Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Metoda ta może więc pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w procesie odkrywania leków dotyczące tego, jak dany lek zachowuje się w żywym organizmie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybkie i skuteczne przesiewanie dużych rozmiarów próbek. Technika ta już teraz ma duży wpływ na odkrywanie leków, umożliwiając bardzo jakościową ocenę skutków potencjalnych leków.

Metoda ta dostarcza nowatorskich informacji mechanistycznych na temat początku i progresji chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem. Co więcej, metoda ta może być również stosowana do innych systemów, takich jak starzenie się i badania genetyczne. Jesteśmy bardzo podekscytowani możliwością wprowadzenia nowych metod fizycznych do przestrzeni odkrywania leków.

Te demonstracje tej metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ etapy badań przesiewowych wymagają dużej znajomości tej nowej techniki automatycznej. Procedurę zademonstruje Sam Casford, asystent poszukiwawczy z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury dodać 2,2 milileta każdego związku leczniczego w odpowiednim stężeniu do sześciu płytek 5-fluorodeoksyurydyny lub FUDR na szczep robaka, ostrożnie rozprowadzając związek na całej powierzchni płytki i wysuszyć płytki w sterylnych warunkach.

Podczas suszenia płytek użyj 15 mililitrów buforu M9, aby umyć robaki z pięciu bogatych płytek czynnika wzrostu nicieni i przenieś uwolnione robaki do stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić nicienie w trzech mililitrach świeżego buforu M9 w celu ilościowego określenia liczby robaków w stadium larwalnym L4 i wysiać 700 larw L4 na każdą z sześciu suchych płytek FUDR na szczep robaka, na związek. Kiedy wszystkie nicienie zostaną wysiane, umieść płytki zawierające szczepy, u których indukowany jest parliz, podnosząc temperaturę do 24 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Następnego dnia włącz światła sceniczne równoległego trackera ślimakowego i wyczyść szklany stolik trackera 70-procentowym etanolem. Jeśli nie pozostały żadne widoczne pozostałości, zdejmij pokrywę obiektywu i użyj miotełki do kurzu, aby wyczyścić soczewkę obrazową. Upewnij się, że aparat jest prawidłowo podłączony i zainstalowany, a następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.

Dostosuj ustawienia kamery, aby nagrywać 20 klatek na sekundę z odpowiednimi parametrami nagrywania mono-16. Użyj pustej, dziewięciocentymetrowej szalki Petriego, aby upewnić się, że stolik jest ustawiony na odpowiednią wysokość i w razie potrzeby wyreguluj stolik. W sterylnych warunkach dodać trzy mililitry roztworu M9 do płytki przesiewowej ruchliwości i użyć dwóch mililitrów roztworu M9 do przemycia jednej trzeciej powierzchni dwóch płytek FUDR załadowanych nicieniami z tej samej grupy eksperymentalnej do płytki przesiewowej.

Następnie umieść płytkę sitową na stoliku trackera. Użyj pojedynczego robaka, aby ustawić ostrość kamery i zacznij nagrywać zwierzęta. Po zakończeniu zapisu należy wyrzucić płytkę ruchliwości i oznaczyć płytki FUDR jako użyte jednorazowo przed powrotem do inkubatora.

Aby przeanalizować dane wideo, otwórz graficzny interfejs użytkownika oprogramowania do analizy danych równoległego śledzenia robaków i użyj funkcji przeglądania, aby załadować interesujące Cię wideo. Wybierz wyjściowy folder docelowy i upewnij się, że ustawiono od 600 do 1200 klatek na 30-sekundową analizę. Wstaw współczynnik konwersji 0,029 piksela na milimetr do obrazowania dziewięciocentymetrowej szalki Petriego w pełnej rozdzielczości i wybierz algorytm śledzenia martwych.

Na karcie parametrów lokalizacyjnych ustaw obrazy użycia Z na 100, dopełnienie Z na 3, standardowe piksele na 54, próg na 9, otwarcie na 1 i zamknięcie na 2. Dostosuj parametry filtrowania do minimalnego rozmiaru 20, maksymalnego rozmiaru 180 i robaka takiego jak 0,94. Ustaw parametry trajektorii formowania na maksymalną odległość ruchu 10, minimalną długość 150 i pamięć 10.

Ustaw parametry zagięć i prędkości na próg zgięcia równy 1,8, minimalną liczbę zagięć na 0 oraz ramki, aby oszacować prędkość na 150. Dostosuj statystyki martwego robaka do maksymalnej liczby uderzeń na minutę wynoszącej 5 i maksymalnej prędkości 1. Wybierz folder wyjściowy i wybierz liczbę ramek wyjściowych na 50 oraz rozmiar czcionki na 10.

Użyj funkcji example, aby przetestować parametry i wyświetlić przykładowe obrazy, aby sprawdzić, czy robaki są widoczne w ośmiu krokach progowania. Następnie uruchom funkcję "Start Job" i połącz poszczególne wyniki dla całego zestawu danych, aby przeanalizować pliki z wynikami testu, zapisując wyniki za pomocą funkcji eksportu do TSV. Metoda ta pozwala na scharakteryzowanie fenotypów nicieni w badaniach populacyjnych różnych robakowych modeli chorób neurodegeneracyjnych, takich jak otępienie czołowo-skroniowe, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i stwardnienie zanikowe boczne.

A także charakterystyka efektów potencjalnych cząsteczek terapeutycznych, przy użyciu robakowych modeli choroby Parkinsona i Alzheimera. Wysoką dokładność tych pomiarów osiąga się poprzez zwiększenie liczby robaków, które można analizować w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zminimalizowaniu czasu między dodaniem robaków do ruchliwości a rozpoczęciem śledzenia.

Po tej procedurze można zastosować inne metody w celu uzupełnienia wyników i powiązania z agregacją białek. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami neurodegeneracyjnymi i chorobami nieprawidłowego fałdowania, takimi jak choroba Parkinsona i Alzheimera, do zbadania odpowiednich zastosowań odkrywczych. Nie zapominaj, że praca z FUDR może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic nitrylowych, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.