Name: Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę oceny żywotności neuronów ziarnistych móżdżku szczura przy użyciu podwójnego barwienia FDA i PI. Technika ta pozwala odróżnić neurony od komórek glejowych w hodowlach MISTA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LY15H310007), Projektu Badań Stosowanych nad Technologią Non-Profit Prowincji Zhejiang (2016C37110), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (U1503223, 81673407), Międzynarodowego Projektu Współpracy Naukowej i Technologicznej w Ningbo (2014D10019), Zespołu ds. Innowacji Miejskich w Ningbo w dziedzinie nauk przyrodniczych i zdrowia (2015C110026), Współpracy Międzynarodowej Prowincji Guangdong Projekt Nauki i Technologii (nr 2013B051000038), Program Badań Podstawowych w Shenzhen (JCYJ20160331141459373), Program Finansowania Współpracy Technologicznej Guangdong-Hongkong (GHP/012/16GD), Rada ds. Grantów Badawczych Hongkongu (15101014), Politechnika w Hongkongu (G-YBGQ) oraz K. C. Wong Magna Fund na Uniwersytecie Ningbo.

Wszystkie procedury były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80-23, poprawione w 1996 roku) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Ningbo (SYXK-2008-0110).
1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych
Uwaga: Odczynniki i zapasy muszą być przygotowywane w sterylnych warunkach. Sterylizować przez filtrowanie za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy poli-L-lizyny (PLL), dodając 5 mg PLL do 10 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Sterylizować przez filtrowanie. Porcję roztworu podstawowego PLL należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować bufor Krebsa, dodając 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2PO4, 2,6 g D-glukozy i 5,94 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Roztwór buforowy Krebsa należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór 3,82% Mg2SO4, dodając 3,82 g Mg2SO4 do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. RoztwórMg2SO4 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 1,2% roztwór CaCl2 dodając 1,2 g CaCl2 do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Przechowywać roztwór CaCl2 w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 2M roztwór KCl, dodając 15 g KCl do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Przechowywać roztwór KCl w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy D-glukozy, dodając 1,8 g D-glukozy do 100 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Porcję i przechowywać roztwór D-glukozy w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy cytozyny β-D-Arabinofuranozydu (Ara-C), dodając 0,24 g Ara-C do 10 ml ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie. Podwielokrotnić i przechowywać roztwór podstawowy Ara-C w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj 250 ml pożywki hodowlanej (dla 25-30 młodych) przy użyciu 25 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2,5 ml 100x glutaminy, 2,78 ml roztworu 2M KCl i 2,5 ml 100x antybiotyków w Basal Medium Eagle (BME). Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę 25K, używając 2,5 ml 100x glutaminy, 2,78 ml roztworu 2M KCl i 2,5 ml 100x antybiotyków w BME. Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę 5K, używając 2,5 ml 100x glutaminy i 2,5 ml 100x antybiotyków w BME. Dostosuj objętość do 250 ml i sterylizuj przez filtrowanie. 
	UWAGA: Pożywka hodowlana, pożywka 25K i pożywka 5K muszą być świeżo przygotowane</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy FDA, dodając 5 mg FDA do 1 ml acetonu. Przechowywać roztwór podstawowy FDA w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy PI, dodając 1 mg PI do 1 ml ddH2O. Przechowywać roztwór podstawowy PI w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy Hoechsta, dodając 5 mg Hoechst 33342 do 1 ml ddH2O. Roztwór podstawowy Hoechst należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów preparacyjnych
UWAGA: Zrób to 1 dzień przed sekcją.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór preparacyjny, dodając 15 ml buforu Krebsa, 1,2 ml 3,82% roztworu 2SO4 i 0,45 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 150mlddH2O. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH.</li>
	<li>Oznacz 5 probówek po 50 ml w następujący sposób: 1, 2, 3, 4 i 5.</li>
	<li>Umieścić 40 ml roztworu preparacyjnego w strzykawce o pojemności 50 ml z filtrem. Przefiltrować 30 ml roztworu rozwarstwiającego do probówki 1 i po 2 ml do kilku szalek do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm, które zostaną użyte do przetwarzania tkanek.</li>
	<li>Do probówki 2 dodać 12,5 mg trypsyny w 50 ml roztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.</li>
	<li>Do probówki 3 dodać 1,2 mg DNAzy I, 7,8 mg inhibitora trypsyny sojowej i 150 μl 3,82% roztworu 2 SO4 w 15 mlroztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.</li>
	<li>Do probówki 4 dodać 5 ml roztworu z probówki 3. Dodać 10,5 ml roztworu preparacyjnego. Sterylizować przez filtrowanie.</li>
	<li>Do probówki 5 dodać 100 μl roztworu 3,82% Mg2SO4 i 15 μl 1,2% roztworu CaCl2 w 12,5 ml roztworu preparacyjnego. Całkowicie wymieszaj przez wirowanie. Sterylizować przez filtrowanie.</li>
	<li>Przed użyciem przechowywać wszystkie probówki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych
UWAGA: Zrób to 1 dzień przed sekcją.
<ol>
	<li>Dodać 1 ml roztworu podstawowego PLL do 100 ml ddH2O (stężenie końcowe: 5 μg/ml). Pokryj plastikowe 6-dołkowe lub 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (2 ml na dołek w przypadku 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 1 ml na dołek w przypadku 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych), dodając 5 μg/ml roztworu poli-L-lizyny.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 dzień (lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny). 1-2 godziny przed sekcją usunąć roztwór za pomocą pipety. Przemyć raz za pomocą ddH2O i wysuszyć w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie tkanek dla 8-dniowych szczurów Sprague-Dawley.
<ol>
	<li>Połóż naczynie o średnicy 100 mm na lodzie. Odetnij głowy szczeniętom szczura do naczynia za pomocą wysterylizowanych nożyczek.</li>
	<li>Włóż nożyczki do otworu wielkiego i odetnij dwie strony czaszki, od uszu do oczu. Podnieś czaszkę za pomocą kleszczy. Upewnij się, że cały mózg znajduje się w czaszce. Odizoluj móżdżek i umieść go w wyżej wymienionym naczyniu o średnicy 35 mm za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Pracuj pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne za pomocą dwóch par kleszczy.</li>
	<li>Posiekaj chusteczki ostrzem. Włóż chusteczki do probówki 1. Wirować przez 5 minut przy temperaturze pokojowej i 1 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zachowaj pellet.</li>
	<li>Dodać roztwór z probówki 2 do osadu. Zawiesić, delikatnie potrząsając.</li>
	<li>Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Delikatnie wstrząsaj co 3 minuty.</li>
	<li>Dodać roztwór z probówki 4 do tego roztworu. Wstrząsać i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zachowaj pellet.</li>
	<li>Dodać roztwór do probówki 3 w celu ponownego zawieszenia osadu.</li>
	<li>Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml. Umieść połowę komórek w każdej probówce. Pipetuj w górę i w dół 60-70 razy za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką, aby homogenizować komórki.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu w probówce 5 do każdej probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw je w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką. Umieścić supernatant w nowych probówkach o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant. Zachowaj pellet.</li>
	<li>Dodaj pożywkę hodowlaną do osadu, aby uzyskać gęstość komórek około 1,5 x 106 komórek/ml (około 100 ml na 10 młodych).</li>
	<li>Umieścić komórki na płytkach hodowlanych i hodować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Dodatek Ara-C i D-glukozy podczas hodowli
<ol>
	<li>Po 24 godzinach dodać roztwór podstawowy Ara-C (10 μl/basenik dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 20 μl/basenik dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; końcowe stężenie: 1 mM) w celu zahamowania wzrostu komórek glejowych.</li>
	<li>W dniu 7 dodać 50 μl roztworu podstawowego D-glukozy na dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 100 μl na basenik dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 mM.</li>
</ol>
6. Podwójne barwienie FDA-PI i potrójne barwienie FDA-PI-Hoechst w hodowli CGN
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy FDA-PI, dodając 20 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe: 10 μg/ml) i 50 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe: 50 μg/ml) w 10 ml PBS. Wymieszaj przez wirowanie i umieść to na lodzie.
	<ol>
		<li>Do roztworu roboczego FDA-PI-Hoechst dodać 20 μl roztworu podstawowego FDA (stężenie końcowe: 10 μg/ml), 50 μl roztworu podstawowego PI (stężenie końcowe: 50 μg/ml) i 10 μl roztworu podstawowego Hoechst (stężenie końcowe: 5 μg/ml) w 10 ml PBS. Wymieszaj przez wirowanie i umieść to na lodzie. 
		UWAGA: Świeżo przygotowany roztwór roboczy FDA-PI i roztwór roboczy FDA-PI-Hoechst tuż przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora. Połóż go na lodzie.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją zimnym PBS. 
	UWAGA: Zmiana roztworu musi być wykonywana powoli i ostrożnie. Unikaj dotykania komórek końcówkami pipet.</li>
	<li>Odessać zimny PBS i zastąpić go zimnym roztworem roboczym FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst (500 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 1 ml/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych). Pozostaw na lodzie na 5 minut.</li>
	<li>Odessać roztwór roboczy FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst i dodać zimny PBS (100 μl/dołek dla 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych lub 50 μl/dołek dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych). 
	UWAGA: Nie należy dopuścić do wyschnięcia komórek podczas robienia zdjęć.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stosować filtr wzbudzenia o paśmie przepustowym 450 - 490 nm. Wykrywanie emisji fluorescencji dla FDA, PI i Hoechst odpowiednio przy 520, 620 i 460 nm. W tych samych warunkach wykonaj zdjęcie w normalnym świetle, korzystając z trybu kontrastu fazowego mikroskopii fluorescencyjnej. 
	UWAGA: Rób zdjęcia w ciągu 15 minut po barwieniu FDA-PI lub FDA-PI-Hoechst. Czas naświetlania wynosi 100-300 ms, a wzmocnienie analogowe 2,8x.</li>
</ol>
7. Ocena żywotności neuronów
<ol>
	<li>W przypadku podwójnego barwienia FDA-PI nałóż obrazy komórek wykrytych po przefiltrowaniu przez różne filtry fluorescencyjne, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki.
	<ol>
		<li>Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy". Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa". Ustaw kontrast obrazów nakładki, wpisując "50" w polu "Kontrast" w sekcji "Obraz"| "Korekty" | "Jasność/Kontrast". Upewnij się, że na obrazach nakładki nie ma podwójnie dodatnich komórek FDA i PI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku potrójnego barwienia FDA-PI-Hoechst nałóż obrazy komórek wykrytych po przefiltrowaniu różnych filtrów fluorescencyjnych, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki. Dostosuj krycie warstwy dodatniej FDA, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy".
	<ol>
		<li>Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa". Przeciągnij warstwę Hoechst-dodatni na scaloną warstwę. Dostosuj krycie warstwy dodatniej Hoechst, wpisując "50%" w polu "Krycie" panelu "Warstwy". Połącz dwie warstwy, klikając przycisk "Scal widoczne" w menu "Warstwa".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualnie odróżnij duże, nieregularne komórki glejowe od CGN, porównując obrazy wykonane w trybie fluorescencyjnym z tymi wykonanymi w trybie kontrastu fazowego - komórki o średnicach trzy razy większych niż CGN są uważane za komórki glejowe i powinny być wykluczone.</li>
	<li>Policz liczbę żywotnych neuronów i martwych neuronów, odpowiednio, za pomocą wtyczki licznika komórek w programie do przetwarzania obrazów (np. ImageJ)4.
	<ol>
		<li>W przypadku podwójnego barwienia FDA-PI należy ręcznie oznaczyć małe komórki dodatnie dla FDA jako żywotne neurony. Ręcznie oznacz komórki PI-dodatnie jako martwe neurony. W przypadku potrójnego barwienia FDA-PI-Hoechst należy ręcznie oznaczyć małe podwójnie dodatnie komórki FDA i Hoechsta jako żywotne neurony. Ręcznie oznacz podwójnie dodatnie komórki PI i Hoechst jako martwe neurony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz procent żywotności neuronów, używając następującego równania: % żywotności neuronów = [liczba żywotnych neuronów / (liczba martwych neuronów + liczba żywotnych neuronów)] x 100%. Dla każdej studzienki wybierz pięć losowych pól i uśrednij procent żywotności neuronów.</li>
</ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP%28%2B%29+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li>
<li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983(2015).</li>
<li>Labno, C. <a target="_blank" href="https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf">Two way to count cells with ImageJ</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf">https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf</a> (2008).</li>
<li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1%28%2B%2F-%29+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572(2012).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990(2009).</li>
<li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine%2C+but+not+donepezil%2C+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143(2011).</li>
<li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li>
<li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium%2Fserum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li>
<li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został zmodyfikowany w stosunku do procedur, które zostały opisane wcześniej 6,7. Naukowcy poświęcili czas na próby zmniejszenia wzrostu komórek nieneuronalnych poprzez poprawę warunków podczas hodowli neuronów pierwotnych in vitro8. Jednak nawet przy poprawie warunków hodowli niektóre komórki glejowe pozostają. Co więcej, komórki nieneuronalne są niezbędne w pierwotnych kulturach neuronalnych, ponieważ pomagają we wz...

Kolorymetryczne testy cytotoksyczności, takie jak test bromku 3- (4, 5-dimetylo-2-tiazolylu)-2, 5-difenylo-2-H-tetrazoliowego (MTT), są powszechnie używane do pomiaru żywotności komórek in vitro. Pierwotne neurony ziarniste móżdżku (CGN) szczurów są wrażliwe na różne neurotoksyny, w tym jon 1-metylo-4-fenylopirydyniowy, nadtlenek wodoru i glutaminian1,2. Dlatego kultury CGN mogą być wykorzystywane jako model in vitro w dziedzinie neuronauki. Hodowle CGN mogą zawierać różne komórki, w tym neurony i komórki glejowe, które mogą stanowić około 1% wszystkich komórek w hodowli CGN. Jednak komórki glejowe reagują inaczej na neurotoksyny w porównaniu z neuronami, co prowadzi do odchylenia żywotności neuronów mierzonej za pomocą testów kolorymetrycznych3.
W żywotnych komórkach, dioctan fluoresceiny (FDA) może być przekształcony we fluoresceinę przez esterazy. Jodek propidyny (PI) może wchodzić w interakcje z DNA po wniknięciu do martwych komórek i może być stosowany do wskazania apoptozy w hodowli. W związku z tym podwójne barwienie FDA-PI może jednocześnie oceniać żywe komórki i martwe komórki, co sugeruje, że żywotność komórek można dokładniej zmierzyć, łącząc obie metody kolorymetryczne. Co więcej, dodanie Hoechst, niebieskiego barwnika fluorescencyjnego dla jąder, można jeszcze bardziej poprawić dokładność żywotności komórek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje podwójne barwienie FDA-PI i potrójne barwienie FDA-PI-Hoechst, które można wykorzystać do dokładnej analizy żywotności neuronów w pierwotnych hodowlanych CGN.
Ten protokół wykorzystuje do wizualizacji i rozróżniania CGN-ów i komórek glejowych według ich różnych rozmiarów i kształtów. Po barwieniu liczba żywotnych neuronów i martwych neuronów jest liczona na podstawie reprezentatywnych obrazów wykonanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Duże komórki glejowe są wykluczone przez porównanie typowych CGN pobranych w trybie fluorescencyjnym z tymi pobranymi w trybie kontrastu fazowego. Podobną strategię można zastosować do pomiaru żywotności neuronów w mieszanych kulturach komórkowych zawierających neurony i komórki glejowe, takich jak pierwotne kultury korowe i hodowle hipokampa.

<table><tbody><tr><td>Poli-L-lizyna (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-Arabinofuranozyd</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>wysokiej jakości FBS jest niezbędny do hodowli</td></tr><tr><td>100x glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (BME)</td><td>Gibco</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny (FDA)</td><td>Sigma</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Yesen</td><td>40731ES10</td><td></td></tr><tr><td>królik Przeciwciało anty-GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab75810</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-GFAP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A602440</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>DNAzy</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Volac</td><td>Z310727</td><td>spalić końcówkę przed używać</td></tr><tr><td>12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>Z707783</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>Z707759</td><td>wysokiej jakości płytka do hodowli komórkowej jest niezbędna do hodowli</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Pipeta Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Excell Bio</td><td>CS017-0004</td><td></td></tr><tr><td>Rozkrój mikroskop</td><td>Szanghaj Caikang</td><td>XTL2400</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>TI-S</td><td></td></tr><tr><td>Filtr fluorescencyjny i kostki emmisyjne</td><td>Nikon</td><td>B-2A, G-2A, UV-2A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie fotograficzne</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Edytor graficzny softeware</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Pierwotne hodowane neurony ziarniste móżdżku (CGN) były szeroko stosowane jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych. Jednak współistnienie komórek glejowych i neuronów w hodowli CGN może prowadzić do błędów w dokładnej ocenie żywotności neuronów. Podwójne barwienie dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) zastosowano do pomiaru żywotności komórek poprzez jednoczesną ocenę komórek żywotnych i martwych. Zastosowaliśmy podwójne barwienie FDA-PI, aby poprawić czułość testów kolorymetrycznych i ocenić żywotność neuronów w CGN. Ponadto dodaliśmy niebieskie fluorescencyjne barwniki DNA (np. Hoechst), aby poprawić dokładność. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można poprawić dokładność oceny żywotności neuronów przy użyciu tych metod w hodowli CGN. Korzystając z tego protokołu, można wykluczyć liczbę komórek glejowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Podobną strategię można zastosować do odróżnienia niechcianych komórek glejowych od neuronów w różnych mieszanych kulturach komórkowych, takich jak pierwotna hodowla korowa i hodowla hipokampa.

Podwójne barwienie immunocytochemiczne na GAP43 (czerwony) i GFAP (zielony) zostało wykorzystane do analizy kształtu odpowiednio neuronów i komórek glejowych2,5. Zarówno neurony, jak i komórki glejowe są obecne w hodowli CGN. Komórki glejowe wykazujące pozytywną reakcję z GFAP są duże i mają nieregularny kształt, co wskazują strzałki na obrazach (Rycina 1). Tradycyjne testy żywotności komórek nie pozwalają odróżni...

Ten protokół opisuje, jak dokładnie mierzyć żywotność neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) w hodowanych ziarnistych neuronach móżdżku, pierwotnej hodowli neuronalnej używanej jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych.

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładny pomiar żywotności komórek w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i neurofarmakologii. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odróżnienia niepożądanych komórek glejowych od neuronów w hodowlach komórek MISTA.Procedury zaprezentują Lin Jiajia, Wang Jialing i Xu Dilin, trójka studentów studiów licencjackich z mojego laboratorium. Rozpocznij sekcję głów ośmiodniowych szczurząt, najpierw wkładając nożyczki do otworu wielkiego i przecinając obie strony czaszki od uszu do oczu. Następnie, za pomocą pęsety, unieś czaszkę.Za pomocą pęsety wyizoluj móżdżek i umieść go w szalce o średnicy 35 mm zawierającej roztwór do sekcji. Przenieś szalkę na stolik mikroskopu sekcyjnego i za pomocą dwóch pęset usuń opony mózgowe oraz naczynia krwionośne. Za pomocą skalpela posiekaj tkankę, a następnie przenieś ją do probówki do wirowania zawierającej 30 ml roztworu do sekcji.Wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy 1 500 x g. Po wirowaniu odessaj nadsącz i zachowaj osad. Następnie dodaj roztwór trypsyny do osadu i resuspenduj poprzez delikatne wstrząsanie.Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Po 15 minutach dodaj roztwór DNase One, inhibitoru trypsyny z soi oraz siarczanu magnezu i wymieszaj. Następnie wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy 1 500 ×g.Po odessaniu nadsączu, zawiesić osad w mniej rozcieńczonym roztworze DNase One, inhibitora trypsyny sojowej i siarczanu magnezu. Następnie przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml. Przenieść połowę komórek do każdej z probówek i pipetować zawiesinę w górę i w dół od 60 do 70 razy, używając pipety Pasteura z watowym korkiem, aby zhomogenizować komórki.Po homogenizacji do każdej probówki 15-mililitrowej należy dodać trzy mililitry roztworu siarczanu magnezu i chlorku wapnia. Probówki pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po upływie tego czasu nadpływ należy ostrożnie usunąć za pomocą pipety Pasteura z bawełnianym zatorem i przenieść do nowych probówek 15-mililitrowych.Wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy 1 500 x g. Dodaj pożywkę hodowlaną do osadu, aby rozcieńczyć go do gęstości komórek wynoszącej około 1,5 x 10⁶ komórek/ml. Przenieś komórki pipetą do płytki 6-dołkowej i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po 24 godzinach należy dodać roztwór zapasowy AraC do stężenia końcowego 1 mM, aby zahamować wzrost komórek glejowych, a następnie ponownie umieścić płytki w inkubatorze. Następnie, w siódmym dniu, należy dodać 50 µL roztworu zapasowego D-glukozy do stężenia końcowego 1 mM. Barwienie należy rozpocząć od zmieszania fluoresceiny diacetanu do stężenia końcowego 10 µg/mL oraz jodku propidyny do stężenia końcowego 50 µg/mL z 10 mL PBS.Wymieszać roztwór FDA/PI za pomocą vortexa i umieścić na lodzie. Płytkę hodowlaną również umieścić na lodzie. Ostrożnie odessać medium hodowlane, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła komórek, a następnie powoli dodać zimny PBS.Odssać PBS, a następnie dodać zimny roztwór roboczy FDA/PI lub FDA/PI/Hoechst. Umieścić płytkę w lodzie na pięć minut. Następnie, po odsasaniu roztworu roboczego FDA/PI lub FDA/PI/Hoechst, dodać zimny PBS do każdej studzienki.Upewnij się, że mikroskop fluorescencyjny został prawidłowo skonfigurowany. Wykryj emisje fluorescencyjne dla FDA, PI oraz Hoechst odpowiednio przy 520, 620 i 460 nanometrach, stosując czas ekspozycji od 100 do 300 milisekund oraz wzmocnienie analogowe 2.8 x. Po zgromadzeniu obrazów fluorescencyjnych wykonaj zdjęcie w świetle widzialnym, korzystając z trybu kontrastu fazowego.W przypadku podwójnego barwienia FDA/PI, nałóż obrazy komórek na siebie, przeciągając warstwę dodatnią dla FDA na warstwę dodatnią dla PI w programie do edycji grafiki. Dostosuj krycie warstwy dodatniej dla FDA, wpisując 50% w polu Opacity (Krycie) panelu Warstwy. Połącz obie warstwy, otwierając menu Warstwa i klikając przycisk Połącz widoczne.Ustaw kontrast obrazów nałożonych, wpisując 50 w polu Contrast w sekcji Image, Adjustments, Brightness/Contrast. Sprawdź, czy na nałożonych obrazach nie występują komórki podwójnie dodatnie dla FDA i PI. W przypadku potrójnego barwienia FDA/PI/Hoechst nałóż obrazy komórek, ponownie przeciągając warstwę dodatnią dla FDA na warstwę dodatnią dla PI, dostosuj przezroczystość warstwy dodatniej dla FDA i połącz obrazy w ten sam sposób co wcześniej.Następnie przeciągnij warstwę z dodatnim sygnałem Hoechst na warstwę scaloną. Dostosuj przezroczystość warstwy z dodatnim sygnałem Hoechst, wpisując 50% w polu Opacity panelu Layers, a następnie scal obie warstwy, otwierając menu Layer i klikając przycisk Merge Visible. Wyróżnij wizualnie duże, nieregularne komórki glejowe od neuronów ziarnistych móżdżku, porównując obrazy uzyskane w trybie fluorescencyjnym z obrazami uzyskanymi w trybie kontrastu fazowego.Poniższe obrazy pokazują, że w hodowli CGN obecne są zarówno małe neurony, jak i duże, nieregularne komórki glejowe. Ten obraz przedstawia barwienie aminokwasowe GAP-43 w hodowli CGN w ósmym dniu in vitro. Niebieskie strzałki wskazują neurony.Tutaj przedstawiono barwienie aminokwasowe GFAP komórek glejowych. Biała strzałka wskazuje komórkę glejową. Ten obraz w kontraście fazowym pokazuje morfologię komórek.Barwienie z użyciem FDA/PI, które pozwala odróżnić komórki glejowe od neuronów, jest korzystne dla dokładnej oceny żywotności neuronów w hodowli CGN. Jest to obraz złączony komórek poddanych potrójnemu barwieniu, hodowanych w standardowej pożywce wzrostowej. Strzałka wskazuje typową komórkę glejową.W tym przypadku podobna hodowla została poddana działaniu pożywki o niskiej zawartości potasu, a strzałka ponownie wskazuje typową komórkę glejową. Należy również zwrócić uwagę na obecność czerwonego barwienia jodkiem propidyny. Po opanowaniu techniki, jej prawidłowe wykonanie zajmuje dwie godziny.Podobną strategię można zastosować do innych mieszanych kultur komórkowych, takich jak pierwotne kultury kory oraz pierwotne kultury hipokampa, aby precyzyjnie przeanalizować żywotność neuronów.

assessment-neuronal-viability-using-fluorescein-diacetate-propidium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Ten film demonstruje technikę oceny śmierci neuronów w wycinkach organotypowych kory nosowej i hipokampa. Śmierć neuronów następuje w wyniku ewoluujących napadów padaczkowych – przypominających padaczkę in vivo – i jest wykrywana poprzez podwójne barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny i immunofluorescencji.

Test śmierci neuronalnej w celu oceny śmierci komórki w modelu padaczki ex vivo

Ten film demonstruje generowanie modelu uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z indukcją uszkodzenia neuronów za pomocą NMDA, agonisty receptora neuroprzekaźnika pobudzającego i glicyny, koagonisty. NMDA i glicyna wiążą się ze specyficznymi receptorami neuronalnymi, powodując ich nadmierną stymulację i powodując masowy wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, co prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek neuronalnych.

Modelowanie uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ten film demonstruje metodę identyfikacji neuronów z mieszanej kultury ziarnistych neuronów móżdżku i komórek glejowych za pomocą podwójnego barwienia dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI), gdzie żywe neurony wydają się zielone, a martwe neurony czerwone.

Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Źródło: Bénard, M.,  i wsp. Ex vivo Obrazowanie migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje konfokalną metodę makroskopową do śledzenia ex vivo migracji komórek ziarnistych w wycinkach móżdżku z postnatalnych mózgów szczurów.

Obrazowanie ex vivo migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej

Podczas rozwoju móżdżku po urodzeniu, niedojrzałe komórki ziarniste pochodzące ze strefy zarodkowej wykazują różne sposoby migracji, aby dotrzeć do miejsca docelowego i ustanowić sieci neuronowe. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków móżdżku i konfokalne podejście makroskopowe stosowane do badania czynników regulujących migrację neuronów.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Mikroglej może wpływać na neurony i inne komórki glejowe w hodowli za pomocą różnych autonomicznych mechanizmów niekomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnych kultur neuronalnych. Metoda ta może potencjalnie wyjaśnić rolę interakcji mikrogleju i neuronów, co ma implikacje dla schorzeń neurodegeneracyjnych, w których zapalenie nerwów jest cechą charakterystyczną.

Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę oceny żywotności neuronów ziarnistych móżdżku szczura przy użyciu podwójnego barwienia FDA i PI. Technika ta pozwala odróżnić neurony od komórek glejowych w hodowlach MISTA.

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku (Wideo) | JoVE Journal

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Przeglądaj więcej filmów