji zwapnień.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują różnice gatunkowe w kinetyce zwapnień aorty pomiędzy mysimi a ludzkimi komórkami pochodzącymi z tętnic wieńcowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czasochłonny charakter sekcji aorty oraz wymóg posiadania specjalistycznego sprzętu obrazującego do detekcji w bliskiej podczerwieni.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Tail Vein Injection
1:35
Mouse Dissection
3:39
Isolation of Primary Murine Aortic VSMCs
5:21
Assessing VSMC Calcification Using the Von Kossa Staining Method
6:43
Results: MGP Deficiency Results in Vascular Calcification in the Absence of Vascular Inflammation and MGP Protects Cultured VSMCs from Calcification
8:03
Conclusion
