Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Nasza praca mapuje dysfunkcyjne interakcje białko-białko bezpośrednio z komórek i tkanek rodzimych, ujawniając, jak choroba zmienia sieci komórkowe. W przeciwieństwie do większości metod międzyatomowych, dfPPI nie wymaga inżynierii genetycznej ani umiejętności wobec kohort pacjentów, stosując jedno multipleksowe przechwycenie na próbkę. Na początek przygotuj bufor ekstrakcji białek zawierający 20 milimolowych tristonów, 20 milimolowych chlorków potasu, 5 milimolowych chlorków magnezu oraz 0,01% Nb-40.

Dodaj inhibitory proteazy i fosfatazy tuż przed użyciem i trzymaj bufor na lodzie. Umieść próbkę zamrożonej tkanki w rurce mikro z tłuczkiem. Dodaj 500-700 mikrolitrów natywnego buforu lizy, dostosowując objętość do zwartej tkanki i łatwości homogenizacji.

Następnie ujednolic próbkę na lodzie, delikatnie poruszając tłukiem w górę i w dół oraz przy ściankach ściernych, aż uzyskamy równomierną zawieszkę. Inkubuj lizaty w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, umieszczając fiolkę na jednostce obrotowej. Delikatnie mieszaj próbki podczas inkubacji i rotacji.

Za pomocą wirówki stołowej wiruj próbki w temperaturze 13 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Ostrożnie zbieraj supernatanty i przelewaj je do przezroczystych rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Określ całkowite stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu do badania BCA zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie weź aliquot koralików poliuretanowych bezpośrednio z materiału izopropanolowego. Pozwól kulkom opadnąć, aby usunąć rozpuszczalnik do przechowywania. Ostrożnie zasysaj izopropanol, następnie dodaj natywny bufor lizowy i całkowicie ponownie zawiesz kulki poprzez delikatne pipetowanie lub inwersję.

Aby umyć i wyrównać kulki, przewij rurkę, a następnie ją odwiruj. Następnie zasysaj supernatant za pomocą linii próżniowej z końcówką pipety, uważając, by nie ruszyć granulki. Dodaj bufor wiązający do pranych koralików w równych proporcjach, aby uzyskać jednolitą zawiesinę działającą do koralików.

Należy zastosować 40 mikrolitrów zawiesiny z kulek poliuretanowych do rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra, używając wyciętego końcówki pipety dla płynnego dozowania. Następnie przemyj kulki trzy razy natywnym buforem liza, dodając 1 mililitr buforu do każdej rurki. Wiruj rurkę, aby ponownie zawiesić kulki, następnie wiruj w 10 000 G przez minutę i wyrzucaj supernatant przez aspirację.

Po końcowym myciu usuń większość pozostałej cieczy z rurek, dbając o to, aby kulka pozostała nienaruszona. Dodaj znormalizowane ekstrakty białkowe do pojedynczych mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra zawierających 40 mikrolitrów zawiesiny z kulek kontrolnych. Dostosuj końcową objętość do 250 mikrolitrów, dodając odpowiednią ilość natywnego buforu lizy.

Inkubuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się na rotatorze end-over over end z prędkością 10-15 obrotów na minutę. Wiruj probówki w 10 000 G przez 1 minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpylić kulki kontrolne wraz z agregowanymi lub nierozpuszczalnymi białkami. Ostrożnie zbieraj supernatant z kulek kontrolnych za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra i przelewaj go do świeżych rurek o pojemności 1,5 mililitra zawierających 40 mikrolitrów zawieśniny z kulek poliuretanowych.

Inkubuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 3 godziny z rotatorem pełnym na końcu. Po dokładnym odwirowaniu rurek zasysaj supernatant i przemyj kulki cztery razy, jak pokazano wcześniej. Usuń resztki PBS z rurki.

Ponownie zawiesić umyte kulki w 80 mikrolitrach 2-molowego mocznika, świeżo przygotowanych w 50-milimolowym wodorowęglanie amonu o pH 8,5 poprzez pipetowanie lub krótkie wirowanie. Następnie dodaj ditiotrytol, aby uzyskać końcowe stężenie 1 milimolaru. Po zakryciu rury inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, potrząsając z prędkością 1,100 obrotów na minutę na podgrzanym orbitalnym wstrząsaczu.

Dodaj jodoacetamid, aby uzyskać końcowe stężenie 3,67 milimolaru. Inkubuj probówki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 45 minut, potrząsając z prędkością 1 100 obrotów na minutę. Następnie dodaj dodatkowy ditiotreitol, aby wygasić ewentualne niezareagowane jodoacetamid, zapewniając końcowe stężenie 3,67 milimola i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.

Do próbki dodaj 750 nanogramów proteazy Lys-C o stężeniu 0,5 miligrama na mililitr spektrometrii mas. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, potrząsając z prędkością 1 150 obrotów na minutę. Następnie do próbki dodaj 750 nanogramów świeżo przygotowanego tripsinu o stężeniu 0,5 miligrama na mililitr o jakości sekwencjonalnej.

Inkubuj mieszankę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząskami o prędkości 1 150 obrotów na minutę. Następnego dnia wiruj próbkę w stężeniu 1 000-5 000 G przez 1-5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przelej supernatant do świeżej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety i wyrzuć kulki.

Dostosuj pH trawienia poniżej 3, dodając po kroplach 50% kwasu trifluorooctowego. Sprawdź pH za pomocą pasków wskaźnikowych. Kulki PU wychwytywały HSP90, HSC70 i gorące białka silnie z epichaperomu wysokiego lizatu z minimalnym sygnałem z epichaperomu o niskim lizacie, co potwierdza biologiczną specyficzność sondy.

Profil ładunku kulki PU wykazał bogaty, wysokocząsteczkowy sygnał na torze kulek PU oraz minimalne tło w torze kulek kontrolnych, potwierdzając skuteczną aktywność sondy. Żele SDS-PAGE barwione przez koomazy wykazały spójny rozkład pasm w czterech próbkach przetworzonych w żelu, potwierdzając pomyślne wzbogacenie kompleksów białkowych z natywnych lizatów przed zastosowaniem spektrometrii mas. Techniczna powtarzalność została potwierdzona analizą głównych składników, gdzie próbki replikujące się skupiały się ciasno, podczas gdy różne próbki rozdzielały się czysto.

Rozkłady intensywności jonów prekursorowych wykazały, że większość cech miała współczynniki zmienności poniżej 20%, z medianą wartości od 9,7% do 11,9% w próbkach, co potwierdza spójną detekcję i odzysk peptydów. Hierarchiczne klastrowanie liczebności białek przekształconych logarytmicznie ujawniło silne rozdzielanie próbek oraz zachowaną zmienność między próbkami, z intensywnością białek od niskiej obfitości do wysoko wzbogaconych białek. Analiza wzbogacenia szlaków wykazała szeroki zakres adnotacji w wielu ontologiach, w tym kategoriach ontologii genów oraz kuratorowanych bazach danych, takich jak Reactome, KEGG i WikiPathways.

dfPPI pozwoliło nam odkryć mechanistyczne i terapeutyczne wglądy, których inne podejścia po prostu nie potrafią osiągnąć. dfPPI podnosi interomikę do poziomu rzeczywistych kohort chorób i warunków rodzimych, umożliwiając precyzyjne mechanistyczne i terapeutyczne hipotezy. Obecnie rozszerzamy dfPPI, aby mapować zmiany na poziomie sieci w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak Alzheimer i Parkinson.