Wielolaboratoryjny model udaru zakrzepowo z trombolizą Stroke Preclinical Assessment Network Stroke: TE-MCAo

Zakres naszych badań polega na opracowaniu modelu udaru zakrzepowo zatorowego z kontrolowaną trombolizą do zastosowań w rygorystycznych, wielolaboratoryjnych testach terapeutycznych przedklinicznych. Nasz protokół dotyczy braku prostego, powtarzalnego modelu udaru zakrzepowo-zatorowego, który naśladowałby kliniczną trombolizę i wspierał wieloośrodkowe badania przedkliniczne. Aby zacząć od tępego wykonania rury PE-50, wycinając jej koniec pod skosowanym kątem.

Przytnij sam czubek fazowego grotu mikronożyczkami. Po przygotowaniu znieczulonego szczura do operacji wykonaj pionowe nacięcie na wewnętrznej stronie uda, o długości około 1,5 do dwóch centymetrów, wzdłuż naturalnego fałdu przecięcia pachwinowego z nogą. Nacięcie powinno być ortogonalne do oczekiwanego przebiegu anatomicznego tętnicy udowej.

Stosując tępy rozwarstwienie, ostrożnie rozcień aż do naczyń udowych. Następnie oddziel tętnicę udową od żyły i nerwu biegnącego w tym samym pęczku. Zrób szkieletonizację tętnicy udowej jak najbliżej, śledząc jej pochodzenie z tyłu otrzewnego.

Luźno załóż pętlę z jedwabiu 5-0 wokół tętnicy udowej i użyj ogona, aby delikatnie naprężyć bliższy koniec tętnicy. Następnie zatkać obwodowo tętnicę udową jedwabną ligaturą 5-0 i użyć ogonów szwów, aby zapewnić lekkie napięcie dystalnie za pomocą zacisków hemostatycznych. Około dwie trzecie odległości od pętli szwów bliższych umieść kawałek jedwabnego szwu pod tętnicą i wykonaj małą arteriotomię dystalnie od luźnego szwu za pomocą mikronożyczek.

Za pomocą ostrych kleszczy podnieś górne otwarcie tętniczki i wprowadź tępy, fazowany cewnik PE-50 do otworu. Przesuń cewnik tak daleko, jak to możliwe, tak aby luźna pętla po zakręceniu obejmowała cewnik. Delikatnie dokręć szew, upewniając się, że nie zatkał cewnika ani nie leżał na fazie.

Zwolnij zacisk z gumowej buty. Cewnik powinien natychmiast wypełnić się krwią. Napełnij trzy rurki wirówki o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po wypełnieniu rurek usuń cewnik PE-50 z tętnicy udowej, podwiązuj bliższy koniec i zamknij nacięcie przerwanymi szwami 5-0 Prolene. Aby przygotować zakrzep, należy przelać 500 mikrolitrów świeżo pobranej lub przechowywanej krwi dawcy do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać jeden mililitr chlorku wapnia w celu odwrócenia krzepnięcia. Następnie natychmiast zasysaj krew z rurki mikrowirówki do rurki PE-50 o średnicy 100 centymetrów, delikatnie ssając, i inkubuj zwiniętą rurkę w podgrzanym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w piekarniku stołowym.

Po wyrzuceniu zakrzepu do szalki Petriego zawierającej PBS, pokrój go na fragmenty o długości około sześciu centymetrów, używając żyletki. Delikatnie włóż każdy zakrzep do cewnika PE-50 i całkowicie go wypróżnij pięć razy, aby go umyć. Przemyj zakrzep ponownie, delikatnie wprowadzając go do cewnika PE-10 i całkowicie wydalając 15 razy.

Dodaj 200 mikrolitrów 4% błękitu Evansa do szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów PBS, aby uzyskać rozcieńczenie numer 1. Następnie pipetuję 400 mikrolitrów rozcieńczenia numer 1 do osobnej szalki Petriego zawierającej 20 mililitrów PBS, aby uzyskać rozcieńczenie numer 2. Umieść skrzep na bardziej skoncentrowanym roztworze niebieskiego Petriego Evansa na jedną sekundę, a następnie przelej go do rozcieńczonej niebieskiej szalki Petriego Evansa.

Załaduj jeden myty krzepnik do prefabrykowanych mikrocewników bez zatorowości powietrznej, stosując metodę mokro-mokro-mokro. Gdy krzep jest w pełni obciążony, wyciągnij tyle krzepów, aby dokładnie pięć centymetrów pozostało w mikrocewniku. Przytnij nadmiar żyletką.

Zaznacz mikrocewnik 16 milimetrów od końca, aby oznaczyć zakres cewnika, który powinien być przesunięty wewnątrz światła. Wstępnie obciążone zakrzepki zostały wstrzyknięte do tętnicy szyjnej wewnętrznej 135 osób w sześciu laboratoriach badawczych, aby przetestować wykonalność modelu zakrzepowego zamknięcia środkowej tętnicy mózgowej. Rezonans magnetyczny wykonano po trzech dniach u 102 zwierząt, co wskazuje na 75% wskaźnika ukończenia skanowania.

Utrata zwierząt przed obrazowaniem była spójna we wszystkich sześciu laboratoriach. Średnia objętość zmian we wszystkich miejscach wynosiła 13% półkuli ipsilateralnej, z pewnymi różnicami w sześciu laboratoriach. Nasz protokół naśladuje ludzki zakrzep i trombolizę, ogranicza użycie zwierząt, standaryzuje operacje i zapewnia niezawodną wieloośrodkową powtarzalność.

W znaczącym efekcie naszych badań stworzyliśmy skalowalny, powtarzalny model TE-MCAo, który można wykorzystać w wielu laboratoriach z konsekwentnymi wynikami i ustrukturyzowaną kontrolą jakości. Model ten może być konsekwentnie stosowany zarówno w pojedynczych, jak i wielolaboratoryjnych badaniach udarów, poprawiając przesiewowe badania terapeutyczne i przyspieszając translację kandydatów na terapie ochronne dla mózgu.