Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Materiais
Buffers
<ol><li>Tampão de lavagem: 1 X salina tamponada de fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio</li>
	<li>Tampão de fixação: 1% paraformaldeído na PBS</li>
	<li>Tampão de permeabilização: 0,1% Triton X-100 na PBS</li>
	<li>Tampão de bloqueio: 1% de albumina de soro bovino na PBS</li>
	<li>Meio de crescimento celular: DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina e L-glutamina</li>
</ol>Equipamento
<ol start="6"><li>Capa de fluxo laminar</li>
	<li>Incubadora umidificada (37°C, 5% CO2)</li>
	<li>Microscópio de varredura a laser confocal; aqui, Nikon Eclipse Ti laser</li>
</ol>Materiais e Reagentes
<ol start="9"><li>Slides de cultura celular câmara</li>
	<li>Mídia de montagem anti-fade com DAPI (para núcleos de coloração)</li>
	<li>Vidro de tampa de microscópio</li>
	<li>Limpezas de tarefas delicadas</li>
	<li>Pipettors e dicas</li>
</ol>Reagentes específicos de ensaio
<ol start="14"><li>Células aderentes (células primárias ou linhas celulares); aqui, foram utilizados fibroblastos de camundongos transfectados com CD1d (LCD1).</li>
	<li>Anticorpos primários para detectar alvos celulares; aqui, foram utilizados CD107a anti-rato de rato (LAMP-1) e CD1d anti-rato do mouse.</li>
	<li>Anticorpos secundários conjugados por fluorofora específicos para isótipos de anticorpos primários; aqui igG anti-rato conjugado ao Alexafluor 488 e anti-mouse IgG conjugado ao Alexafluor 647 foram usados.</li>
</ol>2. Protocolo
Preparando-se para a coloração de anticorpos
Células semeadas
<ol><li>Resuspend as células de interesse em meios de crescimento.</li>
	<li>Em seguida, semente 500 μL da suspensão da célula /por poço nos poços de um slide de câmara de 4 poços. (Aqui, as células LCD1 foram semeadas em 2,5x105 células/câmara em 500 μL de mídia de crescimento. A densidade de semeadura pode variar entre as linhas celulares).</li>
	<li>Incubar o deslizamento da câmara durante a noite em uma incubadora de CO2 de 5%, a 37°C, para permitir que as células aderam ao vidro.</li>
	<li>No dia seguinte, aspire a mídia de cada poço e depois lave as células 1X com 500 μL PBS.</li>
</ol>Fixação
<ol start="5"><li>Para fixar as células, adicione 500 μL 1% de solução de paraformaldeído em cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente de resíduos líquidos perigosos apropriado.</li>
	<li>Em seguida, lave as células 3 vezes com 500 μL PBS para remover quaisquer resquícios do fixador.</li>
</ol>Permeabilização
<ol start="8"><li>Permeabilize as células incubando com 500 μL de permeabilização tampão/poço por 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Em seguida, lave as células brevemente 3 vezes com 500 μL de PBS.</li>
</ol>Bloqueio
<ol start="10"><li>Incubar as células em cada poço com tampão de bloqueio de 500 μL por 1 hora a 4°C, para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.</li>
</ol>Incubação primária de anticorpos
<ol start="11"><li>Aspire o buffer de bloqueio das câmaras de slides.</li>
	<li>Em seguida, adicione 500 μL de solução de anticorpos primários diluídos às células. (Aqui, o anti-CD107a (LAMP-1) foi diluído 1:500 e o anti-CD1d foi usado sem diluição (anticorpo monoclonal 1H6 foi gentilmente fornecido pelo Dr. Randy Brutkiewicz)).</li>
	<li>Incubar os slides durante a noite a 4°C.</li>
</ol>Nota: Se sondar por mais de um alvo, certifique-se de que os anticorpos primários são isótipos diferentes. As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso.
Incubação secundária de anticorpos
<ol start="14"><li>Aspire a solução primária de anticorpos dos poços.</li>
	<li>Lave as câmaras de poço 4 vezes com 500 μL PBS.</li>
	<li>Em seguida, adicione 500 μL da solução de anticorpos secundários diluídos a cada poço. (Aqui, ambos os anticorpos secundários- anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-rato IgG Alexafluor 488 foram diluídos 1:2000 no buffer de bloqueio).</li>
	<li>Incubar à temperatura ambiente por 1h no escuro.</li>
	<li>Após a incubação, aspire a solução de anticorpos secundários.</li>
	<li>Lave as câmaras 4 vezes com 500 μL PBS para remover qualquer anticorpo secundário não ligado.</li>
</ol>Nota: As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso. Se sondar por mais de um alvo, os anticorpos secundários devem ser conjugados a diferentes fluoroforos com espectros exclusivos de excitação/emissão. Tenha também em mente a excitação/emissão da contra-mancha nuclear (ou seja, DAPI) ao selecionar os fluoroforos. A seleção fluorófora pode ser impactada pela configuração a laser do microscópio confocal utilizado. A configuração a laser da máquina ditará quais fluoroforos são adequados para o experimento.
3. Deslizamentos de cobertura de montagem
<ol><li>Primeiro, remova cuidadosamente as câmaras do slide.</li>
	<li>Em seguida, segure o slide no ângulo sobre uma delicada limpeza de tarefas e remova o fluido das bordas sem tocar nas células.</li>
	<li>Adicione 1 gota de meio de montagem antifato, contendo a mancha nuclear DAPI, em cada seção das células.</li>
	<li>Em seguida, coloque uma tampa de 20 mm x 60 mm sobre o slide, segurando-o sobre as bordas usando as pontas dos dedos. (Evite a formação de bolhas sobre as células, pois elas interferem com a imagem).</li>
	<li>Limpe qualquer meio de montagem extra nas laterais com uma delicada limpeza de tarefas e armazene os slides no escuro à temperatura ambiente até uma semana.</li>
</ol>4. Imagem confocal
Amostras de imagem em um microscópio de varredura a laser confocal. Para dados mostrados na Figura 2, o Nikon Eclipse Ti A1R foi usado com o software NIS Elements Advanced Research. A seção a seguir detalha o procedimento para capturar imagens usando o software acima mencionado.
<ol><li>Para começar a fotografar as células, abra o 'nis elements advanced research software' clicando no 'ícone de softwareNIS.'</li>
	<li>Em seguida, na janela de controle clique na guia'TiPad' e escolha o objetivo desejado para a imagem. (Aqui, foi utilizado o primeiro objetivo de 40x).</li>
	<li>Carregue o slide com células no palco e centralizar-o sob a lente.</li>
	<li>Agora, na aba 'A1plus Compact GUI', configure os lasers apropriados para os fluoroforos usados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral e selecione os canais necessários e ajuste o laser para cada canal.</li>
	<li>Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelhodicróico.</li>
	<li>Em seguida, sob a janela 'A1plus Compact GUI', clique em 'Ch. Series' para configurar a série de canais de linha, que configura se os lasers usados dispararão sobre a amostra simultaneamente ou sequencialmente. (Aqui, foram escolhidos passes sequenciais, começando pelo canal 1, seguido pelo canal 2, depois 4).</li>
	<li>Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone 'Ponta de seta' na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, sob a janela' A1plus Compact GUI', clique na escala deslizante e modifique o tamanho do pinhole para garantir a limitação da luz de foco. (Aqui, foi utilizada a configuração mais baixa disponível (0,5).</li>
	<li>Em seguida, ajuste as configurações de 'alta tensão' e 'deslocamento' sob cada laser para níveis apropriados, usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer potencial coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece por imagem desta amostra para cada canal para garantir que as configurações de laser produzam as razões ideais de sinal para ruído. Atenção: a alta intensidade do laser por longos períodos pode causar fotobleaching.
</li>
	<li>Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia 'ND Acquisition' e, em seguida, selecione o ícone 'Z' para configurar os parâmetros para a série Z. Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior da imagem e clique no botão 'inferior' em seguida, encontrar a posição superior da amostra e clicar no botão 'superior'. Defina o tamanho da etapa digitando especificamente o tamanho da etapa preferencial em μm para cada etapa ou especificando quantas etapas totais são necessárias.</li>
	<li>Uma vez definidos os parâmetros da série Z, selecione a resolução de tamanho/pixel desejada da imagem. Para isso, clique na janela 'A1plus Compact GUI' e sob o ícone 'tamanho' selecione a resolução desejada. Para diminuir o ruído da imagem, pode-se selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo 'ø' para obter uma média do número selecionado de imagens.</li>
	<li>Agora, clique na guia 'Executar agora' no menu 'ND Acquisition' para iniciar a imagem da amostra.</li>
	<li>Após a conclusão da imagem, salve a imagem clicando em 'Arquivo', então 'Salve Como', que exportará o arquivo de imagem com a extensão '.nd2'. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras.</li>
</ol>

A coloração fluorescente confocal é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade de espécimes que são preparados de forma semelhante à microscopia de fluorescência convencional. Resumindo, as amostras são fixas, permeabilizadas e bloqueadas. Anticorpos primários contra uma proteína ou proteínas de interesse são permitidos a ligar, então anticorpos secundários conjugados fluoróforos são usados para visualizar a coloração. A microscopia de fluorescência confocal tem aplicações em muit...

microscopia confocal de fluorescência: uma técnica para determinar a localização de proteínas em fibroblastos de camundongos

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Fonte: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 1 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland e o Centro de Câncer Integral Marlene e Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201 2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
A microscopia de fluorescência confocal é uma técnica de imagem que permite maior resolução óptica em comparação com a microscopia convencional de epifluorescência "campo largo". Microscópios confocal são capazes de obter uma resolução óptica x-y melhorada através da "varredura a laser", tipicamente um conjunto de espelhos controlados por tensão (espelhos galvanômetros ou "galvo") que direcionam a iluminação a laser para cada pixel da amostra de cada vez. Mais importante, os microscópios confocal atingem uma resolução z-axial superior usando um pinhole para remover a luz de foco originária de locais que não estão no plano z que está sendo escaneado, permitindo assim que o detector colete dados de um z-plane especificado. Devido à alta resolução z alcançável na microscopia confocal, é possível coletar imagens de uma série de z-planes (também chamado de z-stack) e construir uma imagem 3D através de software.
Antes de discutir o mecanismo de um microscópio confocal, é importante considerar como uma amostra interage com a luz. A luz é composta de fótons, pacotes de energia eletromagnética. Um fóton que implica em uma amostra biológica pode interagir com as moléculas que compõem a amostra de uma das quatro maneiras: 1) o fóton não interage e passa pela amostra; 2) o fóton é refletido/espalhado; 3) o fóton é absorvido por uma molécula e a energia absorvida é liberada como calor através de processos coletivamente conhecidos como decadência nãoraditória; e 4) o fóton é absorvido e a energia é rapidamente reemitida como um fóton secundário através do processo conhecido como fluorescência. Uma molécula cuja estrutura permite a emissão de fluorescência é chamada de fluorófora. A maioria das amostras biológicas contém fluoroforos endógenos insignificantes; portanto, fluoroforos exógenos devem ser usados para destacar características de interesse na amostra. Durante a microscopia de fluorescência, a amostra é iluminada com luz do comprimento de onda apropriado para absorção pelo fluoróforo. Ao absorver um fóton, diz-se que um fluoróforo está "animado" e o processo de absorção é chamado de "excitação". Quando um fluoróforo abre mão de energia na forma de um fóton, o processo é conhecido como "emissão", e o fóton emitido é chamado de fluorescência.
O feixe de luz usado para excitar um fluoróforo é focado pela lente objetiva de um microscópio e converge em um "ponto focal" onde é extremamente focado. Além do ponto focal, a luz novamente diverge. Os feixes de entrada e saída podem ser visualizados como um par de cones tocando no ponto focal (ver Figura 1, painel esquerdo). O fenômeno da difração impõe um limite de quão firmemente um feixe de luz pode ser focado - o feixe realmente se concentra em um ponto de tamanho finito. Dois fatores determinam o tamanho da mancha focal: 1) o comprimento de onda da luz, e 2) a capacidade de captação de luz da lente objetiva, que é caracterizada por sua abertura numérica (NA). O "ponto" focal se estende não só no plano x-y, mas também na direção z, e é na realidade um volume focal. As dimensões deste volume focal definem a resolução máxima alcançável por imagem óptica. Embora o número de fótons seja maior dentro do volume focal, os caminhos de luz cônica acima e abaixo do foco também contêm uma menor densidade de fótons. Qualquer fluoróforo no caminho da luz pode, assim, ser animado. Na microscopia convencional (campo largo), a emissão de fluoroforos acima e abaixo do plano focal contribuem com fluorescência fora de foco (um "fundo nebuloso"), o que reduz a resolução e o contraste da imagem, como demonstrado na Figura 1, com o cubo vermelho representando a emissão de fluorhoreo acima do plano focal (estrela vermelha) que resulta em fluorescência fora de foco (superior à direita). Este problema é amenizado em microscopia confocal, devido à utilização de um orifício. (Figura 2, inferior direito). Como descrito na Figura 3, o orifício permite que as emissões originárias do local focal cheguem ao detector (esquerda), enquanto bloqueiam a fluorescência fora de foco (direita) de atingir o detector, melhorando assim tanto a resolução quanto o contraste.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> Figura 1. Resolução óptica de epifluorescência versus microscopia confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O feixe de luz usado para excitar um fluoróforo é focado pela lente objetiva de um microscópio e converge em um volume focal e, em seguida, diverge (esquerda). A estrela vermelha representa o plano focal de uma amostra que está sendo imagen, enquanto o quadrado vermelho representa a emissão de fluoróforo acima do plano focal. Ao capturar uma imagem desta amostra usando um microscópio epifluorescente, a emissão do quadrado vermelho fora de foco será visível e contribuirá para um "fundo nebuloso" (canto superior direito). Os microscópios confocal têm um orifício que impede a detecção de luz emitida fora do plano focal, eliminando o "fundo nebuloso" (inferior direito).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> Figura 2. Efeito pinhole na microscopia confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora a maior intensidade da luz de excitação esteja no ponto focal da lente (esquerda, oval vermelho), outras partes da amostra não no ponto focal (direita, estrela vermelha) receberão luz e fluoresce. Para evitar que a luz emitida dessas regiões fora de foco chegue ao detector, uma tela com um orifício está presente na frente do detector. Apenas a luz em foco (esquerda) emitindo do plano focal é capaz de viajar através do orifício e alcançar o detector. A luz fora de foco (à direita) é bloqueada com o orifício e não alcança o detector.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> Figura 3. Principais componentes de um microscópio de varredura a laser confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Por uma questão de simplicidade, a descrição mecanicista de um microscópio confocal será limitada à do Nikon Eclipse Ti A1R. Embora possa haver pequenas diferenças técnicas entre diferentes microscópios confocal, o A1R serve bem como um bom modelo para descrever a função de microscópio confocal. O feixe de luz de excitação, produzido por uma matriz de lasers de diodo, é refletido pelo espelho dicroico primário no objetivo, que foca a luz no espécime que está sendo imageado. O espelho dicroico primário reflete seletivamente a luz de excitação, permitindo que a luz em outros comprimentos de onda passe. A luz então encontra os espelhos de varredura que varrem o feixe de luz através do espécime de uma maneira x-y, iluminando um único (x,y) pixel de cada vez. A fluorescência emitida por fluoroforos no pixel iluminado é coletada pela lente objetiva e passa pelo espelhodicrómico primário para alcançar uma matriz de tubos fotomultiplier (PMTs). Espelhos dicroicos secundários direcionam a luz de emissão para o PMT apropriado. A luz de excitação espalhada pela amostra de volta ao objetivo é refletida pelo espelho dirítmico primário de volta para o espécime, e assim impedido de entrar no caminho da luz de detecção e chegar aos PMTs (ver Figura 3). Isso permite que a fluorescência relativamente fraca seja quantificada sem contaminação pela luz espalhada do feixe de luz de excitação, que é tipicamente ordens de magnitude mais intensas do que a fluorescência. Como o orifício bloqueia a luz de fora do volume focal, a luz que chega ao detector vem de um plano Zestreito e selecionado. Portanto, as imagens podem ser coletadas a partir de uma série de z-planesadjacentes; esta série de imagens é frequentemente referida como uma "pilha de z". Usando o software apropriado, uma pilha zpode ser processada para gerar uma imagem 3D do espécime. Uma vantagem particular da microscopia confocal é a capacidade de distinguir a localização subcelular da coloração. Por exemplo, a diferenciação entre a coloração da membrana a partir da coloração intracelular, que é muito desafiadora com a microscopia de epifluorescência convencional (1, 2, 3).
A preparação da amostra é uma faceta importante da imagem confocal. Uma força das técnicas ópticas de microscopia é a flexibilidade para imagem de células vivas ou fixas. Ao tentar produzir imagens 3D, devido ao número de imagens que devem ser adquiridas para uma pilha z, a dificuldade de manter a saúde celular, e o movimento de células vivas e suas organelas, o uso de células fixas é típico. O procedimento para fixação e coloração de células para fluorescência confocal é semelhante ao convencionalmente utilizado na imunofluorescência. Após a cultura em slides de câmara ou em deslizamentos de cobertura, as células são fixadas usando paraformaldeído para preservar a morfologia celular. A ligação de anticorpos não específicos é bloqueada usando albumina de soro bovino, leite ou soro normal. Para manter a especificidade dos anticorpos secundários, a solução utilizada não deve ser originária da mesma espécie em que os anticorpos primários foram gerados. As células são incubadas com anticorpos primários que ligam o antígeno de interesse. Ao rotular vários alvos celulares, os anticorpos primários devem ser derivados de uma espécie diferente. Anticorpos que marcam um antígeno são então ligados por anticorpos secundários conjugados por fluoróforo. Os anticorpos secundários conjugados por fluoróforo devem ser selecionados para que sejam compatíveis com os comprimentos de onda da excitação a laser disponíveis no microscópio confocal. Ao visualizar múltiplos antígenos, os espectros de excitação/emissão dos fluoroforos devem diferir o suficiente para que seus sinais possam ser discriminados pela análise microscópica. O espécime manchado é então montado em um slide para imagens. Um meio de montagem é usado para evitar fotobleaching e desidratação da amostra. Se desejar, um meio de montagem contendo uma contra-mancha nuclear (por exemplo, DAPI ou Hoechst) pode ser usado (4).
No protocolo a seguir, os fibroblastos de camundongos transfectados para expressar CD1d (LCD1) foram manchados com anticorpos que reconhecem CD1d e CD107a (LAMP-1). CD1d é um grande receptor do complexo de histocompatibilidade 1 (MHC 1) presente na superfície de células presentes de antígenos que apresentam antígenos lipídicos. LAMP-1 (proteína de membrana associada à linsósomal-1) é uma proteína transmembrana presente principalmente em membranas lysosômicas. Para apresentação adequada de antígeno, o CD1d é traficado através do compartimento lyososômico de pH baixo, por isso o LAMP-1 está sendo usado como um marcador do compartimento lysosomal para este protocolo. Ao sondar as células LCD1 com anti-CD1d e anti-LAMP-1 que foram produzidas em diferentes espécies, anticorpos secundários com fluoroforos únicos podem ser usados para determinar a localização de cada proteína na célula e se o CD1d está presente nos compartimentos lisesosmal positivos da LAMP-1.

Neste experimento, os fibroblastos de camundongos que expressavam o gene glicoproteína superficial CD1d foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio confocal. Uma imagem representativa obtida usando o protocolo acima é mostrada na Figura 4. No painel superior de A, imagens de um único canal mostrando o padrão de coloração de cada alvo individual são apresentadas. Essas imagens compreendem uma única seção (fatia) da pilha z capturada. O painel direito mostra a coloração da D...

Microscopia confocal de fluorescência: uma técnica para determinar a localização de proteínas em fibroblastos de camundongos

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

A microscopia de fluorescência confocal é uma técnica de imagem especializada para localização de uma proteína ou antígeno de interesse em uma amostra de célula ou tecido, marcando o antígeno com um corante fluorescente conjugado com anticorpos e detectando o sinal fluorescente. Oferece maior resolução espacial do que a microscopia de fluorescência de campo amplo, com a ajuda de dois orifícios colocados nos planos focais da lente objetiva, dando-lhe o nome de confocal. Ele permite que os usuários visualizem a coloração em um nível subcelular, como a diferenciação entre a coloração da membrana superficial da coloração intracelular. Um microscópio confocal segue um princípio básico semelhante ao de um microscópio de fluorescência clássico. O feixe de uma fonte de luz, geralmente um laser para confocal, é refletido por um espelho dicróico e focalizado por uma lente objetiva na amostra. Essa luz excita os fluoróforos para emitir um comprimento de onda diferente, que viaja de volta através da lente objetiva e do espelho dicróico para uma câmera ou ocular. A resolução aprimorada de um microscópio confocal se deve principalmente à presença de dois orifícios, que são orifícios muito pequenos para a passagem da luz nos caminhos da luz de excitação e emissão. Os orifícios são estrategicamente colocados no plano focal da lente objetiva. Agora, vamos mudar para um esquema de vista lateral do arranjo do microscópio para revisar o caminho da luz. Depois de passar pelo orifício de excitação, o feixe de luz de excitação tem o efeito de se originar de um ponto focal, o que permite que a lente objetiva também focalize a luz em um ponto da amostra. O feixe de emissão deste ponto focal converge para o orifício de emissão, o que permite a sua passagem. Agora, durante a excitação, os fluoróforos dentro do caminho da luz, acima e abaixo do ponto focal, também são ligeiramente excitados. Enquanto a luz de emissão originada do ponto focal passa pelo orifício, as emissões dos pontos fora de foco convergem antes ou depois do orifício de emissão e, portanto, são bloqueadas, resultando em fluorescência de fundo reduzida. O ciclo de excitação-emissão-detecção precisa ser repetido para cada ponto de imagem na região de interesse, o que pode ser feito de algumas maneiras diferentes. Por exemplo, o confocal de varredura a laser usa espelhos de varredura galvanômetro, que desviam a luz de excitação em diferentes ângulos. Assim, varrendo o feixe de luz através da amostra no plano XY. O disco giratório confocal usa um disco com uma matriz de orifícios, que gira para mudar o arranjo dos orifícios. Isso permite que os usuários iluminem vários pequenos pontos de imagem na amostra a cada vez, cobrindo gradualmente toda a área à medida que o disco gira. Como resultado dos orifícios, a imagem XY no detector representa um plano Z estreito. Portanto, as imagens podem ser coletadas de uma série de planos Z consecutivos, geralmente chamados de pilha Z. A partir dessas imagens, um software apropriado pode gerar uma representação 3D do padrão de sinal de fluorescência na amostra. Neste protocolo, você observará a imunocoloração de fibroblastos de camundongos, seguida de imagens em um microscópio confocal para visualizar diferencialmente uma proteína de superfície celular e uma proteína lisossômica. Para começar, usando técnicas estéreis, ressuspenda as células de interesse em 500 microlitros de meio de crescimento por poço e, em seguida, semeie-as nos poços de uma lâmina de câmara de quatro poços. Aqui, estamos usando fibroblastos de camundongos que foram transfectados para expressar a molécula apresentadora de antígeno, CD1d. Para permitir que as células adiram ao vidro, coloque a lâmina da câmara em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius e incube durante a noite. De manhã, aspire o meio de cada poço e, em seguida, lave as células uma vez com 500 microlitros de PBS por alguns segundos. Para fixar as células, adicione 500 microlitros de solução de paraformaldeído a 1% em cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente apropriado de resíduos líquidos perigosos e, em seguida, remova quaisquer restos do fixador lavando as células três vezes com PBS por alguns segundos. Para permitir a penetração de anticorpos nas células, adicione 500 microlitros de tampão de permeabilização a cada poço e incube na bancada por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a permeabilização, lave as células brevemente três vezes com 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio a cada poço e incube por uma hora a quatro graus Celsius para evitar a ligação inespecífica de anticorpos. Preparar os anticorpos primários, anti-CD1d e anti-LAMP-1, em concentrações de trabalho adequadas. Em seguida, aspire o tampão dos poços e cubra as células em cada poço com 500 microlitros de solução diluída de anticorpo primário e, em seguida, incube a lâmina em uma superfície plana durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, diluir os anticorpos secundários, neste caso um anticorpo anti-ratinho e anti-rato com marcas fluorescentes distintas, em tampão de bloqueio para concentrações de trabalho apropriadas. Em seguida, aspire a solução de anticorpos primários dos poços e lave as células quatro vezes com 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de anticorpo secundário diluído a cada poço e incube em temperatura ambiente por uma hora no escuro. Após a incubação, aspire a solução de anticorpo secundário e lave os poços quatro vezes com 500 microlitros de PBS para remover qualquer anticorpo secundário não ligado. Para montar as amostras após a lavagem final, retire e remova cuidadosamente as câmaras da lâmina. Para remover o PBS residual, segure a lâmina em um ângulo sobre um lenço delicado e remova o fluido das bordas sem tocar nas células. Uma vez removido o excesso de PBS, adicione uma gota de meio de montagem antidesbotamento, contendo a coloração nuclear DAPI, em cada seção das células. Em seguida, pegue uma lamínula de 20 por 60 milímetros e, usando apenas as pontas dos dedos, comece a abaixar a lamínula lentamente em cada borda, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas sobre as células. Limpe qualquer meio de montagem extra nos slides com uma limpeza de tarefa delicada e guarde os slides no escuro em temperatura ambiente por até uma semana. Para começar a criar imagens das células, primeiro clique no ícone do software NIS na área de trabalho. Uma vez na janela de controle, clique na guia TiPad na parte superior e escolha a objetiva desejada para a imagem. Em seguida, carregue o slide com células no palco e centralize-o sob a lente. Em seguida, na guia A1plus Compact GUI ao lado da guia TiPad, configure os lasers apropriados para os fluoróforos usados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral. Quando o menu de configurações de corante e espectral estiver aberto, selecione os canais necessários e defina o laser para cada canal. Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelho dicróico. Em seguida, na janela A1plus Compact GUI, clique em Ch.Series para configurar a série de canais de linha, que configura se os lasers usados serão disparados na amostra simultaneamente ou sequencialmente. Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone de ponta de seta na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, na janela A1plus Compact GUI, clique na escala deslizante e modifique o tamanho do orifício para garantir a limitação da luz fora de foco. Em seguida, ajuste as configurações de alta tensão e deslocamento em cada laser para os níveis apropriados usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer possível coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece gerando imagens dessa amostra para cada canal para garantir que as configurações do laser produzam relações sinal-ruído ideais. Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia ND Acquisition e selecione o ícone Z para configurar os parâmetros para a série z. Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior localizando a parte inferior da imagem e clicando no botão inferior. Em seguida, encontre a posição superior da amostra e clique no botão superior. Defina o tamanho do passo digitando especificamente o tamanho de passo preferido em mícrons para cada passo ou especificando quantos passos totais são necessários. Para selecionar o tamanho/resolução de pixels desejado da imagem, clique na janela Aiplus Compact GUI e, no ícone de tamanho, selecione a resolução desejada. Para diminuir o ruído da imagem, você pode selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo teta para calcular a média do número selecionado de imagens. Depois disso, clique na guia Executar agora no menu Aquisição ND para iniciar a geração de imagens da amostra. Após a conclusão da imagem, salve a imagem clicando em arquivo e, em seguida, em salvar como, o que exportará o arquivo de imagem com a extensão dot-nd2. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras. Neste experimento, fibroblastos de camundongos que expressam o gene da glicoproteína de superfície CD1d foram fixados, imunomarcados e fotografados em um microscópio confocal. Esta imagem mostra uma única seção de uma pilha Z com ampliação de 40X, onde CD1d é corado em vermelho. A amostra foi corada com LAMP-1, um marcador lisossômico, em verde. A coloração nuclear DAPI foi usada para mostrar os núcleos das células. Em uma imagem composta onde os três canais diferentes são mesclados, o aparecimento de amarelo resulta da sobreposição dos canais vermelho e verde e indica uma área onde CD1d e LAMP-1 estão co-localizados nos lisossomos. Áreas onde apenas uma cor está presente indicam a presença de CD1d ou LAMP-1 sem co-localização. Esta imagem mostra uma renderização 3D das células construídas a partir de imagens capturadas na pilha z e este método permitiu a construção de uma vista lateral deste grupo de células. A imagem a seguir mostra uma fatia da pilha z com ampliação de 100X, demonstrando os padrões de expressão dessas duas proteínas com mais detalhes. A caixa contornada rosa no lado direito da imagem exibe a seção transversal da coordenada x designada pela linha rosa na imagem, que representa a vista lateral na linha rosa. Da mesma forma, a caixa contornada azul na parte inferior da imagem mostra a seção transversal da coordenada y designada pela linha azul na imagem, que representa a vista frontal na linha azul. A renderização 3D da imagem z-stack permite que os usuários visualizem a imagem em 3D, visualizando todos os planos x, y e z. Isso pode ser usado para estudar a co-localização das diferentes colorações em diferentes regiões dentro da célula.

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confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

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Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Esta coleção abrange muitas técnicas básicas de laboratórios de imunologia, incluindo a marcação e classificação de células imunes. Ele também demonstra métodos de proliferação de células imunes e anticorpos, bem como ensaios comuns para atividade imune, incluindo ELISA. Finalmente, demonstra coloração e imagem de tecido imune e amostras celulares.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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