Name: Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę budowy białek chimerycznych poprzez wymianę regionów między podobnymi strukturalnie białkami. Technika ta pozwala identyfikować kluczowe obszary odpowiedzialne za różnorodne funkcje biologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Towarzystwo Maxa Plancka i Klinikę Schüchtermanna (Bad Rothenfelde, Niemcy). Część tych badań została pierwotnie opublikowana w czasopiśmie Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Pętla AB i D-helisa w miejscu wiązania III ludzkiej onkostatyny M (OSM) są wymagane do aktywacji receptora OSM. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © Autorzy.

<ol><li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li>
<li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+%28IL%29+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li>
<li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+recognition+by+gp130+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li>
<li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li>
<li>Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787(2017).</li>
<li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+%28OSM%29+are+required+for+OSM+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+wild+type%2C+truncated%2C+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li>
<li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li>
<li>Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure%2Ffunction+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li>
<li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li>
<li>Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li>
<li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li>
<li>Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li>
<li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surprising+similarities+in+structure+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li>
<li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMDB+and+VAST%2B%3A+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).</li>
<li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980(2003).</li>
<li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).</li>
<li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI%27s+LocusLink+and+RefSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li>
<li>Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/">http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</a> (2018).</li>
<li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539(2011).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS%3A+Minipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate%3A+Maxipreps%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351(2018).</li>
<li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li>
<li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li>
<li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li>
<li>Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cytokine%3AIg-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+in+complex+with+the+LIF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li>
<li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li>
<li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82(2015).</li>
<li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li>
<li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li>
<li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li>
<li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wytwarzanie białek chimerycznych stanowi wszechstronną technikę, która jest w stanie wyjść poza granice białek skróconych, aby odpowiedzieć na takie pytania, jak modułowość domen wiążących cytokiny z receptorem13. Projektowanie chimer jest kluczowym krokiem w tego rodzaju badaniach i wymaga starannego rozważenia. Wstępne badania mające na celu ustalenie domen funkcjonalnych będą na ogół wymagały zastąpienia szerokich regionów w pierwszej fazie, podczas gdy mniejsze zamienniki o zmiennej długości s...

Kilka rodzajów białek, w tym cytokiny i czynniki wzrostu, są zgrupowane w rodziny, których członkowie mają podobne trójwymiarowe struktury, ale często pełnią różne funkcje biologiczne1,2. Ta funkcjonalna różnorodność jest zwykle konsekwencją niewielkich różnic w składzie aminokwasów w obrębie miejsc aktywnych cząsteczki3. Identyfikacja takich miejsc i funkcjonalnych determinantów nie tylko dostarcza cennych informacji ewolucyjnych, ale także pozwala na zaprojektowanie bardziej szczegółowych agonistów i inhibitorów4. Jednak duża liczba różnic w składzie reszt często występujących między strukturalnie spokrewnionymi białkami komplikuje to zadanie. Mimo że konstruowanie dużych bibliotek zawierających setki mutantów jest obecnie wykonalne, ocena każdej pojedynczej odmiany pozostałości i ich kombinacji nadal pozostaje wyzwaniem i czasochłonnym wysiłkiem5.
Techniki oceniające funkcjonalne znaczenie dużych regionów białkowych są zatem wartościowe, aby zredukować liczbę możliwych reszt do możliwej do opanowania liczby6. Ścięte białka są najczęściej stosowanym podejściem do rozwiązania tego problemu. W związku z tym regiony uważa się za funkcjonalnie istotne, jeśli delecja określonego regionu ma wpływ na badaną funkcję białka7,8,9. Jednak głównym ograniczeniem tej metody jest to, że delecje mogą wpływać na drugorzędową strukturę białka, prowadząc do nieprawidłowego fałdowania, agregacji i niemożności zbadania zamierzonego regionu. Dobrym przykładem jest okrojona wersja onkostatyny cytokin M (OSM), w której wewnętrzna delecja większa niż 7 reszt skutkowała nieprawidłowo sfałdowanym mutantem, którego nie można było dalej badać10.
Generowanie białek chimerycznych stanowi alternatywne i innowacyjne podejście, które pozwala na analizę większych regionów białkowych. Celem tej metody jest zamiana obszarów zainteresowania w białku przez strukturalnie powiązane sekwencje w innym białku, w celu oceny wkładu zastąpionych odcinków w określone funkcje biologiczne. Szeroko stosowane w dziedzinie receptorów sygnałowych do identyfikacji domen funkcjonalnych11,12, białka chimeryczne są szczególnie przydatne do badania rodzin białek o małej tożsamości aminokwasowej, ale zachowanej strukturze drugorzędowej. Odpowiednie przykłady można znaleźć w klasie cytokin typu interleukina-6 (IL-6), takich jak interleukina-6 i rzęskowy czynnik neurotroficzny (6% identyczność sekwencji)13 lub czynnik hamujący białaczkę (LIF) i OSM (20% tożsamości)6, na których opiera się poniższy protokół.

<table><tbody><tr><td>Termocykler Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td>Do realizacji tego protokołu można użyć dowolnej konwencjonalnej maszyny do PCR</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Drabinka DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny AscI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polimeraza DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dNTP (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel i zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), zapas glicerolu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MHS6278-202857165</td><td></td></tr><tr><td>LE agaroza</td><td>Biozym</td><td></td><td></td>840004</tr><tr><td>Elementarze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>Ludzka onkostatyna M cDNA</td><td></td><td></td><td>Prezent dr Heike Hermanns (Oddział Hepatologii, Szpital Uniwersytecki W&uuml; rzburg, Niemcy)&nbsp;</td></tr><tr><td>Wektor pCAGGS z miejscami</td><td></td><td></td> ograniczeń PacI i AscI <td>Dar Dr. Andr&eacute; Schneider (Instytut Badań nad Sercem i Płucami im. Maxa Plancka, Bad Nauheim, Niemcy)</td></tr></tbody></table>

identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Celem tego protokołu jest projektowanie białek chimerycznych, w których odrębne regiony białka są zastępowane odpowiadającymi im sekwencjami w strukturalnie podobnym białku, w celu określenia funkcjonalnego znaczenia tych regionów. Takie chimery są generowane za pomocą zagnieżdżonego protokołu PCR przy użyciu nakładających się na siebie fragmentów DNA i odpowiednio zaprojektowanych starterów, a następnie ich ekspresji w systemie ssaków, aby zapewnić natywną strukturę drugorzędową i modyfikacje potranslacyjne. 
Funkcjonalna rola odrębnego regionu jest następnie sygnalizowana przez utratę aktywności chimery w odpowiednim teście odczytu. W związku z tym identyfikowane są regiony zawierające zestaw krytycznych aminokwasów, które można dalej badać za pomocą technik uzupełniających (np. mutagenezy ukierunkowanej na miejsce) w celu zwiększenia rozdzielczości molekularnej. Chociaż jest to ograniczone do przypadków, w których można znaleźć strukturalnie powiązane białko o różnych funkcjach, białka chimeryczne zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji krytycznych regionów wiązania w białkach, takich jak cytokiny i receptory cytokin. Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadkach, w których regiony funkcjonalne białka nie są dobrze zdefiniowane, i stanowi cenny pierwszy krok w podejściu do ukierunkowanej ewolucji w celu zawężenia obszarów zainteresowania i zmniejszenia wysiłku związanego z badaniami przesiewowymi.

Konstrukcja i generowanie białka chimerycznego (Rycina 1) zostaną przedstawione na przykładzie dwóch członków rodziny cytokin interleukiny 6, OSM i LIF, które były przedmiotem niedawno opublikowanej pracy6. Rycina 2 przedstawia trójwymiarową strukturę tych białek. Obie cząsteczki przyjmują charakterystyczną strukturę drugorzędową cytokin klasy I, z czterema helisami (oznaczonymi od A do D) upakowanymi w pę...

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Zamiana regionów strukturalnie podobnych białek w celu stworzenia kimer pozwala nam zbadać znaczenie regionów odpowiedzialnych za funkcje biologiczne badanej cząsteczki. Wymiana regionów poprzedza ogólną drugorzędową strukturę białka, dzięki czemu region ważny dla jego ogólnej struktury może być odróżniony od tych bezpośrednio pośredniczących w funkcjach biologicznych. Może zamieniać się w wybieranie dokładnych regionów do zastąpienia.Rozpoczęcie od większych wymian jest zwykle pomocne w zidentyfikowaniu kluczowej funkcjonalności białka. Aby rozpocząć procedurę, wybierz odpowiednie białko jako dawcę, aby wymienić regiony z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie należy uzyskać sekwencje aminokwasów białkowych białek biorcy i dawcy z bazy danych sekwencji referencyjnych, uzyskując najpierw dostęp do sekcji genów na stronie internetowej ref seq.Wpisz nazwę interesującego Cię białka w polu wyszukiwania i kliknij przycisk wyszukiwania. Kliknij nazwę genu dla żądanego gatunku na wyświetlonej liście. Przewiń w dół do sekcji ref seq, aby zobaczyć wszystkie udokumentowane izoformy.Kliknij identyfikator sekwencji dla interesującej nas izofo

identification-functional-protein-regions-through-chimeric-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z użyciem kolumn wypełnionych kulkami białka A, adsorbery błonowe białka A mogą znacznie przyspieszyć laboratoryjną izolację przeciwciał i innych białek wyrażających fragmenty Fc. Odpowiednie metody analizy i kwantyfikacji mogą jeszcze bardziej przyspieszyć przetwarzanie białek, pozwalając na zakończenie izolacji/charakterystyki w ciągu jednego dnia roboczego, zamiast 20+ godzin pracy.

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD).  IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami.  Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Konstrukt kodujący TMEM184A ze znacznikiem GFP na końcu karboksylowym, przeznaczony do ekspresji eukariotycznej, został wykorzystany w testach mających na celu potwierdzenie identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych.

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.

System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand

Opisujemy metodologię opartą na dywersyfikacji sekwencji w celu oszacowania preferencji aminokwasowych wielospecyficznych miejsc wiązania w interakcjach białko-białko (PPI). W ramach tej strategii tysiące potencjalnych ligandów peptydowych są generowane i badane in silico, pokonując w ten sposób niektóre ograniczenia dostępnych metod eksperymentalnych.

Obliczeniowe przewidywanie preferencji aminokwasów potencjalnie wielospecyficznych domen wiążących peptydy zaangażowanych w interakcje białko-białko

Poznaj metodę budowy białek chimerycznych poprzez wymianę regionów między podobnymi strukturalnie białkami. Technika ta pozwala identyfikować kluczowe obszary odpowiedzialne za różnorodne funkcje biologiczne.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Przeglądaj więcej filmów