Tworzenie i stosowanie odniesienia w celu ułatwienia dyskusji i klasyfikacji białek w zróżnicowanej grupie
16 sierpnia 2017
Celem tego protokołu jest opracowanie odniesienia dla rozbieżnych białek w grupie, która nie ma spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Odniesienie to ułatwi analizy i dyskusję na temat grupy jako całości i może być używane jako uzupełnienie ustalonych nazw.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie standardowego oprogramowania arkuszy kalkulacyjnych do opracowania punktu odniesienia dla białek rozbieżnych w grupie, której brakuje spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu relacji między spokrewnionymi białkami o mylącej lub niespójnej nomenklaturze, takimi jak superrodzina peptydów obronnych z motywem alfa-beta stabilizowanym cysteiną, obejmująca mechanizmy obronne bezkręgowców. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej wizualnej reprezentacji analizowanych białek.
W pierwszej kolejności należy zidentyfikować cechy charakterystyczne dla analizowanej grupy białek. Na przykład motyw CS alpha-beta w strukturze roztworowej białka obronnego i pomocniczego owada Phormia terraenovae definiuje superrodzinę CS alpha-beta. Motyw ten obejmuje również mniejszy element strukturalny zwany helisą stabilizowaną cysteiną, który jest rozpoznawany po sekwencji CXXXC położonej powyżej sekwencji CXC.
Cztery cysteiny tworzą dwie mostki dwusiarczkowe. Aby dopełnić motyw alfa-beta CS, trzeci mostek dwusiarczkowy jest tworzony przez dodatkową parę cystein. Ostatecznie kluczowe jest poznanie przynajmniej niektórych istotnych cech związanych ze strukturą lub funkcją białka.
Bez tego nie ma podstaw do wygenerowania referencji. Teraz wprowadź te cechy charakterystyczne do arkusza kalkulacyjnego. Wykorzystaj kolumny dla cech konserwatywnych oraz do reprezentowania przestrzeni między tymi cechami.
Zachowaj wystarczającą szerokość kolumn, aby pomieściły liczby, i przypisz im jednolity rozmiar. W wierszach opisz sekwencje. Aby oznaczyć sekwencję jako cechę, wypełnij pole cechy kolorem, korzystając z funkcji wypełniania.
Następnie, aby wskazać odstęp między cechami, wprowadź liczbę aminokwasów w polu pomiędzy. Teraz dodaj sekwencje reprezentatywne, które zostały wcześniej określone jako członkowie grupy na podstawie baz danych strukturalnych i opublikowanych wyników. W razie potrzeby dodaj cechy, które mogą definiować podgrupę sekwencji, takie jak dodatkowa cysteina.
Jeśli w danej sekwencji brakuje cech, pozostaw pole puste i połącz je z polami reprezentującymi pomiędzystąpujące aminokwasy. W tym celu użyj funkcji „Scal i wyśrodkuj”. Po wprowadzeniu sekwencji reprezentatywnych zidentyfikuj grupy wyraźnie powiązanych ze sobą sekwencji.
Następnie podsumuj charakterystykę tych grup. W przypadku zróżnicowanej liczby aminokwasów pomiędzy cechami, użyj łącznika do wskazania zakresu lub ukośników do wskazania kilku konkretnych wartości. W razie potrzeby w sposób przejrzysty opisz cechy, które mogą być istotne lub nie są wystarczająco powszechne, aby uwzględnić je w odniesieniu.
Na przykład, ponieważ cysteiny są istotne w tej superrodzinie, można oznaczyć obecność dodatkowych cystein. Czasami, podczas dodawania nowo zidentyfikowanych sekwencji do arkusza kalkulacyjnego, sekwencje jednego gatunku mogą trafić do kilku różnych grup superrodziny, jak ma to miejsce w przypadku niesiorpów. Po zakończeniu procesu wiersze arkusza można posortować, aby wyróżnić zmienność w obrębie gatunku lub zmienność pomiędzy grupami taksonomicznymi.
W tej demonstracji wykorzystano bezpłatnie dostępne oprogramowanie MEGA 6. Można jednak w podobny sposób korzystać z innego oprogramowania. Aby rozpocząć nowe dopasowanie, należy wybrać opcję Edit/Build Alignment w zakładce Align.
Następnie w wyświetlonym oknie wybierz Create a new alignment i kliknij OK. Następnie wybierz Protein. Teraz w menu Edit wybierz Insert Sequence from File, aby zaimportować sekwencje. Sekwencje muszą być w formacie FASTA.
Kolory tła odzwierciedlające różne typy aminokwasów są wyświetlane domyślnie i można je wyłączyć za pomocą przełącznika w menu Wyświetlanie. Po wprowadzeniu wszystkich sekwencji należy kliknąć ikonę zginającego się ramienia, a następnie Align Protein, aby dopasować sekwencje przy użyciu algorytmu muscle. Jeśli pojawi się komunikat: Nothing selected for alignment.
Pojawi się komunikat „Select all?”, wybierz OK. Niektóre parametry można zmienić w oknie pop-up, ale na potrzeby tej demonstracji wystarczą wartości domyślne. Teraz sprawdź dopasowanie w oparciu o istotne cechy superrodziny białek.
Górny pasek zawiera gwiazdkę w każdej pozycji, w której aminokwas jest całkowicie konserwowany. Początkowe dopasowanie identyfikuje trzy z czterech konserwowanych cystein. Jedna sekwencja jest wyraźnie błędnie dopasowana.
Aby poprawić błędnie dopasowaną sekwencję, zaznacz kreski i naciśnij klawisz Delete, uważając, aby przypadkowo nie usunąć aminokwasów. Następnie przesuń aminokwasy do właściwego dopasowania, dodając spacje. Po ręcznym dopasowaniu sekwencji zwróć uwagę, że ostatnia cysteina motywu CXXXC jest zachowana w całym dopasowaniu.
Często konieczna jest ręczna korekta, aby nadać priorytet najważniejszym cechom sekwencji. Dopasowanie w arkuszu kalkulacyjnym wcześniej ustalonej superrodziny CS alfa-beta ujawniło pięć podstawowych wzorców tworzenia wiązań. Nowo zidentyfikowane sekwencje niesiorstek wpisały się w pełne spektrum tych wzorców.
Następnie przeprowadzono analizy filogenetyczne, aby zbadać, w jaki sposób mogła ewoluować ta grupa białek. Sekwencje są jednak zazwyczaj krótkie i wykazują dużą rozbieżność. W konsekwencji uzyskane drzewa były słabo rozdzielone i nie dostarczyły wielu istotnych informacji.
Wielokrotne dopasowanie sekwencji zostało zoptymalizowane z wykorzystaniem sekwencji referencyjnej, jednak w analizie maksymalnej wiarygodności oraz w bayesowskiej analizie filogenetycznej nadal występowała słaba rozdzielczość. Większość kladów wykazywała jedynie niski poziom wsparcia. Niemniej jednak pięć małych grup otrzymało wsparcie w co najmniej jednym z dwóch drzew.
Sekwencje o różnej liczbie cystein w obrębie jednej grupy taksonomicznej mogą być bardziej spokrewnione niż sekwencje o takim samym wzorcu z różnych grup. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego do stworzenia prostej wizualizacji istotnych cech białek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że określanie najbardziej relewantnych cech dla danej grupy białek jest często procesem iteracyjnym i prawdopodobnie konieczna będzie rewizja materiałów referencyjnych.
Do arkusza kalkulacyjnego można w każdej chwili dodawać nowe sekwencje; łatwo jest również tworzyć wiele wersji arkusza, co pozwala na wprowadzanie nowych cech, które mogą być przydatne w klasyfikacji i analizie. Choć dopasowanie w arkuszu kalkulacyjnym umożliwia łatwą wizualizację cech strukturalnych i funkcjonalnych, można zastosować inne metody, takie jak analiza filogenetyczna, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat relacji ewolucyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Celem niniejszego protokołu jest stworzenie referencji dla białek zróżnicowanych w obrębie grupy, której obecnie brakuje spójnej nomenklatury i kryteriów klasyfikacji. Dzięki wyjaśnieniu relacji między powiązanymi białkami, referencja ta usprawni dyskusje i analizy dotyczące tej grupy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Klasyfikacja białek
- Nomenklatura biologiczna
- Peptydy obronne
Wstęp
- Superrodzina alfa-beta stabilizowana cysteiną obejmuje różne peptydy obronne.
- Niespójna nomenklatura komplikuje badanie spokrewnionych białek.
- Do reprezentacji wizualnej można wykorzystać standardowe oprogramowanie arkuszowe.
- Cechy definiujące pomagają w identyfikacji grup białek.
Cel badania
- Opracowanie spójnego punktu odniesienia dla białek dywergentnych.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia i komunikacji w zakresie relacji między białkami.
- Pomoc w klasyfikacji białek o niejednoznacznej nomenklaturze.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie standardowego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych w celu organizacji danych.
- Identyfikacja cech definiujących grupy białek.
- Wizualna reprezentacja białek w celu wyjaśnienia zależności między nimi.
- Koncentracja na motywie strukturalnym alfa-beta stabilizowanym przez cysteinę oraz powiązanych z nim motywach.
Główne wyniki
- Ustalono jasny punkt odniesienia dla białek rozbieżnych.
- Powiązania między białkami przedstawiono wizualnie.
- Problem mylącej nomenklatury rozwiązano poprzez systematyczną klasyfikację.
- Zdobyto nową wiedzę na temat superrodziny białek alfa-beta stabilizowanych cysteiną.
Wnioski
- Protokół stanowi cenne narzędzie do klasyfikacji białek.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie relacji między białkami w obrębie grupy.
- Metodę tę można zastosować do innych rodzin białek pozbawionych spójnej nomenklatury.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wyzwania związane z klasyfikacją białek mogą utrudniać walidację celów oraz analizy porównawcze w programach odkrywania leków, szczególnie gdy nomenklatura i różnorodność sekwencji zacierają zależności funkcjonalne. Ustanowienie ramy odniesienia, która priorytetyzuje cechy strukturalne i związane z aktywnością, umożliwia bardziej niezawodne przypisanie nowych sekwencji i wspiera interdyscyplinarne dyskusje w ramach R&D. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną oraz ułatwia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio w przypadku rodzin białek o wysokiej dywergencji sekwencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wyjaśnia zależności funkcjonalne między zróżnicowanymi białkami w celu rzetelnej walidacji celu terapeutycznego.
- Umożliwia systematyczną analizę zależności między sekwencją a aktywnością w obrębie superrodzin białek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wskazanie konserwowanych motywów strukturalnych istotnych dla mechanizmu działania.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez zapewnienie spójnych ram dla integracji nowych sekwencji.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane zestawy referencyjne dla późniejszego opracowywania testów i procesów przesiewowych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację poprzez zakotwiczenie testów w konserwatywnych cechach sekwencji.
- Umożliwia skalowalną ewaluację nowych sekwencji w odniesieniu do ustalonych punktów odniesienia strukturalnych.
- Wspiera wiarygodną ocenę związków poprzez wyjaśnienie kontekstu relacji sekwencja-funkcja.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie klasyfikacji sekwencji do istotnych dla choroby cech strukturalnych, jeśli jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki spójnej adnotacji.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach translacyjnych obejmujących różnorodne rodziny białek.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez wyjaśnienie relacji ewolucyjnych i funkcjonalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda oparta na referencji integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej identyfikacji celu po optymalizację wiodącego związku, szczególnie w przypadku rodzin białek o złożonej różnorodności sekwencji.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie konserwatywnych cech w zróżnicowanych sekwencjach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki standaryzacji adnotacji i dopasowania sekwencji.
- Analityka: Dostarcza danych ilościowych do porównywania cech sekwencji i wspierania analiz statystycznych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i ciągłość badań przedklinicznych w przypadkach, gdy motywy strukturalne mają znaczenie dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku strukturę klasyfikacji, którą można dostosować do nowych grup białek i rozwijających się zbiorów danych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w klasyfikacji białek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje adnotację sekwencji, poprawiając odtwarzalność i skalowalność w ramach zespołów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie relacji między sekwencją a funkcją.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywania białek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie struktury białek, analizy sekwencji oraz adnotacji w arkuszach kalkulacyjnych.
- Wymagany jest dostęp do baz danych sekwencji, narzędzi do wyrównywania sekwencji oraz oprogramowania do wizualizacji.
- Niezbędne jest uzgodnienie w ramach zespołów priorytetów cech oraz standardów adnotacji.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych rodzin białek lub grup taksonomicznych.
- Ręczna kuratela i iteracyjna rewizja są niezbędne dla zachowania dokładności i aktualności danych referencyjnych.
