Name: Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę behawioralną dużych populacji Caenorhabditis elegans przy użyciu platformy WF-NTP. Ta metoda umożliwia szybkie badanie efektów leków na modele chorób neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Centrum Chorób Nieprawidłowego Fałdowania (CMD). FAA jest wspierana przez stypendium Senior Research Fellowship przyznawane przez Alzheimer's Society w Wielkiej Brytanii (grant numer 317, AS-SF-16-003). Szczepy C. elegans uzyskano z Centrum Genetycznego Caenorhabditis elegans (CGC).

1. Przygotowanie materiałów do protokołów C. elegans 
<ol>
	<li>Aby przygotować 10 x roztwór buforowy M9, dodaj 30 g jednozasadowego fosforanu potasu, 60 g dwuzasadowego fosforanu sodu i 50 g chlorku sodu do butelki o pojemności 1 l.
	<ol>
		<li>Dodać 1 l oczyszczonej wody i sterylizować w autoklawie w temperaturze ok. 121 °C przez 15 min.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 razy w oczyszczonej wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze ok. 121 °C przez 15 min.</li>
		<li>Po schłodzeniu dodać 1 ml roztworu 1 M siarczanu magnezu. 
		UWAGA: W poniższych krokach należy używać tylko 1x M9 (M9) do obsługi ślimaków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę hodowlaną nicieni (Rich-NGM), wymieszaj 2,7 g chlorku sodu, 15,75 g agaru, 5,75 g kazeiny, 900 ml oczyszczonej wody i autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
	<ol>
		<li>Przenieść pożywkę Rich-NGM do pieca grzewczego (ok. 70 °C), jeśli nie zostanie natychmiast użyta; pożywkę Rich-NGM można utrzymywać w stanie stopionym w temperaturze ok. 70 °C przez maksymalnie 12 godzin, zanim stanie się bezużyteczna.</li>
		<li>Do mieszaniny Rich-NGM dodać 900 μl roztworu 1 M chlorku wapnia, 900 μl roztworu 1 M siarczanu magnezu i 900 μl roztworu 5 mg/ml cholesterolu w absolutnym etanolu. 
		nuta: Cholesterol nie wymaga autoklawowania przed użyciem.</li>
		<li>Aby przygotować płytki doświadczalne, które utrzymują populację synchroniczną pod względem wieku, dodaj 92 μl 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR) w 812 μM do 900 ml Rich-NGM. 
		nuta: FUDR jest zarówno toksyczny, jak i rakotwórczy, dlatego oprócz fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych konieczne jest noszenie rękawic nitrylowych. Nie pozwól, aby odpady dostały się do ogólnego strumienia odpadów i zostały usunięte przez spalenie z.</li>
		<li>Wlej 20 ml autoklawizowanego Rich-NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę wzrostową (płytkę Rich-NGM). Wlać 15 ml autoklawizowanego Rich-NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę do pomiaru ruchliwości (płytkę Mot ). Wlej 20 ml Rich-NGM z FUDR do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę FUDR. 
		nuta: Mała objętość agaru na płytce Mot ułatwia ustawianie ostrości przez kamerę i śledzenie robaków (patrz krok 3.2.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować szczep OP50 Escherichia coli, autoklawizując 1 l bulionu LB w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a po schłodzeniu zaszczepić kulturą starterową.
	<ol>
		<li>Pozostawić kulturę bakteryjną do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i wysterylizować probówkę, która ma być użyta do odwirowania.</li>
		<li>Przenieść bakterie do sterylnych probówek i odwirować przy 4 600 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i za pomocą sterylnej wody zawiesić w 10% pierwotnej objętości, aby uzyskać 10-krotny (10-krotny koncentrat) zapas OP50.</li>
		<li>Rozcieńczyć 15 ml 10x OP50 do 150 mL, aby wytworzyć 1x OP50, używając sterylnej wody, przed użyciem do wysiewu płytek Rich-NGM. Użyj pozostałego 10x roztworu do wysiewu płytek FUDR. 
		nuta: Płytki Mot pozostaną niezasiewane i będą używane tylko na etapie pozyskiwania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wysiać płytki z bakteriami, należy posegregować płytki Rich-NGM i FUDR.
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach dodaj 350 μL 1x OP50 do płytek Rich-NGM i równomiernie rozprowadź. 
		nuta: Nie rozprzestrzeniaj się na krawędź talerza, ponieważ robaki będą pełzać po bokach talerza i umierać.</li>
		<li>W sterylnych warunkach dodać 350 μL 10x OP50 do płytek FUDR i równomiernie rozprowadzić.</li>
		<li>Pozostawić płytki do wyschnięcia i inkubować w temperaturze 20 °C przez 2 dni przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie C. elegans do użycia z WF-NTP
<ol>
	<li>Utrzymuj C. elegans na płytkach Rich-NGM lub przenosząc niewielką ilość robaków zawierających agar twarzą w dół na świeżą warstwę bakteryjną. Utrzymuj szczepy C. elegans w ten sposób przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych.</li>
	<li>Stosując technikę przenoszenia (patrz krok 2.1), wysiać 20 płytek każdego szczepu za pomocą dobrze odżywionych, mieszanych robaków i pozostawić je do wzrostu przez 2 dni w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zmyć 5 płytek zawierających robaki za pomocą 15 ml M9 i zebrać w jednej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz te czynności dla wszystkich 20 płytek każdego szczepu.</li>
	<li>Odwirować robaki przy 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 2 ml roztworu M9.</li>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu wybielającego, mieszając 13% podchlorynu sodu i 4 M wodorotlenku sodu w stosunku 3:2 obj./obj. 
	nuta: To rozwiązanie nie wymaga autoklawowania. Zarówno składniki, jak i powstały roztwór są i należy obchodzić się z nimi ostrożnie w rękawicach nitrylowych. Wodorotlenek sodu jest lekko dla szkła i powinien być przechowywany w plastikowych pojemnikach.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu wybielającego do każdej probówki wirówkowej i energicznie wstrząsać przez około 3,5 minuty lub do całkowitego rozpuszczenia naskórka.</li>
	<li>W sterylnych warunkach rozcieńczyć próbki do 15 ml M9 i odwirować przy 2 000 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i zawiesić w 15 ml roztworu M9.</li>
	<li>Powtórz krok 2.7 6 razy, aż pozostaną tylko jaja robaków, a roztwór nie będzie miał już zapachu chloru.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 2 ml roztworu M9.</li>
	<li>W sterylnych warunkach za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść 2 ml jaj zawierających M9 do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 20 °C przez co najmniej 16 godzin 
	nuta: Używaj oddzielnych płytek dla każdego szczepu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Etap przenoszenia z probówek wirówkowych do wielu dołków pomaga uniknąć uduszenia się robaków.</li>
	<li>Przenieść robaki wyklute w nocy z płytek 12-dołkowych do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Weź 3 krople po 5 μl roztworu robaka i policz liczbę robaków obecnych w pierwszym stadium larwalnym (L1).</li>
	<li>Oblicz liczbę robaków na μl roztworu.</li>
	<li>Wysiewać robaki L1 na płytki Rich-NGM w ilości 3 000 robaków na płytkę i pozostawić im wzrost przez 2 dni w temperaturze 20 °C, aż osiągną ostatnie stadium larwalne (L4).</li>
</ol>
3. Ogólny protokół WF-NTP
<ol>
	<li>Dodaj 2,2 ml każdego związku leczniczego o odpowiednim stężeniu (takim jak 25 lub 10 μM dla leków takich jak skwalanamina18 i bexarotene15, odpowiednio) do 6 płytek FUDR i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach dla każdego pożądanego szczepu robaka. 
	nuta: Etap ten powtarza się dla każdego badanego związku, dla każdego stężenia i każdego użytego rozpuszczalnika.
	<ol>
		<li>Zmyć robaki z 5 płytek Rich-NGM przygotowanych w kroku 2.13 przy użyciu 15 ml buforu M9 i przenieść robaki do probówki wirówkowej.</li>
		<li>Wirować przy 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 3 ml M9. Pobrać 3 krople po 5 μl roztworu M9 zawierającego robaki i policzyć liczbę robaków obecnych w ostatnim stadium larwalnym L4.</li>
		<li>Oblicz liczbę robaków na μl buforu M9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewać 700 larw L4 na 6 suchych płytek FUDR zawierających dany związek, powtórzyć dla każdego stężenia każdego związku i pozostawić do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
	<ol>
		<li>Inkubuj robaki w temperaturze 24 °C od L4 dla tych szczepów, w których paraliż robaków jest wywoływany tylko przez podniesienie temperatury, takich jak szczep AD38. Policz dzień następujący po stadium larwalnym L4 jako D0 wieku dorosłego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz światła sceniczne dla trackera.
	<ol>
		<li>Wyczyść szklaną scenę 70% etanolem i upewnij się, że nie pozostały żadne widoczne pozostałości, a następnie zdejmij pokrywę obiektywu. Wyczyść soczewkę obrazową za pomocą miotełki do kurzu. Upewnij się, że aparat jest prawidłowo podłączony i zainstalowany, a następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia kamery, aby nagrywać 20 klatek/s, z ustawieniem parametrów nagrywania mono 16; nagrywaj 1,200 klatek, zapisując w formacie MJPEG ze współczynnikiem kompresji 95%. Użyj pustej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby upewnić się, że stolik jest ustawiony na odpowiednią wysokość i wyreguluj go w razie potrzeby. 
		nuta: Upewnij się, że krawędzie płytki są widoczne na nagraniu, ponieważ pozwoli to na poprawne działanie algorytmu "keep-dead" (Rysunek 1a).</li>
		<li>W sterylnych warunkach należy pobrać 2 płytki przygotowane wcześniej w kroku 3.2 w tych samych warunkach i 1 płytkę przesiewową Mot przygotowaną w kroku 1.2.4. Dodać 3 ml roztworu M9 do płytki Mot . Użyć innych 2 ml M9, aby umyć 1/3 powierzchni 2 płytek przygotowanych w kroku 3.2 na płytce Mot .</li>
		<li>Umieść płytkę Mot zawierającą około 5 ml roztworu M9 i około 600 robaków na stoliku śledzącym. Ustaw ostrość kamery za pomocą pojedynczego robaka i rozpocznij nagrywanie.</li>
		<li>Po zakończeniu zapisu wyrzuć płytkę Mot z robakami; oznacz płytki FUDR jako użyte raz i włóż je z powrotem do inkubatora.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.3.3-3.3.5 dla każdego warunku doświadczalnego.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.3.3 do 3.3.6 dla każdego punktu czasowego w dorosłym życiu. 
		UWAGA: Zabiegi przesiewowe można przeprowadzić w dowolnym momencie dorosłego życia robaka (ok. 3 tygodnie). Protokoły te ułatwiają badania przesiewowe do 9 punktów czasowych; Autorzy zalecają badania przesiewowe co 2 dni, począwszy od 1. dnia dorosłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Optymalizacja dla badań nad dawką dyskretną
<ol>
	<li>Przygotuj robaki, powtarzając kroki od 3.1.1 do 3.1.3.
	<ol>
		<li>Wysiew ok. 1000 robaków L4 na 5 płytek FUDR. Inkubować płytki w temperaturze 24 °C do D3 wieku dorosłego, do eksperymentów z udziałem robaków AD38.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść przygotowane w sterylnych warunkach robaki z płytki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, odwirować przy 2 000 x g przez 2 minuty i usunąć sklarowany nad osadem.
	<ol>
		<li>Zawiesić roztwór robaków w 1 ml buforu M9. Przenieść robaki do probówki do mikrowirówki, odwirować przy 300 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku transdukcji białek dodać 40 μl odczynnika do transfekcji i 20 μl białka natywnego o pożądanym stężeniu (zwykle 40 μM) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść robaki z kroku 4.2.1 do probówki mikrowirówki zawierającej kapsułkowane białko, aby uzyskać całkowitą objętość 1060 μl. Umieścić probówki poziomo i wstrząsać z prędkością 60 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 24 °C przez 8 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sterylnych warunkach dodać 4 ml roztworu M9 do płytki Mot i przenieść jedną probówkę mikrowirówki z robakami i lekiem na płytkę Mot.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj tracker, powtarzając kroki od 3.3 do 3.3.2.</li>
		<li>W sterylnych warunkach dodać 4 ml roztworu M9 do płytki Mot i przenieść jedną probówkę mikrowirówki z robakami i lekiem na płytkę Mot.</li>
		<li>Umieść płytkę Mot na stoliku śledzącym, ustaw ostrość kamerę na pojedynczym robaku i rozpocznij nagrywanie. Po zakończeniu oznacz blachę Mot i odłóż na bok.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.4.1 i 4.4.3 dla wszystkich próbek.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety przenieś robaki w sterylnych warunkach z płytki Mot do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 2 000 x g przez 2 minuty. Usuń supernatant, przenieś osad na płytkę FUDR i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.4.5 dla wszystkich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować robaki w temperaturze 24 °C do D6 wieku dorosłego. 
	nuta: Możliwe są również wielokrotne inkubacje przeciwciał.</li>
	<li>Dodać 3 ml buforu M9 do płytki Mot i użyć 2 ml roztworu M9 do wypłukania wszystkich robaków z płytki FUDR na płytkę Mot .
	<ol>
		<li>Skonfiguruj tracker, powtarzając kroki od 3.3 do 3.3.2.</li>
		<li>Umieść płytkę Mot na stoliku śledzącym, ustaw ostrość kamerę w razie potrzeby i rozpocznij nagrywanie. Po zakończeniu nagrywania wyrzuć płytkę Mot lub odzyskaj ją w celu dalszego badania, jeśli chcesz.</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 4.6 do 4.6.2 dla wszystkich próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych wideo
<ol>
	<li>Po pobraniu filmów wybierz odpowiednie parametry w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania (Rysunek 2) do analizy danych.
	<ol>
		<li>Załaduj jeden lub wiele filmów za pomocą funkcji przeglądania. Wybierz wyjściowy folder docelowy. Upewnij się, że do analizy 30 s używanych jest od 600 do 1 200 klatek. 
		UWAGA: Można analizować dowolny zakres klatek.</li>
		<li>Wstaw współczynnik konwersji pikseli na mm, który będzie wynosił 0,029 dla obrazowania 9-centymetrowej szalki Petriego w pełnej rozdzielczości. Wybierz algorytm śledzenia 'keep dead'. 
		nuta: Współczynnik konwersji będzie zależał od użytego pola widzenia. Algorytm transformacji Z może być również używany jako alternatywa.</li>
		<li>Wypełnij parametry w sekcji Lokalizacja (Rysunek 2): Z użyj obrazów = 100, Dopełnienie Z = 3, Standardowe piksele = 54, Próg = 9, Otwarcie = 1, Zamknięcie = 2. Dostosuj parametry filtrowania do Minimalny rozmiar = 20, Maksymalny rozmiar = 180, Robak = 0,94.</li>
		<li>Dostosuj parametry trajektorii formowania: Maksymalny ruch na odległość = 10; Minimalna długość = 150, pamięć = 10.</li>
		<li>Ustaw parametry zagięć i prędkości. Użyj 1.8 dla progu zgięcia, 0 dla minimalnych zgięć i 150 dla ramek, aby oszacować prędkość.</li>
		<li>Dostrajanie statystyk martwych robaków. Użyj 5.0 dla maksymalnej liczby uderzeń na minutę i 1.0 dla maksymalnej prędkości.</li>
		<li>Wybierz folder wyjściowy. Ustaw liczbę ramek wyjściowych na 50. Ustaw rozmiar czcionki na 10. 
		nuta: Opcjonalnie wybierz co najmniej jeden obszar zainteresowania (ROI).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj parametry przy użyciu funkcji Example. Wyświetl przykładowe obrazy i sprawdź, czy robaki są widoczne w 8 krokach progowania (Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj funkcji Rozpocznij zadanie.</li>
	<li>Analizuj pliki wyników tekstowych, łącząc poszczególne wyniki dla całego zestawu danych. Użyj funkcji Eksportuj do tsv w graficznym interfejsie użytkownika. 
	nuta: Opcjonalnie poszczególne wskaźniki robaków mogą być również brane pod uwagę w badaniach populacyjnych.
	<ol>
		<li>Analizuj dane za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Ze względu na szybki rozwój technik w dziedzinie nauk optycznych, możliwe jest obecnie zaspokojenie zapotrzebowania na zautomatyzowane metody w badaniach C. elegans w zasadniczo nowy sposób. W rezultacie, w ciągu ostatnich kilku lat zaprojektowano i udostępniono szereg cyfrowych platform śledzących 20,41,42,43,44,45,46 w celu zastąpienia ręcznego liczenia parametrów takich jak prędkość ruchu, częstotliwość zginania, szybkość paraliżu, a także bardziej złożonych form zachowań, takich jak skręty omega, i pomiary żywotności. Najnowsze zautomatyzowane platformy znacznie poprawiły odtwarzalność i czułość badań nad C. elegans 41 i dostarczyły wysokiej jakości danych na temat małych kohort, a nawet pojedynczych zwierząt. Zdecydowaliśmy się rozszerzyć automatyzację analizy zachowań robaków, aby umożliwić również równoległą ocenę fenotypów kohort tysięcy zwierząt. Główną zaletą podejścia polegającego na badaniu kohort robaków jest to, że pozwala ono na uwzględnienie wysokiej wewnętrznej zmienności zachowania robaków24 oraz faktu, że badania nad leczeniem farmakologicznym często prowadzą do subtelnych zmian fenotypowych, które są trudne do wykrycia z wystarczającą istotnością statystyczną przy użyciu małej grupy zwierząt. Wysoka moc wykrywania (POD) jest rzeczywiście niezbędna, aby z pewnością wykryć wszelkie znaczące zmiany w zachowaniu i ograniczyć wyniki fałszywie dodatnie25.
W tym miejscu opisaliśmy szereg protokołów opartych na niedawno zgłoszonej metodzie automatycznego badania przesiewowego dla C. elegans, platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)36. Opisany tutaj protokół podzielony jest na 5 części. Części 1 i 2 opisują przygotowanie dużych populacji robaków. Krytycznymi etapami są sterylność warunków pracy oraz przygotowanie odczynników i płytek niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentów. Trybunał zauważa, że ze względu na zwiększoną przepustowość zapewnianą przez ten protokół w porównaniu z innymi metodologiami badań przesiewowych36 wymaga on również zwiększonych ilości odczynników; Czynnik ten należy dokładnie rozważyć w projekcie eksperymentalnym. Zwracamy również uwagę, że etap bielenia ma kluczowe znaczenie i musi zostać przetestowany z wyprzedzeniem, ponieważ do przeprowadzenia tych eksperymentów niezbędna jest duża liczba jaj i zdrowych larw. Część 3 tego protokołu szczegółowo opisuje, w jaki sposób dostarczać leki w pożywkach stałych i populacjach robaków przesiewowych. Zwracamy uwagę, że ta część protokołu jest silnie uzależniona od liczby leków i stężeń leków, które mają być testowane przez użytkownika równolegle. Pełna automatyzacja procedury przesiewowej i szybkie pozyskiwanie danych przesuwają etap graniczny z obserwacji behawioralnej na przygotowanie odczynników oraz wzrost i synchronizację dużych populacji robaków. Kluczowymi krokami podczas behawioralnej kontroli są czas nagrywania i wszelkie kroki związane z obsługą robaków (np. przeniesienie robaków z płytek NGM na platformę śledzącą). Opisany tutaj protokół jest przykładem zaprojektowanym do badania przesiewowego robaków przez okres do 9 dni w dorosłym życiu; Protokół ten można jednak łatwo dostosować do wyświetlania dowolnej liczby punktów czasowych, np. 18 kolejnych dni36. Część 4 ilustruje następnie zastosowanie protokołu do dostarczania cząsteczek białka (np. przeciwciał i molekularnych białek opiekuńczych) do C. elegans i pokazuje, w jaki sposób protokół zilustrowany w częściach 1-3 można łatwo dostosować, w zależności od pożądanego zastosowania. Pokazujemy, w jaki sposób procedura ta może być rozszerzona nie tylko na dostarczanie cząsteczek podobnych do leków, ale także na podawanie molekularnych białek opiekuńczych lub przeciwciał37. Pierwsze cztery etapy (części) przeprowadza się w sterylnych warunkach, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie płynne składniki należy przed użyciem przelać w autoklawie, a etapy inkubacji należy przeprowadzić przy wilgotności względnej 70%. W części 5 opisujemy, jak korzystać z pakietu oprogramowania dostarczanego w połączeniu z etapem śledzenia. To oprogramowanie zostało zaprojektowane specjalnie do analizy danych WF-NTP związanych z zachowaniem dużych populacji robaków. Sugerujemy, aby użytkownik postępował zgodnie ze wskazówkami zawartymi w części 5 dotyczącej analizy danych; Parametry te są jednak zależne od specyficznych cech nagrywanych filmów (tj. FPS, pole widzenia, rozdzielczość wideo, liczba pozyskanych klatek). Przykładowa funkcja dostępna w graficznym interfejsie użytkownika została zaprojektowana tak, aby ułatwić ocenę prawidłowych parametrów przed analizą.
Te serie protokołów umożliwiają skuteczną analizę fenotypów dużych populacji C. elegans (obecnie do 5000 pojedynczych robaków równolegle), redukując artefakty ze względu na wewnętrzną zmienność zachowania zwierząt, zgodnie ze wstępnymi badaniami nad siłą wykrywania niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej dla badań C. elegans25. Platforma wykorzystuje system kamer o wysokiej rozdzielczości, zdolnych do rejestrowania obrazów dużej liczby zwierząt z dużą prędkością, przy jednoczesnym rejestrowaniu wielu dużych kohort. Wysoka wydajność i wysoka przepustowość protokołu WF-NTP umożliwia bardzo dokładne określenie bardzo małych zmian w zachowaniu robaków. W związku z tym metodologia ta umożliwia rozważenie nowych podejść nie tylko do badania biologii C. elegans, ale także do badań farmakologicznych i medycznych, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe modyfikacji genetycznych i leczenia farmakologicznego. Procedura ta ma również tę zaletę, że umożliwia przeprowadzanie badań paraliżu równolegle z innymi pomiarami behawioralnymi, co jest kluczową cechą molekularnych badań przesiewowych.
Wyniki, które zostały osiągnięte do tej pory w programach odkrywania leków AD 15,34,35 i PD 18, pokazują znaczenie pozyskiwania danych o szerokim polu widzenia w znacznym zwiększeniu liczby zwierząt, które mogą być monitorowane w jednym eksperymencie, co znacznie zmniejsza błędy eksperymentalne i znacznie poprawia trafność statystyczną badań. Chociaż obecne podejście opisane w tym protokole koncentruje się na rozwiązywaniu problemów w dziedzinie odkrywania leków, mamy nadzieję, że metodologia zostanie szeroko przyjęta w społeczności, a jej zastosowanie zostanie rozszerzone na złożone badania genetyczne i behawioralne oraz rozszerzy liczbę fenotypów, które są obecnie wykrywalne.

Około pół wieku temu, Sydney Brenner wprowadził Caenorhabditis elegans (C. elegans) jako modelowy system do badań nad rozwojem i neurobiologią, ponieważ ten mały (1 mm długości), przezroczysty robak nicieni jest łatwy do genetycznego manipulowania i utrzymywania w laboratorium1. Obecnie C. elegans jest używany do badania szerokiej gamy procesów biologicznych, w tym apoptozy, sygnalizacji komórkowej, natury cyklu komórkowego, regulacji genów, metabolizmu i starzenia się2. Co więcej, złożoność komórkowa i tkankowa, wzorce ekspresji białek i zachowanie szlaków chorobowych między C. elegans a organizmami wyższymi (80% genów robaków ma ludzki ortolog), w połączeniu z prostotą i opłacalnością uprawy, sprawiają, że jest to skuteczny organizm modelowy in vivo, podatny na wysokoprzepustowość genetyczną3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 i drug14,15,16 pokazów. Z tych wszystkich powodów C. elegans został wykorzystany do scharakteryzowania normalnych i związanych z chorobą szlaków molekularnych; Na przykład w dziedzinie neurodegeneracji umożliwiło to zbadanie wpływu starzenia się na agregację białek3,4,7,15,17,18, oraz charakterystyka promotorów i inhibitorów agregacji białek3,4,5,6,7,14,18.
Ogólna sprawność robaków, która jest ważnym parametrem behawioralnym do zdefiniowania w tego typu badaniu, może być mierzona ręcznie na różne sposoby, np. poprzez liczenie liczby zgięć ciała na minutę (BPM)4,6,19, lub mierząc prędkość ruchu20,21,22, a także poprzez pomiar średniej długości życia i wskaźników paraliżu. Chociaż ręczne pomiary zgięć ciała i prędkości ruchu doprowadziły do wielu ważnych spostrzeżeń na temat różnych ścieżek i mechanizmów molekularnych3,4,14,19,20,23, testy ręczne są obecnie niskoprzepustowe, wysoce pracochłonne i czasochłonne, a jednocześnie podatne na błędy i stronniczość człowieka. Kwestie te stanowią poważne wyzwanie w gromadzeniu danych o wystarczającej mocy statystycznej, aby rozróżnić subtelne zmiany w zachowaniu. To ograniczenie jest szczególnie istotne w przypadku badań przesiewowych leków, ponieważ leczenie potencjalnymi cząsteczkami leku często prowadzi do niewielkich zmian fenotypowych24, co wymaga badania dużej liczby zwierząt w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Aby zilustrować tę kwestię, ostatnie badania wykazały, że wysoka moc wykrywania (POD) jest niezbędna do zdefiniowania z pewnością wszelkich znaczących zmian w zachowaniu i ograniczenia wyników fałszywie dodatnich25. Zaowocowało to silną motywacją w społeczności C. elegans do zastąpienia ręcznego liczenia powtarzalnymi, zautomatyzowanymi, oszczędzającymi czas i koszty pomiarami. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, kilka laboratoriów opracowało ostatnio metody pomiarów o wysokiej czułości i dokładnego śledzenia większej liczby robaków22,26,27,28,29,30,31,32,33.
Aby jeszcze bardziej rozszerzyć proces automatyzacji na duże kohorty zwierząt potrzebnych do statystycznie istotnych pomiarów, niedawno opracowaliśmy platformę śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)15,34,35,36, co umożliwia jednoczesne badanie wielu odczytów fenotypowych w bardzo dużych populacjach robaków, co jest kluczowym czynnikiem w statystycznie istotnym wykrywaniu fenotypów25. WF-NTP nie tylko może obecnie monitorować do 5000 zwierząt równolegle, ale odczyty fenotypowe obejmują również wiele parametrów, w tym szybkość i amplitudę zgięć ciała, prędkość ruchu, część populacji, która jest sparaliżowana i wielkość zwierząt. W związku z tym możliwe jest równoległe przesiewanie tysięcy robaków i łączenie różnych odczytów w mapę behawioralną w celu stworzenia wielowymiarowego odcisku palca36. Powiązane oprogramowanie typu open source jest napisane w języku Python, który jest również wymagany do jego obsługi i jest w pełni konfigurowalne. Dostępny jest również graficzny interfejs użytkownika (GUI), który umożliwia użytkownikom przyjęcie tej technologii.
Tutaj prezentujemy szereg protokołów, które ilustrują niektóre z potencjalnych zastosowań WF-NTP. W szczególności omawiamy podawanie związków, od małych cząsteczek po terapie białkowe, i opisujemy, jak bezpośrednio badać ich działanie na dużych populacjach robaków, skutecznie eliminując w ten sposób potrzebę pobierania próbek od małych subpopulacji. Wykorzystanie WF-NTP do tego celu przyniosło już znaczące korzyści w procedurach mających na celu projektowanie programów odkrywania leków na chorobę Alzheimera (AD)15,34,35 i chorobie Parkinsona (PD)18 wykorzystując dane in vivo do oceny kandydatów terapeutycznych35,37.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>monobasic fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Difco kazeina digest</td><td>Naukowe zaopatrzenie laboratoryjne</td><td>211610</td><td></td></tr><tr><td>dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>absolutny etanol</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoksyurydyna 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td>L16497.ME</tr><tr><td>LB średnie kapsułki</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>13% podchloryn sodu</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td> Uwagi</td></tr><tr><td>szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli szczep OP50</td><td>Dostarczane przez CGC</td><td>Op50</td><td>Szczep E coli</td></tr><tr><td>C. elegans szczep dziki Dostarczane</td><td>przez CGC</td><td>N2</td><td>C. elegans</td></tr> <tr><td>szczepC. elegans szczep AD</td><td>Dostarczony przez CGC</td><td>GMC101</td><td>C. elegans szczep</td></tr><tr><td>C. elegans szczep PD</td><td>Dostarczony przez CGC</td><td>NL5901</td><td>C. elegans szczep<em</td></tr><tr><td>>C. elegans szczep ALS</td><td>Dostarczony przez CGC</td><td>AM725</td><td>C. elegans szczep</td></tr><tr><td>C. elegans szczep Tau</td><td>Dostarczony przez CGC</td><td>BR5485</td><td>C. elegans szczep</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Autoklaw</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 cm sterylne szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 2 L</td><td>Materiały laboratoryjne</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L Wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus</td> wirówka podłogowa <td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>15 mL probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>75004515</tr><tr><td>Rozsiewacze do zaszczepiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>Multipette</td><td>Pipeta Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Pipeta serologiczna Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr> 2 <tr><td></td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 50 ml</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml Pipeta szklana</td><td>Appleton Woods CC214</td><td></td><td></td></tr><tr><td>270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td>Kamera do nagrywania filmów</td></tr><tr><td>pulsin</td><td>Polyplus Transfekcja</td><td>501-04</td><td>Odczynnik do transdukcji</td></tr><tr><td>Multitron Standardowy inkubator wytrząsający</td><td>Infors HT</td><td>INFO28573</td><td></td></tr><tr><td>powietrze miotełka</td><td>powietrza Office Depot</td><td>1511631</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy </td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Komponenty śledzące WF-NTP i oprogramowanie do przechwytywania obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8'' na 8'' Podświetlenie</td><td>Edmond Optics</td><td>88-508</td><td>Element śledzący</td></tr><tr><td>Obiektyw o wysokiej rozdzielczości 16 mm FL do czujnika 1''</td><td>Edmond Optics</td><td>86-571</td><td>Komponent śledzący</td></tr><tr><td>Kamera 6 Mpx</td><td>Edmond Optyka</td><td>33540</td><td>Komponent Tracker</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlyCapture PointGrey</td><td></td><td>SDK v2.12</td><td>Oprogramowanie do przechwytywania obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie WF-NTP</td> Cambridge <td>Enterprise</td><td>v1.0</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Pakiet Office</td><td></td> Microsoft <td>Office 365</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji c. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans to dobrze znany model zwierzęcy w badaniach biomedycznych, szeroko stosowany w genomice funkcjonalnej i badaniach starzenia. Aby ocenić zdrowie i kondycję badanych zwierząt, zazwyczaj opiera się na odczytach ruchliwości, takich jak pomiar liczby zgięć ciała lub prędkości ruchu. Pomiary te zwykle obejmują ręczne liczenie, co utrudnia uzyskanie dobrej istotności statystycznej, ponieważ ograniczenia czasowe i pracochłonne często ograniczają liczbę zwierząt w każdym eksperymencie do 25 lub mniej. Ponieważ wysoka moc statystyczna jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników i ograniczenia wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w przypadku badania słabych efektów fenotypowych, ostatnio podjęto wysiłki w celu opracowania zautomatyzowanych protokołów skoncentrowanych na zwiększeniu czułości wykrywania ruchliwości i wieloparametrycznego profilowania behawioralnego. W celu rozszerzenia granicy wykrywalności do poziomu potrzebnego do uchwycenia małych zmian fenotypowych, które często są kluczowe w badaniach genetycznych i odkrywaniu leków, opisujemy tutaj rozwój technologiczny, który umożliwia badanie do 5000 pojedynczych zwierząt jednocześnie, zwiększając moc statystyczną pomiarów o około 1000-krotnie w porównaniu z testami ręcznymi i około 100-krotnie w porównaniu z innymi dostępnymi metodami automatycznymi.

Łatwość obsługi, analiza multiparametryczna oraz wysoka przepustowość przedstawionego protokołu WF-NTP (Ryciny 1 i 2) umożliwiają bardzo precyzyjne określenie nawet niewielkich zmian w zachowaniu nicieni. Platforma obrazowania opiera się na niestandardowej optomechanice i może zostać zbudowana przy użyciu monochromatycznej kamery 6 MP w połączeniu z wysokorozdzielczym obiektywem o ogniskowej 16 mm dla matrycy 1'', oświetlonej białym podświetleniem o wymiarach 8'' na 8'' (patrz Tabela materiałów oraz odnośnik36 w celu uzyskania dodatkowych informacji). Powiązane oprogramowanie WF-NTP napisane jest w języku Python i zostało opracowane do pracy na platformach Windows. Działa ono na komputerze złożonym na zamówienie z ośmiordzeniowym procesorem 3,00 GHz i 64 GB pamięci operacyjnej (RAM). Oprogramowanie zostało również zaprojektowane tak, aby równoleglić pracę i analizę wideo w zależności od pamięci RAM i procesora komputera; t.j., maszyna o niższej mocy obliczeniowej spowoduje uruchomienie mniejszej liczby filmów równolegle. Konfiguracja, której obecnie używamy, jest zoptymalizowana do równoległego przetwarzania do ok. 16 filmów i może ukończyć analizę ok. 100 filmów w ciągu nocy. Co więcej, wysoki poziom szczegółowości konfiguracji dostępny w interfejsie graficznym (GUI) programu WF-NTP pozwala na dużą kontrolę nad jakością analizy obrazowania. GUI można wykorzystać do bezpośredniego, równoległego przesyłania dużych zestawów danych lub poszczególnych filmów; można również wybrać konkretne klatki do szczegółowej podanalizy, wraz z czynnikiem konwersji pikseli, który może być wykorzystany do szacowania wskaźników behawioralnych. W zależności od tego, czy użytkownik chce uwzględnić sparaliżowane zwierzęta w analizie, można wybrać jeden z dwóch różnych algorytmów śledzenia (keep dead oraz Z-transform). Parametr progowania można dostosować do jakości filmu i eksperymentu. Parametry otwierania i zamykania pozwalają użytkownikowi usunąć szum i dalej wdrażać funkcjonalność progowania. Algorytm szkieletyzacji oferuje alternatywną metodę analizy. Odcięcia wielkości obiektów (filtrowanie) stanowią dodatkowy filtr szumu tła, a parametr worm-like pozwala użytkownikowi uznać za nicienie tylko obiekty o kształcie elipsoidalnym, odróżniając je tym samym od innych obiektów, które mogą mieć taką samą wielkość w pikselach jak nicienie. Po tych operacjach progowania wszystkie wynikowe obszary oznaczone mogą zostać zidentyfikowane jako poszczególne nicienie, a pozycje tych obszarów są następnie zapisywane dla każdej klatki w celu późniejszej analizy i śledzenia. Mimośrodowość każdego śledzonego nicienia jest wykorzystywana do szacowania parametrów nicieni, takich jak stopień zgięcia nicienia (BPM) w funkcji czasu. Użytkownicy mogą również wybrać liczbę klatek używanych do utrzymania nicienia w pamięci oprogramowania po kolizjach, a liczbę pikseli, o które nicień może się przesunąć między klatkami, można dostosować, aby odróżnić zwierzęta od szumu. Opcja minimalnej długości ścieżki pozwala użytkownikowi odrzucić nicienie, które były śledzone tylko przez kilka klatek. Inne kluczowe parametry, takie jak zgięcia i prędkość, pozwalają użytkownikowi wybrać stopień zgięcia niezbędny do uznania go za zgięcie ciała oraz liczbę klatek uznanych za potrzebne do oszacowania prędkości zwierząt. Parametry odcięcia mogą być dalej dostrajane w celu uwzględnienia sparaliżowanych zwierząt. Wynik jest automatycznie wyświetlany w plikach z rezultatami. Wartości te są uznawane za górne granice oceny frakcji sparaliżowanych zwierząt. Użytkownik może również wybrać jeden lub więcej obszarów zainteresowania (ROI). Funkcja ta jest szczególnie przydatna do analizy subpopulacji nicieni, a wynik jest automatycznie sortowany w plikach z rezultatami. Opcja wyjściowa pozwala użytkownikowi wybrać folder wyjściowy oraz liczbę klatek śledzenia, które zostaną dla niego wygenerowane. Do dalszej analizy danych można wykorzystać różne zestawy narzędzi, takie jak narzędzie do wykreślania ścieżek (plot path), które pokazuje indywidualne ścieżki nicieni, oraz narzędzie do tworzenia odcisków palców (fingerprinting), które pozwala użytkownikowi tworzyć mapy fingerprintingowe.
Metodyka ta umożliwia przyjęcie nowych podejść nie tylko w badaniach biologicznych nad C. elegans ale także do celów badań farmakologicznych i medycznych, takich jak wysokoprzepustowy screening modyfikacji genetycznych i terapii lekowych. Potencjał ten zilustrowaliśmy, opisując charakterystykę fenotypów dla badań na dużych populacjach (N &gt; 1000) różnych modeli nicieniowych chorób neurodegeneracyjnych (otępienia czołowo-skroniowego (FTD)39, choroba Parkinsona (PD)7, choroba Alzheimera (AD)16,40or stwardnienie zanikowe boczne (SLA)19 (Rycina 3a), a także charakteryzację efektów potencjalnych cząsteczek terapeutycznych z wykorzystaniem modeli PD u nicieni18 oraz choroba Alzheimera (AD)15,12 (Rycina 3b). Dwie małe cząsteczki, squalamina18 oraz beksaroten15, podawano w stężeniach do 25 µM do PD (Rysunek 3b) i 10 µM do AD38 (Rysunek 3b) nicieni, odpowiednio. Oba związki wykazały wyraźne efekty zależne od dawki w zakresie przetestowanych stężeń. Wykazaliśmy, że tak wysoka dokładność pomiarów została osiągnięta dzięki zwiększeniu liczby analizowanych nicieni w porównaniu z metodami tradycyjnymi (Rycina 3c). Przedstawiliśmy znaczenie wielkości próby (Rysunek 3c) w screeningu molekularnym, a także w charakterystyce szczepów mutantów. Wzrost temperatury z 20 °C prowadzi do paraliżu około połowy nicieni z modelem AD po 3 dniach dorosłości. Populacje nicieni przesiewano w różnych warunkach, np., gdy nicienie wykazujące nadekspresję 42-aminokwasowej formy peptydydu amyloid-β (Aβ1-42) (robaki AD) poddano działaniu subtelnych wahań temperatury (Rysunek 3c, lewy panel), gdy Aβ1-42 wyrażał się we wszystkich neuronach (Rysunek 3c, panel środkowy), lub gdy nicienie z modelem AD były eksponowane na beksaroten (Rycina 3c, prawy panel). Analizie poddano również nicienie z małych obszarów zainteresowania (ROI), wybranych losowo z pełnego pola widzenia filmów zarejestrowanych za pomocą WF-NTP (N &lt; 50, żółte słupki) przedstawiające porównanie ruchliwości tych nicieni ze średnią ruchliwością całej populacji nicieni (N &lt; 1 000). Na wszystkich panelach różnica zmierzona dla całej populacji nicieni wydaje się być istotna statystycznie przy p ≤ 0,0001 (****).
Opisany tutaj protokół WF-NTP umożliwia również jednoczesną rejestrację wielu parametrów (Rysunek 1b), co w optymalny sposób wspiera zarówno walidację wewnętrzną, jak i opracowanie kompleksowego profilu („fingerprint”) szerokiego zakresu warunków w odniesieniu do próbki kontrolnej, pozwalając na istotne porównania między wieloma badaniami. To wieloparametrowe podejście obejmuje jednoczesną analizę wielu cech behawioralnych, w tym częstotliwość wyginania, prędkość, stopień paraliżu, rozmiar, amplitudę wygięcia oraz przemieszczenie podczas wyginania36. Pozwala to na monitorowanie tysięcy zwierząt z dużym szczegółowieniem, przy bardzo wysokiej czułości i istotności statystycznej, co stwarza możliwości prowadzenia badań na dużych populacjach. Ta procedura śledzenia ma również tę zaletę, że pozwala na przeprowadzanie badań nad paraliżem równolegle z innymi pomiarami behawioralnymi, co jest kluczową cechą w badaniach przesiewowych w zakresie biologii molekularnej.
Wyniki osiągnięte do tej pory w poszukiwaniu leków na AD15,34,35 oraz PD18 wykazują znaczenie akwizycji danych z szerokim polem widzenia, co pozwala na znaczne zwiększenie liczby zwierząt monitorowanych w pojedynczym eksperymencie, istotnie zmniejszając błędy doświadczalne i znacznie poprawiając istotność statystyczną badań. W oparciu o te wyniki przewidujemy, że protokół WF-NTP, który udostępniliśmy społeczności naukowej36, znacznie rozszerzy możliwości wykorzystania C. elegans.
<img alt="Schemat analizy wizyjnej; etapy przetwarzania obrazu; wykres radarowy; analiza zachowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etapy analizy WF-NTP i przykład „odcisku palca” (fingerprint). (a) 1. Oryginalne nagranie wideo. 2. Obraz tła. 3. Obraz po odjęciu tła. 4-6. Etapy progowania. 7-9. Pojedyncze etykietowanie nicieni.(b) Wiele fenotypów jest przedstawionych w formie „odcisku palca” dla nicieni typu dzikiego oraz modeli nicieni z PD i AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Graficzny interfejs użytkownika do analizy wideo; narzędzia pomocnicze, schemat ROI; przetwarzanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Graficzny interfejs użytkownika (GUI) programu WF-NTP. W GUI można wybrać konkretne filmy oraz wybrane klatki do analizy, a następnie wprowadzić współczynnik konwersji pikseli, po czym analiza jest przeprowadzana za pomocą jednego z dwóch dostępnych algorytmów śledzenia. Możliwe jest określenie stopnia zgięcia niezbędnego do uznania go za zgięcie ciała, a także liczby klatek potrzebnych do oszacowania prędkości zwierząt. Progi zgięć ciała i prędkości pozwalają na określenie statystyk dotyczących sparaliżowanych nicieni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badania populacyjne i przesiewy molekularne ze Squalamine i Bexarotene, wykresy badające moc detekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykłady zastosowań umożliwionych przez metodę WF-NTP. (a) Zastosowanie WF-NTP w dużych badaniach populacyjnych (N &gt; 1 000) pomiarów BPM dla modeli C. elegans w szeregu chorób neurodegeneracyjnych, w tym FTD, PD, AD i ALS. (b) Zastosowanie WF-NTP w odkrywaniu leków. (c) Znaczenie badań populacyjnych w analizie wrażliwości na temperaturę, skuteczności leków i charakterystyce szczepów mutantów. Fenotypy subpopulacji N &lt; 50 (żółte słupki) są porównane z fenotypami całej populacji nicieni (N &lt; 1 000). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Metoda ta może więc pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w procesie odkrywania leków dotyczące tego, jak dany lek zachowuje się w żywym organizmie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybkie i skuteczne przesiewanie dużych rozmiarów próbek. Technika ta już teraz ma duży wpływ na odkrywanie leków, umożliwiając bardzo jakościową ocenę skutków potencjalnych leków.Metoda ta dostarcza nowatorskich informacji mechanistycznych na temat początku i progresji chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem. Co więcej, metoda ta może być również stosowana do innych systemów, takich jak starzenie się i badania genetyczne. Jesteśmy bardzo podekscytowani możliwością wprowadzenia nowych metod fizycznych do przestrzeni odkrywania leków.Te demonstracje tej metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ etapy badań przesiewowych wymagają dużej znajomości tej nowej techniki automatycznej. Procedurę zademonstruje Sam Casford, asystent poszukiwawczy z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury dodać 2,2 milileta każdego związku leczniczego w odpowiednim stężeniu do sześciu płytek 5-fluorodeoksyurydyny lub FUDR na szczep robaka, ostrożnie rozprowadzając związek na całej powierzchni płytki i wysuszyć płytki w sterylnych warunkach.Podczas suszenia płytek użyj 15 mililitrów buforu M9, aby umyć robaki z pięciu bogatych płytek czynnika wzrostu nicieni i przenieś uwolnione robaki do stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić nicienie w trzech mililitrach świeżego buforu M9 w celu ilościowego określenia liczby robaków w stadium larwalnym L4 i wysiać 700 larw L4 na każdą z sześciu suchych płytek FUDR na szczep robaka, na związek. Kiedy wszystkie nicienie zostaną wysiane, umieść płytki zawierające szczepy, u których indukowany jest parliz, podnosząc temperaturę do 24 stopni Celsjusza na 24 godziny.Następnego dnia włącz światła sceniczne równoległego trackera ślimakowego i wyczyść szklany stolik trackera 70-procentowym etanolem. Jeśli nie pozostały żadne widoczne pozostałości, zdejmij pokrywę obiektywu i użyj miotełki do kurzu, aby wyczyścić soczewkę obrazową. Upewnij się, że aparat jest prawidłowo podłączony i zainstalowany, a następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.Dostosuj ustawienia kamery, aby nagrywać 20 klatek na sekundę z odpowiednimi parametrami nagrywania mono-16. Użyj pustej, dziewięciocentymetrowej szalki Petriego, aby upewnić się, że stolik jest ustawiony na odpowiednią wysokość i w razie potrzeby wyreguluj stolik. W sterylnych warunkach dodać trzy mililitry roztworu M9 do płytki przesiewowej ruchliwości i użyć dwóch mililitrów roztworu M9 do przemycia jednej trzeciej powierzchni dwóch płytek FUDR załadowanych nicieniami z tej samej grupy eksperymentalnej do płytki przesiewowej.Następnie umieść płytkę sitową na stoliku trackera. Użyj pojedynczego robaka, aby ustawić ostrość kamery i zacznij nagrywać zwierzęta. Po zakończeniu zapisu należy wyrzucić płytkę ruchliwości i oznaczyć płytki FUDR jako użyte jednorazowo przed powrotem do inkubatora.Aby przeanalizować dane wideo, otwórz graficzny interfejs użytkownika oprogramowania do analizy danych równoległego śledzenia robaków i użyj funkcji przeglądania, aby załadować interesujące Cię wideo. Wybierz wyjściowy folder docelowy i upewnij się, że ustawiono od 600 do 1200 klatek na 30-sekundową analizę. Wstaw współczynnik konwersji 0,029 piksela na milimetr do obrazowania dziewięciocentymetrowej szalki Petriego w pełnej rozdzielczości i wybierz algorytm śledzenia martwych.Na karcie parametrów lokalizacyjnych ustaw obrazy użycia Z na 100, dopełnienie Z na 3, standardowe piksele na 54, próg na 9, otwarcie na 1 i zamknięcie na 2. Dostosuj parametry filtrowania do minimalnego rozmiaru 20, maksymalnego rozmiaru 180 i robaka takiego jak 0,94. Ustaw parametry trajektorii formowania na maksymalną odległość ruchu 10, minimalną długość 150 i pamięć 10.Ustaw parametry zagięć i prędkości na próg zgięcia równy 1,8, minimalną liczbę zagięć na 0 oraz ramki, aby oszacować prędkość na 150. Dostosuj statystyki martwego robaka do maksymalnej liczby uderzeń na minutę wynoszącej 5 i maksymalnej prędkości 1. Wybierz folder wyjściowy i wybierz liczbę ramek wyjściowych na 50 oraz rozmiar czcionki na 10.Użyj funkcji example, aby przetestować parametry i wyświetlić przykładowe obrazy, aby sprawdzić, czy robaki są widoczne w ośmiu krokach progowania. Następnie uruchom funkcję "Start Job" i połącz poszczególne wyniki dla całego zestawu danych, aby przeanalizować pliki z wynikami testu, zapisując wyniki za pomocą funkcji eksportu do TSV. Metoda ta pozwala na scharakteryzowanie fenotypów nicieni w badaniach populacyjnych różnych robakowych modeli chorób neurodegeneracyjnych, takich jak otępienie czołowo-skroniowe, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i stwardnienie zanikowe boczne.A także charakterystyka efektów potencjalnych cząsteczek terapeutycznych, przy użyciu robakowych modeli choroby Parkinsona i Alzheimera. Wysoką dokładność tych pomiarów osiąga się poprzez zwiększenie liczby robaków, które można analizować w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zminimalizowaniu czasu między dodaniem robaków do ruchliwości a rozpoczęciem śledzenia.Po tej procedurze można zastosować inne metody w celu uzupełnienia wyników i powiązania z agregacją białek. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami neurodegeneracyjnymi i chorobami nieprawidłowego fałdowania, takimi jak choroba Parkinsona i Alzheimera, do zbadania odpowiednich zastosowań odkrywczych. Nie zapominaj, że praca z FUDR może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic nitrylowych, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

automated-behavioral-analysis-large-c-elegans-populations-using-wide

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali.  C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów.  Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Opisana jest skuteczna i prosta metodologia komputerowej analizy zachowania nicieni podczas pływania w cieczy. Metoda ta wymaga niewielkich lub żadnych inwestycji dla laboratoriów C. elegans. Używany sprzęt jest standardowy, a oprogramowanie komputerowe do analizy behawioralnej (CeleST) jest oprogramowaniem typu open source.

Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje prostą, tanią metodę rejestrowania zachowania Caenorhabditis elegans polegającego na unikaniu trawnika, przy użyciu łatwo dostępnych przedmiotów, takich jak smartfon i kaseton świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LED). Udostępniamy również skrypt w języku Python do przetwarzania pliku wideo do formatu bardziej podatnego na zliczanie.

Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj zautomatyzowaną analizę behawioralną dużych populacji Caenorhabditis elegans przy użyciu platformy WF-NTP. Ta metoda umożliwia szybkie badanie efektów leków na modele chorób neurodegeneracyjnych.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Przeglądaj więcej filmów