Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Visão geral do procedimento
O típico ensaio de liberação de 51CR para medir a morte celular envolve as seguintes etapas:
<ol><li>Primeiro, as células-alvo são rotuladas com Na2[51Cr]O4. Isso as distingue das células efeitos no ensaio.</li>
	<li>Enquanto as células-alvo estão rotulando, as células effectoras são coletadas e, usando a técnica de diluição serial, uma titulação decrescente das células de efeito é gerada em uma placa de ensaio fundo redondo de 96 bem.</li>
	<li>No final da rotulagem da célula alvo, as células são primeiro lavadas e, em seguida, um número fixo de células são adicionadas à placa de ensaio que já contém uma série de diluições de células de efeito.</li>
	<li>Em seguida, a mistura celular com efeito-alvo é incubada por um período de tempo definido para permitir interação celular suficiente com as células-alvo, para mediar a lise celular.</li>
	<li>Finalmente, os supernacantes da cultura são colhidos e coletados em tubos. A quantidade de 51Cr é quantitatada usando um contador gama.</li>
	<li>Ao final, os dados são coletados e utilizados para calcular a "porcentagem específica de lise celular" das células-alvo.</li>
</ol>1. Rotulagem de células-alvo com 51Cr
<ol><li>Para começar, prepare as células-alvo,(aqui- linha celular de melanoma humano WM793), em uma única suspensão celular.</li>
	<li>Para fazer isso, primeiro remova a mídia do frasco de cultura tecidual.</li>
	<li>Em seguida, lave as células com 5 mL de 1X PBS.</li>
	<li>Trypsinize as células adicionando 1 mL de trippsina na placa por ~2 min.</li>
	<li>Bata suavemente o frasco para soltar as células da superfície do frasco.</li>
	<li>Adicione 5 mL de mídia RPMI ao frasco e enconha a mídia para cima e para baixo para desprender as células.</li>
	<li>Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm. Decantar o supernatante.</li>
	<li>Adicione 10 mL de mídia à pelota e cano suavemente a mídia para cima e para baixo para colocar as células em suspensão.</li>
	<li>Determine a concentração celular usando um hemócito.</li>
	<li>Transfira 1x106 células para um novo tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm e decantar o supernante.</li>
	<li>Brevemente o vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular no pequeno volume de médio deixado para trás.</li>
	<li>Adicione 100 μCi de 51Cr diretamente à suspensão da célula alvo WM793. Nota: Deve haver um espaço de laboratório dedicado para a radioatividade particular. Além disso, deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do 51Cr durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com 51Cr estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário, para levantamento do espaço para possível contaminação.
</li>
	<li>Adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que o tubo agora é radioativo.</li>
	<li>Coloque o tubo em uma incubadora de 37°C com um escudo de chumbo e incubar por 1h. Flick o tubo a cada 15-20 minutos para aumentar a absorção celular alvo do cromo.</li>
	<li>Após o período de incubação, lave as células-alvo com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso de 51Cr.</li>
	<li>Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min. Decanta radioativa FBS lavar em recipiente de resíduos apropriado.</li>
	<li>Resuspenda a pelota e lave uma segunda vez com fbs. Verifique a pelota para obter radioatividade incorporada usando um contador Geiger.</li>
	<li>Resuspenda a pelota em 10 mL meio completo, alcançando uma concentração celular de 105 células/mL. Nota: A etapa de contagem de células após a rotulagem de 51Cr é omitida aqui em grande parte pelas razões de segurança. Pode-se supor que a concentração celular WM793 é a mesma anterior à rotulagem de 51Cr.
</li>
</ol>2. Preparando células do efeito
<ol><li>Uma variedade de células efeitos podem ser usadas, como células T humanas ou de camundongos e células NK. Neste exemplo, foram utilizados PBMCs, isolados do sangue inteiro por centrifugação gradiente de densidade padrão (para uma concentração de 5x106), foram utilizados.</li>
	<li>Para começar, adicione 100 μL de cultura tecidual a cada poço de uma das linhas (aqui linha A, Ver Tabela 1) de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Aqui, não são adicionadas células de efeitos, e servirão como "em branco" para determinar a "liberação mínima/espontânea de 51Cr" das células-alvo.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> Tabela 1: 51Layout do ensaio de liberação de CR: Células alvo da linha A (104 células/ 100 μL) incubadas apenas com mídia (gera 'branco' para determinar a "liberação mínima/espontânea de 51Cr"). Linhas B a C-poços contendo diferentes efeitos: razãos de células-alvo (E:T), variando de 50:1 a 1,5:1. Células-alvo da linha H (104 células/100 μL) incubadas com 1% de NP-40 (NP-40 lyses as células-alvo, gerando "liberação máxima ou total de 51Cr"). Cada razão de E:T é testada em triplicado para cada condição experimental. Coluna 1-3- PBMCs não estimulados e PBMCs estimulados por CPG.
<ol start="3"><li>Em seguida, gerar uma diluição de células seriais 2X dos PBMCs (em triplicado para cada condição experimental), para obter uma concentração celular effectora variando de 5x105 a 15.625 células/100 μL de mídia (aqui linhas B a G). Nota: Neste exemplo, a razão do efeito inicial: célula alvo (E: T) é de 50:1. No entanto, essa razão pode ser ajustada dependendo das especificidades experimentais.
</li>
	<li>Deixe a última linha vazia (aqui linha H) não adicionando nenhuma célula de efeito a esses poços. (Esta linha será usada para gerar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a "liberação máxima de 51Cr").</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora de 37°C até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.</li>
</ol>3. Adicionando 51cr rotulados WM793 células-alvo ao ensaio
<ol><li>Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso de 51Cr.</li>
	<li>Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min, usando uma centrífuga designada.</li>
	<li>Remova a lavagem FBS (supernanato radioativo) em um recipiente de resíduos apropriado.</li>
	<li>Repita o passo de lavagem resutilização da pelota em um fresco 5 mL de FBS.</li>
	<li>Centrifugar as células novamente a 1200 rpm por 5 min.</li>
	<li>Por fim, resuspense a pelota em 10 mL de meio completo.</li>
	<li>Despeje a suspensão celular WM793 com rótulo de CR (105 células/mL) em um reservatório de reagente descartável.</li>
	<li>Em seguida, adicione 100 μL dessas células-alvo rotuladas, a cada poço da placa celular de efeito de 96 poços, usando uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Em seguida, adicione 100 μL de 1% NP-40 (na água) à linha de poços que são desprovidos de qualquer célula de efeito (aqui linha H). 1% NP-40 irá lise as células-alvo, e assim esses poços servirão como controles para determinar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a liberação máxima de 51Cr.</li>
	<li>Fixar a tampa na placa adicionando um pequeno pedaço de fita permeável a gás em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém 51Cr.</li>
	<li>Resumidamente, centrifugar a placa a 1200 rpm. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga. Nota: É importante usar uma centrífuga marcada para manusear amostras radioativas.
</li>
	<li>Retire a placa da centrífuga.</li>
	<li>Coloque a placa em uma incubadora de 37°C com um pequeno pedaço de chumbo protegendo sobre a placa para maior segurança. Incubar por 16 horas para permitir a lise celular alvo. Nota: O período de incubação pode variar de 4 a 18 h, dependendo das células efetivas utilizadas e do mecanismo potencial de morte empregado.
</li>
</ol>4. Colhendo os Supernantes
<ol><li>No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa.</li>
	<li>Em seguida, coloque o quadro de colheita na placa, certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Isso garantirá a coleta de um supernatante livre de células.</li>
	<li>Agora, devagar e gentilmente pressione os plugues de algodão nos poços.</li>
	<li>Após aproximadamente 10 segundos, solte a pressão sobre os plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para as tiras do tubo.</li>
	<li>Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário.</li>
	<li>Finalmente, carregue os tubos FACS no balcão gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de 51Cr liberada em cada condição. As amostras são tipicamente medidas por 1 minuto, permitindo uma fácil determinação das "contagens/minutos".</li>
	<li>Com cuidado, regise a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.</li>
</ol>5. Análise de dados
<ol><li>Aqui, pbmcs não estimulados foram adicionados às três primeiras colunas, e PBMCs estimulados pelo CpG (CpG ODN, (1 μg/mL) por 24 h) foram adicionados às colunas 4-6. Veja a Tabela 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Um</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eu</td>
			<td colspan="2">Média de A1,A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>C.P.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">Média de B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">Média de C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">Média de D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">Média de E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">Média de F1, F2, F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">Média de G1,G2,G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">Média de H1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>C.P.m máximo</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>Razão E:T</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: 51Dados de ensaio de liberação de cr: Valores de dados 'Contagens por minuto' / 'c. p.m', valores médios de c. p.m e valores de lise por cento.
<ol start="2"><li>Os dados coletados (contagens por minuto, ou seja.c.p.m) foram inseridos nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram dispostas na placa original.</li>
	<li>Primeiro, foram calculadas as médias dos triplicados. Tabela 2 - células I3 a P3, para PBMCs não estimulados e células I6 a P6, para PBMCs estimulados pelo CpG.</li>
	<li>Uma vez determinadas as médias, o percentual de lise específica para cada condição foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula. <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>A porcentagem de lise específica foi calculada para cada condição (Tabela 2 - células J4 a O4, para PBMCs não estimulados e J7 a O7, para PBMCs não estimulados).</li>
</ol>

O ensaio descrito aqui tem uma flexibilidade considerável, pois uma variedade de células-alvo e efeitos podem ser usadas dependendo da pergunta que está sendo feita. Por exemplo, a especificidade celular efeito ou celular pode ser determinada usando diferentes células-alvo ou o mecanismo de matança celular efeitoor pode ser determinado usando células deficientes em proteínas específicas ou usando inibidores específicos de proteínas. Um grande problema com o ensaio de liberação de 51Cr é o potencial para altas ...

ensaio para morte celular: ensaio de liberação de cromo para avaliar a capacidade citotóxica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Fonte: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3e Thomas S. Griffith1,2,3,4 1 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 2 Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 3 Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 4 Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Uma das principais funções das células do sistema imunológico é remover células-alvo que foram infectadas com vírus ou passaram por transformação em células tumorais. Ensaios in vitro para medir a capacidade citotóxica das células imunes têm sido um grampo em laboratórios por muitos anos. Esses ensaios têm sido usados para determinar a capacidade de células T, células NK ou qualquer outra célula imune para matar células-alvo de forma específica de antígeno ou -inespecífica. Ligantes de morte (por exemplo, ligante fas ou TRAIL), citocinas (por exemplo, IFNg ou TNF), ou grânulos citotóxicos (ou seja, perforina/granzyme B) expressos por células effectoras são algumas maneiras pelas quais a morte celular alvo pode ser induzida. Com a explosão na pesquisa de imunoterapia tumoral nos últimos anos, há um crescente interesse em encontrar agentes para aumentar a atividade citotóxica das células imunes para melhorar os resultados dos pacientes. Por outro lado, algumas doenças são marcadas pela atividade excessivamente exuberante da atividade citotóxica das células imunes, resultando em esforços para identificar agentes para temperar essas respostas. Assim, ter um ensaio no qual o usuário pode facilmente integrar qualquer número de células efeitos, células-alvo e/ou modificadores de resposta no design experimental pode servir como um meio valioso de avaliar rapidamente a capacidade citotóxica das células effectoras e/ou a capacidade de resposta da célula alvo.
Esses ensaios in vitro envolvem a mistura de diferentes populações celulares, bem como o uso de um número relativamente baixo de células-alvo e efeitos. Assim, uma necessidade do ensaio é rotular as células-alvo de uma maneira que possa ser facilmente detectada e quantitada, permitindo ao usuário determinar então a "por cento de lise específica" mediada pelas células effectoras. A radioatividade - especialmente, o cromo 51 (51Cr) na forma de Na251CrO4- é uma maneira barata de rotular rapidamente e sem especificação proteínas celulares dentro das células-alvo (1). Os tempos de rotulagem curta e ensaio total reduzem o potencial de mudanças significativas no número e/ou fenótipo das células-alvo, o que poderia influenciar o resultado do ensaio. Após a perda da integridade da membrana das células-alvo como resultado da atividade citotóxica das células effectoras, as proteínas celulares rotuladas por Cr de 51Cr dentro das células-alvo são liberadas na cultura sobrenante, tornando-se disponíveis para quantitação. Como em qualquer ensaio que examine a função das células imunes in vitro,há uma série de considerações importantes para considerar melhorar o desempenho do experimento. Uma das características mais críticas é usar células de efeito saudável (para atividade citotóxica máxima) e alvo (para resposta máxima e morte espontânea mínima/ liberação de51Cr). É necessário contato com o efeito e a célula alvo (levando ao uso comum de placas de fundo redondo de 96 poços para incentivar o contato celular) (2). Por fim, a análise dos dados depende da inclusão de populações celulares alvo de controle positivo e negativo.
O protocolo a seguir delineará as etapas para a realização de um ensaio de liberação padrão de 51Cr para medir a capacidade citotóxica de uma população de células efeitos, embora uma versão nãoradioativa usando europium tenha sido recentemente desenvolvida. 51 Cr é um poderoso emissor de radiação γ. Consequentemente, o uso deste ensaio requer treinamento adequado de segurança de radiação, espaço de laboratório dedicado, um contador gama e descarte de amostras radioativas.
A sequência geral de eventos neste ensaio são: 1) preparar 51alvos rotulados por Cr; 2) preparar células de efeitos e adicionar à placa enquanto as células-alvo estiverem rotulando; 3) adicionar alvos rotulados à placa; 4) placa incubadora; 5) supernastas de colheita; e 6) analisar dados após a execução de amostras no balcão. As amostras são comumente preparadas em triplicado, e então mediadas para explicar quaisquer diferenças sutis de pipetação.
O EPI adequado é importante para este ensaio. Especificamente, o usuário deve usar um jaleco e luvas. Os óculos de segurança podem ser necessários com base no laboratório ou instituição. Deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do 51Cr durante todas as etapas. Por fim, deve haver espaço de laboratório dedicado e equipamentos reservados para o uso de 51Cr, incluindo toda a sinalização adequada para indicar onde as amostras com 51Cr estão sendo mantidas e um contador Geiger equipado com sonda gama para examinar o espaço para possível contaminação.
Neste exercício de laboratório, determinaremos a capacidade das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs), (CpG estimuladas vs. não estimuladas) para matar células de melanoma, usando a linha celular de melanoma humano WM793 como modelo e o ensaio de liberação de cromo.

Neste exemplo, células efeitosas estimuladas com CpG (Figura 1, círculos negros) mataram as células-alvo de forma mais eficaz, à medida que a proporção de células efeitos ou células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados (círculos brancos),indicando que a estimulação do CPG é necessária para o aumento observado da lise celular-alvo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/fil...

Ensaio para Morte Celular: Ensaio de Liberação de Cromo para Avaliar a Capacidade Citotóxica

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Neste vídeo, você observará como realizar o ensaio de liberação de cromo e determinar o potencial citotóxico das células efetoras. As células imunológicas são responsáveis por identificar e remover células potencialmente nocivas, como câncer ou células infectadas por vírus, do corpo, que é parte integrante da resposta imunológica. Várias células imunes, como células T e células NK, possuem uma propriedade conhecida como potencial citotóxico, que é a capacidade de identificar células-alvo e secretar proteínas que induzem a degradação de proteínas, lise e morte dessas células-alvo. A quantificação do potencial citotóxico é fundamental para medir a ativação e a potência das células imunes, e o ensaio de liberação de cromo é comumente usado para esse fim. Este método permite que os usuários comparem a citoxicidade induzida por tipos específicos de células imunes sob diferentes condições, o que é valioso para estudar a imunoterapia contra o câncer e doenças relacionadas à imunidade. Para começar, as células-alvo, como as células cancerígenas, são incubadas com um isótopo radioativo, o cromo 51, que é absorvido pelas células. Em seguida, essas células marcadas com rádio são co-cultivadas com as células imunes isoladas de interesse, também chamadas de células efetoras, em uma placa de fundo redondo de 96 poços para facilitar a interação entre os dois tipos de células. A configuração geral do ensaio envolve a incubação de um número específico de células-alvo com diferentes concentrações de células imunes, juntamente com controles apropriados. A co-cultura permite que as células efetoras induzam apoptose e lise nas células-alvo, resultando na liberação do cromo 51 intracelular no sobrenadante. Em seguida, em um ponto de tempo pré-otimizado, o sobrenadante contendo o cromo liberado é colhido de todos os poços. O cromo 51, sendo radioativo, sofre espontaneamente decaimento radioativo para emitir radiação gama. Os níveis de radiação gama nos sobrenadantes de todos os poços na placa de ensaio representam uma saída quantificável da lise das células-alvo. Isso é medido usando um contador gama, que é então usado para determinar o potencial citotóxico das células imunes. Para começar, as células-alvo, a linha celular de melanoma humano WM793 neste exemplo, são preparadas em uma única suspensão celular. Para fazer isso, primeiro remova o meio do frasco de cultura de tecidos e lave as células com cinco mililitros de 1X PBS. Transvase o PBS e adicione um mililitro de tripsina à placa por aproximadamente dois minutos. Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície do frasco e, em seguida, adicione cinco mililitros de mídia RPMI ao frasco. Pipetar o meio para cima e para baixo para recolher as células e adicionar esta suspensão a um tubo cónico de 15 mililitros. Coloque o tubo na centrífuga por cinco minutos a 1200 RPM. Em seguida, remova a mídia do tubo, certificando-se de não interromper o pellet da célula. Agite suavemente o fundo do tubo para interromper o pellet celular e adicione 10 mililitros de mídia ao tubo. Em seguida, pipete suavemente o meio para cima e para baixo para colocar as células em suspensão. Em seguida, determine a concentração celular usando um hemocitômetro e transfira dois mililitros da suspensão celular original para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Coloque o tubo em uma centrífuga e peletize as células a 12 centenas de RPM por cinco minutos. Após a centrifugação, despeje o excesso de mídia do tubo em um recipiente de resíduos. Um breve vórtice do tubo para ressuspender o pellet celular no pequeno volume de meio deixado para trás. Em seguida, prepare-se para usar o Chromium 51 movendo-se para um espaço de laboratório dedicado a essa radioatividade específica. Deve haver ampla blindagem de chumbo para armazenamento e uso seguro do Chromium 51 durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com Chromium 51 estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário para servir no espaço para possível contaminação. Uma vez configurado para o uso adequado da radioatividade, adicione 100 microcuries de cromo 51 diretamente à suspensão da célula-alvo. Em seguida, adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que a amostra e o tubo agora estão radioativos. Coloque o tubo em uma incubadora de 37 graus Celsius com uma proteção de chumbo e incube por uma hora, sacudindo o tubo a cada 15 a 20 minutos. Enquanto as células-alvo estão marcando, prepare uma suspensão de célula única das células efetoras. Neste exemplo, as células mononucleares do sangue periférico humano, ou PDMCs, foram isoladas do sangue total por centrifugação com gradiente de densidade padrão a uma concentração de 5 vezes 10 elevado a 6. Transfira esta suspensão de células efetoras para um reservatório de reagente descartável e, em seguida, adicione 200 microlitros desta suspensão em cada poço da linha B em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de RPMI a cada poço na linha C a G da placa. Agora, comece a realizar diluições seriais dos PBMCs para ter uma faixa de números de células efetoras, removendo primeiro 100 microlitros das células nos poços na linha B e adicionando-as à linha C. Em seguida, dilua ainda mais as células efetoras transferindo 100 microlitros de células da linha C para a linha D. Continue a diluição serial. Quando a linha G for alcançada, mova 100 microlitros dos poços para deixar um volume final de 100 microlitros em cada poço dessa linha. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura de tecidos aos poços da linha A para servir como controle para a liberação espontânea de cromo 51 das células-alvo, pois nenhuma célula efetora deve ser adicionada a esta linha. Em seguida, coloque uma placa em uma incubadora de 37 graus Celsius até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas. Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mililitros de FBS para remover qualquer excesso de cromo 51. Em seguida, coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire a 1200 rpm por 5 minutos. Remova a lavagem radioativa do FBS em um recipiente de lixo apropriado e repita a etapa de lavagem ressuspendendo o pellet em 5 mililitros novos de FBS. Coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire as células novamente a 1200 rpm por 5 minutos. Remover a segunda lavagem e verificar se o sedimento está incorporado Finalmente, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio completo e despeje a suspensão de célula-alvo marcada com cromo 51 em um reservatório de reagente descartável. Em seguida, adicione 100 microlitros dessas células-alvo marcadas a cada poço da placa de células efetoras de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de NP-40 a 1% em água aos poços da linha H para lisar todas as células-alvo em cada linha. Esses poços serão usados como controle para determinar as contagens totais por minuto, ou cpm. Agora que a placa está preparada, prenda a tampa adicionando um pequeno pedaço de fita adesiva em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém cromo 51. Em seguida, coloque a placa em uma centrífuga marcada para lidar com amostras radioativas. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga. Ajuste a centrífuga para 1200 rpm e aumente a velocidade da placa. Uma vez na velocidade, pare a máquina. Remova a placa da centrífuga. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius com um pequeno pedaço de chumbo protegendo a placa para segurança adicional. Incubar por 16 horas para permitir que as células-alvo se lisem. No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa. Em seguida, coloque a estrutura de colheita na placa, certificando-se de confirmar se os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Agora, lenta e suavemente, pressione os plugues de algodão nos poços. Após aproximadamente dez segundos, libere a pressão nos plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para tiras de tubo. Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário. Finalmente, carregue os tubos FACS em um contador gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de cromo 51 liberada em cada condição. Registre cuidadosamente a ordem em que os tubos foram carregados no balcão. Aqui, PBMCs não estimulados foram adicionados às 3 primeiras pistas e PMBCs estimulados por CPG foram adicionados às pistas 4 a 6. Neste exemplo, as contagens por minuto foram inseridas nas células de uma planilha da mesma maneira que as amostras foram dispostas na placa original e as médias dos triplicados foram calculadas. Por exemplo, para a primeira condição, as células A1, A2 e A3 foram calculadas na célula I3. Uma vez que as médias são determinadas, a porcentagem de lise específica para cada condição pode ser calculada usando esta fórmula. Por exemplo, para calcular a porcentagem de lise específica para as células não estimuladas que tinham uma proporção de 50 para 1 células efetoras para as células-alvo, o CPM espontâneo, que neste exemplo, é 1164,67, foi subtraído do CPM experimental, 1129. 67. Esse número pode então ser dividido pela diferença entre o CPM máximo e o CPM espontâneo e, em seguida, multiplicado por 100 para obter a lise específica percentual. Isso é então calculado para cada condição. Esses dados podem então ser representados graficamente para mostrar a comparação da razão E para T com a lise específica percentual para os PBMCs não estimulados e os PBMCs estimulados por CPG. Neste exemplo, as células efetoras estimuladas com CPG mataram as células-alvo de forma mais eficaz à medida que a proporção de células efetoras para células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados, indicando que a estimulação CPG é necessária para o aumento observado na lise das células-alvo.

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Esta coleção abrange muitas técnicas básicas de laboratórios de imunologia, incluindo a marcação e classificação de células imunes. Ele também demonstra métodos de proliferação de células imunes e anticorpos, bem como ensaios comuns para atividade imune, incluindo ELISA. Finalmente, demonstra coloração e imagem de tecido imune e amostras celulares.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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