Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Ogólnym celem tej procedury jest dokładny pomiar żywotności komórek w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki i neurofarmakologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy odróżnić niechciane komórki glejowe od neuronów w hodowlach komórkowych MISTA.

Procedury zademonstrują Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, trzej studenci z mojego laboratorium. Rozpocznij preparowanie głów ośmiodniowych szczeniąt szczurów, najpierw wkładając nożyczki do otworu wielkiego i przecinając dwie strony czaszki od uszu do oczu. Następnie użyj kleszczy, aby podnieść czaszkę.

Użyj kleszczy, aby wyizolować móżdżek i umieść go w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym roztwór preparacyjny. Przenieś płytkę na etap mikroskopu preparacyjnego i użyj dwóch par kleszczy, aby usunąć opony mózgowe i naczynia krwionośne. Użyj ostrza, aby posiekać tkanki, a następnie przenieś tkankę do probówki wirówkowej zawierającej 30 mililitrów roztworu preparacyjnego.

Wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy 1 500 x g. Po odwirowaniu odessać supernatant i zachować osad. Następnie dodaj roztwór trypsyny do granulki i ponownie zawieś, delikatnie wstrząsając.

Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Po 15 minutach dodaj roztwór DNazy One, inhibitora trypsyny sojowej i siarczanu magnezu i wstrząśnij. Następnie wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy sile 1 500 x g.

Po odessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w mniej rozcieńczonym roztworze DNazy One, inhibitora trypsyny sojowej i siarczanu magnezu. Następnie przygotuj dwie 15-mililitrowe tubki. Umieść połowę komórek w każdej probówce i pipetuj w górę iw dół od 60 do 70 razy za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką, aby homogenizować komórki.

Po homogenizacji dodaj trzy mililitry roztworu siarczanu magnezu i chlorku wapnia do każdej 15-mililitrowej probówki. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po upływie tego czasu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką i przenieść do nowych 15-mililitrowych probówek.

Wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g. Dodać pożywkę hodowlaną do osadu, aby rozcieńczyć do gęstości komórek około 1,5 x 10 do szóstych komórek na mililitr. Pipetować komórki do płytki 6-dołkowej i hodować w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 24 godzinach dodać roztwór podstawowy AraC do końcowego stężenia jednego milimola, aby zahamować wzrost komórek glejowych przed powrotem płytek do inkubatora. Następnie, w siódmym dniu, dodaj 50 mikrolitrów do roztworu podstawowego D-glukozy do końcowego stężenia jednego milimola. Barwienie należy rozpocząć od zmieszania dioctanu fluoresceiny do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i jodku propidyny do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr i 10 mililitrów PBS.

Wymieszaj roztwór FDA/PI przez wirowanie i umieść na lodzie. Umieść płytkę hodowlaną na lodzie. Ostrożnie zassać pożywkę hodowlaną, nie dotykając komórek końcówką pipety, a następnie powoli dodawać zimny PBS.

Odessać PBS, a następnie dodać zimny roztwór roboczy FDA/PI lub FDA/PI Hoechst. Połóż talerz na lodzie na pięć minut. Następnie, po zassaniu roztworu roboczego FDA/PI lub FDA/PI/Hoechst, dodaj zimny PBS do każdej studzienki.

Upewnij się, że mikroskop fluorescencyjny jest prawidłowo ustawiony. Wykrywanie emisji fluorescencyjnych dla FDA, PI i Hoechst odpowiednio przy 520, 620 i 460 nanometrach, przy użyciu czasu ekspozycji od 100 do 300 milisekund i wzmocnienia analogowego 2,8 x. Po zebraniu obrazów fluorescencyjnych zrób zdjęcie w normalnym świetle, korzystając z trybu kontrastu fazowego.

W przypadku podwójnego barwienia FDA/PI nałóż obrazy komórek, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki. Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując wartość 50% w polu Krycie panelu Warstwy. Scal dwie warstwy, otwierając menu Warstwa i klikając przycisk Scal widoczne.

Ustaw kontrast obrazów nakładki, wprowadzając 50 w polu Kontrast w obszarze Obraz, Dopasowania, Jasność/Kontrast. Sprawdź, czy na obrazach nakładki nie ma podwójnie dodatnich komórek FDA i PI. W przypadku potrójnego barwienia FDA/PI/Hoechst nałóż obrazy komórek, ponownie przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI, dostosowując nieprzezroczystość warstwy dodatniej FDA i scalając obrazy jak poprzednio.

Następnie przeciągnij warstwę dodatnią Hoechst na scaloną warstwę. Dostosuj krycie warstwy dodatniej Hoechst, wpisując 50% w polu Krycie panelu Warstwy i połącz dwie warstwy, otwierając menu Warstwa i klikając przycisk Scal widoczne. Wizualnie odróżnij duże, nieregularne komórki glejowe od ziarnistych neuronów móżdżku, porównując obrazy wykonane w trybie fluorescencyjnym z tymi wykonanymi w trybie kontrastu fazowego.

Poniższe obrazy pokazują, że zarówno małe neurony, jak i duże, nieregularne komórki glejowe są obecne w hodowli CGN. To zdjęcie przedstawia barwienie aminokwasami GAP-43 w kulturze CGN po ośmiu dniach in vitro. Niebieskie strzałki wskazują neurony.

Tutaj pokazano barwienie aminokwasowe GFAP komórek glejowych. Biała strzałka oznacza komórkę glejową. Ten obraz kontrastu fazowego pokazuje morfologię komórek.

Barwienie haczykowe FDA/PI, które pozwala odróżnić komórki glejowe od neuronów, jest korzystne dla dokładnej oceny żywotności neuronów w hodowli CGN. Jest to scalony obraz potrójnie wybarwionych komórek wyhodowanych w normalnym pożywce wzrostowej. Strzałka przedstawia typową komórkę glejową.

W tym przypadku podobna kultura została potraktowana pożywką zawierającą niską zawartość potasu, a strzałka ponownie wskazuje na typową komórkę glejową. Zwróć również uwagę na pojawienie się czerwonego zabarwienia jodkiem propidyny. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podobną strategię można zastosować do innych mieszanych kultur komórkowych, takich jak pierwotne kultury korowe i pierwotne kultury hipokampa, aby dokładnie przeanalizować żywotność neuronów.