Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest wykorzystanie nowatorskiego zastosowania technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach do pomiaru neuroprzekaźników u nowonarodzonych prosiąt. W tym przykładzie aktywność glutaminianu in vivo jest badana w celu zbadania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona mierzyć aktywność neuroprzekaźników in vivo z wyjątkową rozdzielczością przestrzenną i czasową w klinicznie istotnym zwierzęcym modelu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanizmy neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem, może być również stosowana do innych stanów patologicznych, takich jak uraz mózgu u dzieci, padaczka i udar. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ korzystanie z modelu prosiąt wymaga doświadczenia i praktyki w wdrażaniu. Ponadto korzystanie z układów mikroelektrod wymaga specjalistycznego zestawu umiejętności.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy chirurgiczne i umieszczania mikroelektrod są trudne do nauczenia się ze względu na ich delikatną naturę. W tym eksperymencie użyj prosiąt w szczytowym okresie wzrostu mózgu, kiedy mają od trzech do pięciu dni. Pozwól im się zaaklimatyzować przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.

Przeszkolony personel musi opiekować się prosiętami. Powinny mieć zapewniony doraźny dostęp do pożywienia, i niektórych zabawek na bodźce. Co najmniej trzy godziny przed znieczuleniem wyjmij preparat mlekozastępczy z klatki, aby upewnić się, że żołądek prosiąt jest pusty.

Postępuj zgodnie z wytycznymi ARRIVE, aby wyeliminować wszelkie potencjalne czynniki zakłócające związane z płcią. Następnie na stanowisku anestezjologicznym wyposażonym w respirator pediatryczny i odpowiednie urządzenia monitorujące, zaintubuj i mechanicznie przewietrz prosię. Następnie podaj znieczulenie sewofluranem w 1 MAC przez 3,5 godziny znieczulenia.

Teraz użyj szczypania palca, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia, a następnie przymocuj prosię do ramy stereotaktycznej specyficznej dla prosiąt, która ma odpowiednią wyściółkę. Umieść zęby szczęki nad listwą zębatą. Następnie zamocuj i dokręć dwie penetrujące nauszniki z prosięciem wyśrodkowanym na linii środkowej.

Włóż nauszniki wystarczająco mocno, aby usłyszeć pękanie błon bębenkowych. Rozpocznij dawkę nasycającą rokuronium i napar, aby zapobiec ruchom, gdy prosię jest zabezpieczone w ramie. Ważne jest, aby prosię było ciepłe i aby monitorowane były jego parametry życiowe

Użyj lampy grzewczej i/lub koca, aby utrzymać normalną termię. Upewnij się, że lampa grzewcza nie jest tak blisko, że się pali. Jeśli pożądane jest przeżycie prosiąt, należy podjąć dodatkowe przygotowania, aby utrzymać sterylność pola operacyjnego.

Teraz przystąp do implantacji układu mikroelektrod. Na początek utwórz od czterech do sześciu centymetrów nacięcie w linii środkowej wzdłuż czaszki, zachowując ostrożność, aby uniknąć nacięcia czaszki skalpelem. Po wykonaniu nacięcia użyj delikatnego wycofania i rozwarstwienia, aby podnieść skórę głowy od czaszki.

Następnie delikatnie wyszoruj czaszkę gazikiem, aby usunąć tkankę łączną i odsłonić linie szwów. Następnie określ zamierzone miejsce kraniotomii. Jeśli obszar zainteresowania pozostaje zasłonięty, dodatkowo odbij skórę głowy.

Teraz użyj wiertła chirurgicznego, aby stworzyć okno kraniotomii, które ma około 0,25 centymetra kwadratowego pokrywającego interesującą Cię strukturę. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej ani leżącego pod nią mózgu. W razie potrzeby użyj drobnych narzędzi chirurgicznych, aby wyciąć oponę twardą pokrywającą tkankę mózgową.

Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. W tym eksperymencie wykorzystano wcześniej opisany układ mikroelektrod na bazie enzymów, wstępnie pokryty oksydazą glutaminianu i galwanicznie pokryty mPD. Układy mikroelektrod mają sztywny trzon o średnicy 40 milimetrów, dostosowany do stosowania z prosiętami.

Przymocuj metalowe ramię do mikromanipulatora, a następnie ustaw układ mikroelektrod tak pionowo, jak to możliwe nad bregmą. Następnie ostrożnie opuść tablicę tak nisko, jak to możliwe, nie dotykając powierzchni czaszki, zwracając uwagę na współrzędne bregmy. Teraz użyj atlasu mózgu prosiąt, aby określić dokładne współrzędne stereotaktyczne interesującej nas struktury, a następnie odpowiednio przestaw mikroelektrodę.

Następnie umieść elektrodę pseudoreferencyjna pod skórą głowy, zapewniając kontakt ze zwierzęciem. Teraz powoli opuść układ mikroelektrod do mózgu na prawie odpowiednią głębokość. Na ostatnich dwóch milimetrach skoku użyj mikronapędu hydraulicznego, aby delikatnie opuścić matrycę do struktury będącej przedmiotem zainteresowania przy minimalnym uszkodzeniu tkanki.

Po ustawieniu układu mikroelektrod odczekaj 30 minut, aby elektrody osiągnęły linię bazową. Następnie wykonuj pomiary przez około trzy godziny. Jeśli prosię ma przeżyć eksperyment, zamknij nacięcie po zebraniu danych.

Pomiary glutaminianu in vivo w czasie rzeczywistym wykonano w hipokampach trzy- do czterodniowych prosiąt w znieczuleniu sewofluranem, zgodnie z opisem. Sesje nagraniowe trwały ponad trzy godziny. Pomiary amperometryczne rejestrowano z częstotliwością 4 Hz i przekształcano na stężenie za pomocą regresji liniowej opartej na parametrach kalibracyjnych.

Dla każdego punktu czasowego sygnały z dwóch miejsc wrażliwych na glutaminian zostały uśrednione przed odjęciem uśrednionego sygnału wartowniczego, aby uzyskać skorygowany sygnał glutaminianu. Średnie podstawowe stężenie glutaminianu wynosiło około 4,6 mikromoli i pozostawało względnie stabilne w trakcie ekspozycji na środek znieczulający. Przejściową aktywność glutaminergiczną zidentyfikowano, analizując piki w sygnale, które nie były skorelowane z sygnałem wartowniczym i miały stosunek sygnału do szumu większy niż trzy.

W okresie eksperymentalnym wykryto łącznie 116 przejściowych pików. Na ogół obserwowano, że amplituda powstałych przejściowych pików mieści się w zakresie 1 mikromola. W celu ilościowego określenia czasu trwania każdego stanu nieustalonego uzyskano czas wymagany do spadku każdej maksymalnej wartości szczytowej o 80% i stwierdzono, że wynosi on około 4 do 5,5 sekundy.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli jest ona metodycznie i starannie wykonana. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu wszelkich niezamierzonych uszkodzeń tkanek, które mogą zakłócić dane eksperymentalne. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak pomiar innych analitów elektrochemicznych, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.