Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Protokół ten umożliwia znakowanie białek w sposób specyficzny dla typu komórki. Jest to pierwsza technika, która daje taką możliwość i można ją wykonać in vitro lub in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że znakowane białka specyficzne dla typu komórki mogą być oczyszczane w sposób niezidentyfikowany lub wizualizowane in situ za pomocą immunofluorescencji.

Aby rozpocząć, przygotuj lizat tkankowy, dodając bufor do lizy o objętości od 12 do 15 razy większej niż mokra masa tkanki i rozcieraj tkankę, aż zostanie zhomogenizowana. Podgrzewaj ten homogenat przez 15 minut do 75 stopni Celsjusza, aby zdenaturować białko, a następnie odwiruj próbkę i przenieś supernatant do nowej probówki. Próbka ta może być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie, w celu alkilacji, rozcieńczyć homogenizowaną próbkę dwa do trzech razy w buforze soli fosforanowej zawierającym inhibitor proteazy wolny od EDTA. Następnie dodaj świeżo przygotowany jodoacetamid do końcowego stężenia 20 milimoli. Pozostaw próbkę na jedną do dwóch godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ciemności.

Powtórz etapy dodawania jodoacetamidu i inkubacji dwukrotnie. Przygotuj kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw wirując kolumny. Następnie zdejmując pokrywkę, odcinając dolną część i odwirowując je.

Następnie przeprowadź wymianę buforu, najpierw równoważąc kolumny wymiany buforu za pomocą bufora wymiany chemicznej kliknięć, a następnie wymieniając wszystkie próbki alkilowane. Aby ocenić inkorporację azydonorleucyny, należy pobrać 40 mikrolitrów podanej próbki i dodać bufor soli fosforanowej do końcowej objętości 120 mikrolitrów. Następnie ustaw reakcję chemii kliknięć, wirując reakcję przez 20 sekund.

Po jak najszybszym dodaniu każdego odczynnika we wskazanej kolejności, należy inkubować próbki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z ciągłą rotacją. Następnego dnia należy odwirować próbki przez pięć minut w temperaturze 17 000 razy G, po odwirowaniu będzie widoczna lekko turkusowa osadka. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do znakowanego oczyszczania białek. Poddać wszystkie próbki procedurze wymiany buforowej, jak wykazano w celu oczyszczenia resztek wolnego alkinu przy użyciu buforu wiążącego neutrawidynę jako buforu równoważącego. Następnie trzykrotnie przemyć kulki neutrawidyny o dużej pojemności, mieszając je z buforem wiążącym.

Odwirować mieszaninę, odrzucić supernatant i powtórzyć to trzy razy. Następnie przygotuj zawiesinę jeden do jednego, dodając taką samą objętość suchych kulek neutrawidyny i buforu wiążącego neutrawidynę. Odłóż na bok od 20 do 40 mikrolitrów każdej próbki jako wstępnie oczyszczony lizat i przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po zmierzeniu stężenia białka w próbce zmieszaj jeden miligram białka z 40 mikrolitrami zawiesiny kulek. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z ciągłą rotacją, umożliwiając znakowane białka związanie się z kulkami. Następnego dnia zebrać supernatant przez odwirowanie.

Odłóż na bok 20 do 40 mikrolitrów podwielokrotności supernatantu do późniejszej analizy, a resztę zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie umyj koraliki trzykrotnie, dodając schłodzony bufor do płukania neutrawidyny. Sedymentacja kulek i odrzucenie supernatantu.

Następnie dodaj ten sam bufor i inkubuj kulki przez 10 minut w ciągłym obracaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed odrzuceniem supernatantu. Powtórzyć płukanie za pomocą płuczących neutrawidynę nr 2 i 3 i wymyć kliknięte białka przez inkubację kulek przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza z objętością buforu elucyjnego neutrawidyny, odpowiadającą jednej objętości użytych suchych kulek. Podczas elucji utrzymuj kulki w zawiesinie z prędkością 1000 obrotów na minutę w wytrząsarce z blokiem termicznym, dwukrotnie wymyj i połącz obie eluty.

Reakcje kliknięć analizowano za pomocą strony SDS i Western immuno blot. Reprezentatywne obrazy z eksperymentów przedstawiono dla podawania azydonorleucyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym oraz dla podawania azydonorleucyny w wodzie pitnej. Kolejny eksperyment dostarcza przykładu do określenia optymalnego stężenia dwusiarczku biotyny w rozszczepialnym alkinie.

W tym przykładzie zmiana krotności między znakowaną próbką a kontrolą jest najwyższa przy stężeniu 14 mikromolowych alkinów. Przykład wyniku spektrometrii mas z wyraźnym wzbogaceniem próbki znakowanej azydonorleucyną w porównaniu z próbką kontrolną przedstawiono tutaj. Różnica ta była już widoczna w całkowitym barwieniu białka.

Oprócz zmian w intensywności peptydów, w obu próbkach znajdują się również unikalne białka. Jest to technicznie złożony protokół i jest to krok, który musi być dokładnie przestrzegany przy użyciu odpowiednich kontroli negatywnych, alkilacji, prawidłowego (niewyraźnego) i odpowiedniego czyszczenia archiwum bez kliknięcia. Nasze kluczowe kroki w tym protokole, oczyszczone białka mogą być zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas, jeśli naukowcy są zainteresowani badaniem białek lub załadować je do żelu w celu badania białek będących przedmiotem zainteresowania za pomocą western blot.

Zdolność tej metody do znakowania białek o określonym pochodzeniu komórkowym ma wiele zastosowań, takich jak napięcie białek lub badanie syntezy białek in vitro lub in vivo.