Name: Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj technologię matryc mikroelektrod do pomiaru aktywności glutaminianu w mózgu prosiąt podczas znieczulenia. Ta metoda pozwala badać neurotoksyczność z wyjątkową rozdzielczością czasową i przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wkład Centrum Technologii Mikroelektrod Uniwersytetu Kentucky (CenMeT) oraz Centrum Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu Stanowego Ohio (ULAR).

Prosięta (Sus scrofa) są przyjmowane przez lokalną farmę wstępnie zatwierdzoną przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU) (IACUC). Po zatwierdzeniu protokołu, eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z polityką IACUC.
1. Obchodzenie się z prosiętami i prosiętami
<ol>
	<li>Wykorzystaj samce i samice prosiąt w sposób systematyczny i losowy, aby wyeliminować wszelkie potencjalne czynniki zakłócające ze względu na płeć zgodnie z wytycznymi ARRIVE19. 
	UWAGA: Ponieważ okres maksymalnego wzrostu mózgu przypada na 3-5 dni od urodzenia prosiąt, eksperymenty przeprowadza się wyłącznie na prosiętach w wieku 3-5 dni.</li>
	<li>Upewnij się, że prosięta przybędą do wiwarium co najmniej 24 godziny przed eksperymentami, aby umożliwić aklimatyzację w środowisku. 
	UWAGA: Przeszkolony personel weterynaryjny zapewnia rutynową opiekę nad zwierzętami. Prosięta są trzymane w indywidualnie utrzymywanych, stale monitorowanych klatkach i otrzymują pełnowartościowy preparat mlekozastępczy ad libitum, aby zapobiec hipoglikemii. Prosięta są również trzymane bez preparatu mlekozastępczego (zero na os) przez co najmniej 3 godziny przed znieczuleniem i są zaopatrywane w koce i zabawki, aby zapewnić normalny poziom stymulacji. Jeśli to możliwe, trzymaj wiele prosiąt w tej samej klatce, aby umożliwić socjalizację.</li>
</ol>
2. Rozwój i dostosowywanie MEA do badań AIN w modelu prosiąt
UWAGA: Ta technologia wykorzystuje MEA oparte na enzymach, które są wstępnie pokryte enzymem i galwanicznie podane dichlorowodorkiem m-fenylenodiaminy (mPD). Elektrody zostały specjalnie zaprojektowane ze sztywnym trzonkiem o średnicy 40 mm i wyprodukowane do użytku u prosiąt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Aby uniknąć redundancji, zapoznaj się ze szczegółowym opisem przygotowania i kalibracji MEA, jak opisano wcześniej15 (Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Znieczulenie i użycie niestandardowego aparatu stereotaktycznego dla prosiąt
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierząt za pomocą stanowiska anestezjologicznego z odpowiednim respiratorem i urządzeniami monitorującymi oraz monitorowanie parametrów fizjologicznych, takich jak pulsoksymetria, nieinwazyjne ciśnienie krwi, elektrokardiografia i temperatura przez cały czas trwania eksperymentu, jak opisano wcześniej19. Zaintubować i przewietrzyć prosięta, a następnie podawać znieczulenie sewofluranem przy 1 minimalnym stężeniu pęcherzykowym (MAC) (około 2,5-3%) przez 3,5 godziny. Upewnij się, że przeszkoleni pracownicy laboratorium są obecni podczas tych eksperymentów. Sierść pokrywająca obszar operacyjny jest usuwana za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia przed przygotowaniem skóry. 
	UWAGA: Stężenie i czas trwania zastosowanego środka znieczulającego pozwala eksperymentowi symulować czas rzeczywistej ekspozycji na znieczulenie podczas zabiegu chirurgicznego. Ponadto sewofluran jest najczęściej stosowanym środkiem znieczulającym w populacji pediatrycznej, co sprawia, że badania dotyczące jego bezpieczeństwa mają ogromne znaczenie.</li>
	<li>Przed umieszczeniem w ramie stereotaktycznej należy rozpocząć podawanie rokuronium w dawce nasycającej 2,5 mg/kg mc. i infuzji 1,5 mg/kg/h, aby zapobiec przemieszczaniu się zwierzęcia w ramie.
	<ol>
		<li>Umieść prosię w ramce stereotaktycznej specyficznej dla prosiąt, gdy odpowiednia głębokość znieczulenia zostanie potwierdzona przez uszczypnięcie palca.</li>
		<li>Zapewnij odpowiednią wyściółkę w ramie stereotaktycznej, umieszczając prosię na podkładce rozgrzewającej z wymuszonym powietrzem z dodatkową wyściółką (np. pozycjonerem fluidalnym), aby zapobiec odleżynom.</li>
		<li>Umieść zęby górnej żuchwy nad listwą zębatą (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Listwa zębowa powinna znajdować się na wystarczającym poziomie, aby bardzo mocno utrzymać czaszkę na miejscu.</li>
		<li>Zamocuj i dokręć penetrujące nauszniki w uszach, uważając, aby prosię znajdowało się w pozycji środkowej. Umieść spiczaste końcówki bocznych uchwytów w przewodzie słuchowym i włóż listwy uszne na tyle mocno, aby usłyszeć dźwięk "trzasku" związany z penetracją błony bębenkowej. Mocno przymocuj nauszniki do czaszki i włóż je na równą głębokość z każdej strony, aby zapobiec ruchowi czaszki podczas eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, Panel A). 
		UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby utrzymywać prosięt w cieple (~ 37,8-38,6 °C) i stale monitorować temperaturę podczas całej procedury w celu utrzymania normotermii. Można to osiągnąć za pomocą koca i/lub lampy grzewczej. Pamiętaj, aby umieścić lampę grzewczą w odpowiedniej odległości, aby uniknąć poparzenia skóry zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 4-6 cm wzdłuż czaszki, zachowując ostrożność, aby uniknąć natarcia czaszki skalpelem. Po wykonaniu nacięcia użyj delikatnego wycofania i rozwarstwienia, aby podnieść skórę głowy od czaszki. Delikatnie wyszoruj czaszkę gazikiem, aby usunąć tkankę łączną i odsłonić linie szwów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4, Panel B). 
	UWAGA: Nie jest konieczne zachowanie sterylności podczas eksperymentów niemających na celu przeżycia. Jednak podczas eksperymentów survivalowych należy zachować sterylność.</li>
	<li>W razie potrzeby należy dodatkowo odbić skórę głowy, aby odsłonić obszar zainteresowania i określić zamierzone miejsce kraniotomii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, Panel A). Użyj wiertła chirurgicznego, aby stworzyć okno kraniotomii o długości około 0,25cm2 (może być większe lub mniejsze w zależności od celów eksperymentalnych) nakładające się na strukturę będącą przedmiotem zainteresowania, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić opony twardej lub leżącego poniżej mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, Panel B). Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć oponę twardą pokrywającą tkankę mózgową (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5, Panel C).</li>
	<li>Umieść elektrodę tak pionowo, jak to możliwe nad bregmą, mocując metalowe ramię stopnia czołowego do mikromanipulatora stereotaksu prosiąt. Opuść elektrodę tak bardzo, jak to możliwe, nie dotykając powierzchni czaszki. Zapisz współrzędne bregmy (Rysunek 6, Panel A).
	<ol>
		<li>Określ współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne, a także głębokość interesującej nas struktury w odniesieniu do bregmy. Określ współrzędne stereotaktyczne za pomocą atlasu stereotaktycznego odpowiedniego dla gatunku i wieku. W takim przypadku należy skorzystać z atlasu stereotaktycznego opracowanego specjalnie dla prosiąt20.</li>
		<li>Zmień położenie elektrody tak, aby miała prawidłowe położenie przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne, upewniając się, że zarówno mikroelektroda, jak i aparat są prostopadłe do powierzchni. Umieść pseudo-elektrodę referencyjną pod skórą głowy, zapewniając kontakt ze zwierzęciem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6, Panel B).</li>
		<li>Powoli i delikatnie opuść elektrodę na odpowiednią głębokość w głąb mózgu za pomocą ramienia stereotaktycznego. W przypadku końcowych 2 mm użyj mikronapędu hydraulicznego, aby dalej napędzać elektrodę do dokładnego miejsca (<silna klasa="xfig">Rysunek 6, Panel C). 
		UWAGA: Pozycja elektrody powinna leżeć nad okienkiem kraniotomii. Głębokość elektrody będzie się różnić w zależności od interesującej struktury mózgu. Nie jest konieczne zamykanie nacięcia po zakończeniu zbierania danych w eksperymentach niemających na celu przeżycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar glutaminianu zewnątrzkomórkowego w znieczuleniu sewofluranem
<ol>
	<li>Upewnij się, że prosięt jest pod ciągłym nadzorem fizjologicznym przez cały czas trwania tej procedury. Prosięta są znieczulane wziewnie (przez stożek twarzowy) w ramach przygotowań do zabiegu. </li>
	<li>Po implantacji MEA odczekaj 30 minut, aby elektroda osiągnęła linię podstawową, aby upewnić się, że prawidłowy pomiar zostanie uzyskany przez 3 godziny (<klasa silna = "xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>0,25% bupiwakainy (1 ml/kg) podaje się podskórnie w miejsce zabiegu w celu leczenia bólu pooperacyjnego. Ponadto buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu jest podawana podskórnie co 72 godziny, w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
5. Perfuzja i ofiara
<ol>
	<li>Wykonaj procedury perfuzji i pobrania tkanki mózgowej zgodnie z wcześniejszym opisem21. W przypadku operacji, które nie dają szansy na przeżycie, zwierzęta są poddawane eutanazji natychmiast po eksperymentach, wciąż w znieczuleniu ogólnym.</li>
	<li>Weź duże przekroje poprzeczne nieruchomego mózgu prosiąt i użyj mikroskopii świetlnej, aby zobrazować tor elektrody, jak opisano wcześniej22, aby umożliwić weryfikację umieszczenia MEA, zapewniając prawidłowe umieszczenie w obszarze zainteresowania.</li>
</ol>

<ol><li>Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+hospital+discharge+Survey%3A+2007+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Health+Stat+Report%22%5BJournal%5D)">National hospital discharge Survey: 2007 summary.</a> Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).</li>
<li>Ikonomidou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+NMDA+receptors+and+apoptotic+neurodegeneration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain.</a> Science. 283 (5398), 70-74 (1999).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+neurotrophic+factors+in+neuronal+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).</li>
<li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+neurotoxicity%2C+oxidative+stress+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria.</a> FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).</li>
<li>Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2210844016300697">Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances.</a> Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).</li>
<li>Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+approach+to+anesthesia-induced+neurotoxicity+and+its+implications+for+future+mechanistic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies.</a> Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+real-time+monitoring+of+glutamate+and+electrophysiology+from+cortex+to+hippocampus+in+mice+based+on+a+microelectrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array.</a> Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).</li>
<li>Hinzman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+brain+injury+elevates+tonic+glutamate+levels+and+potassium-evoked+glutamate+release+in+discrete+brain+regions+at+two+days+post-injury%3A+an+enzyme-based+microelectrode+array+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study.</a> J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).</li>
<li>Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+second-by-second+measures+of+L-glutamate+in+the+central+nervous+system+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats.</a> J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).</li>
<li>Benveniste, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Brain microdialysis.</a> J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).</li>
<li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+changes+in+brain+extracellular+glutamate+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels.</a> J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).</li>
<li>Hascup, K. N., Hascup, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+techniques+for+subsecond+neurotransmitter+detection+in+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents.</a> Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).</li>
<li>Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. <a target="_blank" href="https://infoscience.epfl.ch/record/142939">Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters.</a> EPFL. , Lausanne. (2010).</li>
<li>Fan, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+glutamate+levels+decrease+in+a+non-human+primate+model+of+dopamine+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency.</a> Brain Res. 1552, 34-40 (2014).</li>
<li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+enzyme-based+biosensors+to+measure+tonic+and+phasic+glutamate+in+Alzheimer%27s+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models.</a> J Vis Exp. (123), (2017).</li>
<li>Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+multi-electrode+array+screening+for+anticonvulsants+in+acute+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).</li>
<li>Defranchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+assessment+of+micro-electrode+chip+assay+as+a+method+of+detecting+neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro.</a> Front Neuroeng. 4 (6), (2011).</li>
<li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+piglet+model+for+the+study+of+anesthetic-induced+developmental+neurotoxicity+%28AIDN%29%3A+A+translational+neuroscience+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach.</a> J Vis Exp. (124), (2017).</li>
<li>Kilkenny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+research%3A+reporting+in+vivo+experiments%3A+the+ARRIVE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li>
<li>Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalinas-Zeballos%2C+M+%22A+stereotaxic+atlas+of+the+developing+swine+%28Sus+scrofa%29+forebrain%22">A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain</a>. , 887-906 (1986).</li>
<li>Whitaker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+clinically+relevant+use+of+a+piglet+model+to+study+the+effects+of+anesthetics+on+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain.</a> Clin Transl Med. 5 (1), (2016).</li>
<li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+studies+of+the+effects+of+chronic+implantation+of+ceramic-based+microelectrode+arrays+and+microdialysis+probes+in+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex.</a> Brain Res. , 12-20 (2009).</li>
<li>Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-by-second+measures+of+L-Glutamate+and+other+neurotransmitters+using+enzyme-based+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pharmacology+and+experimental+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays.</a> The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).</li>
<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+spillover+after+quantal+release%3A+rethinking+dopamine+transmission+in+the+nigrostriatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway.</a> Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).</li>
<li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microelectrode+measurements+and+the+origin+and+regulation+of+extracellular+glutamate+in+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).</li>
<li>Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+source+of+physiologically+stimulated+glutamate+efflux+from+the+striatum+of+conscious+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats.</a> J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).</li>
<li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Quintero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometric+measures+of+age-related+changes+in+glutamate+regulation+in+the+cortex+of+rhesus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys.</a> Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).</li>
<li>Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+glutamate+measurements+in+the+putamen+of+awake+rhesus+monkeys+using+an+enzyme-based+human+microelectrode+array+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype.</a> J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).</li>
<li>Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+changes+in+glutamate+concentration+in+the+primate+prefrontal+cortex+during+spatial+delayed+alternation+and+sensory-guided+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks.</a> Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).</li>
<li>Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+monitoring+of+intracerebral+glutamate+levels+in+awake+monkeys+using+microdialysis+and+enzyme+fluorometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection.</a> J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).</li>
<li>During, M. J., Spencer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+hippocampal+glutamate+and+spontaneous+seizure+in+the+conscious+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain.</a> Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).</li>
<li>Reinstrup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+microdialysis+in+clinical+practice%3A+baseline+values+for+chemical+markers+during+wakefulness%2C+anesthesia%2C+and+neurosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery.</a> Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).</li>
<li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li>
</ol>

Greg Gerhardt jest głównym właścicielem Quanteon LLC. Jorge Quintero i Jason Burmeister pełnili funkcję konsultantów Quanteon LLC.

Od początku eksperymentu fizjologiczna homeostaza prosiąt musi być utrzymana, jak opisano we wcześniejszej publikacjitego laboratorium 21. Minimalne monitorowanie powinno obejmować pulsoksymetrię, elektrokardiografię, kapnografię, nieinwazyjne ciśnienie krwi i temperaturę. Potrzebni są przeszkoleni badacze, aby zaburzenia fizjologiczne (np. hipo/hipertermia, niedotlenienie, niedociśnienie, arytmia) mogły być odpowiednio skorygowane.
Przed indukcją przeprowadza się kalibracje MEA in vitro w celu ustalenia funkcjonalności i selektywności MEA w znanych warunkach. Kalibracja i powlekanie MEA ma kluczowe znaczenie dla efektywnego wykorzystania tej technologii. Istnieje wiele potencjalnych błędów, które mogą wystąpić podczas kalibracji. Kalibracja może zidentyfikować te problemy, a także niewłaściwe poszycie, które prowadzi do nieprawidłowej reakcji zakłóceń. Sporządzono bardziej szczegółowy tabelaryczny opis błędów, które mogą wystąpić w odpowiedzi MEA, wraz z godnymi uwagi przyczynami i sugerowanymi rozwiązaniami, które powinny okazać się użytecznym narzędziem do prawdopodobnego rozwiązywania problemów (Tabela 1). Ważne jest, aby pamiętać, że zarówno przed kalibracją, jak i galwanizacją, szklaną elektrodę odniesienia należy sprawdzić pod kątem obecności pęcherzyków powietrza lub białych przebarwień, ponieważ będą one miały negatywny wpływ na funkcję MEA i dokładność zapisu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Objaw</td>
			<td>Przyczyna</td>
			<td>Działania naprawcze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Brak sygnału</td>
			<td>Elektroda nie jest podłączona</td>
			<td>Prawidłowo podłącz elektrodę do sceny czołowej, a scenę czołową do systemu amperometrii FAST.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brak zasilania systemu amperometrycznego FAST</td>
			<td>Włącz wyłącznik zasilania z tyłu systemu FAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Szum sygnału</td>
			<td rowspan="2">Elektroda zanieczyszczona krwią</td>
			<td>Ciągłe nawadnianie powierzchni mózgu podczas wprowadzania elektrody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natychmiast przepłukać elektrodę w dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powłoka enzymatyczna jest luźna</td>
			<td>Oczyść i ponownie pokryj elektrodę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elektroda referencyjna nie została włożona ani pokryta</td>
			<td>Pokryj i umieść elektrodę odniesienia głębiej pod skórą głowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elektroda wykrywa ruch powierzchni mózgu</td>
			<td>Zwykle występuje w strukturach powierzchownych. Jeśli to możliwe, włóż elektrodę głębiej (1 mm na raz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Przemieszczanie zwierząt</td>
			<td>Zwierzę jest nieodpowiednio zabezpieczone</td>
			<td>Przesuń zwierzę w kierunku tylnym, aby lepiej zabezpieczyć uszniki na czaszce. W razie potrzeby unieś tułów, aby umożliwić lepsze ułożenie ciała.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zwierzę jest nieodpowiednio znieczulone</td>
			<td>Sprawdź integralność sprzętu anestezjologicznego. Zwiększyć dawkę środka znieczulającego do skutecznej dawki i podać domięśniowo dawkę rokuronium (5 mg/kg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Niedokładne umieszczenie elektrod</td>
			<td>Elektroda nie jest prawidłowo ustawiona</td>
			<td>Wyreguluj elektrodę, zachowując prawidłowe połączenie ze sceną czołową.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Współrzędne stereotaktyczne są niedokładne</td>
			<td>Upewnij się, że atlas prosiąt, do którego odwołuje się odwołanie, nie używa innego punktu odniesienia lub płaszczyzny wyrównania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uważaj, aby nie zasłaniać śladów szwów poprzez nacinanie czaszki.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Instrukcje dotyczące rozwiązywania problemów ze stosowaniem MEA u prosiąt. Możliwe przyczyny i działania naprawcze pomagające w optymalizacji i rozwiązywaniu problemów.
Atlas stereotaktyczny dla prosiąt służy do określenia współrzędnych stereotaktycznych obszaru zainteresowania w odniesieniu do znanego punktu, takiego jak bregma18. Pręty uszne powinny być odpowiednio zabezpieczone, aby czaszka była wypoziomowana i całkowicie unieruchomiona. Należy zachować ostrożność podczas nacięcia w linii środkowej skóry głowy, aby uniknąć nacięć czaszki, ponieważ może to wpłynąć na wizualizację linii szwów. Okno kraniotomii powinno być wystarczająco duże, aby pomieścić MEA.
Protokół ten wiąże się z szeregiem wyzwań technicznych, które wymagają dobrze zaopatrzonego bloku operacyjnego oraz badacza/zespołu wykwalifikowanego w chirurgicznych i anestezjologicznych aspektach protokołu. Model dodatkowo ma ograniczenia finansowe, ponieważ model prosiąt jest droższy niż model gryzonia; Jest to jednak znacznie mniej kosztowne niż wykorzystanie naczelnych innych niż ludzie, które może kosztować tysiące dolarów. Zastosowanie technologii MEA wiąże się z pewnymi wyzwaniami, ponieważ procedura ręcznego powlekania i powlekania elektrod wymaga wykwalifikowanego badacza lub asystenta, aby zapewnić wystarczającą selektywność i niezawodne działanie. Same mikroelektrody są delikatne, ponieważ są wykonane z ceramiki, a zatem łatwo je uszkodzić, jeśli nie zostanie zachowana odpowiednia ostrożność. Mikroelektrody są narażone na zakłócenia powodowane przez inne urządzenia elektryczne, które mogą powodować szumy w nagraniach, oraz przez krew w miejscu operacji, która może zasłaniać miejsca nagrywania. Potrzeba specjalistycznego sprzętu stanowi dodatkowe obciążenie, ponieważ stereotaktyczna rama chirurgiczna musi być zbudowana na zamówienie, aby unieruchomić czaszkę prosiąt podczas implantacji. Rama stereotaktyczna, oksydaza glutaminianu i same elektrody są kosztowne. Dodatkowo, brak atlasu stereotaktycznego prosiąt w ciągu ostatniej dekady stwarza ograniczenia techniczne, które wymagają szczególnej wiedzy specjalistycznej w celu określenia konkretnej lokalizacji głębokich struktur w mózgu prosiąt. Opracowanie nowego atlasu stereotaktycznego, być może wykorzystującego rezonans magnetyczny, znacznie zwiększyłoby możliwości wykorzystania tej technologii u prosiąt.
Prosięt jest klinicznie istotnym modelem do badania AIN, głównie ze względu na podobieństwa, które istnieją między tym gatunkiem a ludzkim noworodkiem, ponieważ oba mają podobną strukturę i rozwój mózgu. W przeciwieństwie do częściej używanych modeli, takich jak myszy czy szczury, prosię ma większe podobieństwo do OUN do ludzi, co nadaje przekładalność wyników modelu. Model prosiąt jest dodatkowo tańszy i wiąże się z mniej skomplikowaną obsługą niż model naczelnych innych niż człowiek. Model prosiąt ma na celu zbadanie procesu, w którym znieczulenie może wywołać neurotoksyczność rozwojową, zmierzenie jej udziału w uszkodzeniach neurologicznych i zwalczanie problemu uszkodzeń spowodowanych przez zmienne zakłócające. Na przykład niedotlenienie może być błędnie interpretowane jako uszkodzenia spowodowane przez środki znieczulające, ponieważ ma globalny wpływ na mózg. Prosię jest wykorzystywane w tych samych warunkach chirurgicznych i anestezjologicznych, co w medycynie ludzkiej, aby zapewnić wierność wyników.
Zastosowanie technologii MEA na bazie ceramiki eliminuje szereg wad związanych ze współczesną techniką mikrodializy. Mikrodializa ma ograniczoną rozdzielczość czasową i przestrzenną w porównaniu z metodami amperometrycznymi, takimi jak MEA, które mogą w sposób ciągły rejestrować zdarzenia glutaminianu w wielu mikroskopijnych obszarach z częstotliwością do 10 Hz23. Ta szybka częstotliwość próbkowania eliminuje czynnik zakłócający w postaci zlokalizowanej dyfuzji neuroprzekaźników, który jest nieodłącznym elementem metod powolnego próbkowania, takich jak mikrodializa24. Ponadto MEA jest mniej inwazyjną metodą niż sonda mikrodializy, która może powodować znaczne glejozę podczas wprowadzania i może zmieniać aktywność neuroprzekaźników w miejscu wprowadzenia22.
Poprzednie badania wykorzystujące szereg modeli ssaków, technik pomiarowych i obszarów mózgu wykazały podstawowe poziomy glutaminianu porównywalne z tymi, które stwierdzono przy użyciu tej techniki. Sugeruje to, że technologia MEA, po dostosowaniu do modelu prosiąt, zapewnia prawidłowe zapisy stężenia glutaminianu in vivo (Tabela 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autor (rok)</td>
			<td>Technika nagrywania</td>
			<td>Model zwierzęcy</td>
			<td>Wiek</td>
			<td>Region(y) mózgu</td>
			<td>Średnie podstawowe stężenie glutaminianu (μM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hascup i in. (2008)23</td>
			<td>MEA (na bazie enzymów)</td>
			<td>Gryzoń</td>
			<td>20 - 24 tygodnie</td>
			<td>Kora przedczołowa, prążkowie</td>
			<td>3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hascup i in. (2010)25</td>
			<td>MEA (na bazie enzymów)</td>
			<td>Gryzoń</td>
			<td>3 - 6 miesięcy</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>4.7 - 10.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutherford i in. (2007)9</td>
			<td>MEA (na bazie enzymów)</td>
			<td>Gryzoń</td>
			<td>3 - 6 miesięcy</td>
			<td>Kora przedczołowa, prążkowie</td>
			<td>44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0.9 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miele i in. (1996)26</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Gryzoń</td>
			<td>-</td>
			<td>Prążkowiu</td>
			<td>3.6  ± 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day i in. (2006)27</td>
			<td>MEA (na bazie enzymów)</td>
			<td>Gryzoń</td>
			<td>3 - 6 miesięcy</td>
			<td>Kora czołowa, prążkowie</td>
			<td>1.6 ± 0.3 ; 1.4 ± 0.2 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quintero i in. (2007)28</td>
			<td>MEA (na bazie enzymów)</td>
			<td>Naczelny inny niż człowiek</td>
			<td>5,3 - 5,5 roku</td>
			<td>Kora przedruchowa, kora ruchowa</td>
			<td>3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0.9 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stephens i in. (2010)29</td>
			<td>MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)]</td>
			<td>Naczelny inny niż człowiek</td>
			<td>11 - 21 lat</td>
			<td>Skorupa</td>
			<td>8.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodama i in. (2002)30</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Naczelny inny niż człowiek</td>
			<td>-</td>
			<td>Kora przedczołowa</td>
			<td>1.29 - 2.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvan i in. (2003)31</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Naczelny inny niż człowiek</td>
			<td>Młodociany</td>
			<td>Prążkowiu</td>
			<td>28.74 ± 2.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podczas i Spencer (1993)32</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Ludzki</td>
			<td>18 - 35 lat</td>
			<td>Hippocampus</td>
			<td>20.3 ± 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinstrup et al. (2000)33</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Ludzki</td>
			<td>-</td>
			<td>Kora czołowa</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavus i in. (2005)34</td>
			<td>Mikrodializa (na bazie enzymów)</td>
			<td>Ludzki</td>
			<td>15 - 52 lata</td>
			<td>Kora nowa</td>
			<td>2.6 ± 0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Porównanie podstawowych zewnątrzkomórkowych poziomów glutaminianu w różnych modelach zwierzęcych. Wybrany przegląd badań ustalających prawidłowy zewnątrzkomórkowy poziom glutaminianu u zdrowych, obudzonych i znieczulonych zwierząt za pomocą mikrodializy lub mikroelektrod.
Zastosowanie technologii MEA do monitorowania stężeń glutaminianu in vivo w modelu prosiąt może pozwolić na przyszłą ocenę wyników neurologicznych prosiąt po znieczuleniu. Zaplanowano eksperymenty mające na celu przeżycie, które pozwolą lepiej zrozumieć długoterminowy wpływ znieczulenia na dobrostan neurokognitywny noworodków. Eksperymenty survivalowe pozwolą na testowanie behawioralne i monitorowanie zmian glutaminianu jeszcze długo po ekspozycji na znieczulenie. Często zdarza się również, że dzieci poddawane są znieczuleniu w warunkach, w których mogą odczuwać stres fizjologiczny w postaci interwencji chirurgicznej. Przyszłe badania dotyczące wpływu chirurgii na urazy neurologiczne i wzrost neurotoksyczności pozwoliłyby na dokładniejsze modelowanie powszechnego środowiska klinicznego dla dzieci. Możliwe jest również wykorzystanie alternatywnych modeli zwierzęcych, podobnie jak badanie tych różnych modeli poprzez przewlekłą implantację, co pozwala nam śledzić zmiany behawioralne związane z neurotoksycznością. Sama technologia MEA jest wszechstronna, więc przyszłe badania nie muszą ograniczać się do analizy poziomów glutaminianu (np. GABA, choliny, lizyny itp. można przeanalizować).

Każdego roku miliony dzieci są poddawane znieczuleniu zarówno inwazyjnym, jak i nieinwazyjnym zabiegom w Stanach Zjednoczonych1. Lekarze anestezjolodzy od lat zapewniają rodziców o bezpieczeństwie środków znieczulających, nawet u małych dzieci i noworodków. Jednak w 1999 roku odkryto, że przejściowe zablokowanie podtypu N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) receptorów glutaminianu we wczesnym okresie życia może powodować rozległą apoptozę neuronów u szczurów2. Niedawno FDA wydała komunikat dotyczący bezpieczeństwa leków, który będzie wymagał, aby etykiety leków znieczulających zawierały ostrzeżenie o znieczuleniu ogólnym i ich potencjalnym negatywnym wpływie na rozwijające się mózgi dzieci poniżej 3 roku życia (Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków, 2017). Nadal jednak istnieje potrzeba wyjaśnienia możliwych mechanizmów i potencjalnych środków neuroprotekcyjnych.
Normalna aktywność neuroprzekaźników, takich jak glutaminian i kwas gamma-aminomasłowy (GABA), jest niezbędna do prawidłowego rozwoju układu nerwowego. Chociaż większość szlaków zaangażowanych w AIN jest nadal nieuchwytna, jest bardzo prawdopodobne, że zaangażowane są systemy neuroprzekaźników, ponieważ wiadomo, że środki znieczulające modulują te szlaki w celu wytworzenia nieprzytomności. W szczególności pobudzający neuroprzekaźnik glutaminian powoduje ekscytotoksyczność, gdy jego aktywność jest rozregulowana. Ten neuroprzekaźnik jest zwykle zaangażowany w neurogenezę, plastyczność neuronalną, wzrost synaps i neuronów oraz szereg innych krytycznie ważnych funkcji mózgu. Jednak przedłużona aktywacja receptorów glutaminianu może powodować ekscytotoksyczność i apoptozę neuronów, szczególnie w warunkach stresowych, takich jak operacja, niedobór tlenu i zmniejszona dostępność energii3. Wykazano, że wiązanie glutaminianu z receptorem NMDA powoduje napływ Na+ i Cl−. Uważa się, że późniejsza depolaryzacja prowadzi do otwarcia kanału Ca2 + i uwolnienia wewnątrzkomórkowych magazynów Ca2 + 4. Ta dysfunkcja prawdopodobnie prowadzi do kaskady zaburzeń metabolicznych, które ostatecznie zmniejszają proliferację neuronów, zwiększają stan zapalny i prowadzą do śmierci neuronów. Pomimo tych hipotez, prawdziwy mechanizm (mechanizmy) AIN pozostaje niejasny5. Ze względu na swoją rolę w apoptozie, rozregulowanie glutaminianu stanowi nowy szlak, który może przyczyniać się do mechanizmu wcześniej udokumentowanej apoptozy neuronalnej, cechy AIN.
Jedną z przeszkód w badaniu procesów neuronalnych jest ich wysoka złożoność, szczególnie w kontekście rozwoju neuronów. Pierwsze miesiące życia to okres maksymalnej podatności na urazy, podczas którego zachodzi większość ważnych etapów rozwoju neuronów, takich jak fizjologiczna apoptoza (przycinanie neuronów), synaptogeneza, glejogeneza i mielinizacja6. Biorąc pod uwagę złożony charakter komunikacji neuronalnej i trudności w badaniu tych procesów bez zakłócania normalnej funkcji OUN, opracowano nowe technologie, które mają na celu wykrywanie i kwantyfikację in vivo ważnych elementów komunikacji neuronalnej.
Technologia MEA połączona z enzymem została wykorzystana w tym badaniu jako nowatorski sposób badania mechanizmów AIN w klinicznie istotnym modelu prosiąt. Technologia ta może być wykorzystywana do badania złożonych procesów elektrochemicznych w mózgu in vivo, w tym dysregulacji glutaminianu. Wbudowane 4-kanałowe platynowe miejsca zapisu MEA (2 miejsca wrażliwe na glutaminian i 2 miejsca wartownicze) umożliwiają samoodniesienie, co przyczynia się do dokładności wykrywania. Ponadto na każdą elektrodę nakładana jest warstwa wykluczająca, która nadaje selektywność, zapobiegając wykrywaniu innych cząsteczek zakłócających7. Co więcej, niskoprofilowa konstrukcja MEA pozwala na minimalne urazy tkanek w porównaniu z wcześniejszymi technologiami. Ta sama cecha nadaje MEA wyższą rozdzielczość przestrzenną, co ułatwia badanie mikroskopijnych obszarów w mózgu. Na przykład dyskretne obszary hipokampa (zakręt zębaty, CA1, CA2) mogą być specjalnie badane8. Szczegółowe informacje na temat funkcjonalności MEA zostały już wcześniej opisane9.
W porównaniu do elektrochemii MEA, mikrodializa zawiera membranę umieszczoną pomiędzy roztworem będącym przedmiotem zainteresowania a roztworem o podobnym składzie, co pozwala na wykrycie zmian w płynie pozakomórkowym10. Chociaż mikrodializa jest podstawą neurochemii i od dawna jest stosowana do wykrywania neuroprzekaźników, ma wadę w postaci niskiej rozdzielczości w czasie, opóźnionego wykrywania zmian glutaminianu i znacznego urazu tkanki11.
MEA mogą pośrednio wykrywać neuroprzekaźniki, takie jak glutaminian, acetylocholina i cholina, używając odpowiednich enzymów oksydazy, które wytwarzają elektroaktywne cząsteczki reporterowe, takie jakH2O2 lub O212,13.
Technologia MEA jest szeroko stosowana u szczurów i naczelnych do badania neurotoksyczności w kontekście procesów patofizjologicznych innych niż AIN7,14. Wśród niektórych z tych procesów patofizjologicznych, technologia MEA została wykorzystana do badania choroby Alzheimera, epilepsji, urazowego uszkodzenia mózgu oraz wpływu związków farmakologicznych na komunikację synaptyczną8,15,16,17. Chociaż MEA zostały wykorzystane do badania tych patologii u szczurów i naczelnych innych niż ludzie, wysokie podobieństwo rozwojowe między ludźmi a mózgami prosiąt sprawia, że adaptacja technologii MEA u prosiąt jest wysoce odpowiednią techniką do badania mechanizmu(ów) AIN18.

<table><tbody><tr><td>Advance Liqui-Wezjoner Preparat mlekozastępczy dla świń</td><td>PBS Animal Health</td><td>292-13</td><td></td></tr><tr><td>Maska stożkowa do znieczulenia prosiąt</td><td>VetEquip</td><td>921428</td><td></td></tr><tr><td>Integra SL Stacja robocza do anestezjologii</td><td>DRE Veterinary</td><td>2350</td><td>Ta stacja anestezjologiczna została wybrana tak, aby jak najlepiej naśladować monitorowanie kliniczne doświadczane przez pacjentów pediatrycznych na sali operacyjnej. Można użyć dowolnego urządzenia do znieczulenia, o ile pozwala na wystarczające monitorowanie fizjologiczne i interwencję.</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Ultane</td><td>0074-4456-04</td><td></td></tr><tr><td>Bromek rokuronium do wstrzykiwań</td><td>Hospira</td><td>0409-9558-05</td><td></td></tr><tr><td>Medfusion 4000 Wlew dożylny&nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax</td><td>Kopf</td><td></td><td>na zamówienie</td></tr><tr><td>Model 1541 Adapter dla prosiąt</td><td>Kopf</td><td></td><td>na zamówienie</td></tr><tr><td>Lampa punktowa na podczerwień</td><td>Amazon</td><td>B000HHQ94C</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger Koc tułowia</td><td>3M</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger</td><td>3M</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny Podkładka do przygotowania alkoholu</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej</td><td>Bard-Parker#</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel Händel</td><td></td> Nożyczki chirurgiczne <td>HAN-G4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>504615</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do komarów</td><td>Instrumenty chirurgiczne Sklar</td><td>17-1225</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki z gazy</td><td>Fisherbrand</td><td>22-246-069</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek Adson</td><td>Teleflex</td><td>181223</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 111 Frez do grawerowania</td><td>Amazon</td><td>Dremel 111</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Array</td><td>Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky</td><td></td><td>S2 4Ch MEA; wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Quanteon</td><td></td><td>2pA/mV</td></tr><tr><td>Drut, srebrny, PFA, .008" Goły, .0110" powlekany</td><td>A-M Systems</td><td>786500</td><td></td></tr><tr><td>Drobny mikromanipulator</td><td>Narishige Scientific Instrument Lab</td><td>MO-8</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

Każdego roku, miliony dzieci poddawane są znieczuleniu na wiele różnych zabiegów. Jednak badania zarówno na zwierzętach, jak i na ludziach poddały w wątpliwość bezpieczeństwo znieczulenia u dzieci, sugerując, że środki znieczulające są potencjalnie toksyczne dla mózgu w fazie rozwoju. Do tej pory żadne badania nie wyjaśniły skutecznie mechanizmu(ów), dzięki któremu znieczulenie może być neurotoksyczne. Badania na zwierzętach pozwalają na badanie takich mechanizmów, a nowonarodzone prosięta stanowią doskonały model do badania tych efektów ze względu na ich uderzające podobieństwa rozwojowe do ludzkiego mózgu.
Ten protokół dostosowuje wykorzystanie technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach (MEA) jako nowatorski sposób badania mechanizmu(ów) neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem (AIN). MEA umożliwiają monitorowanie aktywności neuroprzekaźników in vivo w czasie rzeczywistym i oferują wyjątkową rozdzielczość czasową i przestrzenną. Przypuszcza się, że neurotoksyczność znieczulenia jest częściowo spowodowana rozregulowaniem glutaminianu, a MEA oferują metodę pomiaru glutaminianu. Nowatorskie zastosowanie technologii MEA w modelu prosiąt stanowi wyjątkową okazję do zbadania AIN.

Niniejsze badanie typu proof-of-concept z wykorzystaniem ceramicznej technologii MEA opartej na enzymach w modelu prosięcia może dostarczyć wyjątkowych informacji na temat dynamiki glutaminianu leżącej u podstaw AIN. Badanie to dodatkowo wykazuje, że technologia MEA oparta na enzymach może zostać z sukcesem zaadaptowana w modelu prosięcia do pomiaru fizjologicznych i związanych z anestezją zmian w aktywności neurotransmiterów z wysoką czułością oraz wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Homeostaza fizjologiczna była utrzymywana przez cały czas trwania eksperymentów przy użyciu metod i standardów istotnych klinicznie, a u żadnego prosięcia nie wystąpiły objawy zaburzeń fizjologicznych.
Uzyskane dane wskazują na zdolność MEA do precyzyjnego i przestrzennego rozdzielania pomiarów neurotransmiterów w strukturach korowych i podkorowych mózgu. Zastosowanie aparatu stereotaktycznego umożliwia jednoznaczną identyfikację powierzchniowej struktury referencyjnej (bregma) w celu spójnego zlokalizowania obszaru zainteresowania, niezależnie od indywidualnych różnic w wielkości i anatomii prosięcia. Wyraźna wizualizacja szwów ułatwia powtarzalne regionalne umieszczenie MEA z dokładnością w zakresie mikrometrów (Rycina 4). Uzyskanie dostępu do powierzchni kory mózgowej jest minimalnie traumatyczne, z pomijalnym krwawieniem, co gwarantuje, że dynamika glutaminianu in vivo nie wynika z niezamierzonego uszkodzenia systemowego lub miejscowego (Rycina 5). Następnie sztywna, niestandardowa MEA jest ustawiana prostopadle do płaszczyzny czołowej prosięcia (Rycina 6). Brak prawidłowego ustawienia MEA przed wprowadzeniem może uniemożliwić dokładną przestrzenną rejestrację z docelowego obszaru, szczególnie w przypadku regionów podkorowych.
Pomiary poziomu glutaminianu in vivo w czasie rzeczywistym przeprowadzono w hipokampach 3-4-dniowych prosiąt (n = 4) w znieczuleniu sewofluranem w stężeniu 2,5-3% (około 1 MAC). Pomiary amperometryczne rejestrowano z częstotliwością 4 Hz i przeliczano na stężenie przy użyciu regresji liniowej opartej na parametrach kalibracyjnych (Rysunek 8, Panel A). Dla każdego punktu czasowego sygnały z dwóch miejsc wrażliwych na glutaminian uśredniano, a następnie odejmowano od nich uśredniony sygnał kontrolny (sentinel), aby uzyskać skorygowany sygnał glutaminianu. Pomiary ciągłe wygładzono za pomocą średniej kroczącej, aby lepiej zwizualizować ogólny trend w czasie (Rysunek 8, Panel B). Średnie podstawowe stężenie glutaminianu obliczono na 4,61 ± 0,02 µM i pozostawało ono stosunkowo stabilne w trakcie ekspozycji na środek znieczulający. Przejściową aktywność glutaminergiczną zidentyfikowano u jednego zwierzęcia poprzez analizę pików w sygnale, które nie były skorelowane z sygnałem kontrolnym (R2 &lt; 0,5) i przekraczały stosunek sygnału do szumu równy 3 (Rysunek 9, Panel A). W okresie 3,5 h wykryto łącznie 116 pików przejściowych (Rysunek 10, Panel A). Zaobserwowano, że amplituda wynikających z tego pików przejściowych mieściła się zazwyczaj w zakresie 1 µM (Rysunek 10, Panel B). W celu ilościowego określenia czasu trwania każdego zjawiska przejściowego wyznaczono czas (t80) potrzebny do spadku każdej maksymalnej wartości piku o 80% (Rysunek 9, Panel B). Średni t80 wszystkich zjawisk przejściowych glutaminianu podczas 3,5 h okresu rejestracji wynosił 4,68 ± 0,82 s (Rysunek 10, Panel C). Dane te wykazują, że możliwe jest dokładne pomiar zarówno przedłużonej, jak i przejściowej aktywności neuroprzekaźników w regionie podkorowym mózgu znieczulonego prosięcia.
<img alt="Schemat sondy do rejestracji aktywności neuronów; trzpienie elastyczne i sztywne z miejscami rejestracji do elektrofizjologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Porównanie wizualne typów matryc mikroelektrod SG-2. Matryce SG-2 zawierają dwa miejsca wrażliwe na glutaminian oraz dwa miejsca strażnicze niewrażliwe na glutaminian (150 µm x 20 µm na miejsce).(A) Po lewej stronie przedstawiono matrycę mikroelektrod z elastycznym trzpieniem. Matryca mikroelektrod z sztywnym trzpieniem została zaprojektowana specjalnie do użytku u prosiąt i umożliwia głębszą implantację u dużych zwierząt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat cyklu przygotowania MEA: powlekanie, utwardzanie, galwanizacja, kalibracja do analizy enzymatycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przegląd procesu przygotowania i kalibracji macierzy mikroelektrodowej (MEA). Całość przygotowania i kalibracji MEA trwa około jednego tygodnia. Enzym do powlekania, warstwa wykluczająca oraz anality do kalibracji są specyficzne dla badanego neuroprzekaźnika. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna u prosięcia w badaniach medycznych na zwierzętach, przedstawiająca ustawienie eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Umieszczenie prosięcia w aparacie stereotaksycznym. Pysk prosięcia zostaje oparty na pręcie do pyska bezpośrednio za kłami. Penetracyjne pręty uszne są wprowadzane do kanałów słuchowych, aby unieruchomić tylną część czaszki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Szywy czaszkowe prosięcia oznaczone w procedurze chirurgicznej; schemat do badań anatomicznych i szkolenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Umieszczenie prosięcia w aparacie stereotaktycznym do kraniotomii. (A) Głowa prosięcia jest ściśle zabezpieczona w niestandardowej ramie stereotaktycznej, co zapewnia spójne umiejscowienie MEA. Widoczne jest równoodległe umiejscowienie penetrujących prętów usznych. (B) Przednio-tylne nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy. Unikano nacinania czaszki, aby uwidocznić szwy czołowe i strzałkowe oraz zoptymalizować wizualizację bregma. Pasek skali wskazuje względną wielkość nacięcia i lokalizację okna kraniotomii. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces regeneracji chirurgicznego ubytku kostnego w serii modeli zwierzęcych, pokazujący etapy zamykania rany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Kraniotomia w celu uzyskania dostępu do hipokampa. (A) Dalsze odwarstwienie skóry głowy w celu odsłonięcia przybliżonej lokalizacji wprowadzenia MEA zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi. Zakreślony obszar został zaznaczony (czarna kropka), aby pokierować kraniotomią. (B) Okno kraniotomii (0,25 cm2) z usuniętym płatem czaszki w celu odsłonięcia leżącej pod nim opony twardej. (C) Ostrożne usunięcie opon mózgowych w celu odsłonięcia powierzchownej kory mózgowej bez urazu tkanki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający rozmieszczenie elektrod i sprzęt do badania nerwów czaszkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Pozycjonowanie i wprowadzanie MEA do hipokampa. (A) Umieszczenie MEA w punkcie bregma w celu określenia względnej lokalizacji stereotaksycznej hipokampa. (B) Stereotaksyczne umieszczenie MEA na powierzchni mózgu w celu określenia głębokości wprowadzenia do hipokampa. Srebrna pseudo-elektroda referencyjna bezpiecznie umieszczona pod skórą głowy (wskazana strzałką). (C) MEA wprowadzona na odpowiednią głębokość w celu uzyskania pomiarów zewnątrzkomórkowego glutaminianu w hipokampie w czasie rzeczywistym, in vivo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres spadku stężenia glutaminianu; skala logarytmiczna; analiza danych z zakresu neuronauki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Zachowanie MEA podczas 30-minutowego okresu ustalania linii bazowej. Początkowy gwałtowny wzrost odpowiada wprowadzaniu MEA do hipokampa za pomocą mikromanipulatora. Okres bazowy rozpoczyna się w momencie osiągnięcia przez MEA odpowiedniej głębokości (linia przerywana). Pomiary pozakomórkowego glutaminianu będą spadać w ciągu 30 min i nie powinny być interpretowane jako odczyty fizjologiczne. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres stężenia glutaminianu w czasie; analiza danych eksperymentalnych; poziomy μM; porównania A i B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Pomiary stężenia glutaminianu zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym w hipokampie noworodka świni pod wpływem anestezji sewofluranem. (A) Średnia krocząca stężenia glutaminianu w hipokampie jednego noworodka świni pod wpływem anestezji sewofluranem (z wykorzystaniem 10 punktów danych). Pomiary były wykonywane z częstotliwością 4Hz przez 3 h po krótkim, 30-minutowym okresie bazowym. (B) Wygładzenie pomiarów glutaminianu przy użyciu średniej kroczącej ze 100 punktów co 15 min w celu lepszej wizualizacji trendu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres stężenia glutaminianu w funkcji czasu, przedstawiający zmienność danych i analizę szczytów, wykres eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Identyfikacja przejściowej aktywności glutaminianu w hipokampie noworodka świni podczas znieczulenia sewofluranem. (A) Przejściowe szczyty glutaminianu (zaznaczone na czerwono) wskazano na zapisie stężenia glutaminianu w czasie rzeczywistym. Szczyty uznano za istotne, gdy stosunek sygnału do szumu przekraczał 3, a ich sygnał nie był skorelowany z sygnałem kontrolnym (R2 &lt; 0,5). (B) Reprezentatywny szczyt przejściowy zidentyfikowany na Rycynie 9, Panel A. Linie przerywane wskazują całkowity czas wymagany do spadku szczytu o 80%. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy glutaminianu; piki, amplituda i dane dotyczące średniego czasu w ciągu 3,5 godziny; wykresy słupkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Charakterystyka przejściowych zmian stężenia glutaminianu w hipokampie noworodka świni pod narkozą sewofluranem. (A) Liczba przejściowych pików glutaminianu w 15-minutowych odstępach czasu. Piki uznano za istotne, gdy stosunek sygnału do szumu przekroczył 3, a ich sygnał nie był skorelowany z sygnałem referencyjnym (R2 &lt; 0,5). (B) Amplituda przejściowych pików glutaminianu. Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. (C) Średni T80 przejściowych pików glutaminianu. Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

To badanie bada nowatorskie zastosowanie technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach (MEA) do monitorowania in vivo aktywności neuroprzekaźników u prosiąt.Postawiono hipotezę, że rozregulowanie glutaminianu przyczynia się do mechanizmu neurotoksyczności znieczulającej. W tym miejscu przedstawiamy protokół adaptacji technologii MEA do badania mechanizmu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.

Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Every year, millions of children undergo anesthesia for a multitude of procedures. However, studies in both animals and humans have called into question ...

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest wykorzystanie nowatorskiego zastosowania technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach do pomiaru neuroprzekaźników u nowonarodzonych prosiąt. W tym przykładzie aktywność glutaminianu in vivo jest badana w celu zbadania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona mierzyć aktywność neuroprzekaźników in vivo z wyjątkową rozdzielczością przestrzenną i czasową w klinicznie istotnym zwierzęcym modelu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanizmy neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem, może być również stosowana do innych stanów patologicznych, takich jak uraz mózgu u dzieci, padaczka i udar. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ korzystanie z modelu prosiąt wymaga doświadczenia i praktyki w wdrażaniu. Ponadto korzystanie z układów mikroelektrod wymaga specjalistycznego zestawu umiejętności.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy chirurgiczne i umieszczania mikroelektrod są trudne do nauczenia się ze względu na ich delikatną naturę. W tym eksperymencie użyj prosiąt w szczytowym okresie wzrostu mózgu, kiedy mają od trzech do pięciu dni. Pozwól im się zaaklimatyzować przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.Przeszkolony personel musi opiekować się prosiętami. Powinny mieć zapewniony doraźny dostęp do pożywienia, i niektórych zabawek na bodźce. Co najmniej trzy godziny przed znieczuleniem wyjmij preparat mlekozastępczy z klatki, aby upewnić się, że żołądek prosiąt jest pusty.Postępuj zgodnie z wytycznymi ARRIVE, aby wyeliminować wszelkie potencjalne czynniki zakłócające związane z płcią. Następnie na stanowisku anestezjologicznym wyposażonym w respirator pediatryczny i odpowiednie urządzenia monitorujące, zaintubuj i mechanicznie przewietrz prosię. Następnie podaj znieczulenie sewofluranem w 1 MAC przez 3,5 godziny znieczulenia.Teraz użyj szczypania palca, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia, a następnie przymocuj prosię do ramy stereotaktycznej specyficznej dla prosiąt, która ma odpowiednią wyściółkę. Umieść zęby szczęki nad listwą zębatą. Następnie zamocuj i dokręć dwie penetrujące nauszniki z prosięciem wyśrodkowanym na linii środkowej.Włóż nauszniki wystarczająco mocno, aby usłyszeć pękanie błon bębenkowych. Rozpocznij dawkę nasycającą rokuronium i napar, aby zapobiec ruchom, gdy prosię jest zabezpieczone w ramie. Ważne jest, aby prosię było ciepłe i aby monitorowane były jego parametry życiowe.Użyj lampy grzewczej i/lub koca, aby utrzymać normalną termię. Upewnij się, że lampa grzewcza nie jest tak blisko, że się pali. Jeśli pożądane jest przeżycie prosiąt, należy podjąć dodatkowe przygotowania, aby utrzymać sterylność pola operacyjnego.Teraz przystąp do implantacji układu mikroelektrod. Na początek utwórz od czterech do sześciu centymetrów nacięcie w linii środkowej wzdłuż czaszki, zachowując ostrożność, aby uniknąć nacięcia czaszki skalpelem. Po wykonaniu nacięcia użyj delikatnego wycofania i rozwarstwienia, aby podnieść skórę głowy od czaszki.Następnie delikatnie wyszoruj czaszkę gazikiem, aby usunąć tkankę łączną i odsłonić linie szwów. Następnie określ zamierzone miejsce kraniotomii. Jeśli obszar zainteresowania pozostaje zasłonięty, dodatkowo odbij skórę głowy.Teraz użyj wiertła chirurgicznego, aby stworzyć okno kraniotomii, które ma około 0,25 centymetra kwadratowego pokrywającego interesującą Cię strukturę. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej ani leżącego pod nią mózgu. W razie potrzeby użyj drobnych narzędzi chirurgicznych, aby wyciąć oponę twardą pokrywającą tkankę mózgową.Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. W tym eksperymencie wykorzystano wcześniej opisany układ mikroelektrod na bazie enzymów, wstępnie pokryty oksydazą glutaminianu i galwanicznie pokryty mPD. Układy mikroelektrod mają sztywny trzon o średnicy 40 milimetrów, dostosowany do stosowania z prosiętami.Przymocuj metalowe ramię do mikromanipulatora, a następnie ustaw układ mikroelektrod tak pionowo, jak to możliwe nad bregmą. Następnie ostrożnie opuść tablicę tak nisko, jak to możliwe, nie dotykając powierzchni czaszki, zwracając uwagę na współrzędne bregmy. Teraz użyj atlasu mózgu prosiąt, aby określić dokładne współrzędne stereotaktyczne interesującej nas struktury, a następnie odpowiednio przestaw mikroelektrodę.Następnie umieść elektrodę pseudoreferencyjna pod skórą głowy, zapewniając kontakt ze zwierzęciem. Teraz powoli opuść układ mikroelektrod do mózgu na prawie odpowiednią głębokość. Na ostatnich dwóch milimetrach skoku użyj mikronapędu hydraulicznego, aby delikatnie opuścić matrycę do struktury będącej przedmiotem zainteresowania przy minimalnym uszkodzeniu tkanki.Po ustawieniu układu mikroelektrod odczekaj 30 minut, aby elektrody osiągnęły linię bazową. Następnie wykonuj pomiary przez około trzy godziny. Jeśli prosię ma przeżyć eksperyment, zamknij nacięcie po zebraniu danych.Pomiary glutaminianu in vivo w czasie rzeczywistym wykonano w hipokampach trzy- do czterodniowych prosiąt w znieczuleniu sewofluranem, zgodnie z opisem. Sesje nagraniowe trwały ponad trzy godziny. Pomiary amperometryczne rejestrowano z częstotliwością 4 Hz i przekształcano na stężenie za pomocą regresji liniowej opartej na parametrach kalibracyjnych.Dla każdego punktu czasowego sygnały z dwóch miejsc wrażliwych na glutaminian zostały uśrednione przed odjęciem uśrednionego sygnału wartowniczego, aby uzyskać skorygowany sygnał glutaminianu. Średnie podstawowe stężenie glutaminianu wynosiło około 4,6 mikromoli i pozostawało względnie stabilne w trakcie ekspozycji na środek znieczulający. Przejściową aktywność glutaminergiczną zidentyfikowano, analizując piki w sygnale, które nie były skorelowane z sygnałem wartowniczym i miały stosunek sygnału do szumu większy niż trzy.W okresie eksperymentalnym wykryto łącznie 116 przejściowych pików. Na ogół obserwowano, że amplituda powstałych przejściowych pików mieści się w zakresie 1 mikromola. W celu ilościowego określenia czasu trwania każdego stanu nieustalonego uzyskano czas wymagany do spadku każdej maksymalnej wartości szczytowej o 80% i stwierdzono, że wynosi on około 4 do 5,5 sekundy.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli jest ona metodycznie i starannie wykonana. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu wszelkich niezamierzonych uszkodzeń tkanek, które mogą zakłócić dane eksperymentalne. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak pomiar innych analitów elektrochemicznych, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.

adaptation-microelectrode-array-technology-for-study-anesthesia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje pomiar poziomu glutaminianu w mózgu znieczulonego noworodka prosiąt za pomocą układu mikroelektrod (MEA). Procedura polega na stworzeniu okienka kraniotomii w czaszce świni i wprowadzeniu MEA do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Pokryte oksydazą glutaminianu miejsca zapisu MEA przekształcają zewnątrzkomórkowy glutaminian mózgu w nadtlenek wodoru, który generuje mierzalny prąd. Prąd ten jest mierzony i normalizowany na tle szumu tła w celu określenia...

Pomiar poziomu glutaminianu w mózgu w znieczuleniu u nowonarodzonych prosiąt za pomocą układu mikroelektrod

Ten film demonstruje wszczepienie miękkiego zestawu elektrokortykograficznego i długoterminowe zapisy korowe u miniświnki. Przedstawiono w nim etapy związane z chirurgicznym wszczepieniem macierzy w korze słuchowej świnki miniaturowej i rejestrowaniem potencjałów czynnościowych neuronów wywołanych zarówno bodźcem podstawowym, jak i dźwiękowym.

Implantacja podtwardówkowa miękkiej matrycy elektrokortykograficznej do rejestracji elektrofizjologii kory mózgowej u świnek miniaturowych

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Wykorzystanie modelu prosiąt do badania neurotoksyczności rozwojowej wywołanej znieczuleniem (AIDN): podejście neurologiczne translacyjne

Celem tego artykułu i filmu instruktażowego jest opisanie jak odsłonić i usunąć pośmiertny mózg świni i przysadkę mózgową w stanie nienaruszonym, nadającym się do późniejszej analizy makroskopowej i histologicznej.

Ekspozycja OUN świni do analizy histologicznej: podręcznik dekapitacji, otwierania czaszki i usuwania mózgu

Tutaj prezentujemy protokół do rejestrowania telemetrycznych elektroencefalogramów (EEG) od swobodnie poruszających się prosiąt bezpośrednio w kojcu bez użycia środka uspokajającego, umożliwiając rejestrowanie typowych wzorców EEG podczas snu non-REM, takich jak pęknięcia wrzeciona.

Nieinwazyjne zapisy EEG od swobodnie poruszających się prosiąt

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

Poznaj technologię matryc mikroelektrod do pomiaru aktywności glutaminianu w mózgu prosiąt podczas znieczulenia. Ta metoda pozwala badać neurotoksyczność z wyjątkową rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Przeglądaj więcej filmów