Tworzenie i stosowanie odniesienia w celu ułatwienia dyskusji i klasyfikacji białek w zróżnicowanej grupie
16 sierpnia 2017
Celem tego protokołu jest opracowanie odniesienia dla rozbieżnych białek w grupie, która nie ma spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Odniesienie to ułatwi analizy i dyskusję na temat grupy jako całości i może być używane jako uzupełnienie ustalonych nazw.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie standardowego oprogramowania arkusza kalkulacyjnego do opracowania odniesienia dla rozbieżnych białek w grupie, która nie ma spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Ta metoda może pomóc w wyjaśnieniu relacji między powiązanymi białkami, które mają mylącą lub niespójną nomenklaturę, taką jak stabilizowana cysteiną nadrodzina peptydów obronnych alfa-beta, która obejmuje obronę bezkręgowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prostą wizualną reprezentację interesujących białek.
Na początek zidentyfikuj cechy definiujące grupę białek, która jest przedmiotem zainteresowania. Na przykład fałd CS alfa-beta w strukturze roztworu obrony przed owadami i pomocy z phormia terraenovae definiuje nadrodzinę CS alfa-beta. Fałd ten zawiera również mniejszy motyw zwany helisą stabilizowaną cysteiną, który jest identyfikowany przez CXXXC przed CXC.
Cztery cysteiny tworzą dwa wiązania dwusiarczkowe. Aby uzupełnić motyw CS alfa-beta, dodatkowe wiązanie dwusiarczkowe jest tworzone przez dodatkową parę cystein. Ostatecznie bardzo ważne jest, aby znać przynajmniej kilka ważnych cech związanych ze strukturą lub funkcją białka.
Bez tego nie ma podstaw do generowania referencji. Teraz wprowadź te definiujące cechy do arkusza kalkulacyjnego. Kolumny służą do reprezentowania zachowanych obiektów oraz do reprezentowania odstępów między tymi obiektami.
Kolumny powinny być wystarczająco szerokie, aby zmieściły się liczby, i nadaj im stałą szerokość. W wierszach opisz sekwencje. Aby wskazać sekwencję jako obiekt, wypełnij pole funkcji kolorem, używając funkcji wypełnienia.
Następnie, aby wskazać odstępy między obiektami, wprowadź liczbę aminokwasów w polu pomiędzy. Teraz dodaj reprezentatywne sekwencje, które zostały wcześniej ustalone jako członkowie grupy na podstawie strukturalnych baz danych i opublikowanych wyników. W razie potrzeby dodaj cechy, które mogą zdefiniować podgrupę sekwencji, takie jak dodatkowa cysteina.
Jeśli w danej sekwencji brakuje cech, pozostaw pole niewypełnione i połącz je z polami reprezentującymi aminokwasy pośrednie. Aby to zrobić, skorzystamy z funkcji Scal i Wyśrodkuj. Po wprowadzeniu reprezentatywnych sekwencji należy zidentyfikować grupy wyraźnie powiązanych sekwencji.
Następnie podsumuj charakterystykę tych grup. Gdy liczba aminokwasów między cechami jest różna, użyj łącznika, aby wskazać zakres lub ukośników, aby wskazać kilka określonych liczb. W razie potrzeby twórczo dodawaj adnotacje do funkcji, które mogą być istotne lub nie są na tyle powszechne, aby uwzględnić je w odwołaniu.
Na przykład, ponieważ cysteiny są ważne w nadrodzinie, obecność dodatkowych cystein można oznaczyć. Czasami, podczas dodawania nowo zidentyfikowanych sekwencji do arkusza kalkulacyjnego, sekwencje jednego gatunku należą do kilku różnych grup nadrodziny, na przykład w przypadku niesporczaków. Po zakończeniu wiersze arkusza kalkulacyjnego można następnie posortować, aby podkreślić różnice w obrębie gatunku lub różnice między grupami taksonomicznymi.
W tej demonstracji wykorzystano ogólnodostępne oprogramowanie MEGA 6. Jednak inne oprogramowanie może być używane w podobny sposób. Aby rozpocząć nową linię trasowania, wybierz opcję Edytuj/zbuduj wyrównanie na karcie Wyrównanie.
Następnie wybierz opcję Utwórz nową linię trasowania w wyświetlonym polu i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Białko. Teraz wybierz opcję Wstaw sekwencję z pliku w menu Edycja, aby zaimportować sekwencje. Sekwencje muszą być w formacie FASTA.
Kolory tła odzwierciedlające różne typy aminokwasów są wyświetlane domyślnie i można je wyłączyć za pomocą przełącznika w menu Wyświetlacz. Po wprowadzeniu wszystkich sekwencji kliknij ikonę zginanego ramienia, a następnie Wyrównaj białko, aby wyrównać sekwencje za pomocą algorytmu mięśniowego. Jeśli pojawi się komunikat, Nic nie wybrano do wyrównania.
Zaznacz wszystko? wyskakuje i wybierz przycisk OK. Niektóre parametry można zmienić w wyskakującym okienku, ale w przypadku tej demonstracji wystarczą wartości domyślne. Teraz sprawdź wyrównanie w oparciu o ważne cechy nadrodziny białek.
Górny pasek pokazuje gwiazdkę w dowolnej pozycji, w której aminokwas jest całkowicie zachowany. Początkowe wyrównanie identyfikuje trzy z czterech konserwatywnych cystein. Jedna sekwencja jest wyraźnie niedopasowana.
Aby naprawić niewyrównaną sekwencję, zaznacz kreski i naciśnij Delete bez przypadkowego usuwania aminokwasów. Następnie przesuń aminokwasy do ich prawidłowego ułożenia, dodając spacje. Po ręcznym wyrównaniu sekwencji należy zauważyć, że ostatnia cysteina motywu CXXXC jest zachowana w całym wyrównaniu.
Ręczna regulacja jest często konieczna, aby nadać priorytet najważniejszym cechom sekwencji. Wyrównanie arkusza kalkulacyjnego wcześniej ustalonej nadrodziny CS alfa-beta ujawniło pięć podstawowych wzorców tworzenia wiązań. Nowo zidentyfikowane sekwencje niesporczaków mieściły się w pełnym spektrum tych wzorców.
Następnie wykorzystano analizy filogenetyczne w celu zbadania, w jaki sposób ta grupa białek mogła ewoluować. Sekwencje są jednak na ogół krótkie i bardzo rozbieżne. W związku z tym powstałe drzewa były słabo rozwiązane i oferowały niewielki wgląd.
Wyrównanie wielu sekwencji zostało zoptymalizowane przy użyciu odniesienia, ale nadal występowała słaba rozdzielczość w analizie maksymalnego prawdopodobieństwa i w bayesowskiej analizie filogenetycznej. Większość kladów miała tylko niski poziom wsparcia. Jednak pięć małych grup było wspieranych w co najmniej jednym z dwóch drzew.
Sekwencje o różnej liczbie cysteiny w grupie taksonomicznej mogą być bliżej spokrewnione niż sekwencje o tym samym wzorcu z różnych grup. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych do generowania prostej wizualizacji ważnych cech białka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że określenie najistotniejszych cech dla grupy białek jest często procesem iteracyjnym i prawdopodobnie konieczna będzie rewizja odniesienia.
Do arkusza kalkulacyjnego zawsze można dodawać nowe sekwencje, a także łatwo jest mieć wiele wersji pozwalających na dodawanie nowych funkcji, które mogą być przydatne do klasyfikacji i analizy. Chociaż wyrównanie arkusza kalkulacyjnego umożliwia łatwą wizualizację cech strukturalnych i funkcjonalnych, inne metody, takie jak analiza filogenetyczna, mogą być wykonane w celu uzyskania dodatkowego wglądu w relacje ewolucyjne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Celem tego protokołu jest stworzenie referencji dla różnych białek w grupie, która obecnie brakuje spójnej nomenklatury i kryteriów klasyfikacji. Wyjaśniając relacje między powiązanymi białkami, referencja ta poprawi dyskusje i analizy grupy.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Klasyfikacja białek
- Nomenklatura biologiczna
- Peptydy obronne
Tło
- Superrodzina alfa-beta stabilizowana cysteiną obejmuje różne peptydy obronne.
- Niespójna nomenklatura komplikuje badania powiązanych białek.
- Standardowe oprogramowanie arkuszy kalkulacyjnych można wykorzystać do wizualnego przedstawienia.
- Definujące cechy pomagają w identyfikacji grup białek.
Cel badania
- Opracowanie spójnej referencji dla różnych białek.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia i komunikacji dotyczącej relacji między białkami.
- Pomoc w klasyfikacji białek o mylnej nomenklaturze.
Stosowane metody
- Wykorzystanie standardowego oprogramowania arkuszy kalkulacyjnych do organizacji danych.
- Identyfikacja cech definiujących grup białek.
- Wizualne przedstawienie białek w celu wyjaśnienia relacji.
- Skupienie się na składce alfa-beta stabilizowanej cysteiną i powiązanych motywach.
Główne wyniki
- Ustalono jasną referencję dla różnych białek.
- Relacje między białkami zostały wizualnie przedstawione.
- Mylna nomenklatura została rozwiązana poprzez systematyczną klasyfikację.
- Zdobyto wgląd w superrodzinę alfa-beta stabilizowaną cysteiną.
Wnioski
- Protokół zapewnia cennym narzędziem do klasyfikacji białek.
- Poprawia zrozumienie relacji między białkami w grupie.
- Ta metoda może być zastosowana do innych rodzin białek brakujących spójnej nomenklatury.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Protein classification challenges can impede target validation and comparative analyses across discovery programs, especially when nomenclature and sequence diversity obscure functional relationships. Establishing a reference framework that prioritizes structural and activity-related features enables more reliable placement of new sequences and supports cross-functional R&D discussions. This approach enhances predictive confidence and portfolio decision-making for protein families with high sequence divergence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Clarifies functional relationships among divergent proteins for robust target validation.
- Enables systematic interrogation of sequence-activity relationships within protein superfamilies.
- Supports biological de-risking by highlighting conserved structural motifs relevant to mechanism.
- Facilitates portfolio triage by providing a coherent framework for new sequence integration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated reference sets for downstream assay development and screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization by anchoring assays to conserved sequence features.
- Enables scalable evaluation of novel sequences against established structural benchmarks.
- Supports reliable compound evaluation by clarifying sequence-function context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sequence classification with disease-relevant structural features when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent annotation.
- Reduces mechanistic ambiguity in translational studies involving diverse protein families.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying evolutionary and functional relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This reference-based method integrates into the discovery continuum from early target identification through lead optimization, especially for protein families with complex sequence diversity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping conserved features across divergent sequences.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility by standardizing sequence annotation and alignment.
- Analytics: Delivers quantitative outputs for comparing sequence features and supporting statistical analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when structural motifs are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable classification framework adaptable to new protein groups and evolving datasets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein classification.
- Operational Value: Standardizes sequence annotation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying sequence-function relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein structure, sequence analysis, and spreadsheet-based annotation.
- Needs access to sequence databases, alignment tools, and visualization software.
- Demands cross-team agreement on feature prioritization and annotation standards.
- May require adaptation for different protein families or taxonomic groups.
- Manual curation and iterative revision are necessary to maintain reference accuracy and relevance.
