Name: Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę mapowania dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w tkankach natywnych przy użyciu sond chemicznych i spektrometrii masowej. Ta technika umożliwia identyfikację zmian sieci komórkowych w chorobach bez inżynierii genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez NIH (R01 CA172546, U01 AG032969, P01 CA186866, R56 AG061869, R01 AG067598, R01 AG074004, R01 AG072599, R56 AG072599, RF1 AG071805, P30 CA008748, S10 RR027990) oraz pana Williama H. i panią Alice Goodwin, a także Commonwealth Foundation for Cancer Research i Experimental Therapeutics Center of MSKCC (G.C.). S.S. pragnie podziękować wsparciu finansowemu od BrightFocus Foundation (ID nagrody: A2022020F).

<ol><li>Liu, Z., Miller, D., Li, F., Liu, X., Levy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+accessory+protein+interactome+is+rewired+across+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A large accessory protein interactome is rewired across environments.</a> Elife. 9, e62365(2020).</li>
<li>Omranian, S., Nikoloski, Z., Grimm, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+identification+of+protein+complexes+from+network+interactions%3A+Present+state%2C+challenges%2C+and+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Computational identification of protein complexes from network interactions: Present state, challenges, and the way forward.</a> Comput Struct Biotechnol J. 20, 2699-2712 (2022).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Sharma, S., Norton, L., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+stressor-induced+dysfunctions+in+protein-protein+interaction+networks+via+epichaperomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting stressor-induced dysfunctions in protein-protein interaction networks via epichaperomes.</a> Trends Pharmacol Sci. 44 (1), 20-33 (2023).</li>
<li>Nussinov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+in+molecular+biology%3A+Conformational+ensembles+in+molecular+recognition%2C+allostery%2C+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pioneer in molecular biology: Conformational ensembles in molecular recognition, allostery, and cell function.</a> J Mol Biol. 437 (11), 169044(2025).</li>
<li>Lacoste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+mislocalization+of+pathogenic+coding+variants+underlying+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pervasive mislocalization of pathogenic coding variants underlying human disorders.</a> Cell. 187 (23), 6725-6741.e13 (2024).</li>
<li>Liu, X., Abad, L., Chatterjee, L., Cristea, I. M., Varjosalo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-protein+interactions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. , (2024).</li>
<li>Luck, K., Sheynkman, G. M., Zhang, I., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-scale+human+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteome-scale human interactomics.</a> Trends Biochem Sci. 42 (5), 342-354 (2017).</li>
<li>Greenblatt, J. F., Alberts, B. M., Krogan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+significance+of+protein-protein+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease.</a> Cell. 187 (23), 6501-6517 (2024).</li>
<li>Gonzalez-Avendano, M., Lopez, J., Vergara-Jaque, A., Cerda, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+computational+proteomics+platforms+to+decipher+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The power of computational proteomics platforms to decipher protein-protein interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 88, 102882(2024).</li>
<li>Komives, E. A., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial+overview%3A+Protein+networks+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Editorial overview: Protein networks in health and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 90, 102953(2025).</li>
<li>Botticelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+enabled+systems-level+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry enabled systems-level structural biology.</a> Curr Opin Struct Biol. 87, 102872(2024).</li>
<li>Chakrabarty, S., Wang, S., Roychowdhury, T., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+dysfunctional+protein-protein+interactome+%28dfppi%29+-+a+platform+for+systems-level+protein-protein+interaction+%28ppi%29+dysfunction+investigation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Introducing dysfunctional protein-protein interactome (dfppi) - a platform for systems-level protein-protein interaction (ppi) dysfunction investigation in disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 88, 102886(2024).</li>
<li>Pasala, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epichaperomes%3A+Redefining+chaperone+biology+and+therapeutic+strategies+in+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Epichaperomes: Redefining chaperone biology and therapeutic strategies in complex diseases.</a> RSC Chem Biol. 6 (5), 678-698 (2025).</li>
<li>Chu, F., Sharma, S., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTMs+as+molecular+encoders%3A+Reprogramming+chaperones+into+epichaperomes+for+network+control+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">PTMs as molecular encoders: Reprogramming chaperones into epichaperomes for network control in disease.</a> Trends Biochem Sci. , (2025).</li>
<li>Chiosis, G., Digwal, C. S., Trepel, J. B., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+complexity+of+hsp90+in+cellular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional complexity of hsp90 in cellular homeostasis and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (11), 797-815 (2023).</li>
<li>Rodina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epichaperome+is+an+integrated+chaperome+network+that+facilitates+tumour+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The epichaperome is an integrated chaperome network that facilitates tumour survival.</a> Nature. 538 (7625), 397(2016).</li>
<li>Rodina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation.</a> Nat Commun. 14 (1), 26(2023).</li>
<li>Inda, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epichaperome+is+a+mediator+of+toxic+hippocampal+stress+and+leads+to+protein+connectivity-based+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The epichaperome is a mediator of toxic hippocampal stress and leads to protein connectivity-based dysfunction.</a> Nat Commun. 11 (1), 19(2020).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically+controlling+protein-protein+interactions+through+epichaperomes+for+therapeutic+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically controlling protein-protein interactions through epichaperomes for therapeutic vulnerability in cancer.</a> Commun Biol. 4 (1), 20(2021).</li>
<li>Bay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+interactome+mapping+reveals+actionable+protein+network+dysregulation+across+the+alzheimer%27s+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Sq%22%5BJournal%5D)">Systems-level interactome mapping reveals actionable protein network dysregulation across the alzheimer's disease spectrum.</a> Res Sq. , (2025).</li>
<li>Moulick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+proteomics+reveal+cancer-specific+networks+coordinated+by+HSP90%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by HSP90.</a> Nat Chem Biol. 7 (11), 818-826 (2011).</li>
<li>Kishinevsky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90-incorporating+chaperome+networks+as+biosensor+for+disease-related+pathways+in+patient-specific+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hsp90-incorporating chaperome networks as biosensor for disease-related pathways in patient-specific midbrain dopamine neurons.</a> Nat Commun. 9, 15(2018).</li>
<li>Roychowdhury, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+epichaperome+assembly+is+a+regulator+of+cellular+adaptability+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven epichaperome assembly is a regulator of cellular adaptability and proliferation.</a> Nat Commun. 15 (1), 8912(2024).</li>
<li>Roychowdhury, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+native-page+for+the+identification+of+epichaperomes+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of native-page for the identification of epichaperomes in cell lines.</a> Methods Mol Biol. 2693, 175-191 (2023).</li>
<li>Taldone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synthesis%2C+and+evaluation+of+small+molecule+HSP90+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">synthesis, and evaluation of small molecule HSP90 probes.</a> Bioorg Med Chem. 19 (8), 2603-2614 (2011).</li>
<li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+stagetips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flashpack%3A+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Flashpack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Mol Cell Proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).</li>
<li>Sinitcyn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxdia+enables+library-based+and+library-free+data-independent+acquisition+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Maxdia enables library-based and library-free data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Biotechnol. 39 (12), 1563-1573 (2021).</li>
<li>DiscoveryLibraries. , The Max Planck Institute of Biochemistry. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf?dir=/DiscoveryLibraries">https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf?dir=/DiscoveryLibraries</a> (2025).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diapasef%3A+Parallel+accumulation-serial+fragmentation+combined+with+data-independent+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Diapasef: Parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition.</a> Nat Methods. 17 (12), 1229-1236 (2020).</li>
<li>Lou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+commonly+used+software+suites+and+analysis+workflows+for+dia+proteomics+and+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Benchmarking commonly used software suites and analysis workflows for dia proteomics and phosphoproteomics.</a> Nat Commun. 14 (1), 94(2023).</li>
<li>Demichev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dia-pasef+data+analysis+using+fragpipe+and+dia-nn+for+deep+proteomics+of+low+sample+amounts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dia-pasef data analysis using fragpipe and dia-nn for deep proteomics of low sample amounts.</a> Nat Commun. 13 (1), 3944(2022).</li>
<li>Wen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+DDA+library-free+strategies+for+phosphoproteomics+and+ubiquitinomics+data-independent+acquisition+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of DDA library-free strategies for phosphoproteomics and ubiquitinomics data-independent acquisition data.</a> J Proteome Res. 22 (7), 2232-2245 (2023).</li>
<li>Bowler-Barnett, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniprot+and+mass+spectrometry-based+proteomics-A+2-way+working+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Uniprot and mass spectrometry-based proteomics-A 2-way working relationship.</a> Mol Cell Proteomics. 22 (8), 100591(2023).</li>
<li>Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dia-nn%3A+Neural+networks+and+interference+correction+enable+deep+proteome+coverage+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dia-nn: Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput.</a> Nat Methods. 17 (1), 41-44 (2020).</li>
<li>Wang, T., Digwal, C. S., Alam, A., Chiosis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((script+epichaperomics+-+systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">script epichaperomics - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation.</a> Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7416220 (2022).</li>
<li>Chaperomics_ad_2019. , Chiosislab. 
 <a target="_blank" href="https://github.com/chiosislab/Chaperomics_AD_2019">https://github.com/chiosislab/Chaperomics_AD_2019</a> (2019).</li>
<li>Chaperomics_controllability_2020. , Chiosislab. 
 <a target="_blank" href="https://github.com/chiosislab/Chaperomics_controllability_2020">https://github.com/chiosislab/Chaperomics_controllability_2020</a> (2019).</li>
<li>Alam, A., Wang, T., Chiosis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+files+-+systems-level+analyses+of+protein-protein+interaction+network+dysfunctions+via+epichaperomics+identify+cancer-specific+mechanisms+of+stress+adaptation+%5Bdata+set%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Cytoscape files - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation [data set].</a> Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7433980 (2022).</li>
<li>Kolberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%3AProfiler-interoperable+web+service+for+functional+enrichment+analysis+and+gene+identifier+mapping+%282023+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G:Profiler-interoperable web service for functional enrichment analysis and gene identifier mapping (2023 update).</a> Nucleic Acids Res. 51 (W1), W207-W212 (2023).</li>
<li>Yan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+stressors+engender+protein+connectivity+dysfunction+through+aberrant+n-glycosylation+of+a+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular stressors engender protein connectivity dysfunction through aberrant n-glycosylation of a chaperone.</a> Cell Reports. 31 (13), 27(2020).</li>
<li>Castelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+aberrant+n-glycosylation+can+alter+protein+functionality+and+ligand+binding%3A+An+atomistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">How aberrant n-glycosylation can alter protein functionality and ligand binding: An atomistic view.</a> Structure. 31 (8), 987-1004.e8 (2023).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+epichaperome+modulation+by+zelavespib%3A+Biochemical+insights+on+target+occupancy+and+extended+residence+time+at+the+site+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of epichaperome modulation by zelavespib: Biochemical insights on target occupancy and extended residence time at the site of action.</a> Biomedicines. 11 (10), 2599(2023).</li>
<li>Guzman, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+label-free+quantification+and+comprehensive+proteome+coverage+with+narrow-window+data-independent+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition.</a> Nat Biotechnol. 42 (12), 1855-1866 (2024).</li>
</ol>

Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) posiada prawa intelektualne do portfela epichaperomu. G.C., A.R., C.S.D. i S.S. są wynalazcami licencjonowanej własności intelektualnej. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Opisany tutaj protokół umożliwia mapowanie dysfunkcyjnych inhibitorów protonowych środków protonowych w natywnych próbkach biologicznych za pomocą platformy dfPPI. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod wnioskujących o dysfunkcji wynikających ze zmian obfitości lub ekspresji, ta platforma rejestruje przekształcenie sieci na poziomie strukturalnym poprzez izolowanie specyficznych dla choroby interaktorów poprzez oczyszczanie powinowactwa sondami celującymi w epichaperom, a następnie ilościowe SM oparte na bezoznakowaniu. Chociaż obecne zastosowanie koncentruje się na tkance mózgu po śmierci, metoda ta jest szeroko stosowalna do innych typów próbek i modeli chorób, w tym hodowanych komórek i tkanek z modeli nowotworów, neurodegeneracji i zaburzeń odporności 16,17,18,19,20,22,23.
dfPPI opiera się na sondach, które kinetycznie wybierają epichaperomy i zatrzymują zespoły z ich powiązanymi interaktorami. PU-kulki (pochodzące z chemotypów wiążących epichaperom, takich jak PU-H71/PU-AD) angażują epichaperomy z jądrem HSP90 niekowalencyjne, ale z długim czasem pobytu, co jest cechą kinetycznej selektywności konformacji epichaperomu w porównaniu do konwencjonalnych kompleksów chaperonów23. YK5-B to biotinylowana, kowalencyjna sonda skierowana na HSC70 w epichaperomach, umożliwiająca wychwytywanie wewnątrzkomórkowych przed lizą i zachowując endogenne inhibitory pompy proponacyjne17. Selektywność wynika z PTM związanych z chorobą, które remodelują konformacje HSP90/HSC70 oraz chemię kieszonkową i stabilizują zespoły epichaperomu 14,23,43,44; te zmiany prowadzą do wiązaniao wysokiej afinitecie, wolnego wiązania K dla sond niekowalencjnych typu PU45 (oraz umożliwiają wychwytywanie kowalencyjne z HSC70-skierowanym YK5-B), tym samym zachowując kompleksy epichaperomowe kinetycznie i izolując ich bezpośrednie i pośrednie interaktory dla LC-MS/MS. W praktyce kulki PU są optymalne do procesów lizatanowych/homogenicznych, podczas gdy YK5-B obsługuje przechwytywanie komórek żywych; oba zachowują kontekstowo zależne zespoły, które mogą być identyfikowane przez LC-MS/MS i wykorzystywane do dalszej analizy dfPPI.
Do dfPPI wymagana jest specjalistyczna wiedza chemiczna do syntezy sond chwytających. Jednak ten wymóg nie jest unikalny dla dfPPI: szeroko stosowane metody PPI (AP-MS, oznakowanie zbliżeniowe, XL-MS) również opierają się na specjalistycznych umiejętnościach, np. klonowanie/inżynieria tagowanych przynęt, generowanie stabilnych linii komórkowych, optymalizacja znakowania/sieci krzyżowych oraz złożone potoki bioinformatyczne. Dla kontrastu, dfPPI unika manipulacji genetycznej i nadmiernej ekspresji przynęty, działa bezpośrednio na komórkach lub tkankach rodzimych (w tym na rzadkich klinicznych próbkach biologicznych) oraz wykorzystuje standardowe procesy chwytania powinowactwa i LC-MS, które są już rutynowe w rdzeniach proteomicznych. Aby obniżyć bariery adopcyjne, zweryfikowane kulki PU i dopasowane koraliki kontrolne są dostępne za pośrednictwem MTA w laboratorium Chiosis, a kroki obsługi i kontroli jakości są w pełni określone w krokach 1.3 i 1.4. Na koniec, analizę wspiera internetowa aplikacja dfPPI, która implementuje wymagane statystyki oraz odczyty ścieżek/sieci, zmniejszając obciążenie bioinformatyczne (czyli dla użytkowników bez doświadczenia kodistycznego i z podstawowymi umiejętnościami bioinformatycznymi).
AP-MS, XL-MS, znakowanie zbliżeniowe, kofrakcjonacja oraz CETSA/TPP odpowiadają na różne pytania (bezpośrednie wiązaczy, bliskość przestrzenna, oznakowanie sąsiedztwa, współskładanie lub kostabilność termiczna). dfPPI jest metodą wybieraną, gdy celem jest mapowanie endogennego, kontekstowo zależnego przeprogramowania w chorobach – szczególnie w tkankach rodzimych lub dużych kohortach klinicznych, gdzie oznaczanie genetyczne nie jest możliwe, oraz gdy pożądane są odczyty na poziomie szlaku/sieci z pojedynczego przechwytu. dfPPI wykorzystuje epichaperomy jako przynęty multipleksowe do rejestrowania skoordynowanych zmian interakcji między wieloma białkami w jednym pull-down, umożliwiając skalowalną identyfikację LC-MS/MS oraz analizę skoncentrowaną na szlakach na podstawie materiału pierwotnego. W praktyce dfPPI może zasiewać walidację skoncentrowaną na przynęcie (np. AP-MS na konkretnych węzłach), podczas gdy tradycyjne metody mogą udoskonalać topologię (bezpośrednie kontakty, ograniczenia przestrzenne) dla kompleksów zaznaczonych przez dfPPI. Zobacz Tabelę 1 , aby porównać obok siebie.
Na skuteczność przepływu pracy wpływa kilka kluczowych kroków. Po pierwsze, wysokiej jakości ekstrakty białkowe są niezbędne. Wymaga to ostrożnego obchodzenia się z tkankami lub komórkami – najlepiej mrożonymi i przechowywanymi w temperaturze -80 °C – aby zminimalizować proteolizę i zachować naturalne kompleksy. Uwzględnienie zarówno inhibitorów proteazy, jak i fosfatazy jest niepodważalne: integralność epichaperomu, która pełni rolę funkcjonalnej "przynęty" w tym teście, zależy od specyficznych modyfikacji podstawowych składników po translacji, takich jak HSP90 23,43. Na przykład fosforylacja Ser226 i Ser255 jest niezbędna do stabilizacji konformacji epichaperomu i zachowania jego funkcji rusztowania.23. Brak inhibitorów fosfatazy grozi upadkiem strukturalnym i utratą specyficzności biologicznej.
Kolejnym kluczowym czynnikiem jest jakość i obsługa macierzy powinowactwa kulek PU. Koraliki powinny być przechowywane w 100% izopropanolu w temperaturze -20 °C i używane w określonym przedziale aktywności, najlepiej w ciągu 1-2 lat. Aktywność powinna być weryfikowana przed krytycznymi eksperymentami, ponieważ starzejące się kulki mogą wykazywać zmniejszoną zdolność wiązania lub zwiększoną interakcję niespecyficzną. Czas inkubacji i dopływ białka muszą być również zoptymalizowane: nadinkubacja może podnieść tło, podczas gdy niewystarczający poziom dostarczania białek może obniżyć głębię detekcji. Zalecamy 3-godzinne inkubacje oraz pilotażowe wyciąganie w celu kalibracji odpowiedniego wejścia dla każdego typu próbki.
Z tym protokołem są kompatybilne dwie strategie trawienia: on-bead i in-gel. Oba procesy przynoszą powtarzalne rezultaty, ale każdy z nich ma swoje kompromisy. Trawienie w żelu może wprowadzać zanieczyszczenia, takie jak keratyna, i wymaga dodatkowych kroków obsługi. Trawienie na kulkach usprawnia przepływ pracy i jest zazwyczaj preferowane, gdy przepustowość próbki lub ilość wejścia jest ograniczająca. Jednak ilość proteazy musi być kalibrowana na podstawie całkowitego spożycia białka: chociaż metoda została zaprojektowana na 750 ng trypsyny, przy wysokim poziomie białka może wystąpić niepełne trawienie, co prowadzi do nieudanych rozszczepień i zmniejszonej regeneracji peptydów. Zaleca się ocenę wydajności trawienia i odpowiednie dostosowanie dopływu enzymów. Wszystkie etapy trawienia powinny być wykonywane w probówkach o niskim wiążeniu, używając świeżo przygotowanych, wolnych od zanieczyszczeń odczynników, aby zapewnić spójność i zminimalizować tło.
Obciążenie białkiem na jedno zastrzyknięcie LC-MS zależy od procesu wychwytu, wydajności peptydu oraz pojemności kolumny. Dla digestów na kulkach analizowanych na standardowych kolumnach nano-LC C18 (~50-75 μm ID, ~15-25 cm) zazwyczaj ładujemy 300-500 ng na jedno wstrzyknięcie; Nie zaobserwowaliśmy wzrostu wydajności powyżej ~400-500 ng, podczas gdy wyższe obciążenia sprzyjają tłumieniu jonów i szczytowemu rozszerzaniu. W przypadku procesów w żelu (np. pięć plasterków na tor) zazwyczaj wstrzykujemy ~25% odsolonego materiału na kawałek na replikację i zachowujemy ~50% jako zapas na ponowne wstrzykiwanie, jeśli zajdzie taka potrzeba. We wszystkich przypadkach należy zmierzyć stężenie peptydu przed wtryskiem, zweryfikować odpowiedź liniową za pomocą digestu QC i dostrojić obciążenie tak, aby kształt szczytu chromatograficznego i głębokość identyfikacji były zachowane bez przeciążenia.
Ilościfikacja bez etykiet za pomocą DIA jest szeroko stosowana w proteomice ze względu na swoją powtarzalność i głębokość46. Jednak w kontekście eksperymentów z przechwytywaniem powinowactwa, takich jak ten, gdzie celem jest identyfikacja białek wchodzących w interakcje z rusztowaniami epichaperomowymi, a nie mierzenie globalnej obfitości białek – strategie normalizacji, takie jak MaxLFQ, nie są odpowiednie. Te podejścia zakładają jednolite wejście wejściowe i podobieństwo w całym proteomie, które są naruszane przez etap wzbogacania nieodłączny dla tego protokołu. Zamiast tego wartości intensywności lub liczby widmów MS/MS zapewniają wystarczającą i biologicznie istotną ilościowość do dalszej analizy funkcjonalnej. Te wskaźniki odzwierciedlają względną siłę lub częstotliwość interakcji białek z epichaperomami w różnych warunkach. Jak wykazały wcześniejsze badania 16,17,18,20, wartości te doskonale nadają się do analiz interaktomowych na poziomie systemowym, takich jak dfPPI, które identyfikują zmienione szlaki biologiczne bez polegania na normalizacji całej proteomu. Zachowując rzeczywistą zmienność biologiczną wprowadzoną przez chorobę lub leczenie, ilościowa ilościowa metoda oparta na intensywności lub MS/MS umożliwia dokładne i solidne mapowanie dysfunkcji sieci PPI.
Chociaż przechwytywanie powinowactwa zmniejsza przestrzeń wyszukiwania w porównaniu do całego lizatu, pull-downy dfPPI nadal zawierają setki do tysięcy białek obejmujących szeroki zakres dynamiczny, plus współwzbogacone tło. Dla porównań na skalę kohort, stochastyczny wybór prekursorów DDA prowadzi do brakujących wartości run-to-run oraz zmiennego próbkowania interaktorów o niskiej obfitości18. DIA systematycznie fragmentuje wszystkie jony w określonych oknach, zapewniając większą głębię, mniej brakujących wartości oraz wyższe właściwości powtarzalności run-to-run, które są kluczowe, gdy wnioskowanie w dalszej fazie jest na poziomie ścieżki/sieci, a nie pojedynczego białka. Dlatego standaryzujemy DIA dla dfPPI.
Jak w przypadku wszystkich metod wychwytywania powinowactwa, niespecyficzne wiązanie białek jest istotnym czynnikiem. Białka mogą być zatrzymywane ze względu na lepkość żywicy, dużą ilość lub agregację. Chociaż takie niespecyficzne interaktory mogą pojawić się w eluzji pull-down, ich obecność nie podważa dalszego celu analitycznego protokołu17. Workflow dfPPI nie jest zaprojektowany do definiowania interakcji binarnych, lecz do wydobywania wzorców przeprogramowania PPI na poziomie systemowym. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego są przeprowadzane na interaktorach różnicowych i wykorzystują statystyki sieciowe do ujawniania skoordynowanych zmian na poziomie szlaków. Jak wykazano w poprzednich badaniach17, takie podejście na poziomie systemowym minimalizuje wpływ izolowanych niespecyficznych białek i pozwala na wyciąganie solidnych wniosków biologicznych na podstawie danych na poziomie kohort.
W porównaniu z konwencjonalnymi podejściami do mapowania interaktomów – takimi jak współimmunoprecipitacja, znakowanie bliskości czy sieciowanie – platforma dfPPI oferuje wyraźną przewagę: rejestruje funkcjonalną remodelację interaktomów w warunkach związanych z chorobą, bez konieczności inżynierii przynęt czy nadmiernej ekspresji. Ponieważ metoda izoluje kompleksy białkowe utworzone wokół epichaperomów supramolekularnych, wykrywa powstające zespoły białkowe, które nie występują w zdrowych układach, co umożliwia odkrycie nowych czynników choroby. Podejście to jest skalowalne i adaptowalne w zależności od tkanek, gatunków i stanów chorobowych, a już dostarczyło unikalnych wglądów w przebudowywanie proteomów w nowotworach i neurodegeneracji. W związku z tym ta metoda stanowi potężne narzędzie do odkrywania sieci funkcjonalnych zakłóconych w chorobach ludzkich.
Poza przykładami tutaj, dfPPI jest dobrze przygotowane dla (i) dużych kohort klinicznych, aby stratyfikować pacjentów według dysfunkcji sieci oraz odkrywać farmakodynamiczne biomarkery raportujące zaangażowanie celów i korektę szlaków; (ii) podłużne próbkowanie (np. przed/po terapii, etap choroby) w celu śledzenia trajektorii przeprogramowania i przewidywania respondentów; (iii) integrację z fosfoproteomiką i innymi omikami świadomymi PTM w celu powiązania zmian stanu interakcji z sygnalizacją upstream; (iv) przestrzennie rozdzielone fragmenty z mikrorozciętych obszarów (interfejsy guz-normalne, podregiony mózgu) do mapowania lokalnej patobiologii sieci; (v) przesłony perturbacyjne (genetyczne lub złożone), gdzie odczyty dfPPI nominują węzły i mechanizmy działania, które można wykonywać; oraz (vi) modelowanie grafów/AI, które uczy się specyficznych dla choroby cech sieci z map dfPPI dla prognozowania i projektowania terapii. Metodologicznie miniaturyzacja, automatyzacja (np. formaty 96-dołkowe) oraz standaryzowana kontrola jakości umożliwią wysokoprzepustowe pipeline'y dla badań translacyjnych i badań klinicznych. Wreszcie, wyniki dfPPI mogą zasiewać ukierunkowane follow-upy – AP-MS, XL-MS lub oznakowanie bliskości – aby rozwiązać topologię priorytetowych modułów, podkreślając komplementarność metody w ramach narzędzi interaktomicznych.

Funkcja komórek, a co za tym idzie organizmów, zależy od precyzyjnej koordynacji sieci interakcji białko-białko (PPI) 1,2. Te sieci odpowiadają za organizację i realizację niemal wszystkich procesów biologicznych. Chociaż sieci PPI są z natury dynamiczne i reagują na stres, w chorobach mogą ulegać nieprawidłowemu przeprogramowaniu, prowadząc do nieprawidłowych funkcji. Co ważne, ta zmiana nie musi wiązać się ze zmianami w ekspresji genów czy białek; wynika raczej ze zmienionych interakcji fizycznych między białkami, które normalnie są wyrażanejako 3,4,5. Tradycyjne podejścia w biologii systemów, takie jak transkryptomika czy proteomika, nie są w stanie uchwycić tych kluczowych zmian na poziomie interakcji.
Technologie mapowania PPI znacznie się rozwinęły, dostarczając informacji o organizacji i regulacji sieci komórkowych 6,7,8,9,10,11. Powszechnie stosowane podejścia, takie jak oczyszczanie powinowactwa – spektrometria mas (AP-MS), sieciowanie (XL)-MS, znakowanie zbliżeniowe oraz kofrakcjonacja, oferują specyficzne zalety, takie jak wysoka specyficzność, rozdzielczość przestrzenna czy zdolność wykrywania kompleksów przejściowych 6,8,9,10,11 . Jednak metody te często wymagają białek przynętowych, manipulacji genetycznej lub złożonej bioinformatyki i mogą mieć trudności z uchwyceniem wielkoskalowego, chorobowo napędzanego przeprogramowania sieci białek w natywnych systemach biologicznych 6,7,8,9,10,11 . Większość z nich również nie jest skalowalna, co czyni je niepraktycznymi do analizy dużych kohort próbnych lub systematycznego mapowania zmian interaktomowych między warunkami, typami komórek lub punktamiczasowymi 6,7,8,9,10,11 (Tabela 1).
Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy dysfunkcyjną platformę Protein-Protein Interactome (dfPPI), metodę chemoproteomiczną, która bezpośrednio identyfikuje dysfunkcje sieci PPI odpowiedzialne za fenotypy chorobowe12. Wykorzystuje kluczową wiedzę biologiczną: w stanach chorobowych podzbiór molekularnych chaperonów tworzy rusztowania nadmolekularne zwane epichaperomami 13,14,15. Struktury te nie działają w fałdowaniu białek, lecz pełnią funkcję rusztowania, które reorganizują łączność białek3. Co istotne, białka przechowywane w epichaperomach nie są losowe; Są to osoby aktywnie zaangażowane w utrzymanie fenotypuchorobowego 16,17,18,19,20. Poprzez wychwytywanie tych białek związanych z epichaperomem oraz ich interaktorów, dfPPI identyfikuje dokładne zmiany sieciowe powodujące określone stany chorobowe. Przełączenie sieci sterowane przez epichaperom jest powszechne we wszystkich chorobach – głównie w kohortach z chorobą Alzheimera oraz ~70% w próbkach nowotworowych16,20 – potwierdzające zastosowanie dfPPI w dużych, skoncentrowanych na chorobie badaniach.
Platforma dfPPI obejmuje cały proces od przygotowania próbki, przechwytywania powinowactwa epichaperomu oraz identyfikacji interaktomów przez MS, po analizy bioinformatyczne w dalszej fazie, takie jak wzbogacanie szlaków i modelowanie funkcjonalnych sieci białkowych (Rysunek 1). Metoda wykorzystuje specyficzne dla epichaperomu sondy chemiczne unieruchomione na macierzach powinowactwa (kulki PU lub inne sondy)13,16,17 do izolacji funkcjonalnego interaktomu z komórek lub tkanek. Te badania zostały już rygorystycznie zatwierdzone w wielu publikacjach pod kątem swoistości do epichaperomów oraz dopasowania do dfPPI 16,17,18,20,21,22. Zdobyte kompleksy poddawane są MS, stosując zarówno procesy trawienia na kulce, jak i w żelu, a następnie LC-MS/MS BEZ ETYKIET. Uzyskane dane mogą być następnie analizowane za pomocą dedykowanego potoku bioinformatycznego, który definiuje dysfunkcje na poziomie interakcji i łączy je z procesami biologicznymi oraz fenotypami. Ponieważ epichaperomy konstruują kontekstowo-specyficzne interaktomy 17,18,20, dfPPI ujawnia, jak sieci białkowe są przekształcane w danej chorobie, typie komórki lub stadium, co czyni go potężnym narzędziem biologii systemowej do precyzyjnego fenotypowania.
Metoda ta jest wysoce skalowalna i została zastosowana na setkach próbek klinicznych i eksperymentalnych, w tym na tkankach ludzkich po śmierci oraz komórkach hodowlanych, w różnych chorobach, takich jak nowotwory i neurodegeneracja 16,17,18,19,20,22,23 . Poprzez ujawnienie zmian PPI definiujących stan patologiczny, dfPPI umożliwia zarówno mechanistyczne wglądy, jak i odkrycie praktycznych celów terapeutycznych 16,17,18,19,20,22,23.
W tym protokole szczegółowo opisujemy eksperymentalne komponenty platformy dfPPI, od wychwytywania powinowactwa interaktomów związanych z epichaperomem, przez przygotowanie próbki do LC-MS/MS, aż po identyfikację interaktomów za pomocą MS. Pipeline analizy obliczeniowej – czyli to, co robi się z listą białek zidentyfikowanych przez MS do definiowania różnicowych interakcji i konsekwencji funkcjonalnych – nie jest tu omówiony ze względu na ograniczenia miejsca. Jednak jest bezpłatnie dostępny i szeroko udokumentowany przez aplikację dfPPI Shiny w https://epichaperomics.mskcc.org (zaktualizowaną do https://dfppi.mskcc.org) oraz na stronie internetowej Chiosis Lab pod https://www.chiosislab.com/resources. Oprócz tych portali, pełny pipeline bioinformatyczny oraz towarzyszące mu recepty zostały uwzględnione w kilku publikacjach stosujących dfPPI do raka 16,17,19 oraz choroby Alzheimera 18,20.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Toksyczne, łatwopalne</td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN) Optima&nbsp;</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>A955-1</td><td>Klasa LC/MS (łatwopalna)</td></tr><tr><td>Ośrodek chromatografii aktywowanej Affi-Gel 10</td><td>Bio-Rad</td><td>1536099</td><td>Wykorzystywane do produkcji kulek PU i kontrolnych kulek (łatwopalne)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu (ABC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Ultimate 25x75 C18 kolumna UHPLC</td><td>IonOpticks</td><td>AUR3-25075C18-CSI</td><td></td></tr><tr><td>Film autoradiograficzny</td><td>EWEN-PARKER X-RAY CORP</td><td>EBA45</td><td>Alternatywa wykrywania sygnału chemicznego po zachodnim blocie</td></tr><tr><td>Mikro homogenizator tkanek Biomasher</td><td>DWK Nauki o Życiu Kimble</td><td>7496250010</td><td>Wykorzystywane do homogenizacji zamrożonej tkanki mózgowej do ekstrakcji białka</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówek 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówek 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Z regulacją temperatury</td></tr><tr><td>Wirówka do probówek 15-50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Stosowane do lamp stożkowych</td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td>Stosowane do densytometrii żelowej/blot</td></tr><tr><td>Piec kolumnowy</td><td>Sonation GmBH, Niemcy</td><td>ES071/ES072</td><td>Utrzymuje kolumnę nanoLC w temperaturze 50 i stopni; C oznacza stałą retencję</td></tr><tr><td>Stożkowe lampy (15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kontrolne</td><td>Laboratorium Chiosis</td><td>N/A</td><td>Taldone i in. (PMID:&nbsp; 21459002)</td></tr><tr><td>Bejca Coomassie G-250 (Bio-safe)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610786</td><td></td></tr><tr><td>Ciemne rurki Eppendorfa (1,5 mL)</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2507</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roche</td><td>10197777001</td><td>Drażniące</td></tr><tr><td>Łatwy nLC 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Łatwy nLC 1000</td><td>System LC używany z Q Exactive HF</td></tr><tr><td>Dyski ekstrakcji fazowej Empore</td><td>Kompania 3M</td><td>2215-C18 (Octadecyl)</td><td>Używany do przygotowania StageTips do odsolania peptydów; Aktywowany 100% metanolem</td></tr><tr><td>Zestaw do zwiększonej chemiluminescencji (ECL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Lampy Eppendorfa (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA) Optima&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-10X1AMP</td><td>Klasa LC/MS</td></tr><tr><td>g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)</td><td>BIIT Group-Tartu & Uuml; likool</td><td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td><td>Wzbogacenie ścieżek</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP229-1</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP381-5</td><td>Proszek krystaliczny</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom sprzężone z HRP (RRID: AB_2619742)</td><td>Sothern Biotech</td><td>1030-05</td><td>Wtórny przeciwciało H90-10</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw kozikom sprzężone z HRP (RRID: AB_2632593)</td><td>Sothern Biotech</td><td>4010-05</td><td>Drugorzędny dla HSP90&alpha; oraz przeciwciała HOP</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw szczurom sprzężone z HRP u kóz (RRID: AB_2716837)</td><td>Sothern Biotech</td><td>3030-05</td><td>Wtórny przeciwciało HSC70</td></tr><tr><td>Podgrzewana orbitalna wstrząsająca</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C (2231001127)</td><td></td></tr><tr><td>Metoda trawienia białka HeLa standardowo-Pierce'a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88329</td><td>Wykorzystywane do oceny jakości jakości LC-MS</td></tr><tr><td>Przeciwciało HOP (RRID: AB_10828378)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5670</td><td>Dla kontroli jakości kulek PU</td></tr><tr><td>Przeciwciało HSC70 (RRID: AB_10617277)</td><td>Enzo</td><td>SPA-815</td><td>Dla kontroli jakości kulek PU</td></tr><tr><td>Przeciwciało HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)</td><td>StressMarq</td><td>SMC-107</td><td>Dla kontroli jakości kulek PU</td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa HSP90 (RRID: AB_303423)</td><td>Abcam</td><td>Ab2928</td><td>Dla normalizacji zgodnie z Sekcją 1.2</td></tr><tr><td>Linia komórkowa ludzka: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td>Linia komórkowa kontrolna, epichaperom niski/chaperon wysoki</td></tr><tr><td>Linia komórkowa ludzka: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td>Linia komórkowa kontrolna, epichaperom wysoki/chaperon wysoki</td></tr><tr><td>ImageJ (v1.54p)</td><td>Wayne Rasband</td><td>https://imagej.net/ij/</td><td>Densytometria</td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149-5G</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Mikrowirówki niskobiałkowe</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza Lys-C</td><td>Promega&nbsp;</td><td>VA1170</td><td>Klasa LC/MS</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>MaxQuant (v2.1.1.0)</td><td>Max-Planck-Instytut Biochemii</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td>Workflow MaxDIA do identyfikacji peptydów/białek oraz ilościowej ilościowej opartej na intensywności bez oznak</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454-4</td><td>Klasy HPLC, łatwopalny, toksyczny</td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa z mini inhibitorem proteazy (kompletna)</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td></td></tr><tr><td>Mini elektroforetyczna komórka transferowa Trans Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-żelowy zbiornik elektroforezy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Stosowane do żeli prefabrykowanych Novex</td></tr><tr><td>Komórka Elektroforezy Pionowej Mini-PROTEAN Tetra&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>Stosowane do żeli białkowych Mini-PROTEAN Prefabrykowanych lub ręcznie odlewanych żeli</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; TGX Prefabrykowane Żele Białkowe (4&ndash; 20%)</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Agilent</td><td>BioTek Synergy H1</td><td>Używany do szacowania stężenia peptydów przed iniekcją LC-MS</td></tr><tr><td>NanoElute 2</td><td>Bruker</td><td>https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf</td><td>Zastosowanie w przepływie pracy diaPASEF</td></tr><tr><td>Źródło Nanospray Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES071</td><td>Dla nanospray ESI sprzężenia</td></tr><tr><td>Nowy obiektyw PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P</td><td>New Objective Inc.</td><td>PF360-75-10-N-5</td><td>Wypełnione zawiesiną C18 do długości 20 cm</td></tr><tr><td>Błona nitrocelulozowa</td><td>Cytiva Amersham</td><td>10600006</td><td></td></tr><tr><td>Mleko suche bez tłuszczu</td><td>Laboratorium naukowe</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele Novex 8% Tris-Glycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP00080BOX</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa inhibitora fosfatazy PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testowania białka BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pojemniki</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Kołysak platformowy</td><td>Corning</td><td>6705</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP366-1</td><td>Białe Kryształy</td></tr><tr><td>Zasilacz uniwersalny PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610375</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki PU</td><td>Laboratorium Chiosis</td><td>N/A</td><td>Taldone i in. (PMID:&nbsp; 21459002)</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Orbitrap spektrometr mas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf</td><td>Wykorzystywane w DIA-MS</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro; m</td><td>Dr. Maisch GmbH, Niemcy</td><td>R13.aq</td><td>Medium krzemionkowe do separacji peptydów; Zawiesina proszkowa/metanolu (1:3, v/v)</td></tr><tr><td>Jednostka obrotowa (rotator end-over-end)</td><td>Barnstead&nbsp; Międzynarodowy</td><td>400110</td><td></td></tr><tr><td>Naboje Sep-Pak C18 (100 mg)</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP166-500</td><td>Stopień elektroforezy</td></tr><tr><td>Sonifikacji</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate czytnik</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Paradygmat SpectraMax</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys</td><td>https://biognosys.com/software/spectronaut/</td><td>workflow directDIA</td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>Savant SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>Podciśnienie ssące</td><td>Kardynał Zdrowia</td><td>CDL-65651-320</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr mas TimsTOF HT</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html</td><td>Wykorzystywane do analizy diaPASEF</td></tr><tr><td>Kwas trójfluoroctowy (TFA) Optima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>LC/MS klasy (, palne)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP152-5</td><td>Proszek krystaliczny; Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Tris, pH 6,8 (1 M)</td><td>Teknova</td><td>T1068</td><td></td></tr><tr><td>Tris, pH 7,5 (1 M)</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP1757-500</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Bufor soli fizjologicznej z buforem tris-buffer (20x TBS)</td><td>VWR, nauki przyrodnicze</td><td>97064-338</td><td></td></tr><tr><td>Tris-glycine-SDS (TGS 10x) z buforem żelowym</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP13414</td><td>Elektroforezy</td></tr><tr><td>Trypsyna &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Stopień sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td>Stopień LC/MS</td></tr></tbody></table>

mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Mapping Dysfunctional Protein-Protein Interactions in Disease

Sieci interakcji białko-białko (PPI) są dynamicznie przekształcane w chorobach, jednak większość podejść biologii systemowej koncentruje się na zmianach w obfitości białek, pomijając krytyczne dysfunkcje na poziomie interakcji. Przedstawiamy tutaj solidną, chemoproteomiczną metodę – dysfunkcyjną interaktom białko-białkowy (dfPPI) – która umożliwia wysokoprzepustowe, systematyczne, kontekstowe mapowanie dysfunkcji sieci PPI w komórkach i pierwotnej tkance ludzkiej. Metoda ta integruje sondy biologii chemicznej, które selektywnie rejestrują interaktomy oparte na epichaperomie, z bezoznakową chromatografią cieczową i spektrometrią mas tandemową (LC-MS/MS) oraz analizą obliczeniową opartą na sieci, aby odkryć przekształcenie sieci białkowych, które nie są widoczne wyłącznie z danych transkryptomicznych lub proteomicznych. Platforma dfPPI może być stosowana w różnych stanach choroby, gatunkach i tkankach, aby identyfikować możliwe do działania węzły dysfunkcji oraz umożliwiać wysokorozdzielcze, systemowe wglądy w postęp choroby. W tym protokole demonstrujemy krok po kroku procedury przygotowywania próbek, obróbki sondą chemiczną, wzbogacania powinowactwa, analizy LC-MS/MS bez oznakowania oraz bioinformatyczne przepływy pracy wykorzystywane do generowania i interpretacji zbiorów danych dfPPI. Niniejszy artykuł ma na celu promowanie powtarzalności i dostępności tego podejścia, wspierając jego przyjęcie przez szersze środowiska biologii systemowej i badań translacyjnych.

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Protein-protein interaction (PPI) networks are dynamically remodeled in disease, yet most systems biology approaches focus on changes in protein ...

Nasza praca mapuje dysfunkcyjne interakcje białko-białko bezpośrednio z komórek i tkanek rodzimych, ujawniając, jak choroba zmienia sieci komórkowe. W przeciwieństwie do większości metod międzyatomowych, dfPPI nie wymaga inżynierii genetycznej ani umiejętności wobec kohort pacjentów, stosując jedno multipleksowe przechwycenie na próbkę. Na początek przygotuj bufor ekstrakcji białek zawierający 20 milimolowych tristonów, 20 milimolowych chlorków potasu, 5 milimolowych chlorków magnezu oraz 0,01% Nb-40.Dodaj inhibitory proteazy i fosfatazy tuż przed użyciem i trzymaj bufor na lodzie. Umieść próbkę zamrożonej tkanki w rurce mikro z tłuczkiem. Dodaj 500-700 mikrolitrów natywnego buforu lizy, dostosowując objętość do zwartej tkanki i łatwości homogenizacji.Następnie ujednolic próbkę na lodzie, delikatnie poruszając tłukiem w górę i w dół oraz przy ściankach ściernych, aż uzyskamy równomierną zawieszkę. Inkubuj lizaty w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, umieszczając fiolkę na jednostce obrotowej. Delikatnie mieszaj próbki podczas inkubacji i rotacji.Za pomocą wirówki stołowej wiruj próbki w temperaturze 13 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Ostrożnie zbieraj supernatanty i przelewaj je do przezroczystych rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Określ całkowite stężenie białka w supernatancie za pomocą zestawu do badania BCA zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie weź aliquot koralików poliuretanowych bezpośrednio z materiału izopropanolowego. Pozwól kulkom opadnąć, aby usunąć rozpuszczalnik do przechowywania. Ostrożnie zasysaj izopropanol, następnie dodaj natywny bufor lizowy i całkowicie ponownie zawiesz kulki poprzez delikatne pipetowanie lub inwersję.Aby umyć i wyrównać kulki, przewij rurkę, a następnie ją odwiruj. Następnie zasysaj supernatant za pomocą linii próżniowej z końcówką pipety, uważając, by nie ruszyć granulki. Dodaj bufor wiązający do pranych koralików w równych proporcjach, aby uzyskać jednolitą zawiesinę działającą do koralików.Należy zastosować 40 mikrolitrów zawiesiny z kulek poliuretanowych do rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra, używając wyciętego końcówki pipety dla płynnego dozowania. Następnie przemyj kulki trzy razy natywnym buforem liza, dodając 1 mililitr buforu do każdej rurki. Wiruj rurkę, aby ponownie zawiesić kulki, następnie wiruj w 10 000 G przez minutę i wyrzucaj supernatant przez aspirację.Po końcowym myciu usuń większość pozostałej cieczy z rurek, dbając o to, aby kulka pozostała nienaruszona. Dodaj znormalizowane ekstrakty białkowe do pojedynczych mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra zawierających 40 mikrolitrów zawiesiny z kulek kontrolnych. Dostosuj końcową objętość do 250 mikrolitrów, dodając odpowiednią ilość natywnego buforu lizy.Inkubuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając się na rotatorze end-over over end z prędkością 10-15 obrotów na minutę. Wiruj probówki w 10 000 G przez 1 minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpylić kulki kontrolne wraz z agregowanymi lub nierozpuszczalnymi białkami. Ostrożnie zbieraj supernatant z kulek kontrolnych za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra i przelewaj go do świeżych rurek o pojemności 1,5 mililitra zawierających 40 mikrolitrów zawieśniny z kulek poliuretanowych.Inkubuj próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 3 godziny z rotatorem pełnym na końcu. Po dokładnym odwirowaniu rurek zasysaj supernatant i przemyj kulki cztery razy, jak pokazano wcześniej. Usuń resztki PBS z rurki.Ponownie zawiesić umyte kulki w 80 mikrolitrach 2-molowego mocznika, świeżo przygotowanych w 50-milimolowym wodorowęglanie amonu o pH 8,5 poprzez pipetowanie lub krótkie wirowanie. Następnie dodaj ditiotrytol, aby uzyskać końcowe stężenie 1 milimolaru. Po zakryciu rury inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, potrząsając z prędkością 1,100 obrotów na minutę na podgrzanym orbitalnym wstrząsaczu.Dodaj jodoacetamid, aby uzyskać końcowe stężenie 3,67 milimolaru. Inkubuj probówki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 45 minut, potrząsając z prędkością 1 100 obrotów na minutę. Następnie dodaj dodatkowy ditiotreitol, aby wygasić ewentualne niezareagowane jodoacetamid, zapewniając końcowe stężenie 3,67 milimola i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.Do próbki dodaj 750 nanogramów proteazy Lys-C o stężeniu 0,5 miligrama na mililitr spektrometrii mas. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, potrząsając z prędkością 1 150 obrotów na minutę. Następnie do próbki dodaj 750 nanogramów świeżo przygotowanego tripsinu o stężeniu 0,5 miligrama na mililitr o jakości sekwencjonalnej.Inkubuj mieszankę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząskami o prędkości 1 150 obrotów na minutę. Następnego dnia wiruj próbkę w stężeniu 1 000-5 000 G przez 1-5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przelej supernatant do świeżej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety i wyrzuć kulki.Dostosuj pH trawienia poniżej 3, dodając po kroplach 50% kwasu trifluorooctowego. Sprawdź pH za pomocą pasków wskaźnikowych. Kulki PU wychwytywały HSP90, HSC70 i gorące białka silnie z epichaperomu wysokiego lizatu z minimalnym sygnałem z epichaperomu o niskim lizacie, co potwierdza biologiczną specyficzność sondy.Profil ładunku kulki PU wykazał bogaty, wysokocząsteczkowy sygnał na torze kulek PU oraz minimalne tło w torze kulek kontrolnych, potwierdzając skuteczną aktywność sondy. Żele SDS-PAGE barwione przez koomazy wykazały spójny rozkład pasm w czterech próbkach przetworzonych w żelu, potwierdzając pomyślne wzbogacenie kompleksów białkowych z natywnych lizatów przed zastosowaniem spektrometrii mas. Techniczna powtarzalność została potwierdzona analizą głównych składników, gdzie próbki replikujące się skupiały się ciasno, podczas gdy różne próbki rozdzielały się czysto.Rozkłady intensywności jonów prekursorowych wykazały, że większość cech miała współczynniki zmienności poniżej 20%, z medianą wartości od 9,7% do 11,9% w próbkach, co potwierdza spójną detekcję i odzysk peptydów. Hierarchiczne klastrowanie liczebności białek przekształconych logarytmicznie ujawniło silne rozdzielanie próbek oraz zachowaną zmienność między próbkami, z intensywnością białek od niskiej obfitości do wysoko wzbogaconych białek. Analiza wzbogacenia szlaków wykazała szeroki zakres adnotacji w wielu ontologiach, w tym kategoriach ontologii genów oraz kuratorowanych bazach danych, takich jak Reactome, KEGG i WikiPathways.dfPPI pozwoliło nam odkryć mechanistyczne i terapeutyczne wglądy, których inne podejścia po prostu nie potrafią osiągnąć. dfPPI podnosi interomikę do poziomu rzeczywistych kohort chorób i warunków rodzimych, umożliwiając precyzyjne mechanistyczne i terapeutyczne hipotezy. Obecnie rozszerzamy dfPPI, aby mapować zmiany na poziomie sieci w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak Alzheimer i Parkinson.

mapping-dysfunctional-protein-protein-interactions-in-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD).  IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami.  Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Kontrolowanie ekspresji białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żyjącego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Przedstawiony protokół przedstawia zastosowanie interferencji przeciwciał w komórkach ssaków, w tym w pierwotnych neuronach hipokampa, a także demonstruje zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji w badaniu funkcji białek.

Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Przedstawiono protokół obliczeniowy, CaseOLAP LIFT, oraz przypadek użycia do badania białek mitochondrialnych i ich powiązań z chorobami sercowo-naczyniowymi, jak opisano w raportach biomedycznych. Protokół ten można łatwo dostosować do badania wybranych przez użytkownika składników komórkowych i chorób.

Podejście oparte na grafie wiedzy w celu wyjaśnienia roli szlaków organellarnych w chorobie za pomocą raportów biomedycznych

Stosujemy magnetoencefalografię (MEG) oraz elektroencefalografię (EEG) w celu zmapowania obszarów mózgu zaangażowanych w przetwarzanie prostych bodźców sensorycznych.

Mapowanie funkcjonalne z jednoczesną rejestracją MEG i EEG

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Poznaj metodę mapowania dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w tkankach natywnych przy użyciu sond chemicznych i spektrometrii masowej. Ta technika umożliwia identyfikację zmian sieci komórkowych w chorobach bez inżynierii genetycznej.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Przeglądaj więcej filmów