Name: Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj szybką glikoinżynierię przeciwciał w komórkach CHO. Ta metoda umożliwia przesiewowe badanie enzymów glikozylacji w celu poprawy aktywności przeciwciał i zwiększenia skuteczności terapeutycznej produktów biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PK dziękuje Wydziałowi Inżynierii Chemicznej Imperial College London za stypendium. RD dziękuje Brytyjskiej Radzie ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych za stypendium. MM jest finansowany przez U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (numer grantu: BB/S006206/1). IAG dziękuje Irlandzkiej Radzie ds. Badań Naukowych (stypendium nr 2. GOIPG/2017/1049) i CONACyT (stypendium nr 438330).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szlaki glikozylacji obejmują złożoną sieć metaboliczną enzymów i białek pomocniczych. Analizowanie funkcji składników szlaku jest zniechęcające, jeśli opiera się wyłącznie na konwencjonalnych strategiach inżynierii genetycznej knockout lub knockin. Alternatywnym podejściem jest wstępne badanie przesiewowe elementów szlaku za pomocą testu przejściowej utraty funkcji. W tym celu połączono dwa szybkie protokoły, detekcję RNAi i CGE-LIF, aby stworzyć bardziej efektywny sposób charakteryzowania genów glikozylacji. Opisana metoda wymaga 5-7 dni na wykonanie w porównaniu z konwencjonalnymi metodami, które mogą trwać kilka tygodni. Co więcej, środowiska badawcze z możliwościami automatyzacji mogą wykorzystać tę metodę do badania przesiewowego większej liczby kandydatów na geny, niż jest to wykonalne przy ręcznej obsłudze.
Powodzenie przejściowej kampanii glikoinżynieryjnej zależy w dużej mierze od projektu siRNA. Niestandardowe projekty DsiRNA muszą być zgodne z wcześniej opisanymi zasadami lub dla ułatwienia użytkownicy mogą zdecydować się na dostępne na rynku wstępnie zaprojektowane sekwencje. Podobnie jak inne strategie modyfikacji genów, RNAi może powodować efekty niezamierzone. W związku z tym zachęca się użytkowników do oceny niezamierzonego celowania w geny za pomocą metod obliczeniowych41. Eksperymentalne wybory projektowe mogą również pomóc w ograniczeniu efektów niedocelowych. Kittler i in. wykazali, że multipleksowane dostarczanie siRNA prowadziło do zmniejszenia efektów poza celem42. Chociaż wydaje się to sprzeczne z intuicją, sugeruje się, że mieszanka główna zmniejsza stężenie każdego konstruktu siRNA, ograniczając w ten sposób możliwość wyciszenia genów poza celem. Kolejną korzyścią jest to, że jednoczesna transfekcja struktur siRNA, które są ukierunkowane na ten sam gen, zwiększa prawdopodobieństwo udanego RNAi. Zastosowanie mieszanki wzorcowej zapewnia również spójność między próbkami i powtórzeniami oraz przyspiesza proces transfekcji. Po wstępnym badaniu przesiewowym mieszanych konstruktów siRNA, można przeprowadzić kolejny eksperyment z wykorzystaniem indywidualnych konstruktów w celu ustalenia wydajności RNAi każdej sekwencji. W tym i innych badaniach knockdown do trzech siRNA zostało połączonych i dostarczonych do komórek 43,44,45. Jednak pożądane może być badanie przesiewowe więcej niż trzech siRNA jednocześnie, aby skutecznie celować w pojedynczy gen lub kilka genów. Rzeczywiście, jedno z badań wykazało multipleksowane wyciszanie do sześciu genów za pośrednictwem siRNA na poziomach porównywalnych z wyciszaniem pojedynczych genów46. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby określić maksymalną liczbę konstruktów siRNA, które można wykorzystać w puli bez uszczerbku dla wydajności wyciszania. Strategia multipleksu została zaproponowana przez Martina i in. w celu zwiększenia tempa eksperymentów przesiewowych w bibliotece RNAi46, a podobna koncepcja może okazać się przydatna do badań przesiewowych genów glikozylacji.
Opisany w niniejszym dokumencie protokół służy jako dowód słuszności koncepcji z oczekiwaniem, że kolejne eksperymenty zostaną przeprowadzone w celu walidacji innych genów glikozylacji. Nowe geny będące przedmiotem zainteresowania mogą być niescharakteryzowane lub mniej popularne niż Fut8, a pierwszorzędowe przeciwciała wykrywające wyciszenie genów mogą być słabe lub niedostępne. W tym scenariuszu alternatywne metody, takie jak RT-PCR, mogą być stosowane do ilościowego określania wyciszania genów47, ale należy zauważyć, że RT-PCR wykrywa mRNA, a nie białko. Gdy dostępne są przeciwciała przeciwko western blot, częstym problemem jest słaba wykrywalność lub obecność niespecyficznych prążków. Dostępne są przewodniki rozwiązywania problemów, które pomagają użytkownikom rozwiązywać typowe problemy, a te zwykle obejmują szereg rozwiązań, takich jak miareczkowanie przeciwciał pierwotnych, alternatywne blokowanie i warunki wykrywania48,49. W tym badaniu FUT8 nieoczekiwanie pojawił się jako podwójne pasmo przy ~65 i ~70 kDa. Możliwe, że pasmo ~70 kDa reprezentuje glikozylowany FUT8. Dowody literaturowe z ludzkich linii komórkowych opisują glikozylację sprzężoną z O w Thr 56450,51, miejscu, które jest konserwatywne w sekwencjach chomika chińskiego i CHO K1 FUT8.
Jak wspomniano wcześniej, szlaki glikozylacji często obejmują złożony zestaw enzymów. Obecny protokół został opracowany, zoptymalizowany i zademonstrowany przy użyciu monogenowej reakcji glikozylacji kontrolowanej przez Fut8. Dlatego konieczne są dalsze badania, aby potwierdzić solidność tej metody, gdy gen docelowy koduje enzym o alternatywnej kinetyce i poziomach ekspresji lub szlaku regulowanym przez izoenzymy o nadmiarowych funkcjach.
Podsumowując, zdolność do szybkiego wyciszania genów i wykrywania zmodyfikowanych glikoprofili IgG jest użytecznym narzędziem w wysiłkach na rzecz niestandardowych przeciwciał glikoinżynieryjnych. Wnioski z podobnych badań krótkoterminowych można wykorzystać do wygenerowania stabilnych komórek glikoinżynieryjnych do wykorzystania w długoterminowych testach, takich jak hodowla w partiach karmionych. Poza kontekstem farmaceutycznym, metoda ta przyczynia się do badań nad biologią glikanów i podkreśla ważną funkcję glikanów w rozwoju, zdrowiu i chorobie.

Glikozylacja połączona z N jest procesem enzymatycznym, w którym ugrupowania oligosacharydowe są kowalencyjnie połączone z resztami Asn. W przeciwieństwie do syntezy białek de novo, synteza glikanów jest reakcją bez szablonu, w wyniku której dochodzi do niejednorodnej glikozylacji białek. Struktura, skład i dystrybucja glikanów mogą wpływać na konformację i funkcję białek. Rzeczywiście, N-glikozylacja w regionie krystalizowanego fragmentu (Fc) immunoglobuliny G (IgG) reguluje skuteczność terapeutyczną, immunogenność i okres półtrwania przeciwciała1. W związku z tym paradygmat jakości w fazie projektowania (QbD) dla rozwoju rekombinowanych bioterapeutycznych produktów białkowych w naturalny sposób identyfikuje glikozylację jako krytyczny atrybut jakości (CQA)2,3. Komórki ssaków są często preferowanymi systemami ekspresji, ponieważ z natury wytwarzają podobne do ludzkich wzorce glikozylacji ściślej niż bakterie, drożdże, owady lub komórki roślinne. Co więcej, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) są wybierane spośród innych linii komórkowych ssaków, ponieważ są odporne na infekcję wirusem ludzkim, wydzielają produkty o wysokim mianie i mogą być hodowane w hodowli zawiesinowej do wysokiej gęstości żywotnych komórek4. Jeśli chodzi o tworzenie glikanów, mysie komórki produkcyjne inne niż CHO wytwarzają immunogenne glikany (galaktoza [α(1-3)-Gal] sprzężona z α(1-3)-Gal] i kwas N-glikolylneuraminowy [NeuGc]), które wpływają na bezpieczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb)5. Korzyści te sprawiają, że komórki CHO są najważniejszym systemem ekspresji, odpowiedzialnym za produkcję ponad 80% nowych bioterapeutyków w latach 2014-20186. Jednak glikozylacja niezależna od matrycy jest konserwatywnym mechanizmem, który prowadzi do bioterapeutyków pochodzących z CHO z szeregiem glikoform.
Strategie rozwoju bioterapeutycznego mają na celu kontrolowanie heterogeniczności komórek CHO za pomocą inżynierii genetycznej. Niektóre przykłady literaturowe obejmują knockdown sialidaz (Neu1, Neu3)7, GDP-mannoza 4,6-dehydrataza (GMD) knockout8 oraz nadekspresja glikozylotransferaz (GnTIII)9. Postępy w glikoinżynierii są możliwe dzięki połączeniu publicznie dostępnych zasobów, takich jak CHO genome10, oraz ciągłemu rozwojowi narzędzi inżynierii genetycznej, takich jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN), nukleazy palców cynkowych (ZFN) i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) związane z białkiem 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14. Narzędzia te są zwykle dostarczane do komórek CHO w postaci plazmidowego DNA lub oczyszczonych kompleksów rybonukleoprotein (RNP). I odwrotnie, interferencja RNA (RNAi) jest technologią inżynierii genetycznej, która w swojej najprostszej formie wymaga jedynie dostarczenia oczyszczonych oligonukleotydów krótkiego interferującego RNA (siRNA). Białka endogenne przetwarzają dwuniciowe siRNA na pojedyncze nici, a nukleaza, kompleks wyciszający indukowany RNA (RISC), tworzy kompleks z siRNA w celu rozszczepienia docelowych sekwencji mRNA15,16,17. Wyciszanie genów za pomocą tej metody jest przejściowe ze względu na niestabilność RNA, ale badanie w niniejszym artykule wykorzystuje tę cechę, aby pomóc w szybkim badaniu przesiewowym.
Model enzymu wybranego do obecnego badania, α1,6-fukozylotransferaza (FUT8), wytwarza N-glikany z α-1,6 L-fukozą (Fuc) połączoną z rdzeniem. Modyfikacja ta jest głównym wyznacznikiem aktywności cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), o czym świadczą badania komercyjnych przeciwciał. W przypadku braku fukozylacji rdzenia, rytuksymab (anty-CD20 IgG1) zwiększa ADCC 50-krotnie i zwiększa ADCC w trastuzumabie (anty-Her2 IgG1) poprzez poprawę wiązania FcgRIIIa18,19. Fukozylacja rdzeniowa jest zatem uważana za niepożądaną cechę mAb, która uzasadnia wysiłki na rzecz odwrócenia tego fenotypu. Istnieją przykłady udanego celowania w gen Fut8 przy użyciu siRNA z jednoczesnym wzrostem ADCC20,21,22, aczkolwiek te przykłady dostarczają siRNA Fut8 kodowane na plazmidowym DNA. Takie eksperymenty generują stabilne wyciszanie genów, ponieważ plazmidowe DNA służy jako matryca do syntezy siRNA. Dzięki temu komórki mogą uzupełniać cząsteczki siRNA, które są degradowane przez wewnątrzkomórkowe RNazy i fosfatazy. I odwrotnie, dostarczenie egzogennego syntetycznego siRNA pozwala tylko na przejściowe wyciszenie genów, ponieważ siRNA nie może być uzupełnione z powodu braku wewnątrzkomórkowej matrycy. Dlatego użytkownicy powinni rozważyć, czy projekty eksperymentalne są kompatybilne z pochodzącym z plazmidu lub syntetycznym siRNA. Na przykład badania koncentrujące się na szczytowej produkcji mAb, zwykle szóstego dnia culture23,24, mogą optować za syntetycznym siRNA, które może być dostarczone do komórek na kilka dni przed ekspresją szczytu. Korzyści płynące z podejścia przejściowego z wykorzystaniem syntetycznego siRNA obejmują możliwość outsourcingu produkcji oraz fakt, że wiele konstruktów siRNA może być generowanych w ułamku czasu potrzebnego do wygenerowania konstruktów w plazmidach. Co więcej, syntetyczne siRNA jest skuteczne, o czym świadczą literaturowe przykłady wyciszania genu Fut8, które są wystarczające do zmniejszenia ekspresji białka FUT825 i uzyskania afukozylowanych IgG ze zwiększonym wiązaniem FCgRIIIa i ADCC26.
Sukces tego protokołu glikoinżynierii zadecydował stopień glikozylacji Fc. Spektrometria mas jest zwykle metodą z wyboru do analiz glikomicznych; jednak elektroforeza w żelu kapilarnym i detekcja fluorescencji indukowanej laserem (CGE-LIF) jest doskonale podatna na rozdzielczość profilu glikologicznego oczyszczonych IgG i ma tę zaletę, że jest szybsza i prostsza. Protokoły spektrometrii mas muszą łączyć odpowiednie metody chromatograficzne i derywatyzacji, źródła jonizacji i analizatory mas27,28,29. Oprócz tego, że wymaga to wyszkolonego specjalisty, protokoły spektrometrii mas są długie, a różnorodność metod utrudnia porównywanie danych między laboratoriami o różnych konfiguracjach. W kontekście biofarmaceutyków, CGE-LIF jest czułą metodą, która może dostarczyć wystarczających szczegółów na temat profilu glikologicznego przeciwciał i jest łatwo skalowalna dla metod wysokoprzepustowych. W przypadku bardzo złożonych mieszanin o niskiej liczebności ze słabo scharakteryzowanymi glikoproteinami zalety spektrometrii mas mogą pozostać. Jednak analiza mAb o wysokiej rozdzielczości i wysokiej czułości, jaką zapewnia analiza N-glikanów oparta na CGE-LIF, służy jako uzasadnienie do wypróbowania tej metody. Co więcej, przygotowanie i analiza próbki są zakończone w ciągu zaledwie kilku godzin30. Ostatnie badania wykazały, że CGE-LIF może być używany do monitorowania glikanów pochodzących z ludzkiego osocza31, mouse32 i CHO IgGs33. Badania te podkreślają zastosowanie CGE-LIF do wysokoprzepustowej analizy próbek i małych objętości próbek.
Metoda CGE-LIF ma ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Istotną barierą w stosowaniu tego i innych urządzeń do analizy glikanów jest koszt. Koszty te są jednak typowe dla tej dziedziny, a CGE-LIF jest uważany za opłacalną opcję34. Laboratoria z mniejszym budżetem mogą uznać, że bardziej praktyczne jest wynajęcie maszyn lub zlecenie analizy próbek na zewnątrz. Kolejną kwestią braną pod uwagę w przypadku każdej metody analitycznej jest powtarzalność. Ocenę CGE-LIF przeprowadzono przy użyciu 48 powtórzeń tej samej próbki, które były testowane w różnych dniach. Względne odchylenie standardowe na kapilarnę określono dla powtarzalności wewnątrzwsadowej i międzywsadowej. Stwierdzono, że w porównaniu wewnątrzseryjnym kontrprób względne odchylenie standardowe wynosi 6,2%, co wskazuje, że wydajność kapilarna nie jest jednolita. Co więcej, porównanie danych międzywsadowych wykazało względne odchylenie standardowe wynoszące 15,8%31, co wskazuje, że wydajność kapilary zmienia się w czasie. Stwierdzone niedociągnięcia operacyjne mogą nie mieć zastosowania w obecnym badaniu, w którym wykorzystuje się różne maszyny i zastrzeżone odczynniki. Jeśli użytkownicy zamierzają opracować własny protokół, warto byłoby rozważyć badanie przeprowadzone przez Ruhaaka i wsp.31, który dokładnie ocenił odczynniki do CGE-LIF. W związku z tym zoptymalizowano odczynniki do wstrzykiwania próbek (Hi-Di Formamid i DMSO), znakowania glikanów (NaBH3CN lub 2-pikolinowy boran)31 i inne.
To badanie przedstawia efektywny czasowo protokół inżynierii glikotechnicznej, który łączy szybkość bezpośredniego RNAi z dalszą analizą glikomiczną. Metodologia została zilustrowana przy użyciu genu Fut8 jako celu z powodów opisanych powyżej.

<table><tbody><tr><td>32 Karat software</td><td>SCIEX</td><td>skontaktuj się z producentem</td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych glikanów przy użyciu protokołu analizy Fast Glycan i metody separacji.</td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr>.<tr><td>Przeciwciało anty-FUT8</td><td>AbCam</td><td>ab198741</td><td>Królik poliklonalny do Fut8. Użyj tego przeciwciała do ilościowego określenia ekspresji białka Fut8; zastąpić to przeciwciało, jeśli używasz siRNA ukierunkowanego na inny gen.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>AbCam</td><td>ab181602</td><td>Królik monoklonalny przeciwko GAPDH. Istnieją alternatywne geny porządkowe, które mogą być preferowane przez użytkownika.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr BioDrop</td><td>Biochrom</td><td>80 3006 55</td><td>Przyrząd służący do ilościowego oznaczania stężenia białka.</td></tr><tr>Instrument <td>BLItz</td><td>ForteBio</td><td>45 5000</td><td>. System analizy białek bez znaczników.</td></tr><tr><td>BRAND Hemocytometr</td><td>Sigma Alrich</td><td>BR717810</td><td>Komora licząca</td></tr><tr><td>Wkład kapilarny</td><td>SCIEX</td><td>A55625</td><td>Wstępnie zmontowany wkład kapilarny z okienkiem (długość całkowita 30 cm, 375 &mikro; m średnica zewnętrzna (OD), x 50 i mikro; m średnica wewnętrzna (i.d).</td></tr><tr><td>Analiza glikanów C100HT&mdash; elektroforeza kapilarna</td><td>SCIEX</td><td>skontaktuj się z producentem</td><td>Przyrząd do elektroforezy kapilarnej w żelu, obecnie używany jest przyrząd CESI 8000 Plus.</td></tr><tr><td>CD CHO Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10743029</td><td>Zastąp go pożywką hodowlaną odpowiednią dla wybranej linii komórkowej.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Greiner Bio</td><td>188261</td><td>Sterylna probówka polipropylenowa.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 50 ml</td><td>Greiner Bio</td><td>227270</td><td>Sterylna probówka polipropylenowa.</td></tr><tr><td>CHO IgG</td><td>MedImmune</td><td>Prezent Komórki</td><td>jajnika chomika chińskiego wyrażające przeciwciało monoklonalne IgG (CHO T127). Stworzony przy użyciu systemu GS.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco 14190144</td><td></td> <td>1x PBS, bez wapnia i magnezu.</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera z nasadką odpowietrzającą, 125 ml</td><td>Corning</td><td>431143</td><td>Zastąp to naczyniem hodowlanym odpowiednim do hodowli wybranej linii komórkowej.</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera z nasadką odpowietrzającą, 250 ml</td><td>Corning</td><td>431144</td><td>Zastąp to naczyniem hodowlanym odpowiednim do hodowli wybranej linii komórkowej.</td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania i analizy glikanów</td><td>SCIEX</td><td>B94499PTO</td><td>znakuje N-glikany za pomocą APTS, a następnie wykorzystuje system czyszczenia oparty na kulkach magnetycznych w celu usunięcia nadmiaru APTS.</td></tr><tr><td>Fut8 DsiRNA</td><td>IDT</td><td>Custom</td><td>Specjalnie zaprojektowany kierunek DsiRNA Fut8.</td></tr><tr><td>Kuwety Gene Pulser, 0,4 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td>Kuweta do elektroporacji.</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td><td>Bio-Rad</td><td>165 2661</td><td>Insturment. Jednostka główna Xcell z mocdulą przedłużacza pojemności (CE) i ShockPod.</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-FL PVDF&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Membrana przenosząca immunoblot, niskie tło.</td></tr><tr><td>L-metioninasulfoksymina (MSX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5379</td><td>Niezbędne tylko dla linii komórkowych CHO przy użyciu systemu selekcji syntetazy glutaminy (GS).</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10623111</td><td>Chusteczki o niskiej zawartości kłaczków, wysokiej chłonności i obojętności chemicznej.</td></tr><tr><td>M-PER Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78505</td><td>Odpowiednie są również alternatywne do lizy, takie jak RIPA.</td></tr><tr><td>Metanol, rozpuszczalnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>10365710</td><td>klasy</td> HPLC.</tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>616201</td><td>probówki do sterylizacji w autoklawie.</td></tr><tr><td>System pionowych komórek do elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>1658035FC</td><td>Instrument. Pojemność 4 żeli, do żeli do ręcznego odlewania żeli o grubości 1,0 mm, z modułem Mini Trans-Blot i zasilaczem PowerPac HC.</td></tr><tr><td>NC-Slide A8</td><td>ChemoMetec</td><td>942 0003</td><td>Prowadnica 8-komorowa do użytku z NucleoCounter NC 250.</td></tr><tr><td>Kontrola ujemna DsiRNA, 5 nmol</td><td>IDT</td><td>51 01 14 04</td><td>Niecelujące DsiRNA.</td></tr><tr><td>Beznukleazowy bufor dupleksowy</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td>Bufor do rekonstytucji dla DsiRNA.</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-250</td><td>Chemometec</td><td>skontaktuj się z producentem</td><td>Przyrząd. Automatyczny analizator komórek</td></tr><tr><td>Drabinka page-liler, od 10 do 180 kDa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>Mieszane wzorce białek niebieskich, pomarańczowych i zielonych do SDS PAGE i western blot.</td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Greiner Bio 608281</td><td></td><td>Probówki do sterylizacji w autoklawie do aliqoutów DsiRNA i preparatu glikanów.</td></tr><tr><td>Końcówki filtrów do pipet sterylizowane&nbsp; (10, 200, 1000 i mikro; L)</td> <td>Gibson</td><td>F171203, F171503, F171703</td><td>sterylne końcówki filtra, aby uniknąć zanieczyszczenia RNA.</td></tr><tr><td>Enzym PNGaza F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td>Enzymatyczne rozszczepianie glikanów z glikoprotein.</td></tr><tr><td>Kolumny polipropylenowe, 1 ml</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Kolumny do chromatografii grawitacyjno-przepływowej.</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td>Hamowanie seryny, cysteiny, proteaz asparaginowych i aminopeptydaz</td></tr><tr><td>Białko-A Koraliki agarozy</td><td>Merck-Millipore</td><td>16 125</td><td>Do oczyszczania immunoglobulin ludzkich, mysich i króliczych.</td></tr><tr><td>Biosensor Protein-A</td><td>ForteBio</td><td>18 5010</td><td>Końcówki funkcjonalizowane białkiem A do szybkiej oceny ilościowej przeciwciał.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Usuwa zanieczyszczenie RNAzą.</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do próbek</td><td>ForteBio</td><td>18 1104</td><td>Activate Protein A tips.</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (5, 10, 25 ml)</td><td>Corning</td><td>4487, 4488, 4489</td><td>Stosowany do sterylnych technik hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Roztwór cyjanoborowodorku sodu 1 M w THF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296813</td><td>Środek redukujący.</td></tr><tr><td>Roztwór 18</td><td>ChemoMetec</td><td>910-3018</td><td>Odczynnik barwiący zawierający oranż akrydynowy (AO) i filtry probówkowe do wirówek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI)</td></tr> <tr><td>Spin-X</td><td>Corning</td><td>8161</td><td>&nbsp; 0,22 &mikro; m porów, membrana z octanu celulozy.</td></tr><tr><td>Płytka do zawieszania z pokrywką, 6-dołkowa</td><td>Greiner Bio</td><td>657 185</td><td>Hydrofobowa płytka hodowlana do wzrostu kultur zawiesinowych.</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe,&nbsp; 0,22 &mu; m</td><td>Sartorius</td><td>514 7011</td> Strzykawki <td>z octanu celulozy (SFCA) bez środków powierzchniowo czynnych</td></tr> z <tr><td>końcówką Luer lock, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10569215</td><td>Do bezpiecznego połączenia z filtrem strzykawkowym.</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Plami martwe i umierające komórki.</td></tr><tr><td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td><td>Sartorius</td><td>VS0191</td><td>Polyethersulfone</td></tr><tr><td>WesternBreeze Chromogenic Kit, zestaw do wykrywania Western blot przeciw królikom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WB7105</td><td>, alternatywne blokujące i rozcieńczalniki przeciwciał mogą być wykonane przez użytkownika na podstawie przepisów dostępnych w Internecie.</td></tr></tbody></table>

szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Rekombinowane przeciwciała monoklonalne wiążą określone cele molekularne, a następnie wywołują odpowiedź immunologiczną lub hamują wiązanie innych ligandów. Jednak funkcjonalność przeciwciał monoklonalnych i okres półtrwania mogą być zmniejszone przez rodzaj i dystrybucję glikozylacji specyficznej dla gospodarza. Próby wytworzenia lepszych przeciwciał zainspirowały rozwój genetycznie zmodyfikowanych komórek produkcyjnych, które syntetyzują przeciwciała zoptymalizowane pod kątem glikoterapii. Glikoinżynieria zazwyczaj wymaga wytworzenia stabilnej linii komórkowej z nokautem lub knockinem przy użyciu metod takich jak białko 9 związane z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR). Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez zmodyfikowane komórki są następnie charakteryzowane za pomocą metod spektrometrii mas w celu określenia, czy uzyskano pożądany profil glikoprofilowy. Ta strategia jest czasochłonna, wymagająca technicznie i wymaga specjalistów. Dlatego alternatywna strategia, która wykorzystuje uproszczone protokoły glikoinżynierii genetycznej i wykrywania glikanów, może pomóc w dążeniu do optymalnych przeciwciał. W tym badaniu potwierdzającym słuszność koncepcji, komórka jajnika chomika chińskiego wytwarzająca IgG posłużyła jako idealny gospodarz do optymalizacji glikoinżynierii. Krótkie, interferujące RNA ukierunkowane na gen Fut8 dostarczono do komórek jajnika chomika chińskiego, a uzyskane w ten sposób zmiany w ekspresji białka FUT8 określono ilościowo. Wyniki wskazują, że nokdaun tą metodą był skuteczny, prowadząc do ~60% redukcji w FUT8. Uzupełniającą analizę profilu glikologicznego przeciwciała przeprowadzono przy użyciu szybkiej, ale bardzo czułej techniki: elektroforezy w żelu kapilarnym i detekcji fluorescencji indukowanej laserem. Wszystkie eksperymenty z knockdownem wykazały wzrost afukozylowanych glikanów; Jednak największa zmiana osiągnięta w tym badaniu wyniosła ~20%. Protokół ten upraszcza wysiłki związane z glikoinżynierią poprzez wykorzystanie narzędzi do projektowania in silico, komercyjnie syntetyzowanych odczynników do celowania w geny oraz szybkich testów ilościowych, które nie wymagają dużego wcześniejszego doświadczenia. W związku z tym efektywność czasowa oferowana przez ten protokół może pomóc w badaniach nad nowymi celami genów.

Analiza Western blot wykazała zmniejszoną ekspresję białka FUT8 w komórkach transfekowanych mieszanką trzech konstruktów DsiRNA przeciwko Fut8. W próbkach kontrolnych transfekowanych nietargetującym DsiRNA białko FUT8 pojawiło się jako podwójny prążek przy ~65 i 70 kDa. Ponieważ przewidywana masa cząsteczkowa białka FUT8 wynosi 66 kDa, zmniejszenie intensywności sygnału prążka o niższej masie cząsteczkowej świadczy o wyciszeniu genu. Aby potwierdzić i ilościowo określić stopień wyciszenia genu, poziom białka FUT8 znormalizowano względem względnego poziomu białka GAPDH. Analiza Western blot wykazała dwa prążki dla GAPDH przy ~37 i 35 kDa. Prążek o wyższej masie cząsteczkowej odpowiada przewidywanej wielkości białka i dlatego został wykorzystany w obliczeniach normalizacji. Po normalizacji względem poziomów białka GAPDH ekspresja białka FUT8 została zredukowana o maksymalnie 60% (Rycina 1).
Zgodnie z obserwacją wyciszenia genu w 48 h po transfekcji, odpowiednie próbki mAb poddano analizie za pomocą CGE-LIF. Struktury glikanów z komórek z wyciszonym genem wykazały spadek fukozylacji. Tendencja ta była najbardziej wyraźna w strukturach agalaktozylnych (G0F) i zaobserwowano ją w mniejszym stopniu w strukturach galaktozylnych (G1F, G1F' oraz G2F). Z tego zbioru danych wynika, że całkowita fukozylacja rdzenia IgG spadła do ~75%, w porównaniu do ~95% fukozylacji rdzenia zaobserwowanej w warunkach kontrolnych negatywnych (Rysunek 2). Przewidywano większy spadek fukozylacji rdzenia, biorąc pod uwagę ~60% spadek poziomu białka FUT8. Po analizie warto zauważyć, że profil glikozylacji reprezentuje glikozylowane przeciwciała mAb, które nagromadziły się w okresie 48 h od transfekcji, podczas gdy wyciszenie genu reprezentuje poziomy białek obecne wyłącznie w momencie zbioru.
Dalsza analiza tej metody wyciszania obejmowała zmienność stężenia DsiRNA, czasu zbioru oraz warunków elektroporacji. Każdy z tych czynników badano oddzielnie w celu określenia jego znaczenia. Wpływ parametrów impulsów elektroporacyjnych na fukozylację rdzeniową i żywotność komórek przedstawiono w eksperymentach B, C, D i E. Wyniki te wskazują na dwukrotny spadek fukozylacji rdzeniowej przy zastosowaniu dwóch impulsów prostokątnych podczas elektroporacji (eksperyment C) w porównaniu do pojedynczego impulsu prostokątnego (eksperyment B), bez istotnych różnic w żywotności komórek (Tabela 2). Warunek elektroporacji e3 (eksperyment D) doprowadził do najniższej żywotności komórek (~90%) oraz najniższej wydajności IgG w tym punkcie czasowym. Jednak komórki, które przeżyły proces elektroporacji, zostały umiarkowanie transfekowane, o czym świadczy spadek fukozylacji rdzeniowej o ok. 10% (Tabela 2). Co ciekawe, w eksperymencie D zastosowano warunki elektroporacji, które zapewniły największą redukcję fukozylacji rdzeniowej (14,7%), ale były ewidentnie szkodliwe dla żywotności komórek (żywotność 91%-93%). Ten ograniczony zestaw eksperymentów ilustruje konieczność ustalenia takich ustawień elektroporacji, które umożliwią wystarczającą permeabilizację błony komórkowej, nie powodując nieodwracalnych uszkodzeń. Warto również zwrócić uwagę na rolę stężenia siRNA i czasu zbioru w procesie fukozylacji rdzeniowej. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie stężenia siRNA ma większy wpływ na fukozylację rdzeniową niż wydłużenie czasu zbioru (eksperymenty B, F, G w porównaniu do eksperymentów A, B, H). W przyszłych badaniach interesujące byłoby miareczkowanie stężeń siRNA dostarczanych metodą elektroporacji e2.
<img alt="Proces edycji genów: projektowanie siRNA, transfekcja, PCR, potwierdzenie wyciszenia genu; sekwencja schematu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Schemat przebiegu eksperymentu. Etapy glikoinżynierii i analizy próbek przedstawiono wraz z czasem wymaganym dla każdego z nich. Projektowanie siRNA zajmuje kilka godzin, w zależności od liczby genów docelowych lub konstruktów na jeden gen docelowy. Transfekcja komórek CHO za pomocą siRNA kończy się w ciągu kilku godzin, a przekształcone komórki pozostawia się do wzrostu na 48 h. Osady komórkowe oraz nadsączniki są zbierane w ciągu kilku godzin. Osady komórkowe poddaje się lizie, a białka wewnątrzkomórkowe rozdziela w metodzie SDS-PAGE, a następnie poddaje procesowi transferu (blotting) i inkubacji z przeciwciałami przeciwko genowi docelowemu. Glikany są odcinane od oczyszczonych przeciwciał i analizowane metodą CGE-LIF. Każdy z tych testów może wymagać 1 dnia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyciszenie białka FUT8, wynik Western blot, drabinka białkowa, kontrola GAPDH; analiza masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Potwierdzenie interferencji RNA. Wykrywanie poziomów białka $\alpha$-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) metodą Western blot w próbkach traktowanych Fut8 lub niedukładny kontrolny DsiRNA (non-targeting control). Prążki odpowiadające FUT8 są bardziej intensywne w grupie kontrolnej niż Fut8 próbki z wyciszeniem genu. Oceniono również poziom białka GAPDH w celu normalizacji ekspresji genu docelowego. Wszystkie próbki pobrano z eksperymentu G (patrz Tabela 2). Przedrukowano z Kotidis i wsp.52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy rozkładu glikanów; wyciszenie Fut8 vs kontrola; analiza glikozylacji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wpływ wyciszenia Fut8 na skumulowaną glikozylację IgG po 48 h. W próbkach z wyciszonym genem stwierdzono przesunięcie w rozkładzie glikanów. W szczególności w eksperymencie z wyciszeniem zredukowana została względna obfitość głównych struktur z fukozylacją rdzeniową (G0F), natomiast zwiększyła się liczba gatunków afukozylanych. Pomiary wykonano na próbkach z eksperymentu G (patrz Tabela 2). Troje biologicznych powtórzeń dla każdego eksperymentu zmieszano po zbiorze w celu zmniejszenia nakładu pracy przy analizach następczych. Przedrukowano z Kotidis et al.52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="3">Nazwa eksperymentu</td>
			<td colspan="2">Metoda elektroporacji</td>
			<td colspan="2">Stężenie DsiRNA (nΜ)</td>
			<td >Czas zbioru (h)</td>
			<td >Żywotność (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 komórek·mL-1)</td>
			<td >Miano IgG (mg·L-1)</td>
			<td colspan="2">Różnica w fukozylacji rdzenia (%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >24</td>
			<td >98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td >122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >24</td>
			<td >98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td >110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td >453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td >469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td >449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td >454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td >318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td >311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td >380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >48</td>
			<td >93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td >422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td >48</td>
			<td >96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td >501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td >48</td>
			<td >95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td >504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td >48</td>
			<td >96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td >422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td >48</td>
			<td >95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td >499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >72</td>
			<td >94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td >925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td >72</td>
			<td >95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td >1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Optymalizacja transfekcji. Iteracyjne modyfikacje metody elektroporacji, stężenia DsiRNA oraz czasu zbioru doprowadziły do zmian w żywotności komórek, gęstości żywych komórek, mianie IgG w czasie zbioru oraz różnic w fukozylacji rdzenia. W każdym doświadczeniu porównywano knockdown z odpowiednią kontrolą negatywną, aby ustalić, czy modyfikacja wywołuje pożądany efekt (tj. zmniejszenie fukozylacji). Parametry elektroporacji były następujące: e1: 1200 V, 0,1 ms, przebieg prostokątny; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s przerwy między impulsami, przebieg prostokątny; e3: 150 V, 20 ms, przebieg prostokątny; e4: 250 V, 500 μF, spadek wykładniczy. Przedrukowano z Kotidis et al.52.

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Protokół ten może być wykorzystany do badania przesiewowego wpływu wielu enzymów glikozylacji na profil glikologiczny białka docelowego i przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji enzymu. Charakter protokołu pozwala na badanie przesiewowe enzymów glikozylacji w sposób przejściowy, ale wysokoprzepustowy. Zmienione profile glikozylacji mogą prowadzić do poprawy aktywności przeciwciał, a tym samym do zwiększenia skuteczności produktu końcowego.Firmy biofarmaceutyczne ściśle monitorują glikozylację jako krytyczny atrybut jakości. Nieprawidłowa glikozylacja jest cechą charakterystyczną chorób takich jak rak. Dlatego metoda ta jest istotna dla badań farmakologicznych i biomedycznych.Protokół zakłada, że użytkownicy mają doświadczenie w kilku technikach eksperymentalnych, w tym transfekcji komórek ssaków i plamach zachodnich. Lepiej jest zacząć od mniejszej liczby próbek i w pierwszej kolejności użyć punktów zatrzymania. Zacznij od oceny gęstości i żywotności komórek jajnika chomika chińskiego.Następnie dokładnie wyczyść szafę bezpieczeństwa biologicznego i cały sprzęt 70% etanolem i roztworem inhibitora RNazy, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie osadzaj komórki w temperaturze 100 razy G przez pięć minut i ponownie zawieś je we wstępnie podgrzanym podłożu o gęstości komórek pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Przenieś osiem mikrolitrów głównej mieszanki lub kontroli DsiRNA do sterylnej kuwety do elektroporacji.Dodaj 800 mikrolitrów zawiesiny ogniw do tej samej kuwety, wymieszaj i dostarcz impuls elektroporacyjny. Następnie przenieś zawiesinę komórek z kuwety do jednego dołka sześciodołkowej płytki, unikając materiału przypominającego pianę. Inkubuj komórki przez 10 minut bez wstrząsania.Po inkubacji dodaj 800 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki, aby uzyskać końcową objętość 1,6 mililitra na studzienkę. Hoduj transfekowane komórki w inkubatorze, wytrząsając z prędkością 150 obr./min. Po 48 godzinach zebrać supernatant i komórki.Po oczyszczeniu IgG dodać elucję A do koncentratora odśrodkowego o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej o grubości trzech kilodaltonów i odwirować przy 13 300 razy G przez 40 do 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirowanie jest zakończone, gdy pozostała objętość jest równa lub mniejsza niż 50 mikrolitrów. Odrzucić przepływ i dodać 500 mikrolitrów wstępnie schłodzonego 1X PBS w celu rozcieńczenia pozostałego supernatantu.Ponownie odwirować próbkę w tych samych warunkach, aż pozostanie 50 mikrolitrów resztkowego supernatantu. Aby uzyskać 100-krotne rozcieńczenie supernatantu, dodaj 500 mikrolitrów wstępnie schłodzonego 1X PBS i powtórz proces wirowania. Stężyć supernatant do końcowego stężenia około 2,5 grama na litr w 40 mikrolitrach, aby zapewnić zgodność z metodą analizy glikanów.W celu analizy glikanów przenieś 200 mikrolitrów roztworu kulek magnetycznych do 2-mililitrowej probówki do PCR. Umieść go na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu i ostrożnie wyjmij supernatant. Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj oczyszczoną próbkę białka i wir.Następnie dodać bufor denaturacyjny do probówki z próbką i inkubować przez osiem minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Probówki z próbkami należy utrzymywać otwarte, aby zapewnić optymalną wydajność reakcji. Po inkubacji dodać PNGazę F i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby rozszczepić glikany z oczyszczonych przeciwciał.Po uwolnieniu N-glikanów zamknij probówkę z próbką i zawiruj. Następnie dodaj acetonitryl do probówki z próbką, odwiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Umieść probówki z próbkami w stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od roztworu.Następnie za pomocą pipety ostrożnie usunąć supernatant, nie dotykając kulek. Dodać roztwór do znakowania glikanów zawierający fluorofor do próbki w dygestorii i wymieszać przez wirowanie. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza z otwartymi pokrywkami usunąć nadmiar barwnika, myjąc próbkę trzykrotnie w acetonitrylu.Następnie wymyj znakowane glikany w podwójnie destylowanej wodzie. Umieścić probówkę z próbką w stojaku magnetycznym i zebrać supernatant wzbogacony oczyszczonymi i znakowanymi glikanami. Następnie należy przygotować i załadować wszystkie wymagane wzorce i próbki do wyznaczonych pozycji tacy.Uruchom protokół analizy glikanów oraz przeanalizuj i zidentyfikuj glikany obecne w próbce za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Analiza Western blot wykazała zmniejszoną ekspresję białka Fut8 w komórkach transfekowanych mieszaniną trzech konstruktów Fut8 DsiRNA. Struktury glikanowe z komórek knockdown również wykazywały zmniejszoną fukozylację.Tendencja ta była najbardziej wyraźna w strukturach agalactozylowanych i obserwowana w mniejszym stopniu w strukturach galaktozylowanych. Zaobserwowano dwukrotne zmniejszenie fukozylacji rdzenia w wyniku elektroporacji przy użyciu dwóch impulsów fali prostokątnej w porównaniu z pojedynczym impulsem fali prostokątnej bez istotnych różnic w żywotności komórek. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie stężenia krótko-interferującego RNA ma większy wpływ na fukozylację rdzenia niż wydłużenie czasu zbiorów.Stosunek wody do acetonitrylu określa, czy glikany są w roztworze, czy w części kulek. Należy o tym pamiętać podczas etapów mycia, aby uniknąć przypadkowego usunięcia oznaczonych glikanów z roztworu. Eksperyment uzupełniający może obejmować charakterystykę oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych przy użyciu testów komórkowych w celu ilościowego określenia cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał i cytotoksyczności zależnej od dopełniacza.

rapid-antibody-glycoengineering-in-chinese-hamster-ovary-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano opracowanie niestandardowych analiz na platformie ViBE w celu uzyskania bardziej czułych, powtarzalnych i zautomatyzowanych wyników w złożonych matrycach. Uniwersalny kartridż pozwala na łatwe dostosowanie analiz do zastosowań niestandardowych. Ta wszechstronność umożliwia szybkie opracowanie i walidację nowych analiz lub zautomatyzowanych wersji istniejących analiz manualnych, co zostało zilustrowane w tym filmie.

Opracowywanie spersonalizowanych testów białek komórek gospodarza z linii Chinese Hamster Ovary z wykorzystaniem technologii akustycznej mikrocząsteczkowej membrany

Opracowaliśmy bezkomórkowy test wiązania receptorowego w celu oszacowania wiązania czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) z receptorami. Umożliwia on ocenę konkurencyjnego hamowania wiązania biotynylowanego GM-CSF do rozpuszczalnego receptora alfa GM-CSF przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF z doskonałą powtarzalnością.

Bezkomórkowy system analizy szacujący zdolność neutralizacji przeciwciał przeciw GM-CSF z wykorzystaniem rekombinowanego rozpuszczalnego receptora GM-CSF

Ten film demonstruje technikę badania in vivo lokalizacji przeciwciał specyficznych dla nowotworu w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Po podskórnym wstrzyknięciu komórek rakowych myszom w celu powstania guza, wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, które wiążą się z receptorami specyficznymi dla guza, umożliwiając ocenę in vivo lokalizacji przeciwciał za pomocą obrazowania.

Technika oceny lokalizacji in vivo przeciwciał specyficznych dla nowotworu

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Ten protokół opisuje produkcję przeciwciała terapeutycznego w systemie ekspresji ssaków. Opisane metody obejmują przygotowanie DNA wektora, stabilną transfekcję i adaptację ludzkiej linii komórkowej 293 zarodka nerki bez surowicy, stworzenie kultur na dużą skalę i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Poznaj szybką glikoinżynierię przeciwciał w komórkach CHO. Ta metoda umożliwia przesiewowe badanie enzymów glikozylacji w celu poprawy aktywności przeciwciał i zwiększenia skuteczności terapeutycznej produktów biologicznych.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Przeglądaj więcej filmów