Stereotaktycznie sterowana ablacja kory słuchowej szczura i lokalizacja zmiany w mózgu
October 11th, 2017
Opisujemy metodę stereotaktycznego lokalizowania, ekspozycji i ablacji kory słuchowej u szczurów. Lokalizacja ablacji jest oceniana za pomocą mapy współrzędnych sporządzonej post mortem.
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie stereotaktycznie sterowanej ablacji kory słuchowej i wykorzystanie mapy współrzędnych do zlokalizowania zmiany na obrazie powierzchni mózgu. Ta metoda może pomóc badaczom neurobiologii słuchowej w zajęciu się rolą kory mózgowej w szlaku percepcji dźwięku. A także mechanizmy i plastyczność pozycyjna linii.
Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia chirurgiczne odsłonięcie i ablację kory słuchowej przy użyciu podstawowych metod, które mogą być dostosowane przez każdego badacza. Tak więc ta metoda może być przydatna w dziedzinie neuronauki słuchowej, może być również stosowana w innych systemach, takich jak wzrokowy i somatosensoryczny. Metoda ta może być również stosowana do badania defektów, jakie jednostronna ablacja kory słuchowej wywiera w innych obszarach kory mózgowej.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ właściwa identyfikacja i translacja współrzędnych stereotaktycznych do kości skroniowej jest niezbędna do dokładnego zlokalizowania kory słuchowej. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczulonego szczura na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Następnie ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie za pomocą dwóch nauszników i belki do gryzienia.
Ogolić skórę głowy i zdezynfekować obszar operacyjny jodonem powidonu. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć okostną pokrywającą powierzchnię czaszki. Następnie użyj sterylnej bawełnianej końcówki, aby delikatnie usunąć krew pokrywającą powierzchnię czaszki.
Aby uwidocznić Bregmę, Lambdę i linię międzyuszną, wykonaj nacięcie w mięśniu skroniowym w pobliżu jego przyczepu grzbietowego na czaszce za pomocą skalpela. Następnie wyciągnij mięsień za pomocą igły i materiału do szycia i przymocuj materiał szwu do ramy stereotaktycznej, aby odsłonić kość skroniową. Powoli opuść sterylną prostą igłę, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią czaszki, tak aby końcówka igły była ustawiona na zero międzyuszne.
Ustaw ten punkt na zero. Następnie wyceluj w AC za pomocą czterech punktów. Następnie opuść igłę tuż nad kością skroniową, aby uwidocznić każdy z tych czterech punktów.
Zaznacz punkty markerem na kości skroniowej i połącz je, aby narysować prostokąt. Prostokąt posłuży jako przewodnik do otwarcia okna w kości. W tej procedurze otwórz okno za pomocą wiertarki elektrycznej i małego wiertła.
Wywierć obwód prostokąta z prędkością 8 000 obr./min, aż kość się podda. Schłodzić powierzchnię wiercenia, spłukując ją zimną sterylną solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniu struktur podkorowych. Kiedy kość ustępuje, uważaj, aby nie wwiercić się w mózg.
Kiedy granice zostaną utracone, podciągnij kość pokrywającą za pomocą cienkich kleszczy i przechowuj ją w zimnym, sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Za pomocą mikroskopu chirurgicznego delikatnie przeciąć opony mózgowe nożem mikrochirurgicznym i usunąć je za pomocą dwóch drobno zakończonych kleszczyków. Jeśli wystąpi krwawienie, przepłucz miejsce operowane zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
Następnie delikatnie zassaj klimatyzację za pomocą chirurgicznego urządzenia ssącego połączonego ze sterylną igłą o końcówce 20 rozmiarów. Odessaj tylko sześć warstw korowych, a nie leżącą pod spodem istotę białą. Ten punkt jest krytyczny i należy go wykonać bardzo ostrożnie.
Po zakończeniu aspiracji przykryj pole operacyjne pobraną kością i przyłóż wchłanialną gazę hemostatyczną. Pozwól mięśniowi skroniowemu odzyskać swoją pierwotną pozycję, a następnie zszyj skórę za pomocą klipsów do ran. Następnie nałóż maść z antybiotykiem na ranę.
Następnie należy wstrzyknąć buprenorfinę podskórnie w grzbiet szczura jako środek przeciwbólowy, godzinę i osiem godzin po zakończeniu operacji. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej, dopóki się nie obudzi i włóż je z powrotem do klatki w celu odzyskania zdrowia. Po zakończeniu badań przeprowadzonych na szczurze poddanym ablacji AC, należy go znieczulić terminalnie przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 mililitra pentobarbitalu sodu.
Po wykonaniu wewnątrzsercowej obfitości roztworu Ringera i formaldehydu, usuń skórę i mięśnie z głowy, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą nożyczek Spencera wykonaj poprzeczne nacięcie w kości oczodołu. Następnie usuń tylną część czaszki i użyj rongeurs, aby przeciąć wzdłuż górnych krawędzi czaszki, aby odsłonić mózg.
Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Po odsłonięciu mózgu ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą cienkich kleszczy. Użyj palca, aby delikatnie zgarnąć i podnieść mózg.
Następnie podnieś mózg i przetnij nerwy, aż będzie wolny. Następnie zanurz mózg w roztworze formaldehydu i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po utrwaleniu ostrożnie umieść mózg w strzałkowej matrycy mózgu szczura, odsłaniając boczną powierzchnię mózgu.
Umieść kamerę 21 centymetrów nad powierzchnią kory mózgowej za pomocą uchwytu na kamerę. Następnie wybierz tryb fotografowania super-makro i zrób zdjęcie powierzchni mózgu. Następnie, za pomocą edytora obrazów, otwórz obrazy i zmniejsz je o 50%Zidentyfikuj odniesienia Bregma, Lambda i międzyuszne zero i zaznacz ich położenie na zdjęciach.
Narysuj kontur ablacji na bocznym obrazie mózgu. Zaimportuj mapę współrzędnych, w której znajdują się pierwszorzędowe i drugorzędne regiony kory słuchowej, do pliku edytora. Następnie kliknij na mapę i przeciągnij ją, aby nałożyć się na boczne zdjęcie mózgu poddanego ablacji.
Spraw, aby odniesienia Bregma i Lambda na mapie współrzędnych pokrywały się z odniesieniami Bregma i IA zidentyfikowanymi na obrazie bocznego mózgu. Następnie użyj szczeliny nosa jako odniesienia, aby dostosować obraz mózgu do mapy i sprawić, by się pokrywały. Ważne jest, aby potwierdzić, że istota biała jest nienaruszona.
Można to zrobić poprzez wstępne barwienie immunologiczne szeregowego odcinka mózgu. Aby wykazać skuteczność naszego protokołu, utrzymaliśmy trzy szczury poddane ablacji AC w wieku jednego tygodnia, a następnie pobraliśmy ślimaki, aby zbadać zmiany w ekspresji najbardziej istotnych podjednostek AMPA obecnych w ślimaku dorosłego, GluA2 i GluA3 za pomocą qPCR. Porównanie transkryptów od szczurów poddanych ablacji AC i pozorowanych zwierząt kontrolnych wykazało regulację w dół dla GluA2 i regulację w górę dla GluA3 w obu ślimakach, co jest zgodne z naszym poprzednim badaniem.
Przystępując do zabiegu, należy pamiętać o trzech rzeczach: wierceniu kości skroniowej z najniższą prędkością przy minimalnym nacisku, ostrożnym usuwaniu opon mózgowych, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych oraz ograniczeniu aspiracji do istoty szarej. Po opanowaniu chirurgiczne odsłonięcie i ablację kory słuchowej można wykonać w ciągu 45 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać metody fizjologiczne, behawioralne i/lub immunocytochemiczne w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. jak brak kory słuchowej wpływa na funkcjonowanie dalszych układów sensorycznych.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę stereotaktycznie kierowanej ablacji kory słuchowej u szczurów. Technika ta umożliwia precyzyjne zlokalizowanie uszkodzenia za pomocą mapy współrzędnych, która jest oceniana po śmierci.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Przetwarzanie dźwięku
- Techniki chirurgiczne
Tło
- Kora słuchowa odgrywa kluczową rolę w percepcji dźwięku.
- Zrozumienie funkcji korowych może pomóc w badaniach nad neuronauką słuchu.
- Pojedyncze ablacje mogą wpływać na inne obszary korowe.
- Wizualna demonstracja metody jest niezbędna do dokładnej implementacji.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół do ablacji kory słuchowej.
- Ułatwić badania nad rolami korowymi w percepcji dźwięku.
- Możliwość adaptacji metody dla innych układów zmysłowych.
Stosowane metody
- Stabilizacja głowy szczura w rama stereotaktyczna.
- Nacięcie i ekspozycja czaszki w celu ukierunkowanej ablacji.
- Wykorzystanie mapy współrzędnych do precyzyjnej lokalizacji kory słuchowej.
- Oceny pośmiertnej uszkodzenia za pomocą technik obrazowania.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na pomyślną ablacje kory słuchowej.
- Analiza pośmiertna potwierdza dokładne zlokalizowanie uszkodzeń.
- Wykazano potencjał badania wpływu na inne obszary korowe.
- Protokół można dostosować do innych układów zmysłowych.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w badaniach nad korą słuchową.
- Stanowi podstawę do dalszych badań nad funkcjami korowymi.
- Wyrazistość wizualna i proceduralna poprawia reprodukowalność badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise stereotactic ablation and postmortem lesion mapping of the rat auditory cortex, supporting mechanistic studies of cortical function in sensory processing pathways. The method provides a reproducible preclinical model for investigating target engagement and downstream neural effects following cortical perturbation, relevant to de-risking hypotheses in CNS target validation. By combining surgical intervention with coordinate-based lesion confirmation, it enhances data interpretability and reduces ambiguity in linking cortical ablation to phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of auditory cortex function in sound perception pathways to validate mechanistic hypotheses about cortical targets.
- Operational Value: Uses standardized stereotactic coordinates to ensure consistent targeting across experiments, reducing variability in lesion placement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates lesion-defined models suitable for screening compensatory changes in connected sensory systems, such as contralateral cortical or subcortical nuclei.
- Operational Value: Relies on basic neurosurgical tools (drill, suction, forceps) accessible to most academic and industrial discovery labs, supporting broad adoption.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of unilateral auditory cortex ablation effects on gene expression in peripheral systems like the cochlea, enabling cross-level mechanistic de-risking.
- Operational Value: Includes postmortem validation via coordinate mapping and immunostaining to confirm lesion extent and white matter integrity, improving model reliability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where targeted cortical ablation supports hypothesis testing and pathway clarification before advancing to lead identification or phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of cortical targets by enabling precise ablation and postmortem confirmation of lesion localization.
- Screening: Prepares validated lesion models for downstream assessment of molecular or physiological readouts in interconnected neural circuits.
- Analytics: Enables quantitative comparison of molecular markers (e.g., GluA2/GluA3 expression) between ablated and control tissues using qPCR or immunostaining.
- Translational Research: Links central cortical manipulation to peripheral biomarker changes, supporting translational continuity from CNS to sensory periphery.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other sensory systems (visual, somatosensory), allowing reuse of the surgical and mapping framework across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by confirming lesion location and extent, increasing confidence in target–phenotype relationships.
- Operational Value: Employs reproducible stereotactic steps and coordinate-based validation, enhancing inter-lab consistency.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether cortical target modulation produces expected downstream effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic neurosurgery and microsurgical techniques to avoid damaging subcortical structures during bone drilling and meningeal removal.
- Depends on sterile instruments, a stereotaxic frame, surgical microscope, and imaging setup for postmortem brain visualization.
- Necessitates standardization of coordinate mapping procedures to ensure accurate lesion localization across operators and sessions.
- Must be adapted carefully when applying to other sensory systems due to differences in cortical anatomy and stereotactic coordinates.
- Limited to acute or subchronic studies due to postoperative survival constraints; chronic effects require additional recovery and monitoring protocols.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Location of the AC in the Temporal Bone of the Rat
3:04
Surgical Exposure and Ablation of the AC
5:07
Tissue Collection
6:18
Localization of the AC Lesions
7:56
Results: Changes in mRNA Levels of AMPA Receptor Subunits GluA2 and GluA3 After Unilateral AC Ablation 7 Days Post-Lesion
8:38
Conclusion
