Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych
8 stycznia 2019
Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.
Zamiana regionów strukturalnie podobnych białek w celu stworzenia kimer pozwala nam zbadać znaczenie regionów odpowiedzialnych za funkcje biologiczne badanej cząsteczki. Wymiana regionów poprzedza ogólną drugorzędową strukturę białka, dzięki czemu region ważny dla jego ogólnej struktury może być odróżniony od tych bezpośrednio pośredniczących w funkcjach biologicznych. Może zamieniać się w wybieranie dokładnych regionów do zastąpienia.
Rozpoczęcie od większych wymian jest zwykle pomocne w zidentyfikowaniu kluczowej funkcjonalności białka. Aby rozpocząć procedurę, wybierz odpowiednie białko jako dawcę, aby wymienić regiony z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie należy uzyskać sekwencje aminokwasów białkowych białek biorcy i dawcy z bazy danych sekwencji referencyjnych, uzyskując najpierw dostęp do sekcji genów na stronie internetowej ref seq.
Wpisz nazwę interesującego Cię białka w polu wyszukiwania i kliknij przycisk wyszukiwania. Kliknij nazwę genu dla żądanego gatunku na wyświetlonej liście. Przewiń w dół do sekcji ref seq, aby zobaczyć wszystkie udokumentowane izoformy.
Kliknij identyfikator sekwencji dla interesującej nas izoformy. Przewiń w dół i kliknij cds, aby podświetlić region kodujący białko genu. W prawym dolnym rogu ekranu kliknij FAFSDA i skopiuj sekwencję genu.
Zapisz sekwencję DNA za pomocą odpowiedniego oprogramowania do edycji DNA. Korzystając z ogólnodostępnego APE, otwórz program, wklej skopiowaną sekwencję w pustym polu, wybierz nazwę sekwencji i kliknij Zapisz. Teraz wybierz regiony białkowe, które mają zostać podstawione w różnych konstruktach kimerycznych, najpierw dzieląc interesującą sekwencję białka na odrębne regiony strukturalne.
W tym celu należy pobrać dane strukturalne interesującego nas białka ze strony internetowej PDBe. Wejdź na stronę PDBe dla białka i pobierz plik PDBe, klikając pobierz po prawej stronie ekranu. Otwórz plik PDBe w systemie wizualizacji molekularnej, takim jak Pymol.
W Pymol wyświetl sekwencję nukleotydów, ukryj domyślne dane strukturalne i wybierz widok kreskówki, aby wyraźnie zwizualizować cechy strukturalne białka. Kliknij sekwencję nukleotydów u góry ekranu, aby podświetlić różne części cząsteczki, zwracając uwagę na aminokwasy odpowiadające każdej charakterystycznej cesze strukturalnej. Teraz opisz różne regiony strukturalne w sekwencji DNA w APE, otwierając sekwencję DNA, wybierając ją i klikając ORF translować, a następnie kliknij ostatni aminokwas pierwszego regionu, aby podkreślić jego pozycję w sekwencji DNA i wybierz kodowanie nukleotydu dla tego regionu.
Kliknij zaznaczenie prawym przyciskiem myszy i wybierz nową funkcję, aby nadać jej nazwę i kolor. Powtórz ten proces dla każdego obszaru strukturalnego zidentyfikowanego w poprzednim kroku. Aby wyrównać sekwencje reszt dwóch białek, najpierw uzyskaj pełne sekwencje aminokwasów białek donorowych i receptorowych w APE.
Tak jak poprzednio, otwórz sekwencję DNA dawcy, wybierz ją i kliknij ORF-y translate. Następnie wejdź na stronę internetową Clustal Omega, a następnie umieść sekwencje aminokwasów dwóch białek. Każda sekwencja powinna być poprzedzona linią tekstową z nazwą białka, aby mogła być prawidłowo zidentyfikowana.
Przewiń w dół i kliknij Prześlij. Pobierz plik wyrównania, klikając kartę Pobierz plik wyrównania i zapisz go. Plik ten można otworzyć za pomocą dowolnego programu do edycji tekstu.
Używając pliku wyrównania jako odniesienia, opisz odpowiednie regiony strukturalne białka dawcy w ich sekwencji DNA. Utwórz kopię opisanej sekwencji DNA białka receptorowego i zmień jej nazwę na białko kimeryczne. Otwórz sekwencję DNA o zmienionej nazwie w APE.
Wybierz region do wymiany w białku dawcy, a następnie wybierz odpowiedni region w białku receptorowym o zmienionej nazwie. Wklej sekwencję DNA białka dawcy, a następnie zapisz zmiany. Zaprojektuj końcowe startery za pomocą edytora DNA, takiego jak APE.
Utwórz nowy plik DNA, zainicjuj końcowy starter końcowy sekwencją prowadzącą. Następnie następuje pierwsze miejsce restrykcyjne wybrane w wektorach MCS i opcjonalny odstęp w początkowych 18 do 27 parach zasad interesującego genu. W nowym pliku DNA zaprojektuj sekwencję startera C-końcowego tak, aby zaczynała się od końcowych 18 do 27 par zasad genu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie opcjonalnego dystansu, drugiego wybranego miejsca restrykcyjnego i sekwencji lidera.
Zaznacz całą sekwencję, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odwrócony komplement, aby uzyskać odwrotny podkład. Teraz zaprojektuj elementarze dla każdego z regionów granicznych w konstruktach kimerycznych. W sekwencji DNA kimery podkreśl region 30 par zasad w strefie, w której stykają się sekwencje oryginalne i wstawione.
Składa się z 15 par zasad w każdej sekwencji. Skopiuj region i wklej go do nowego pliku DNA. Ta sekwencja będzie podstawowym elementarzem.
Utwórz kopię startera do przodu wygenerowanego w poprzednim kroku i zmień jego nazwę na starter odwrotny. Podświetl sekwencję starterów, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odwrotny komplement, aby wygenerować odwrotną sekwencję starterów. Powtórz te kroki dla każdej strefy kontaktu w sekwencji kimerycznego DNA.
Ogólnie rzecz biorąc, do wytworzenia jednej kimery wymagane są dwa zestawy starterów do przodu i do tyłu, chyba że wymiana następuje w regionach końcowych N lub C. Przygotować indywidualną mieszaninę reakcyjną PCR dla każdego z fragmentów składających się na białko kimeryczne. Najpierw ustaw jednopunktową pięciomililitrową rurkę z mikrobezpiecznikiem na lodzie i odpipetuj różne odczynniki mieszanin PCR w kolejności podanej w protokole tekstowym.
Upewnij się, że dla każdej reakcji PCR stosowane są odpowiednie startery i matryce. Oznaczyć dwie cienkościenne probówki do PCR w punkcie zerowym w dwóch mililitrach dla każdej reakcji i przenieść 20 mikrolitrów odpowiedniej mieszaniny PCR do każdej probówki. Przenieś probówki PCR do termocyklera PCR i zainicjuj protokół zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Po zakończeniu reakcji PCR dodaj cztery mikrolitry sześciokrotnego buforu ładującego DNA do każdej probówki. Wprowadzić jednoprocentowy żel agarozowy do urządzenia do elektroforezy i przykryć buforem TAE. Ostrożnie załaduj próbki do żelu wraz z później o masie cząsteczkowej.
Po uruchomieniu żelu pod napięciem od 80 do 120 woltów przez 20 do 45 minut wyłącz jednostkę do elektroforezy i usuń żel agoross. Wizualizuj amplifikowane prążki DNA w świetle UV. Za pomocą żyletki wytnij pojedyncze fragmenty DNA z żelu i przenieś je do oznaczonych dwóch mililitrowych probówek z mikrobezpiecznikami.
Po użyciu zestawu do czyszczenia PCR w celu oczyszczenia fragmentów DNA, określ ilościowo ilość odzyskanego DNA, mierząc absorbancję próbek przy 260 nanometrach i 340 nanometrach w spektrofetometrze. Teraz wykonaj amplifikację PCR, aby wygenerować kimeryczną sekwencję DNA. Najpierw ustaw 50 mikrolitrów reakcji PCR, aby połączyć oddzielne składniki kimery, tak jak poprzednio.
Zastosuj startery końca N i C, wraz z 10 nanogramami każdego z amplifikowanych fragmentów DNA. Odzyskaj i oznacz ilościowo oczyszczony fragment DNA jak poprzednio, w 30 mikrolitrach wody wolnej od jądra. Fragment ten zawiera kimeryczną sekwencję DNA otoczoną miejscami restrykcyjnymi zawartymi w końcowych starterach.
Przykładem wytwarzania białka kimerycznego są dwaj członkowie rodziny inter luke i sześciu sytokin. Oncostaten M w czynniku hamującym białaczkę. Kimera windy OSM powstaje w wyniku zamiany obszaru pętli BC OSM na odpowiadającą mu sekwencję windy.
Pierwszy etap amplifikacji PCR składał się z trzech oddzielnych reakcji. N-końcowy fragment OSM, który wymagał N-terminalnych starterów OSM do przodu i BC start odwrotny, używał OSM jako szablonu. Pętlę LIF BC uzyskano za pomocą starterów BC start forward i BC N reverse przy użyciu LIF jako szablonu.
Fragment OSM C-terminala używał starterów BC end forward i C terminal odwrotny OSM, a także OSM jako szablonu. Te oczyszczone fragmenty zostały następnie użyte jako matryca w drugiej reakcji PCR wraz z N-końcowymi starterami OSM do przodu i C-końcowymi starterami odwróconymi OSM w celu amplifikacji odpowiedniej sekwencji genu pętli OSM LIF, BC. Po oczyszczeniu i przekształceniu w e-coli, poszczególne plazmidy wyizolowano i poddano badaniom przesiewowym za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym w celu prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA.
Elektroforeza żelowa ujawniła dodatnie trafienia, które następnie zostały wysłane do weryfikacji sekwencji. Białka kimeryczne muszą być produkowane, a aktywność mierzona w doskonałych układach frakcyjnych. W celu określenia znaczenia zastąpionych regionów dla tej konkretnej frakcji.
Technika ta była bardzo przydatna i często stosowana, zakłócana przez receptory sygnałowe w celu identyfikacji kluczowych domen funkcyjnych i miejsc rozpoznawania receptorów. Liczba, której używam do elektroforezy DNA, powinna być obsługiwana przy użyciu jednorazowych rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada tworzenie białek chimerycznych poprzez wymianę regionów strukturalnie podobnych białek w celu zbadania ich różnych funkcji biologicznych. Analizując te wymiany, naukowcy mogą zidentyfikować krytyczne regiony odpowiedzialne za funkcjonalną dywergencję białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria białek
- Biologia funkcjonalna
- Biologia strukturalna
Tło
- Białka strukturalnie spokrewnione często pełnią różne role biologiczne.
- Białka chimeryczne mogą pomóc w wyjaśnieniu funkcji określonych regionów białka.
- Rozumienie tych funkcji jest kluczowe dla różnych zastosowań biologicznych.
- Wymiana regionów może pomóc w odróżnieniu ról strukturalnych i funkcjonalnych.
Cel badania
- Zbadanie znaczenia określonych regionów białka w funkcjach biologicznych.
- Identyfikacja kluczowych funkcjonalności białek poprzez wymianę regionów.
- Dostarczenie metody wybierania odpowiednich białek donorów do wymiany.
Zastosowanie metod
- Wybór białek donorów i odbiorców do wymiany regionów.
- Dostęp do sekwencji aminokwasowych z baz danych referencyjnych.
- Przeprowadzanie większych wymian w celu zidentyfikowania kluczowych funkcjonalności.
- Wykorzystanie protokołów do systematycznej wymiany regionów.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja regionów krytycznych dla funkcji białka.
- Wykazano użyteczność białek chimerycznych w analizie funkcjonalnej.
- Dostarczono wglądu w wymagania strukturalne dla aktywności biologicznej.
- Podkreślono znaczenie metodycznej selekcji regionów.
Wnioski
- Białka chimeryczne są cennym narzędziem do badania funkcji białek.
- Wymiana regionów może wyjaśnić role określonych domen białkowych.
- To podejście może prowadzić do postępów w inżynierii białek i biologii funkcjonalnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Chimeric protein construction enables systematic interrogation of protein regions to distinguish structural from functional domains, supporting target validation in early discovery. This approach reduces mechanistic ambiguity by pinpointing critical amino acid sets, informing lead identification and preclinical de-risking. It is particularly valuable when functional regions are poorly defined, serving as a first step in directed evolution to focus screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies functional protein regions by measuring loss of activity in chimeras, clarifying therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Uses nested PCR and mammalian expression to generate structurally relevant variants for functional screening.
- Strategic Value: Narrows regions of interest for downstream mutagenesis, reducing screening space in lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates chimeric proteins with defined region swaps to enable quantitative functional readouts in assay systems.
- Operational Value: Produces expression-ready DNA fragments compatible with mammalian systems for consistent protein production.
- Strategic Value: Supports assay standardization by defining structure-function relationships critical for reproducible screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Identifies regions critical for biological activity, informing mechanistic de-risking before preclinical investment.
- Operational Value: Enables structure-guided design of variants for further engineering, such as cytokine or receptor optimization.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by validating target regions early using orthogonal functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where region swapping informs hypothesis testing and biological de-risking prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests functional importance of protein domains by exchanging regions with structurally similar proteins.
- Screening: Produces chimeric proteins suitable for functional assays that measure activity changes due to region swaps.
- Analytics: Relies on activity readouts to quantify functional impact, enabling comparison across chimeric variants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying regions whose alteration affects function, guiding further engineering.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for region-swapping across protein families with structural homologs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through empirical measurement of region-specific functional contributions.
- Operational Value: Standardized workflow using nested PCR, gel purification, and mammalian expression for reproducible chimera generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying which regions drive biological activity, reducing wasted effort on non-functional targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanistic understanding of functional domains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein sequence analysis, structural visualization, and PCR-based DNA engineering.
- Depends on access to structural data (e.g., PDB) and sequence alignment tools (e.g., Clustal Omega) for region annotation.
- Necessitates mammalian expression systems to ensure proper folding and post-translational modifications for functional assessment.
- Limited to cases where a structurally related protein with differing function exists as a donor for region exchange.
- Relies on functional readout assays to detect activity loss, making assay sensitivity a practical constraint.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Chimeric Protein Design
5:00
Preparation for Molecular Cloning
7:05
Polymerase Chain Reaction (PCR) Amplification of the Individual DNA Fragments Forming the Chimera and to Generate the Chimeric DNA Sequence
9:22
Results: Generation of the Oncostatin M BC Loop Chimera
10:55
Conclusion
